CN103245788A - 一种用于b细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术 - Google Patents

Abstract

本发明是一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，包括以下步骤：1)多肽芯片的合成，用半自动合成仪吸取足量的氨基酸活化溶液点印于纤维素膜上，进行多肽点合成反应；2)多肽侧链保护基团的去除；3)多肽芯片的杂交反应。本发明提供一种高密度、高通量、可同时检测上万个多肽相关相互作用的合成技术。本发明采用自控机器逐层氨基酸点膜技术进行多肽微阵列的化学合成。合成多肽微阵列可用于蛋白质间以及蛋白质与其它生物大分子间的相互作用研究，例如寻找抗体识别多肽序列、药物的作用靶位点、蛋白质相互作用位点、筛查特定疾病相关蛋白的抗原表位，建立与某种疾病相关的多肽数据库、探讨蛋白质构效关系及作用机理等。

Description

一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术

技术领域

本发明涉及一种多肽阵列合成技术，尤指一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术。 

背景技术

在后基因组时代，科学家已经把研究重心从基因组研究转向蛋白质功能研究，从分子整体水平对蛋白质的组成及其活动规律等生物学功能进行研究，并探索人类健康和疾病的奥秘，即蛋白质组学。对蛋白质与蛋白质或其他物质(如核酸、多糖、化学物等)相互关系的研究是蛋白质组学中的关键热点，而多肽技术正是这关键研究热点的核心技术之一。 

多肽阵列是一种新型生物芯片，是后基因时代揭示各种疾病和生化现象的最直接的研究技术。通过该技术平台的软件设计系统和自动化设备，可以将任意设计的氨基酸序列一多肽，在经过特殊处理的芯片上予以高密度地原位合成，每张芯片可承载几千个甚至更多的原位合成多肽。该阵列技术可以根据已知蛋白的氨基酸序列，按序列漂移原则在芯片上原位合成多肽氨基酸序列，或者也可以根据待测物质的结构任意合成氨基酸序列，并将这些多肽按一定次序高密度地排列在芯片上，然后将测试物质(如抗体、血清、靶蛋白等)和芯片反应，经过免疫或反射等检测技术发现与测试物质有结合反应的位点/域；同时，结合反应的数据可以输入计算机进行三维结构处理，从而寻找到蛋白质与测试物质的结合部位。另外，该技术可以根据目标蛋白质设计多肽抑制物或激动剂，使得新药发现的过程大为缩短。多肽阵列技术被认为是后基因组时代与 基因芯片、蛋白芯片相蓖美的新型蛋白位点检测技术，而在疫苗、药物、诊断试剂等研发领域具广阔的应用前景。 

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种高密度、高通量、可同时测定上万个多肽相关相互作用的合成技术。 

本发明是一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，包括以下步骤： 

1)多肽芯片的合成，具体包括： 

1.1多肽微阵列芯片上的多肽合成：用半自动合成仪吸取足量的氨基酸活化溶液点印于纤维素膜上，进行多肽点合成反应； 

1.2多肽微阵列芯片合成中侧链钝化； 

1.3多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除； 

1.4多肽微阵列芯片合成过程中的染色； 

1.5重复1.2至1.4步骤继续合成多肽微阵列芯片，按照预先设定的程序，直至多肽合成完成； 

1.6将完成最后一层氨基酸合成的多肽微阵列芯片膜置于-20℃冰箱保存或直接进行下一步反应； 

2)多肽侧链保护基团的去除； 

3)多肽芯片的杂交反应。 

所述步骤1.1中的的氨基酸活化溶液的配制方法为： 

1)配制氨基酸激活剂：以DMF为溶剂，配制0.5M DIC溶液； 

2)配制各种氨基酸储备液溶液：以DMF为溶剂，配制0.5M HOBt溶液， 再将配制好的0.5M的HOBt溶液作为溶剂分别配制不同种类的Fmoc保护氨基酸，使溶液达到浓度为0.5M的氨基酸储备液； 

3)配制氨基酸激活溶液：用步骤1)中配制0.5M的DIC氨基酸激活剂和步骤2)中各种氨基酸储备液溶液以1∶1的比例混合，所得溶液即浓度为0.25M的氨基酸激活溶液。 

所述氨基酸激活溶液配制后室温静置15min以上使用。 

还包括步骤4)多肽微阵列芯片的再生。 

所述步骤1.2多肽微阵列芯片合成中侧链钝化的方法为：在多肽微阵列芯片合成每一层结束后，纤维素膜正面朝下置于玻璃平皿中，用钝化溶液I完全浸润10min后，弃去钝化溶液I，加入钝化溶液II，再次静置10min，弃去钝化溶液II，将纤维素膜正面朝上，加入DMF溶液，再震荡洗膜6次，每次2min，所述钝化溶液I为2％乙酸酐的DMF溶液，所述钝化溶液II为含2％酸酐、2％二异丙基胺的DMF溶液。 

