CN106546580B

CN106546580B - 一种用于鉴别人参产地的多肽微阵列芯片

Info

Publication number: CN106546580B
Application number: CN201510591302.5A
Authority: CN
Inventors: 赵树民; 鲍勇刚; 石松传; 王利峡; 邱国松
Original assignee: Beijing Pepnoch Biotech Corp Ltd
Current assignee: Beijing Pepnoch Biotech Corp Ltd
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2035-09-16
Also published as: CN106546580A

Abstract

本发明基于发现能够与从不同产地的人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应的多肽序列，利用多肽微阵列技术，提供了一种用于鉴别人参产地的多肽微阵列芯片。

Description

一种用于鉴别人参产地的多肽微阵列芯片

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种用于鉴别人参产地的生物芯片。

背景技术

人参由于“大补元气”，兹补强壮、安神益智，广泛用于延缓衰老、防治抑郁，尤其是衰老、应激等所致的各种学习记忆减退性疾病。以人参为来源的药品和保健品是我国中药类产品市场占有量最大的品种。目前我国人参以栽培为主，产地主要集中在寒温带东北地区：黑龙江省和吉林省。这两个省的人参产量约占全国的80％以上。由于受生长环境的影响，不同产地的人参，其主要药效成分如人参皂苷和人参多糖等的种类和含量各有不同，从而导致人参的价格会有很大差异。因此，需要能够快速、高效和准确地对人参的产地进行鉴定，从而快速确定人参的品质。

过去人们主要根据人参的外形、重量、主侧根形状不同来鉴别不同产地的人参。这是一种较粗放的主观的鉴别方法，在区别野生人参方面有一定的优势。随着栽培人参规模的不断扩大，这种方法已经不能够满足市场的需求。目前，区分人参不同产地的方法主要是通过对人参进行理化分析，根据不同产地的人参中多糖、皂苷和微量元素的含量不同来进行鉴别。但是这种鉴别方法过程繁琐，而且缺乏特异性，难以用于大规模快速地对人参产地进行筛查识别。目前，市场上急需一种精确客观易于操作的方法对不同产地人参给予快速检测判定的方法。

发明内容

本发明基于发现能够与从不同产地的人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应的多肽序列，利用多肽微阵列技术，提供一种多肽微阵列芯片。

具体来说，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽 C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽(以下字母是组成生物体蛋白的二十种氨基酸的缩写形式，下同)：T Y P C V R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P和P G A D F P I F中的至少一种；F P T Y D M N K、H Q S N Y I A A、W P R D N D S I和N D R P L D I L中的至少一种；D L L A N P F V、M G H V N F G A、M M R Y Y V A G和N F L R I H M T中的至少一种；以及T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F L V Q V S Q中的至少一种。在优选的实施方案中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：T Y P CV R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P、P G A D F P I F、F P T Y D M N K、H Q SN Y I A A、W P R D N D S I、N D R P L D I L、D L L A N P F V、M G H V N F G A、M MR Y Y V A G、N F L R I H M T、T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F L V Q V S Q。

在前述这些多肽中，T Y P C V R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P、P GA D F P I F能够与从产地为黑龙江木兰县的栽培人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应。同样地，F P T Y D M N K、H Q S N Y I A A、 W P R D N D S I、N D R P L D I L能够与从产地为黑龙江逊克县的栽培人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应；D L L A NP F V、M G H V N F G A、M M R Y Y V A G、N F L R I H M T能够与从产地为吉林长白县的栽培人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应；T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、AQ C E M D D H、A F L V Q V S Q能够与从产地为吉林抚松县的栽培人参中提取的人参总蛋白发生特异性反应。因此，该多肽微阵列芯片能够鉴别栽培人参的产地。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：T Y P C V R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P和P G A DF P I F中的至少一种。在优选的实施方案中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：TY P C V R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P和P G A D F P I F。该多肽微阵列芯片能够鉴别人参是否为黑龙江木兰县的栽培人参。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：F P T Y D M N K、H Q S N Y I A A、W P R D N D S I和N D R PL D I L中的至少一种。在优选的实施方案中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：FP T Y D M N K、H Q S N Y I A A、W P R D N D S I和N D R P L D I L。该多肽微阵列芯片能够鉴别人参是否为黑龙江逊克县的栽培人参。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：D L L A N P F V、M G H V N F G A、M M R Y Y V A G和N F L RI H M T 中的至少一种。在优选的实施方案中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：D L L A N P F V、M G H V N F G A、M M R Y Y V A G和N F L R I H M T。该多肽微阵列芯片能够鉴别人参是否为吉林长白县的栽培人参。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F L VQ V S Q 中的至少一种。在优选的实施方案中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F L V Q V S Q。该多肽微阵列芯片能够鉴别人参是否为吉林抚松县的栽培人参。

