WO2010052939A1 - アレルゲンのエピトープ又はその候補の検出方法及びその利用 - Google Patents

アレルゲンのエピトープ又はその候補の検出方法及びその利用 Download PDF

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peptide
candidate
overlapping
peptides
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本多裕之
大河内美奈
加藤竜司
松本直樹
川部勤
松島充代子
吉田安子
高瀬智和
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国立大学法人名古屋大学
日本碍子株式会社
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an allergen epitope, and more particularly, to a method for detecting a set of at least two epitopes and use thereof.
  • allergen-specific antibody levels are being measured.
  • Patent Document 1 there is a method (Patent Document 1) for measuring the amount of antibodies such as IgA, IgG, and IgE specific to an allergen in the blood of a patient.
  • an array of IgG and IgE peptide fragments of the antigen protein can be created, and using this peptide array, the IgE epitope and IgG epitope to which IgE and IgG specifically bind can be identified. Is also disclosed (Non-Patent Document 1).
  • Basophils and mast cells play an important role in the development of allergic symptoms.
  • Patients with allergic diseases produce IgE antibodies specific for allergens involved in the manifestation of symptoms.
  • This allergen-specific IgE antibody remains on these cells in a state of being bound to an IgE receptor (Fc ⁇ RI) expressed on the surface of mast cells or basophils.
  • Fc ⁇ RI IgE receptor
  • cross-linking of the IgE receptor occurs, which triggers a signal transmitted from the IgE receptor and releases granules such as histamine that directly cause allergic symptoms (degranulation).
  • Patent Document 1 cannot identify epitopes, and the method of Non-Patent Document 1 can detect epitopes in individual patients, but a combination of two or more epitopes that cause degranulation. Cannot be detected.
  • the problem with the current allergen test is that it cannot be detected until there is a combination of epitopes (IgE binding sites) necessary to effectively cause degranulation, and there is simply an IgE binding site on the allergen. Since only the presence is detected, the frequency of false positives is high.
  • the present invention aims to provide a method for detecting a set of two or more epitopes in one allergen, and to provide the epitope thus obtained and the use of the set.
  • the present inventors obtain an overlapping peptide for an antigen protein, create a peptide array, and analyze it by a specific method to detect an epitope set that may be related to induction or exacerbation of allergic reaction
  • the present invention has been completed by finding out what can be done.
  • the inventors have found a set of epitopes related to the onset and exacerbation of milk allergy and have completed the present invention. According to the present invention, the following means are provided.
  • a method for detecting an epitope of an allergen or a candidate thereof comprising the following steps: (A) As a test sample, each of a test sample group containing an antibody derived from a plurality of allergy positive individuals and a control sample group containing an antibody derived from a plurality of allergy negative individuals, A sample of each group is supplied to an array in which a plurality of overlapping peptides of a predetermined length based on a possible allergen protein or a part of the amino acid sequence thereof are immobilized, and the plurality of overlapping peptides and the one kind Or contacting two or more antibodies, (B) detecting a specific binding of the plurality of overlapping peptides with the one or more antibodies, (C) An overlap peptide selected from the plurality of overlap peptides, obtained from the control sample group and average control intensity information regarding the intensity of the specific binding of the overlap peptide obtained from the control sample group and the test sample group One or more of the overlapping peptid
  • the detection method further includes the following steps: (E) For each of the first epitope candidates, a step of obtaining, for each overlapping peptide, the number information of the test sample using the overlap peptide as the second epitope or a candidate thereof, and Furthermore, (f) for each of the first epitope or candidate thereof, when the test sample of a predetermined ratio or more in the test sample group has the specific overlapping peptide as the second epitope or candidate thereof, A step of using the first epitope or candidate thereof and the second epitope or candidate thereof as an epitope set or candidate thereof in the allergen.
  • the step (c) is based on the average test intensity information obtained for one of the overlapping peptides of the test sample group and the average control intensity information of the corresponding overlapping peptide.
  • the step of setting the one overlapping peptide as the first epitope or a candidate thereof may include one overlapping peptide of the test sample group.
  • the one The overlapping peptide may be the step of setting the first epitope or a candidate thereof, and when both of the requirements are satisfied, the one overlapping peptide may be the step of setting the first epitope or the candidate thereof.