所述步骤1.3多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除方法为：多肽微阵列芯片合成中侧链钝化后，将纤维素膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保护基团溶液后震荡反应去除Fmoc氨基保护基团，此步骤重复两次，每次10min，之后用DMF溶液震荡洗膜6次，每次2min；再用无水乙醇震荡洗膜两次，每次2min，室温晾干，所述去Fmoc保护基团溶液为含20％Piperidine的DMF溶液。 

所述步骤1.4多肽微阵列芯片合成过程中的染色方法为：在多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除后，将纤维素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量无水乙醇完全浸没纤维素膜，并加入5-6滴溴酚蓝染色溶液，摇动染色2min至膜上呈现蓝色多肽点时用无水乙醇震荡洗膜2-5次直至洗液无蓝色出现，取出纤维素膜室温晾干或者使用冷风从芯片反面使纤维素膜干燥，所述溴酚蓝染色溶液为含0.1％溴酚蓝的乙醇溶液。 

所述步骤步骤2)多肽侧链保护基团的去除方法为： 

1)将完成最后一层氨基酸合成的多肽芯片膜，面向上置于玻璃平皿中，去保护基溶液浸没，摇动反应两次，每次5min；此后，用DMF溶液摇动冲洗纤维素洗膜4次，每次2min；再用DCM洗膜3次，每次2min，所述去保护基溶液为含20％Piperidine的DMF溶液； 

2)将玻璃平皿中残余DCM溶液弃尽，多肽芯片膜完全浸入cocktail I溶液中后盖严玻璃盖，置于通风橱中静置反应30min，所述cocktail I溶液为5％的去离子水，3％的三异丙基硅烷，1％的浓度为90％的苯酚溶液，1％的二氯甲烷及90％的TFA溶液混合制成； 

3)倒出盒中cocktail I溶液，使用DCM溶液震荡洗涤盒中膜片5次，每次2min，完全洗净cocktail I残液； 

4)弃尽洗膜盒中残余DCM溶液，多肽芯片膜完全浸入cocktail II液体中后盖严，置于通风橱中静置反应2h，所述cocktail II为2％去离子水，3％三异丙基硅烷，1％浓度为90％的苯酚溶液，44％DCM，及50％TFA混合制成； 

5)倒出盒中TFA cocktail II溶液，使用DCM溶液震荡洗膜5次，每次2min；用DMF洗膜3次，每次2min完全洗净cocktail II残液，之后用无水乙醇溶液震荡洗膜5次，每次2min； 

6)使用吹风机凉风干燥多肽芯片膜后，密封于干净塑料袋中置于-80℃冰箱长期保存；或者置于-20℃冰箱中待用。 

所述步骤3)多肽芯片的杂交反应的方法为： 

1)多肽微阵列芯片活化：将干燥的多肽微阵列芯片膜，置于玻璃平皿中使用无水乙醇震荡洗涤3次，每次5min，活化多肽微阵列芯片； 

2)多肽芯片平衡：活化后多肽微阵列芯片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T溶液震荡洗涤3次，每次10min，平衡膜片使膜片的微环境与平衡液相似，所 述TBS-T溶液为将Tween20加入TBS溶液中并且使Tween20浓度为0.2％的溶液； 

3)多肽芯片封闭：将平衡后的多肽微阵列芯片膜放入平皿中，加入封闭液，室温震荡封闭4h，所述封闭液为以TBS-T溶液作为溶剂配制含蔗糖5％、脱脂奶粉4％的封闭液； 

4)使用TBS-T溶液震荡洗涤膜一次，5min，洗去微阵列芯片膜表面附着的封闭液； 

5)使用TBS-T封闭液稀释样品溶液使之含有的总蛋白量终浓度为0.1-1ug/ml的反应溶液，将多肽微阵列芯片膜与反应溶液4℃震荡孵育过夜或室温震荡孵育至少2h充分反应； 

6)使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次5min； 

7)用封闭液稀释HRP标记的二抗溶液至终浓度为0.1-0.5ug/ml的反应溶液，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2h； 

8)使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次5min； 

9)弃去多肽芯片膜上多余缓冲溶液，在膜上滴加化学发光反应液，反应液完全覆盖膜片表面后充分反应2min，保持膜片湿润； 

10)将膜片放入化学发光检测仪中扫描膜片上发光斑点，保存扫描图片； 

11)使用TBS-T溶液震荡洗膜一次，5min，使用去离子水洗膜三次，每次5min；洗完后可进行膜再生。 

所述步骤4)多肽微阵列芯片的再生的方法为： 

1)用足量去离子水洗多肽微阵列芯片膜三次，每次5min；用足量DMF洗涤多肽微阵列芯片膜三次，每次5min，取出膜片表面粘附的杂质； 

2)用足量再生液A浸润多肽微阵列膜片，放入密闭容器内，室温，过夜， 使多肽微阵列膜片上的蛋白质变性脱离下来，所述再生液A为；用去离子水配制足量的蛋白变性液使其含有浓度为8M的尿素、质量分数1％的SDS、体积比为0.1％巯基乙醇，即为再生溶液A； 