在本发明的多肽微阵列芯片中，所述基片为纤维素膜、玻璃板或者不锈钢板等。连接有多肽的区域的面积至少0.005cm²，优选至少0.01cm²，更优选0.01-0.1cm²，更优选0.02-0.05cm²，最优选约0.03cm²；每个区域中多肽的含量至少2nmol，优选至少4nmol，进一步优选5-50nmol，更优选 10-20nmol，最优选约12nmol。

本发明进一步提供了制备多肽微阵列芯片的方法，包括如下步骤：

(1)将表面带有羟基的基片用染色液染色；

(2)在基片上进行多肽微阵列原位合成；

(3)对氨基酸残基进行侧链钝化；

(4)去除氨基酸残基的氨基保护基团；

(5)用染色液染色；

(6)重复步骤(2)-(5)，直至合成多肽的最后一个氨基酸；

(7)去除多肽侧链保护基团；和

(8)干燥，密封包装。

在优选的技术方案中，在上述步骤(1)中，首先将表面带有羟基的基片用染色液染色10s-1min，优选约30s，染色液为溴酚蓝乙醇溶液或茚三酮乙醇溶液，优选溴酚蓝乙醇溶液，更优选质量分数为约0.1％的溴酚蓝乙醇溶液；然后用无水乙醇或DCM(二氯甲烷)，优选无水乙醇洗脱1-5 次，优选2次，每次1-5min，优选约2min；最后干燥。

在上述步骤(2)中，在基片上进行多肽微阵列原位合成时，在基片的每个区域点印氨基酸激活溶液1-5次，优选3次，每次0.04-0.12μL，优选约0.08μL，点印完后反应5-40min，优选10-20min，进一步优选室温反应约15min，使之充分反应。其中，氨基酸激活溶液中含有氨基酸激活剂、缩合催化试剂和α-氨基被保护的氨基酸，以DMF(二甲基甲酰胺)、NMP (N-甲基-吡咯烷酮)或者THF(四氢呋喃)为溶剂，优选以DMF为溶剂。其中，氨基酸激活剂为DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、DCC(N,N'- 二环己基碳二亚胺)或者EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，优选DIC，氨基酸激活剂的浓度为0.1-0.4M，优选约0.165M；缩合催化试剂为HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯)或TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸)，优选 HOBt，缩合催化试剂的浓度为0.1-0.4M，优选约0.165M；α-氨基被保护的氨基酸的浓度为0.1-0.4M，优选约0.165M，保护剂为Fmoc(N-芴甲氧羰基)、Boc酸酐(二-叔-丁基二碳酸酯)或9-芴甲醇，优选Fmoc。

在上述步骤(3)中，首先与钝化溶液I反应5-20min，优选约10min；然后与钝化溶液II反应5-20min，优选约10min；最后用DMF、DCM或 NMP，优选DMF洗脱2-8次，优选5次，每次1-5min，优选约2min。其中，钝化溶液I中含有乙酸酐，浓度为1％-5％(体积百分比V/V)，优选约2％；钝化溶液II中含有乙酸酐和N,N-二异丙基乙胺，乙酸酐的浓度为1％-5％(V/V)，优选约2％，N,N-二异丙基乙胺的浓度为1％-5％ (V/V)，优选约2％；钝化溶液I和II的溶剂为DMF、NMP或THF，优选DMF。

在上述步骤(4)中，首先用DMF、NMP或THF，优选DMF洗脱 2-8次，优选5次，每次1-5min，优选约2min；然后与去保护基溶液反应 1-5次，优选2次，每次5-15min，优选约10min；然后用DMF、NMP或 THF，优选DMF洗脱2-8次，优选5次，每次1-5min，优选约2min；然后用无水乙醇或甲醇，优选无水乙醇洗脱1-5次，优选2次，每次1-5min，优选约2min；最后干燥。其中，去保护基溶液中含有哌啶、TFA(三氟乙酸)或TMSBr(三甲基甲硅烷基溴化物)，优选哌啶，浓度为15-25％ (V/V)，优选约20％，溶剂为DMF、NMP或THF，优选DMF。

在上述步骤(5)中，首先用无水乙醇或甲醇，优选无水乙醇洗脱1-5 次，优选2次，每次1-5min，优选约2min；然后用染色液染色10s-1min，优选约30s，染色液为溴酚蓝乙醇溶液或茚三酮乙醇溶液，优选溴酚蓝乙醇溶液，更优选质量分数为约0.1％的溴酚蓝乙醇溶液；最后干燥。