  • a method for detecting an epitope of an allergen or a candidate thereof comprising the following steps: (A) For each of a test sample containing an antibody derived from an allergy positive individual and a control sample group containing an antibody derived from a plurality of allergy negative individuals, A sample of each group is supplied to an array in which a plurality of overlapping peptides of a predetermined length based on a possible allergen protein or a part of the amino acid sequence thereof are immobilized, and the plurality of overlapping peptides and the one kind Or contacting two or more antibodies, (B) for the plurality of overlapping peptides, detecting specific binding with the one or more antibodies, and (c) for the allergy positive individual, The specific binding is positive based on the individual test strength information obtained for each overlapping peptide and the average control strength information regarding the strength of the specific binding obtained for each overlapping peptide of the control sample group.
  • One or two or more overlapping peptides to be used as a first epitope or a candidate thereof, and obtained from the overlapping peptide other than the first epitope or the candidate based on the average control intensity information A step of using one or two or more overlapping peptides having individual test intensity information that is greater than or equal to a critical value or more than the critical value as a second epitope or a candidate thereof in the allergen, A method is also provided comprising:
  • a method for testing allergic diseases there is a possibility of allergic diseases against two or more types of epitope peptides each containing two or more types of epitopes related to expression of allergic reactions.
  • Supplying a test sample containing an antibody derived from an individual, bringing the two or more types of epitope peptides into contact with the antibody, and detecting specific binding of the two or more types of epitope peptides with the antibody A method is provided.
  • the contact step is preferably a step using a solid phase carrier on which the two or more types of epitope peptides are immobilized.
  • the two or more types of epitope peptides preferably include a first epitope peptide and a second epitope peptide determined by any one of the epitope detection methods described above.
  • a peptide array for testing allergic diseases wherein two or more types of epitope peptides each containing two or more types of epitopes related to expression of allergic reaction are immobilized on a solid phase carrier.
  • An array is provided.
  • FIGS. 1 to 51 show the arrangement numbers in FIGS. 1 to 51 correspond to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 51.
  • FIG. 3 is a diagram showing the number of overlapping peptides used for determining the epitope of ⁇ -lactalbumin protein or a candidate thereof, individual identification numbers, amino acid sequences, and the like for a milk allergy positive sample group.
  • FIGS. 1 to 40 correspond to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 52 to 91. It is a figure which shows the number of the overlap peptide used for determination of the epitope of alpha-lactalbumin protein, or its candidate about a milk allergy hypersensitivity test substance group, each identification number, an amino acid sequence, etc. FIG. It is a figure which shows the number of the overlap peptide used for determination of the epitope of alpha-lactalbumin protein or its candidate about a milk allergy weak positive sample group, each identification number, an amino acid sequence, etc. FIG. FIG. FIG.
  • FIG. 3 is a diagram showing the number of overlapping peptides, individual identification numbers, amino acid sequences, and the like used to determine the epitope of ⁇ s1-casein protein or candidate thereof for a group of milk allergy positive samples. Note that the arrangement numbers in FIGS. 1 to 63 correspond to SEQ ID NOs: 92 to 154. It is a figure which shows the number of each overlapping peptide used for the determination of the epitope of alpha s1-casein protein or its candidate about a milk allergy hypersensitivity test substance group, each identification number, an amino acid sequence, etc.
  • FIG. 5 is a diagram showing the number of overlapping peptides, individual identification numbers, amino acid sequences, and the like used for determining the epitope of ⁇ s2-casein protein or candidates thereof for the milk allergy positive sample group. Note that the arrangement numbers in FIGS. 1 to 66 correspond to SEQ ID NOs: 155 to 220.
  • FIG. 5 is a diagram showing the number of overlapping peptides used for determining the epitope of ⁇ s2-casein protein or its candidate, individual identification numbers, amino acid sequences, and the like for the milk allergy weakly positive sample group. It is a figure which shows the number of the overlap peptide used for determination of the epitope of a beta-casein protein, or its candidate about a milk allergy positive sample group, each identification number, an amino acid sequence, etc.
  • 1 to 67 correspond to SEQ ID NOS: 221 to 287, respectively. It is a figure which shows the number of the overlap peptide used for determination of the epitope of ⁇ -casein protein, or its candidate about a milk allergy hypersensitivity test substance group, each identification number, an amino acid sequence, etc. FIG. It is a figure which shows the number of the overlap peptide used for determination of the epitope of ⁇ -casein protein, or its candidate about a milk allergy weak positive sample group, each identification number, an amino acid sequence, etc. FIG. It is a figure which shows the number of overlap peptide used for determination of the epitope of a kappa-casein protein, or its candidate about a milk allergy positive sample group, each identification number, an amino acid sequence, etc.