3)用25ml再生液B洗膜三次，每次10min，将变性完成后的蛋白洗脱下来，再生液B为；用去离子水配制足量洗涤溶液使之含有体积比为50％乙醇、体积比为10％乙酸即为再生溶液B； 

4)用25ml无水乙醇洗膜二次，每次10min，冷风吹干或室温晾干膜； 

5)再生膜可-20℃保存或者置于-80℃保存或者直接用于免疫印迹实验。 

本发明的有益技术效果在于： 

1.高密度、高通量：可同时测定上万个蛋白-多肽生化反应。 

2.高特异性：深层揭示蛋白结合机制，准确定位抗体特异表位和蛋白结合区域。 

3.成本低、周期短、操作简单：基于化学合成的多肽阵列芯片成本为基于生物培养的抗体芯片、全蛋白芯片的数百分之一。 

4.准确可靠(纯度稳定、结果明确、直观、易分析)。 

5、高速阵列膜合成：采用自控机器人逐层氨基酸点膜技术，比多肽逐点点膜技术速度提高几十倍。 

6、介质-多肽分子“立式”固定：与多数其他多肽芯片合成采用的“卧式”分子固定方式相比，更接近于生物液相反应环境。 

附图说明

图1：本发明单张芯片示意图表。 

图2：图编号为N的阴性实验结果(血吸虫病人血清印迹反应实验)。 

图3：图编号为L的血吸虫病人血清印迹反应实验结果。 

图4：图编号为C的重度血吸虫病人血清印迹反应实验结果。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

本发明是多肽微阵列芯片的合成与生物样本检测技术。采用软件设计多肽微阵列，采用自控机器人逐层氨基酸点膜技术进行多肽微阵列的化学合成。合成多肽微阵列可用于实验室的常规分子生物学试验，例如寻找药物的靶位点、蛋白质相互作用机理研究、筛查特定疾病试剂盒，建立与某种疾病相关的多肽数据库、探讨蛋白质作用的机理等等。 

1、氨基酸储备液、工作溶液的制备 

本发明采用边配制边用的方法，提高多肽微阵列芯片上氨基酸的结合效率；并且相较于应用与活化氨基酸溶液大大节省成本。 

1.1氨基酸激活剂的配制 

以DMF为溶剂，配制0.5M DIC(注解：DIC，二异丙基碳化二亚胺diisopropylcarbodiimide，MW126.2)溶液，所得溶液即为氨基酸激活剂。此浓度的氨基酸激活液可与0.5M的氨基酸溶液等体积混合得到0.25M的活化的氨基酸溶液，操作方便易行。此配置方法得到的溶液是为了制作多肽微阵列专门优化处理的最佳试剂比例。 

1.2各种氨基酸储备液溶液的配制 

称取一定量的HOBt用DMF为溶剂溶解，完全溶解后，加DMF定量，使配制的HOBt溶液浓度达到0.5M。以配好的0.5M的HOBt溶解作为溶剂分别配制不同种类的Fmoc保护氨基酸，配制完成后使他们浓度为0.5M的氨基酸储备液。由于氨基酸溶液没有被DIC激活，处于相对稳定的水平，此储备液可在-20℃保存至少一周；下表给出各种Fmoc保护的氨基酸的分子量，和配制2.5ml、5ml、10ml氨基酸储备液所需的Fmoc保护的氨基酸的质量供操作者参考。这样就不必每次合成前配制氨基酸溶液，可大大降低实验工作量量。 

1.3氨基酸激活溶液的配制 

用步骤1.1中配制0.5M的DIC氨基酸激活剂和步骤1.2中各种氨基酸储备液溶液以1∶1的比例混合，所得溶液即浓度为0.25M的氨基酸激活溶液的工作液。工作液室温静置15min以上使用，静置的目的是使得DIC与各种Fmoc保护氨基酸工作液充分反应。此配置方法目的是为了制作多肽微阵列专门优化处理的最佳试剂比例。 