在上述步骤(7)中，首先与去侧链保护基溶液反应1-5次，优选2次，每次2-8min，优选约5min；然后用DMF、NMP或THF，优选DMF洗脱1-5次，优选4次，每次1-5min，优选约2min；然后用DCM、丙酮或乙醇，优选DCM洗脱1-5次，优选3次，每次1-5min，优选约2min；然后与TFAcocktail I溶液反应15-45min，优选约30min；然后用DCM、丙酮或乙醇，优选DCM洗脱2-8次，优选5次，每次1-5min，优选约2min；然后与TFA cocktail II溶液反应1-3h，优选约2h；然后用DCM、丙酮或乙醇，优选DCM洗脱2-8次，优选5次，每次1-5min，优选约2min；然后用DMF、NMP或THF，优选DMF洗脱1-5次，优选3次，每次1-5min，优选约2min；最后用无水乙醇或甲醇，优选无水乙醇洗脱2-8次，优选5 次，每次1-5min，优选约2min。其中，去侧链保护基溶液中含有哌啶或 TMSBr(三甲基甲硅烷基溴化物)，优选哌啶，浓度为15-25％(V/V)，优选约20％，溶剂为DMF、NMP或THF，优选DMF。TFA cocktail I 溶液中含有去离子水2％-8％(V/V)，优选约5％；三异丙基硅烷2％-5％ (V/V)，优选约3％；质量分数为90％的苯酚水溶液0.5％-3％(V/V)，优选约1％；DCM0.5％-3％(V/V)，优选约1％；和TFA 85％-95％(V/V)，优选约90％。TFA cocktail II溶液中含有去离子水1％-3％(V/V)，优选约2％；三异丙基硅烷2％-5％(V/V)，优选约3％；质量分数为90％的苯酚水溶液0.5％-3％(V/V)，优选约1％；DCM 36％-52％(V/V)，优选约44％；和TFA40％-60％(V/V)，优选约50％。

在上述各步骤中，干燥可以冷风吹干、滤纸吸干或者自然晾干，优选为自然晾干，在室温下进行。

本发明的芯片的保存温度优选不超过30℃，进一步优选不超过20℃，进一步优选不超过4℃，更优选不超过-20℃，最优选-80℃。例如可以在室温、4℃冷藏、-20℃冷冻或-80℃超低温冷冻的条件下保存。

本发明进一步提供了利用本发明的多肽微阵列芯片检测不同产地人参的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测人参根部总蛋白质，并标记；

(2)对多肽微阵列芯片依次进行活化、平衡和封闭；

(3)将标记的人参根部总蛋白质与多肽微阵列芯片反应；

(4)与多肽微阵列芯片反应的人参根部总蛋白质的显色；和

(5)根据发光区域判定人参的产地。

在优选的技术方案中，在上述步骤(1)中，首先将人参根洗净、切碎，加植物组织蛋白提取液研磨至浆状，取浆液离心后，中间层透明液体即为人参根部总蛋白提取液；然后将提取的人参根部总蛋白提取液用本领域常规的标记试剂进行标记，优选用生物素标记，在用生物素标记时，优选将提取的人参根部总蛋白提取液与生物素标记试剂室温反应30-90min，更优选约60min；最后经离心过滤柱离心，滤液即为标记了的人参根部总蛋白质溶液。其中，植物组织蛋白提取液和标记试剂用本领域常用的各种试剂，可以自行配制或市售获得。本发明所用植物组织蛋白提取液的商用试剂盒例如Pierce公司的商品编号为89803的植物组织总蛋白提取试剂盒；标记试剂的商用试剂盒例如Thermo Scientific公司的商品编号为21455的 EZ-Link生物素标记试剂盒。

在上述步骤(2)中，首先将多肽微阵列芯片用无水乙醇或甲醇，优选无水乙醇洗脱1-5次，优选3次，每次2-8min，优选约5min，以激活多肽微阵列芯片上的多肽活性；然后用TSB-T溶液洗脱1-5次，优选3次，每次5-20min，优选约10min，以使多肽微阵列芯片的微环境与待测人参根部总蛋白提取液相适应；最后与封闭液反应2-6h，优选约4h，以防止多肽微阵列芯片与除人参根部总蛋白之外的其他物质非特异性结合。其中， TBS-T溶液为含0.05％-0.5％(V/V)，优选约0.2％的Tween20的TBS 溶液；封闭液为含质量分数为3％-10％，优选约5％的蔗糖，和质量分数为3％-10％，优选约4％的脱脂奶粉的TBS-T溶液。TBS溶液为25mM的Tris缓冲盐溶液，pH值为7.2-8.3，优选约8.0。

在上述步骤(3)中，首先用封闭液将标记的人参根部总蛋白溶液稀释至总蛋白浓度为0.8-1.2μg/ml，优选约1μg/ml；然后将其与多肽微阵列芯片在4℃密闭反应8-14h，优选约12h。