  • FIG. Note that the arrangement numbers in FIGS. 1 to 53 correspond to SEQ ID NOs: 288 to 340. It is a figure which shows the number of the overlap peptide used for determination of the epitope of the (kappa) -casein protein, or its candidate about a milk allergy hypersensitivity specimen group, each identification number, an amino acid sequence, etc. FIG. It is a figure which shows the number of overlap peptide used for determination of the epitope of a (kappa) -casein protein, or its candidate about a milk allergy weak positive sample group, each identification number, an amino acid sequence, etc. FIG.
  • FIG. 9 shows the numbers of the overlapping peptides shown in FIG. 9 . It is a figure which shows the analysis result of the epitope of ⁇ s2-casein protein, or its candidate, A dark gray section shows the combination whose number of corresponding patients is 95th percentile or more, and a middle gray section shows the number of corresponding patients 90th percentile. The combination of the above is shown. In the vertical and horizontal item columns, the numbers of the overlapping peptides shown in FIG. 12 are shown.
  • FIG. 15 shows the numbers of the overlapping peptides shown in FIG. 15 . It is a figure which shows the analysis result of the epitope of beta-casein protein, or its candidate, A dark gray section shows the combination whose number of corresponding patients is 95th percentile or more, and a middle gray section shows the number of corresponding patients 90th percentile. The combination of the above is shown. In the vertical and horizontal item columns, the numbers of the overlapping peptides shown in FIG. 15 are shown.
  • Patient # 8 shows a combination of two IgEs that are thought to be involved in the induction of allergic reactions. It is a figure which shows the content of 5 epitope sets among the 10 epitope setters obtained by the analysis of the peptide array of Example 2. It is a figure which shows the content of the remaining 5 epitope sets among the 10 epitope setters obtained by the analysis of the peptide array of Example 2. It is a figure which shows the table
  • FIG. 2 It is a figure which shows the table
  • FIG. 2 It is a figure which shows the table
  • FIG. 2 It is a figure which shows the table
  • FIG. It is a figure which shows the table
  • the present invention relates to a method for detecting an allergen epitope or a candidate thereof.
  • an epitope important for expression of allergic symptoms or a combination of candidates thereof can be obtained.
  • the first epitope or candidate thereof determined by this detection method is an important epitope that is highly common to the test sample group, that is, allergy-positive individuals, and is an important element for determining the set of epitopes. .
  • the 2nd epitope determined by this detection method or its candidate is an important epitope set with high possibility of inducing allergic reaction in many allergy positive individuals.
  • the epitope or candidate detection method of the present invention first comprises (a) a test sample group containing antibodies derived from a plurality of allergy-positive individuals and an antibody derived from a plurality of allergy-negative individuals as test samples.
  • each sample of each group is supplied to a solid phase carrier on which a plurality of overlapping peptides of a predetermined length based on a potential allergen protein or a part of the amino acid sequence thereof are immobilized, A step of contacting the plurality of overlapping peptides with an antibody is performed. By this step, the overlapping peptide and the antibody contained in the sample can be brought into contact with each other to generate an antigen-antibody reaction.
  • the test sample contains an antibody derived from an allergy positive individual.
  • the test sample is not particularly limited as long as it contains an antibody.
  • blood or serum collected from an allergy positive individual is used.
  • the allergy positive individual may be a human or a non-human animal. Allergy positive individuals are allergy positive individuals for the same allergen. For example, allergy positive individuals for individual foods such as milk, eggs, cedar pollen, cypress pollen, etc. Positive individuals for the same allergen. The same allergen may be limited to the same protein.
  • the test sample group is a set of a plurality of test samples.
  • the number of test samples constituting the test sample group is not particularly limited.
  • the allergy positive individual which is a collection source of the test sample which comprises a test sample group is limited to a certain range in the grade of an allergic symptom and an IgE antibody level. This is because when the degree of allergic symptoms differs greatly, the epitope recognized by the antibody may be different, and it may be difficult to determine important epitopes and sets. Therefore, a plurality of test sample groups consisting of test samples derived from allergic positive individuals within a range of predetermined allergic symptoms and IgE antibody levels may be prepared.
  • the control sample group is a set of a plurality of control samples.
  • the number of control samples is not particularly limited.
  • the allergy negative individual from which the control data is collected is an allergy negative individual for at least allergen positive allergen.