2，多肽芯片制备 

此步的目的：在特殊处理纤维素膜上进行多肽芯片合成。本发明使用Aurora公司半自动多肽合成仪，按Fmoc化学合成法在活化纤维素膜上进行多肽合成。 

具体操作步骤： 

2.1试剂准备 

①氨基酸工作溶液配制：按步骤1氨基酸溶液的制备的方法配制。 

②钝化溶液配制 

钝化溶液I：配制含2％(v/v)乙酸酐(Acetic anhydride)的DMF溶液。 

钝化溶I I：配制含2％(v/v)酸酐、2％(v/v)DIPEA(DIPEA，二异丙基胺，diisopropylamine)的DMF溶液。 

③去保护基溶液的配制 

配制含20％(v/v)Piperidine(注解：Piperidine，哌啶/六氢吡啶，MW＝129.1d：0.742)的DMF溶液。 

④多肽芯片染色液：配制0.1％溴酚蓝/乙醇溶液即为芯片染色液。 

2.2多肽微阵列芯片上的多肽合成 

将干燥的多肽微阵列合成专用纤维素膜(-20℃保存)取出放入玻璃平皿中铺平，加入足量无水乙醇使其没过纤维素膜，摇床水平摇动5min/3次。然后把纤维素膜取出挂在通风柜内室温(20-25℃)晾干。(此步操作为了活化多肽微阵列合成专用纤维素膜)。将晾干的纤维素膜置于半自动合成仪相应位置，根据实验要求及预先设定好的程序，用半自动合成仪吸取足量(每次吸取0.3ul)的氨基酸活化溶液点印于纤维素膜上，进行多肽点合成反应。根据程序的设定合成多肽微阵列芯片的其中一层，每一层点样程序需要重复两次或三次，以保证微阵列芯片上每个点的合成效果。多肽微阵列芯片每层合成完毕要室温静置15min以上以保证氨基酸缩合反应完成。用于合成多肽微阵列芯片的膜是特殊材质特殊处理的。 

2.3多肽微阵列芯片合成中侧链钝化 

在多肽微阵列芯片合成每一层结束后，将纤维素膜正面(即含多肽合成点面)朝下置于玻璃平皿中，加入钝化溶液I完全浸润纤维素膜并使膜下无气泡，保证反应充分无漏点，盖上玻璃盖子。室温静置10min；弃去钝化溶液I，加入钝化溶液II，再次静置10min使得芯片上每层氨基酸侧链上氨基钝化。弃去盒中钝化溶液II，将纤维素膜正面朝上，加入DMF溶液，在震荡洗膜6次，每次2min，洗去钝化溶液。此步骤目的多肽微阵列芯片合成中保护氨基酸的侧链，使侧链氨基不参与下一层的合成反应反应。 

2.4多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除 

在多肽微阵列芯片合成每一层结束后，将步骤2.2中用DMF洗过的膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保护基团溶液后在水摇床上震荡反应去除Fmoc氨基保护基团。此步骤重复两次，每次10min，以保证去除完全Fmoc保护基团；之后用DMF溶液震荡洗膜6次，每次2min；再用无水乙醇震荡洗膜两次，每次2min，室温晾干。此步骤目的多肽微阵列芯片合成中去除α-氨基的保护基团使氨基活化，使之能够参与肽链延长的反应。 

2.5多肽微阵列芯片合成过程中的染色 

在多肽微阵列芯片合成每一层结束后，将纤维素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量无水乙醇完全浸没纤维素膜，并加入5-6滴步骤2.1中配制的溴酚蓝染色溶液，在摇床上摇动染色2min至膜上呈现蓝色多肽点时用无水乙醇震荡洗膜2-5次直至洗液无蓝色出现，此步骤目的多肽微阵列芯片合成中检验合成的效果。 

取出纤维素膜室温晾干或者使用电吹风机用冷风从芯片反面使纤维素膜干燥。此步骤目的多肽微阵列芯片合成中使得纤维素膜干燥处于工作状态，可以避免氨基酸发生化学性质变化。 

2.6重复2.3至2.5步骤继续合成多肽微阵列芯片，按照预先设定的程序，直至多肽合成完成(注意多肽微阵列芯片最后一层合成完成后直接按照步骤2.6操作)。 

2.7将完成最后一层氨基酸合成的多肽微阵列芯片膜置于-20℃冰箱保存或直接进行下一步反应。 

以上步骤2.2-2.7综合为多肽微阵列芯片合成，目的是半自动的方法用多肽微阵列仪，按照指定程序合成目的芯片，整个过程独创，相较于手工合成大大提高合成的准确率，并且大大提高工作效率，提高了此类实验的通量。 

3，多肽侧链保护基团的去除 

此步实验的目的是使用强的有机酸TFA与去除多肽芯片上的多肽侧链保护基团。 

3.1此步实验试剂的配制 

①苯酚溶液(90％)配制： 

准确称量足量苯酚试剂溶解于去离子水中，剧烈摇动使苯酚溶解，加水定容使得苯酚浓度达到90％。 

②cocktail I溶液(注解：多肽链末端钝化溶液)配制： 

按照以下试剂比例配制足量溶液：5％(v/v)的去离子水，3％(v/v)的三异丙基硅烷(triisopropylsilane)，1％(v/v)的苯酚溶液(90％)，1％的二氯甲烷(DCM Dichloromethane)，90％的TFA(注解：TFA，三氟乙酸，Trifluoroacetic acid)，混匀。 

③cocktail II溶液(注解：多肽链末端钝化溶液)配制： 

按照以下试剂比例配制足量溶液：2％(v/v)去离子水，3％(v/v)三异丙 基硅烷，1％(v/v)苯酚溶液(90％)，44％DCM，及50％TFA，混匀。 

④去保护基溶液的配制： 

配制含20％(v/v)Piperidine的DMF溶液。 

3.2将完成最后一层氨基酸合成的多肽芯片膜，面向上置于玻璃平皿中，用3.1中配制的④去保护基溶液浸没，摇动反应两次，每次5min；此后，用DMF溶液摇动冲洗纤维素洗膜4次，每次2min；再用DCM洗膜3次，每次2min。此步骤目的多肽微阵列芯片合成完成后，去除侧链保护基团，恢复氨基酸残基侧链的原始状态。 