在上述步骤(4)中，首先将多肽微阵列芯片用TBS-T溶液洗脱1-5次，优选3次，每次2-8min，优选约5min，以使多肽微阵列芯片的微环境与封闭液相适应；然后将多肽微阵列芯片与含有0.1mg/ml的HRP标记的链霉亲和素(Streptavidin)的封闭液反应1-3h，优选约2h；然后将多肽微阵列芯片用TBS-T溶液洗脱1-5次，优选3次，每次2-8min，优选约5min，以去除多肽微阵列芯片表面附着但未与多肽微阵列结合的人参根部蛋白质；然后弃去多肽微阵列芯片上多余的TBS-T溶液，并在其上滴加电化学发光液使之完全覆盖多肽微阵列芯片的表面，避光反应1-3min，优选约2min；最后将多肽微阵列芯片放入化学发光检测仪中扫描发光斑点。其中，电化学发光液使用本领域常用的各种电化学发光液。例如Pierce公司提供的货号为 32109的ECL发光试剂盒。

在上述步骤(5)中，如果多肽微阵列芯片上的多肽T Y P C V R L N、 H W Y K RN I L、P L Y L R A F P和P G A D F P I F中的至少一种发光，表明为黑龙江木兰县的栽培参。

如果多肽微阵列芯片上的多肽F P T Y D M N K、H Q S N Y I A A、 W P R D ND S I和N D R P L D I L中的至少一种发光，表明为黑龙江逊克县的栽培参。

如果多肽微阵列芯片上的多肽D L L A N P F V、M G H V N F G A、 M M R Y YV A G和N F L R I H M T中的至少一种发光，表明为吉林长白县的栽培参。

如果多肽微阵列芯片上的多肽T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、 A Q C E MD D H和A F L V Q V S Q中的至少一种发光，表明为吉林抚松县的栽培参。

本发明的多肽微阵列芯片可以用后即抛，也可以再生从而重复利用。因而，本发明进一步提供了再生多肽微阵列芯片的方法，包括如下步骤：

(1)清洗多肽微阵列芯片；

(2)用再生液A处理多肽微阵列芯片；

(3)用再生液B清洗多肽微阵列芯片；

(4)用无水乙醇清洗多肽微阵列芯片；和

(5)干燥，密封保存。

其中，再生液A为尿素、十二烷基硫酸钠(SDS)和巯基乙醇的水溶液，其中尿素的摩尔浓度为6-10M，优选约8M；SDS的质量分数为0.5-2％，优选约1％；巯基乙醇的浓度为0.05-0.2％(V/V)，优选约0.1％(V/V)。再生液B为冰乙酸或三氟乙酸(TFA)的水溶液，优选TFA的水溶液，其中冰乙酸或TFA的浓度为50％-99％(V/V)，优选约90％(V/V)。

在优选的实施方案中，在上述步骤(1)中，优选依次用去离子水和 DMF清洗多肽微阵列芯片，分别清洗1-5次，优选3次，每次清洗2-8min，优选约5min，以去除微阵列芯片表面粘附的杂质。

在上述步骤(2)中，优选多肽微阵列芯片与再生液A在37℃反应8-14h，优选约12h，以使与多肽微阵列芯片上的多肽结合的蛋白质变性。

在上述步骤(3)中，优选用再生液B在室温下清洗多肽微阵列芯片 1-5次，优选3次，每次清洗30-90min，优选约60min，以将多肽微阵列芯片上附着的已经变性的蛋白质洗脱下来。

在上述步骤(4)中，优选用无水乙醇清洗多肽微阵列芯片1-5次，优选3次，每次清洗5-20min，优选约10min。

在上述步骤(5)中，干燥可以冷风吹干、滤纸吸干或者室温晾干，优选为自然晾干，一般在室温下进行。

根据本发明的另一个方面，本发明还涉及一种具有选自如下序列的多肽：T Y P CV R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P、P G A D F P I F、F P T Y D M N K、H Q SN Y I A A、W P R D N D S I、N D R P L D I L、D L L A N P F V、M G H V N F G A、M MR Y Y V A G、N F L R I H M T、T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F L V Q V S Q。

本发明的多肽可以通过前述方法在基片上原位合成或者利用本领域已知的其他方法，例如固相合成的方法合成，合成后再连接到基片上。

在本发明中，T为苏氨酸Thr，Y为酪氨酸Tyr，P为脯氨酸Pro，C 为半胱氨酸Cys，V为缬氨酸Val，R为精氨酸Arg，L为亮氨酸Leu，N 为天冬酰胺Asn，H为组氨酸His，W为色氨酸Trp，K为赖氨酸Lys， I为异亮氨酸Ile，A为丙氨酸Ala，F为苯丙氨酸Phe，G为甘氨酸Gly， D为天冬氨酸Asp，M为蛋氨酸Met，Q为谷氨酰胺Gln，S为丝氨酸Ser， E为谷氨酸Glu。