3.3将洗玻璃平皿中残余DCM溶液弃尽，加入足量的cocktail I溶液，多肽芯片膜完全浸入液体中后盖严玻璃盖，置于通风橱中静置反应30min(禁止摇晃)。此步骤以及3.4、3.5、3.6目的多肽微阵列芯片合成完成后，封闭末端的α-氨基，使其处于稳定状态。 

3.4小心倒出盒中cocktail I溶液，使用DCM溶液震荡洗涤盒中膜片5次，每次2min，完全洗净cocktail I残液。 

3.5弃尽洗膜盒中残余DCM溶液，向盒中加入足量的cocktail II溶液，多肽芯片膜完全浸入液体中后盖严，置于通风橱中静置反应2h(禁止摇晃)。 

3.6倒出盒中TFA cocktail II溶液，使用DCM溶液震荡洗膜5次，每次2min；用DMF洗膜3次，每次2min完全洗净cocktail I残液。之后用无水乙醇溶液震荡洗膜5次，每次2min。 

3.7使用吹风机凉风干燥多肽芯片膜后，密封于干净塑料袋中置于-80℃冰箱长期保存；或者置于-20℃冰箱中待用。此步骤目的多肽微阵列芯片合成中使得纤维素膜干燥处于工作状态。 

4，多肽芯片的杂交反应 

此步实验的目的是用于多肽芯片免疫学杂交反应并得到杂交实验的具体数据(图像)。 

此步实验的原理：是利用生物样品中蛋白质与芯片上多肽序列的特异性结合反应，通过酶二抗及化学发光技术对这一特异性结合进行免疫学检测，得出实验数据(图像)。 

4.1试剂配制 

①TBS(Tris-缓冲盐溶液)溶液配制： 

称取足量化学试剂置于烧杯中，加入一定量的去离子水(不超过总体积的80％)溶解烧杯中溶质，使用NaOH或强碱HCl调整溶液pH值为8.0，使用去离子水定容；最终溶液中各组分浓度控制在Tris-base(50mM)、KCl(27mM)、NaCl(136mM)。 

②0.2％的TBS-T溶液配制： 

加Tween20溶液至TBS溶液中，Tween20终浓度为0.2％，即为0.2％的TBS-T溶液，现用现配。 

③封闭液配制： 

用4.1步骤中所配制的0.2％的TBS-T溶液作为溶剂配制含蔗糖5％、脱脂奶粉4％的封闭液。 

4.2多肽微阵列芯片活化：将从-20℃冰箱取出的干燥的多肽微阵列芯片膜，置于玻璃平皿中使用无水乙醇震荡洗涤3次，每次5min，活化多肽微阵列芯片。目的在于多肽微阵列芯片的活化，活化后芯片进行免疫学反应测试，或其他化学结合反应测试。 

4.3多肽芯片平衡：活化后多肽微阵列芯片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T 溶液震荡洗涤3次，每次10min，平衡膜片使膜片的微环境与平衡液相似。 

4.4多肽芯片封闭：将平衡后的多肽微阵列芯片膜放入平皿中，加入封闭液，室温震荡封闭4h。 

4.5使用0.2％的TBS-T溶液震荡洗涤膜一次，5min，洗去微阵列芯片膜表面附着的封闭液。 

4.6用0.2％的TBS-T封闭液稀释样品溶液使之含有的总蛋白量终浓度为0.1-1ug/ml的反应溶液，将多肽微阵列芯片膜与反应溶液4℃震荡孵育过夜或室温震荡孵育至少2h充分反应。 

4.7使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次5min。 

上述步骤4.4-4.7目的在于多肽微阵列芯片的活化后适应于免疫反应的前处理过程，处理后芯片进行免疫学反应测试，或其他化学结合反应测试。 

4.8用0.2％的TBS-T封闭液稀释HRP标记的二抗溶液至终浓度为0.1-0.5ug/ml(通常稀释比例为1∶2000)的反应溶液，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2h。 

4.9使用0.2％的TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次5min。 

4.10弃去多肽芯片膜上多余缓冲溶液，在膜上滴加化学发光反应液，反应液完全覆盖膜片表面后充分反应2min，保持膜片湿润。 

4.11将膜片放入化学发光检测仪中扫描膜片上发光斑点，保存扫描图片。 

4.12使用TBS-T溶液震荡洗膜一次，5min，使用去离子水洗膜三次，每次5min；洗完后可进行膜再生。 

上述步骤4.8-4.10目的在于多肽微阵列芯片的活化后适应于免疫反应、显色反应及以后的多肽微阵列芯片膜再生前处理过程。 

5，多肽微阵列芯片的再生 

此步实验的目的是用于多肽芯片再生的操作。 

此步实验的原理：利用尿素的蛋白变性作用，将与多肽或膜结合的蛋白质从膜芯片上洗脱下来，使多肽芯片能够重复使用。 

5.1此步实验的试剂配制： 

①TBS(Tris-缓冲盐溶液)溶液配制： 

称取足量化学试剂置于烧杯中，加入一定量的去离子水(不超过总体积的80％)溶解烧杯中溶质，使用NaOH或强碱HCl调整溶液pH值为8.0，使用去离子水定容；最终溶液中各组分浓度控制在Tris-base(50mM)、KCl(27mM)、NaCl(136mM)。 