本发明的有益效果在于，利用多肽微阵列技术，通过多肽与人参蛋白的特异性结合，实现了对栽培人参产地的快速检测判定，方法简便易操作，成本低廉。

附图说明

图1用实施例2制备的多肽微阵列芯片检测不同产地人参的发光斑点扫描图，其中A为黑龙江木兰县的栽培参；B为黑龙江逊克县的栽培参；C 为吉林长白县的栽培参；D为吉林抚松县的栽培参。

图2用实施例3制备的多肽微阵列芯片检测不同产地人参的发光斑点扫描图，其中A为黑龙江木兰县的栽培参；B为黑龙江逊克县的栽培参；C 为吉林长白县的栽培参；D为吉林抚松县的栽培参。

图3用实施例4制备的多肽微阵列芯片检测不同产地人参的发光斑点扫描图，其中A为黑龙江木兰县的栽培参；B为黑龙江逊克县的栽培参；C 为吉林长白县的栽培参；D为吉林抚松县的栽培参。

图4用实施例5制备的多肽微阵列芯片检测不同产地人参的发光斑点扫描图，其中A为黑龙江木兰县的栽培参；B为黑龙江逊克县的栽培参；C 为吉林长白县的栽培参；D为吉林抚松县的栽培参。

具体实施方式

实施例1

1.1配制各种氨基酸激活溶液

1.1.1配制氨基酸激活剂：以DMF为溶剂，配制0.33M的DIC溶液；

1.1.2配制各种氨基酸储备液：以DMF为溶剂，配制0.33M的HOBt溶液；再以0.33M的HOBt溶液为溶剂，分别配制20种不同的α-氨基被Fmoc 保护的氨基酸，氨基酸的浓度为0.33M；

1.1.3配制各种氨基酸激活溶液：将步骤1.1.1中配制的氨基酸激活剂和步骤1.1.2中配制的氨基酸储备液以1:1的比例混合，得到0.165M的各种氨基酸激活溶液，室温静置15min以上再用。

1.2基片预处理

首先将表面带有羟基的纤维素膜在质量分数为0.1％的溴酚蓝乙醇溶液中染色30s；然后用无水乙醇洗脱2次，每次2min；最后室温晾干。

1.3多肽微阵列原位合成

用半自动多肽微阵列合成仪在纤维素膜基片上合成如下序列的多肽： T Y P C VR L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P、P G A D F P I F、 F P T Y D M N K、H Q SN Y I A A、W P R D N D S I、N D R P L D I L、 D L L A N P F V、M G H V N F G A、MM R Y Y V A G、N F L R I H M T、T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F L V Q V S Q。

每层氨基酸每个区域点印氨基酸激活溶液3次，每次0.08μL，点印完后室温反应15min，使之充分反应。

1.4氨基酸残基侧链钝化

在每合成一层后，首先将纤维素膜基片正面朝下在钝化溶液I中浸泡反应10min后，弃去钝化溶液I；然后在钝化溶液II中浸泡反应10min后，弃去钝化溶液II；最后用DMF震荡洗脱5次，每次2min。其中，钝化溶液I为含 2％(V/V)乙酸酐的DMF溶液；钝化溶液II为含2％(V/V)乙酸酐和2％ (V/V)N，N-二异丙基乙胺的DMF溶液。

1.5氨基酸残基的氨基保护基团的去除

首先将纤维素膜基片用DMF震荡洗脱5次，每次2min；然后将纤维素膜基片与去Fmoc保护基溶液震荡反应2次，每次10min，以去除Fmoc氨基保护基团；然后用DMF震荡洗脱5次，每次2min；然后用无水乙醇震荡洗脱2次，每次2min；最后室温晾干。其中，去Fmoc保护基溶液为含20％(V/V) 哌啶的DMF溶液。

1.6染色

首先将纤维素膜基片用无水乙醇震荡洗脱2次，每次2min；然后在质量分数为0.1％的溴酚蓝乙醇溶液中染色30s；最后室温晾干。

1.7重复步骤1.3到1.6直至最后一层氨基酸合成完毕。

1.8去除多肽侧链保护基团

首先将纤维素膜基片正面朝上在去侧链保护基溶液中浸泡，震荡反应2 次，每次5min；然后用DMF震荡洗脱4次，每次2min；然后用DCM洗脱3 次，每次2min；然后将纤维素膜基片在TFA cocktail I溶液中浸泡，密闭反应30min后，弃去TFA cocktail I溶液；然后用DCM震荡洗脱5次，每次2min，以完全去除TFA cocktail I残液；然后再在TFA cocktail II溶液中浸泡，密闭反应2h后，弃去TFA cocktail II溶液；然后用DCM震荡洗脱5次，每次2min，然后用DMF震荡洗脱3次，每次2min，以完全去除洗净TFA cocktail II残液；最后用无水乙醇震荡洗脱5次，每次2min。