②0.2％的TBS-T溶液配制： 

加Tween20溶液至TBS溶液中，Tween-20终浓度为0.2％，即为0.2％的TBS-T溶液，现用现配。 

③再生溶液A配制： 

用去离子水配制足量的蛋白变性液使其含有尿素(浓度8M)、SDS(质量分数1％)、巯基乙醇(0.1％(v/v))，即为再生溶液A。 

④再生溶液B配制： 

用去离子水配制足量洗涤溶液使之含有乙醇(50％(v/v))、乙酸(10％)即为再生溶液B。 

此步实验的操作步骤5.2-5.6步骤用于多肽微阵列芯片膜的再生。 

5.2用足量去离子水(完全浸润膜片)洗多肽微阵列芯片膜三次，每次5min；用足量(完全浸润膜片)DMF洗涤多肽微阵列芯片膜三次，每次5min。目的在于取出膜片表面粘附的杂质。 

5.3用足量再生液A(完全浸润膜片)浸润多肽微阵列膜片，放入密闭 容器内，室温，过夜，使多肽微阵列膜片上的蛋白质变性脱离下来。 

5.4用25ml再生液B洗膜三次，每次10min，将变性完成后的蛋白洗脱下来。 

上述步骤5.3-5.4的目的在于去除多肽微阵列膜上蛋白质和化学染料的结合物变性并洗脱下来，使芯片重新格式化。 

5.5用25ml无水乙醇洗膜二次，每次10min，冷风吹干或室温晾干膜。 

此步骤的目的在于重新格式化去除多肽微阵列芯片膜的有机物质去除和干燥。 

5.6再生膜可-20℃保存(如需长期存放，置于-80℃保存)，或者直接用于免疫印迹实验。 

应用实例：针对血吸虫/肝吸虫病人血清学检测的多肽微阵列芯片设计、合成与生物学检测 

概述：根据研究的需要，研究人员选定24条多肽序列作为目标，合成多肽微阵列芯片，每个多肽做一次相邻的重复以验证重复性。每个我们用多肽微阵列合成技术制作了15张多肽微阵列芯片，每张芯片上排列48条多肽，即24种多肽重复一次。15张多肽微阵列芯片为15个重复芯片，用于检测不同的血清。我们用多肽微阵列芯片对2份健康人血清，7份血吸虫病人血清4份及肝吸虫病人血清进行了测试。测试结果良好找出了目标多肽，可用于进一步的实验检测或筛选目标多肽。 

方法： 

1、设计多肽微阵列：应用多肽微阵列设计软件设计出多肽微阵列，每张芯片上排列48条多肽，即24种多肽重复一次。15张多肽微阵列芯片为15个重复芯片。方法按照上述方法进行。 