其中，去侧链保护基溶液为含有20％(V/V)哌啶的DMF溶液；TFA cocktail I溶液由5％(v/v)的去离子水、3％(v/v)的三异丙基硅烷、1％ (v/v)的质量分数为90％的苯酚水溶液、1％(v/v)的DCM及90％(v/v) 的TFA充分混合制成；TFA cocktail II溶液由2％(v/v)的去离子水、3％(v/v)的三异丙基硅烷、1％(v/v)的质量分数为90％的苯酚水溶液、44％(v/v)的DCM及50％(v/v)的TFA充分混合制成。

1.9用吹风机凉风干燥多肽微阵列芯片，直接使用；或者密封，置于室温、冷藏(4℃)、冷冻(-20℃)或超低温冷冻(-80℃)保存。

经检测，芯片上每个区域的面积约0.031cm²，每个区域中多肽的含量约12.4nmol。

实施例2

按照实施例1相同的方法，制备了包含4个区域的多肽微阵列芯片，这4 个区域分别包含具有如下序列的多肽：T Y P C V R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P和P GA D F P I F。

实施例3

按照实施例1相同的方法，制备了包含4个区域的多肽微阵列芯片，这4个区域分别包含具有如下序列的多肽：F P T Y D M N K、H Q S N Y I A A、W P R D N D S I和N D RP L D I L。

实施例4

按照实施例1相同的方法，制备了包含4个区域的多肽微阵列芯片，这4个区域分别包含具有如下序列的多肽：D L L A N P F V、M G H V N F G A、M M R Y Y V A G和N F LR I H M T。

实施例5

按照实施例1相同的方法，制备了包含4个区域的多肽微阵列芯片，这4个区域分别包含具有如下序列的多肽：T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和A F LV Q V S Q。

实施例6人参产地的检测判定

6.1提取待测人参根部总蛋白质，并用生物素标记

6.1.1人参根部总蛋白质的提取：取不同产地(分别为黑龙江木兰县、黑龙江逊克县、吉林长白县和吉林抚松县的栽培参各10株)的新鲜人参根分别用水洗净、切碎；加植物组织蛋白提取液研磨至浆状，取浆液在4℃、 13000rpm，离心30min，中间层透明液体即为人参根部总蛋白提取液。植物组织蛋白提取液为Pierce公司的商品编号为89803的植物组织总蛋白提取试剂盒内溶液。

6.1.2人参根部总蛋白质的生物素标记：取6.1.1中得到的人参根部总蛋白提取液100μL，使用Pierce公司的商品编号为23228的蛋白定量试剂盒，采用BCA蛋白质定量测定法测定其浓度。取0.1ml不同产地的人参根部总蛋白提取液(分别含有约10mg人参根部总蛋白质)，加入13.3μL的20mM的 NHS-PEG4-Biotin(Thermo Scientific公司的商品编号为21455的EZ-Link 生物素标记试剂盒的主要组份)溶液，混匀，室温反应1h后，反应液于离心过滤柱13000rpm，离心2min，滤液即为标记了生物素的人参根部总蛋白质。

6.2多肽微阵列芯片的活化、平衡和封闭

首先分别将实施例2-5制备得到的干燥的多肽微阵列芯片用无水乙醇震荡洗脱3次，每次5min，以激活多肽微阵列芯片上的多肽活性；然后用 TBS-T溶液震荡洗脱3次，每次10min，以使多肽微阵列芯片的微环境与待测人参根部总蛋白提取液相适应；最后将多肽微阵列芯片浸泡在封闭液中，室温震荡反应4h，以防止多肽微阵列芯片与除人参根部总蛋白之外的其他物质非特异性结合。其中，TBS-T溶液为含0.2％(V/V)的Tween20的TBS 溶液；封闭液为含质量分数为5％的蔗糖和质量分数为4％的脱脂奶粉的 TBS-T溶液；TBS溶液为25mM的Tris缓冲盐溶液，pH值为8.0。