2、如图1所示的单张芯片示意图表，其中，示意图表中数字代表的序列如下，每行序列后是此多肽的长度： 

①DTNSKAYMCKGVLTAV      16 

②CKGVLTAVSNVNNIIA      16 

③SNVNNIIAPALLKKQI      16 

④PALLKKQIPVTNQSEVDQ    18 

⑤TGASSFTEAMQMGSE       15 

⑥NPQSAESHWLSPDEMA      16 

⑦WLSPDEMANVYKEMIQK     17 

⑧NVNGRLISVYCERDPL      16 

⑨VYCERDPLNIPWNKD       15 

⑩GKGATYDQIKAVIKAGAN    18 

AGQACKKAYTPQENAL      16 

VLATWQGKKENVHAAQ      16 

KENVHAAQEELLKLAKANGA  20 

DGKVTNTQRI            10 

LMKPPEEKEKISKEIL       16 

KISKEILNGKVPILLQA      17 

CETLKESTGNLTVGDK       16 

EEAISYLDSNPQAEVE       16 

SNPQAEVEELKQKKKEF      17 

SLYQQSGAPPPTQPEQER     19 

DDSPDLPKLKPD           12 

SFHCCGVKGPDDYKGNVPASCK 20 

示意图每行中相邻两个位置是一个编号，这是由于这两个位置是同一个多肽，后面一个孔是前面一个的重复，这是做了一次重复试验，为了保证试验的可靠性。 

3，多肽阵列与病人血清免疫反应的测定： 

①封闭4％skim milk+5％sucrose in TBS-T buffer； 

②病人血清1∶200稀释；与多肽阵列反应，40C下过夜； 

③用TBS-T buffer漂洗，10min×3次； 

④二抗(羊抗人)IgG-HRP，1∶1000或1∶2000稀释，室温下2h； 

⑤用TBS-T buffer漂洗，10min×3次； 

⑥加入ECL发光剂，数字成像； 

⑦使用Gel-Pro analyzer4进行图像分析，以＞＝2.1倍阴性对照的灰度值(以及绝对差值＞40)判断为阳性。 

4，试验结果如下： 

①如图2所示为阴性实验结果(血吸虫病人血清印迹反应实验)。 

图编号：N 

健康人血清：1∶200稀释 

二抗(羊抗人)IgG-HRP1∶1000 

阳性反应多肽片段： 

6    PALLKKQIPVTNQSEVDQ 

13    AGQACKKAYTPQENAL 

②如图3所示的血吸虫病人血清印迹反应实验结果， 

图编号：L 

血清编号：健康人1 

二抗(羊抗人)IgG-HRP1∶1000 

阳性反应多肽片段： 

17 LMKPPEEKEKISKEIL 

③如图4所示的重度血吸虫病人血清印迹反应实验结果， 

图编号：C 

血清编号：YX-HB-02 

二抗(羊抗人)IgG-HRP1∶2000 

阳性反应多肽片段： 

4   CKGVLTAVSNVNNIIA 

14 VLATWQGKKENVHAAQ 

19 CETLKESTGNLTVGDK 

5，空白对照(质控)试验： 

本实验合成的多肽阵列中的1～4个多肽为内置阴性对照，实验选用两张空白膜按照测试条件，做免疫印迹反应：封闭后，只加二抗(羊抗人)IgG-HRP1∶1000，反应后发光照相，多肽阵列反应未呈现明显的阳性反应。 

6，结论： 

通过计算机软件设计出多肽微阵列，化学合成多肽微阵列芯片；通过免疫学实验反应的到结果显示：正常人的血清与花血吸虫病的血清所作用的多肽点不同，据此可以找出与血吸虫病引起血液中抗体的变化，可据此试验找出的多肽做进一步研究。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。 

Claims (10)

1.一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，包括以下步骤：

1)多肽芯片的合成，具体包括：

1.1多肽微阵列芯片上的多肽合成：用半自动合成仪吸取足量的氨基酸活化溶液点印于纤维素膜上，进行多肽点合成反应；

1.2多肽微阵列芯片合成中侧链钝化；

1.3多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除；

1.4多肽微阵列芯片合成过程中的染色；

1.5重复1.2至1.4步骤继续合成多肽微阵列芯片，按照预先设定的程序，直至多肽合成完成；

1.6将完成最后一层氨基酸合成的多肽微阵列芯片膜置于-20℃冰箱保存或直接进行下一步反应；

2)多肽侧链保护基团的去除；

3)多肽芯片的杂交反应。

2.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤1.1中的的氨基酸活化溶液的配制方法为：

1)配制氨基酸激活剂：以DMF为溶剂，配制0.5M DIC溶液；

2)配制各种氨基酸储备液溶液：以DMF为溶剂，配制0.5M HOBt溶液，再将配制好的0.5M的HOBt溶液作为溶剂分别配制不同种类的Fmoc保护氨基酸，使溶液达到浓度为0.5M的氨基酸储备液；

3)配制氨基酸激活溶液：用步骤1)中配制0.5M的DIC氨基酸激活剂和步骤2)中各种氨基酸储备液溶液以1∶1的比例混合，所得溶液即浓度为0.25M的氨基酸激活溶液。

3.根据权利要求2所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述氨基酸激活溶液配制后室温静置15min以上使用。

4.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，还包括步骤4)多肽微阵列芯片的再生。

5.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤1.2多肽微阵列芯片合成中侧链钝化的方法为：在多肽微阵列芯片合成每一层结束后，纤维素膜正面朝下置于玻璃平皿中，用钝化溶液I完全浸润10min后，弃去钝化溶液I，加入钝化溶液II，再次静置10min，弃去钝化溶液II，将纤维素膜正面朝上，加入DMF溶液，再震荡洗膜6次，每次2min，所述钝化溶液I为2％乙酸酐的DMF溶液，所述钝化溶液II为含2％酸酐、2％二异丙基胺的DMF溶液。

6.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤1.3多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除方法为：多肽微阵列芯片合成中侧链钝化后，将纤维素膜放入新的玻璃平皿中，加入去Fmoc保护基团溶液后震荡反应去除Fmoc氨基保护基团，此步骤重复两次，每次10min，之后用DMF溶液震荡洗膜6次，每次2min；再用无水乙醇震荡洗膜两次，每次2min，室温晾干，所述去Fmoc保护基团溶液为含20％Piperidine的DMF溶液。

7.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤1.4多肽微阵列芯片合成过程中的染色方法为：在多肽微阵列芯片合成中每层Fmoc保护基团的去除后，将纤维素膜放入新的玻璃平皿中，加入足量无水乙醇完全浸没纤维素膜，并加入5-6滴溴酚蓝染色溶液，摇动染色2min至膜上呈现蓝色多肽点时用无水乙醇震荡洗膜2-5次直至洗液无蓝色出现，取出纤维素膜室温晾干或者使用冷风从芯片反面使纤维素膜干燥，所述溴酚蓝染色溶液为含0.1％溴酚蓝的乙醇溶液。

8.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤步骤2)多肽侧链保护基团的去除方法为：

1)将完成最后一层氨基酸合成的多肽芯片膜，面向上置于玻璃平皿中，去保护基溶液浸没，摇动反应两次，每次5min；此后，用DMF溶液摇动冲洗纤维素洗膜4次，每次2min；再用DCM洗膜3次，每次2min，所述去保护基溶液为含20％Piperidine的DMF溶液；

2)将玻璃平皿中残余DCM溶液弃尽，多肽芯片膜完全浸入cocktail I溶液中后盖严玻璃盖，置于通风橱中静置反应30min，所述cocktail I溶液为5％的去离子水，3％的三异丙基硅烷，1％的浓度为90％的苯酚溶液，1％的二氯甲烷及90％的TFA溶液混合制成；

3)倒出盒中cocktail I溶液，使用DCM溶液震荡洗涤盒中膜片5次，每次2min，完全洗净cocktail I残液；

4)弃尽洗膜盒中残余DCM溶液，多肽芯片膜完全浸入cocktail II液体中后盖严，置于通风橱中静置反应2h，所述cocktail II为2％去离子水，3％三异丙基硅烷，1％浓度为90％的苯酚溶液，44％DCM，及50％TFA混合制成；

5)倒出盒中TFA cocktail II溶液，使用DCM溶液震荡洗膜5次，每次2min；用DMF洗膜3次，每次2min完全洗净cocktail II残液，之后用无水乙醇溶液震荡洗膜5次，每次2min；

6)使用吹风机凉风干燥多肽芯片膜后，密封于干净塑料袋中置于-80℃冰箱长期保存；或者置于-20℃冰箱中待用。

9.根据权利要求1所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤3)多肽芯片的杂交反应的方法为：

1)多肽微阵列芯片活化：将干燥的多肽微阵列芯片膜，置于玻璃平皿中使用无水乙醇震荡洗涤3次，每次5min，活化多肽微阵列芯片；

2)多肽芯片平衡：活化后多肽微阵列芯片膜放入玻璃平皿中，使用TBS-T溶液震荡洗涤3次，每次10min，平衡膜片使膜片的微环境与平衡液相似，所述TBS-T溶液为将Tween20加入TBS溶液中并且使Tween20浓度为0.2％的溶液；

3)多肽芯片封闭：将平衡后的多肽微阵列芯片膜放入平皿中，加入封闭液，室温震荡封闭4h，所述封闭液为以TBS-T溶液作为溶剂配制含蔗糖5％、脱脂奶粉4％的封闭液；

4)使用TBS-T溶液震荡洗涤膜一次，5min，洗去微阵列芯片膜表面附着的封闭液；

5)使用TBS-T封闭液稀释样品溶液使之含有的总蛋白量终浓度为0.1-1ug/ml的反应溶液，将多肽微阵列芯片膜与反应溶液4℃震荡孵育过夜或室温震荡孵育至少2h充分反应；

6)使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次5min；

7)用封闭液稀释HRP标记的二抗溶液至终浓度为0.1-0.5ug/ml的反应溶液，将多肽芯片膜置于反应液中震荡孵育2h；

8)使用TBS-T溶液震荡洗膜3次，每次5min；

9)弃去多肽芯片膜上多余缓冲溶液，在膜上滴加化学发光反应液，反应液完全覆盖膜片表面后充分反应2min，保持膜片湿润；

10)将膜片放入化学发光检测仪中扫描膜片上发光斑点，保存扫描图片；

11)使用TBS-T溶液震荡洗膜一次，5min，使用去离子水洗膜三次，每次5min；洗完后可进行膜再生。

10.根据权利要求4所述的一种用于B细胞抗原表位筛查的多肽阵列合成技术，其特征在于，所述步骤4)多肽微阵列芯片的再生的方法为：

1)用足量去离子水洗多肽微阵列芯片膜三次，每次5min；用足量DMF洗涤多肽微阵列芯片膜三次，每次5min，取出膜片表面粘附的杂质；

2)用足量再生液A浸润多肽微阵列膜片，放入密闭容器内，室温，过夜，使多肽微阵列膜片上的蛋白质变性脱离下来，所述再生液A为；用去离子水配制足量的蛋白变性液使其含有浓度为8M的尿素、质量分数1％的SDS、体积比为0.1％巯基乙醇，即为再生溶液A；

3)用25ml再生液B洗膜三次，每次10min，将变性完成后的蛋白洗脱下来，再生液B为；用去离子水配制足量洗涤溶液使之含有体积比为50％乙醇、体积比为10％乙酸即为再生溶液B；

4)用25ml无水乙醇洗膜二次，每次10min，冷风吹干或室温晾干膜；

5)再生膜可-20℃保存或者置于-80℃保存或者直接用于免疫印迹实验。

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