6.3生物素标记的人参根部总蛋白质与多肽微阵列芯片反应

首先用封闭液将不同产地的标记了生物素的人参根部总蛋白溶液稀释至总蛋白浓度约为1μg/ml；然后将其分别与多肽微阵列芯片在4℃密闭旋转反应约12h。

6.4与多肽微阵列芯片反应的人参根部总蛋白质的显色

首先将多肽微阵列芯片用TBS-T溶液震荡洗脱3次，每次5min，以使多肽微阵列芯片的微环境与封闭液相适应；然后将多肽微阵列芯片浸泡在含有0.1mg/ml的HRP标记的链霉亲和素(Streptavidin)的封闭液中，震荡孵育反应2h；然后将多肽微阵列芯片用TBS-T溶液震荡洗脱3次，每次 5min，以去除多肽微阵列芯片表面附着但未与多肽微阵列结合的人参根部蛋白质；然后弃去多肽微阵列芯片上多余的TBS-T溶液，并在其上滴加ECL 发光液(电化学发光液)使之完全覆盖多肽微阵列芯片的表面，避光反应 2min；最后将多肽微阵列芯片放入化学发光检测仪中扫描发光斑点。其中 ECL发光液为Pierce公司提供的货号为32109的ECL发光试剂盒。

6.5检测结果

用实施例2-5制备得到的多肽微阵列芯片检测不同产地的人参的典型发光斑点扫描见附图1-4。结果表明，从产地为黑龙江木兰县的栽培参中提取的人参总蛋白能够与实施例2制备得到的芯片中的多肽T Y P C V R L N、H W Y K R N I L、P L Y L R A F P和P GA D F P I F全部反应，但从其他产地的栽培参中提取的人参总蛋白均不会与实施例2制备得到的芯片中的多肽反应。从产地为黑龙江逊克县的栽培参中提取的人参总蛋白能够与实施例3制备得到的芯片中的多肽F P T Y D M N K、H Q S N Y I A A、W P R D N D S I和ND R P L D I L全部反应，但从其他产地的栽培参中提取的人参总蛋白均不会与实施例3制备得到的芯片中的多肽反应。从产地为吉林长白县的栽培参中提取的人参总蛋白能够与实施例4制备得到的芯片中的多肽D L L A N P F V、M G H V N F G A、M M R Y Y V A G和NF L R I H M T全部反应，但从其他产地的栽培参中提取的人参总蛋白均不会与实施例4制备得到的芯片中的多肽反应。从产地为吉林抚松县的栽培参中提取的人参总蛋白能够与实施例5制备得到的芯片中的多肽T A C K A S C H、R M F A Y Q E Q、A Q C E M D D H和AF L V Q V S Q全部反应，但从其他产地的栽培参中提取的人参总蛋白均不会与实施例5制备得到的芯片中的多肽反应。因此，实施例2-5制备得到的多肽微阵列芯片可以用于检测判定人参产地。

实施例7多肽微阵列芯片的再生

7.1取实施例6中已使用的一个多肽微阵列芯片，依次用去离子水和 DMF清洗，分别清洗3次，每次5min，去除膜片表面粘附的杂质；

7.2将多肽微阵列芯片浸泡在再生液A中，37℃反应12h，使与多肽微阵列芯片上的多肽结合的蛋白质变性。再生液A为尿素、SDS和巯基乙醇的水溶液，其中，尿素的摩尔浓度为8M，SDS的质量分数为1％，巯基乙醇的浓度为0.1％(V/V)。

7.3用再生液B室温下清洗多肽微阵列芯片3次，每次60min，以将多肽微阵列芯片上附着的已经变性的蛋白质洗脱下来。再生溶液B为TFA的水溶液，其中TFA的浓度为90％(v/v)。

7.4用无水乙醇清洗多肽微阵列芯片3次，每次10min。

7.5用吹风机凉风干燥多肽微阵列芯片，直接使用该芯片按照实施例6 相同的方法检测人参并据此判定人参产地，发现其再生后仍可用于检测人参产地。

Claims

1.一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

T Y P C V R L N、

H W Y K R N I L、

P L Y L R A F P和

P G A D F P I F中的至少一种；

F P T Y D M N K、

H Q S N Y I A A、

W P R D N D S I和

N D R P L D I L中的至少一种；

D L L A N P F V、

M G H V N F G A、

M M R Y Y V A G和

N F L R I H M T中的至少一种；以及

T A C K A S C H、

R M F A Y Q E Q、

A Q C E M D D H和

A F L V Q V S Q中的至少一种。

2.如权利要求1所述的芯片，其中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

T Y P C V R L N、

H W Y K R N I L、

P L Y L R A F P、

P G A D F P I F、

F P T Y D M N K、

H Q S N Y I A A、

W P R D N D S I、

N D R P L D I L、

D L L A N P F V、

M G H V N F G A、

M M R Y Y V A G、

N F L R I H M T、

T A C K A S C H、

R M F A Y Q E Q、

A Q C E M D D H和

A F L V Q V S Q。

3.一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

T Y P C V R L N、

H W Y K R N I L、

P L Y L R A F P和

P G A D F P I F中的至少一种。

4.如权利要求3所述的芯片，其中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

T Y P C V R L N、

H W Y K R N I L、

P L Y L R A F P和

P G A D F P I F。

5.一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

F P T Y D M N K、

H Q S N Y I A A、

W P R D N D S I和

N D R P L D I L中的至少一种。

6.如权利要求5所述的芯片，其中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

F P T Y D M N K、

H Q S N Y I A A、

W P R D N D S I和

N D R P L D I L。

7.一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

D L L A N P F V、

M G H V N F G A、

M M R Y Y V A G和

N F L R I H M T中的至少一种。

8.如权利要求7所述的芯片，其中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

D L L A N P F V、

M G H V N F G A、

M M R Y Y V A G和

N F L R I H M T。

9.一种多肽微阵列芯片，包括基片，在该基片上的不同区域连接有不同的多肽，连接于所述不同区域的不同的多肽彼此互不干扰，所述基片通过其所带有的羟基与多肽C端的羧基反应从而与多肽相连，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

T A C K A S C H、

R M F A Y Q E Q、

A Q C E M D D H和

A F L V Q V S Q中的至少一种。

10.如权利要求9所述的芯片，其中，所述不同的多肽包括具有如下序列的多肽：

T A C K A S C H、

R M F A Y Q E Q、

A Q C E M D D H和

A F L V Q V S Q。

11.如权利要求1-10中任一项所述的芯片，其中，所述基片为纤维素膜、玻璃板或者不锈钢板。

12.如权利要求11所述的芯片，其中，连接有多肽的区域的面积至少0.005cm²。

13.如权利要求12所述的芯片，其中，连接有多肽的区域的面积至少0.01cm²。

14.如权利要求13所述的芯片，其中，连接有多肽的区域的面积为0.01-0.1cm²。

15.如权利要求14所述的芯片，其中，连接有多肽的区域的面积为0.02-0.05cm²。

16.如权利要求15所述的芯片，其中，连接有多肽的区域的面积为0.03cm²。

17.如权利要求11所述的芯片，其中，每个区域中多肽的含量至少2nmol。

18.如权利要求17所述的芯片，其中，每个区域中多肽的含量至少4nmol。

19.如权利要求18所述的芯片，其中，每个区域中多肽的含量为5-50nmol。

20.如权利要求19所述的芯片，其中，每个区域中多肽的含量为10-20nmol。

21.如权利要求20所述的芯片，其中，每个区域中多肽的含量为12nmol。

22.制备如权利要求1-21中任一项所述的芯片的方法，包括如下步骤：

(1)将表面带有羟基的基片用染色液染色；

(2)在基片上进行多肽微阵列原位合成；

(3)对氨基酸残基进行侧链钝化；

(4)去除氨基酸残基的氨基保护基团；

(5)用染色液染色；

(6)重复步骤(2)-(5)，直至合成多肽的最后一个氨基酸；

(7)去除多肽侧链保护基团；和

(8)干燥。

23.一种用于检测人参产地的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测人参根部总蛋白质，并标记；

(2)对如权利要求1-21中任一项所述的多肽微阵列芯片依次进行活化、平衡和封闭；

(3)将标记的人参根部总蛋白质与多肽微阵列芯片反应；

(4)与多肽微阵列芯片反应的人参根部总蛋白质的显色；和

(5)根据发光区域判断人参的产地。

24.再生如权利要求1-21中任一项所述的多肽微阵列芯片的方法，包括如下步骤：

(1)清洗多肽微阵列芯片；

(2)用再生液A处理多肽微阵列芯片；

(3)用再生液B清洗多肽微阵列芯片；

(4)用无水乙醇清洗多肽微阵列芯片；和

(5)干燥；

其中，再生液A为尿素、十二烷基硫酸钠和巯基乙醇的水溶液，其中尿素的摩尔浓度为6-10M；十二烷基硫酸钠的质量分数为0.5-2％；巯基乙醇的浓度以体积百分比计为0.05-0.2％；再生液B为冰乙酸或三氟乙酸的水溶液，其中冰乙酸或三氟乙酸的浓度以体积百分比计为50％-99％。

25.如权利要求24所述的方法，其中，尿素的摩尔浓度为8M。

26.如权利要求24所述的方法，其中，十二烷基硫酸钠的质量分数为1％。

27.如权利要求24所述的方法，其中，巯基乙醇的浓度以体积百分比计为0.1％。

28.如权利要求24所述的方法，其中，冰乙酸或三氟乙酸的浓度以体积百分比计为90％。

29.一种具有选自如下序列的多肽：

T Y P C V R L N、

H W Y K R N I L、

P L Y L R A F P、

P G A D F P I F、

F P T Y D M N K、

H Q S N Y I A A、

W P R D N D S I、

N D R P L D I L、

D L L A N P F V、

M G H V N F G A、

M M R Y Y V A G、

N F L R I H M T、

T A C K A S C H、

R M F A Y Q E Q、

A Q C E M D D H或

A F L V Q V S Q。