  • An allergy negative individual can be determined by, for example, allergic symptoms or IgE antibody levels.
  • the overlapping peptide has an appropriate length (for example, about 12 to 25 residues) based on the amino acid sequence of the potential allergen protein or a portion thereof, and the overlapping (overlapping region of the sequence) is, for example, 8 to It is designed to be about 17 residues.
  • an overlapping peptide is provided over an amino acid sequence that covers all the primary structure of the allergen protein.
  • each amino acid sequence of the overlapping peptide overlaps a predetermined number of residues by shifting the amino acid sequence of a predetermined length from the N-terminal to the C-terminal direction of the allergen protein by a predetermined residue. It can be decided sequentially so that it becomes.
  • the number of overlapping peptides that prepare a certain length of overlapping region for one allergen protein depends on the size of the primary structure to cover, the length of the overlapping peptide, and the number of overlapping residues.
  • overlapping peptides can be prepared for one or more allergen proteins selected from these plurality of allergen proteins.
  • allergen proteins when detecting an epitope for milk allergy, allergen proteins include six major milk allergen proteins, ⁇ -lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ - Examples thereof include one or more selected from casein and ⁇ -casein.
  • overlapping peptides may be obtained for all of these allergen proteins, or a part thereof.
  • the overlap peptide is immobilized on an appropriate solid phase carrier.
  • the solid phase carrier is not particularly limited as long as it is a carrier insoluble in a solvent in a reaction system for antigen-antibody reaction, and a known solid phase carrier can be used.
  • an appropriate shape may be selected according to the purpose of use, and examples thereof include a test plate shape, a bead shape, a spherical shape, a disk shape, a tube shape, and a filter shape.
  • the solid phase carrier has a flat plate shape such as a test plate shape, a disk shape, or a filter shape.
  • those used as usual carriers for immunoassays for example, synthetic resins such as polypropylene, polystyrene, polyacrylamide, etc., or reactive properties such as sulfonic acid groups and amino groups by known methods are used. Examples thereof include those having a functional group introduced, glass, polysaccharides, silica gel, porous ceramics, and metal oxides.
  • the method for immobilizing the epitope polypeptide on the solid phase carrier can be a known method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or a crosslinking method, but is not particularly limited.
  • a person skilled in the art can appropriately select from known methods to immobilize the overlapping peptide on the solid phase carrier.
  • Each test sample of the test sample group and each control sample of the target sample group are supplied to the overlap peptide immobilized on the solid phase carrier, respectively, and conditions for causing an antigen-antibody reaction between the overlap peptide and the antibody are set. Give. Such conditions are appropriately determined.
  • the antigen-antibody reaction on the solid phase carrier can be detected using a labeling substance used in a conventional immunoassay.
  • the labeling substance include fluorescent substances, luminescent substances, dyes, enzymes, coenzymes, and radioisotopes.
  • the labeling substance can be labeled by directly binding to an epitope polypeptide or a secondary antibody against an antibody that binds to the epitope polypeptide.
  • indirect labeling can be performed using an antibody that recognizes a labeling substance or an avidin-biotin system.
  • Specific binding is detected using a detection device corresponding to the type of signal based on such a labeling substance.
  • the detected signal intensity can be related to the amount of specifically bound antibody.
  • the first epitope or candidate thereof is selected from overlapping peptides.
  • Individual signal intensity information (hereinafter referred to as individual test intensity information) about the overlapping peptide on the solid phase carrier obtained for each test sample is obtained. From these individual test information, it is possible to obtain signal intensity information (referred to as average test intensity information) obtained by averaging all individual test intensity information for the same overlapping peptide for each test sample group.
  • the average test intensity information can be, for example, a simple average of all individual test intensity information.
  • individual signal intensity information (hereinafter referred to as individual control intensity information) about the overlapping peptide on the solid phase carrier obtained for each control sample is obtained.
  • signal intensity information (referred to as average control intensity information) obtained by averaging all the individual control intensity information for the same overlapping peptide can be obtained for the control sample group.
  • the average control intensity information can be, for example, a simple average of all individual control intensity information.
  • the determination method include the following methods (1) to (3).
  • the average test intensity information is higher than the average control intensity information, and p-0.05 is satisfied in the test sample group and the control sample group by performing the t-test with a two-sided test, for example.
  • p ⁇ 0.05 is satisfied, the specific binding between a specific overlapping peptide and the antibody of the test sample group is affirmed.
  • the composite test intensity information obtained by averaging the average test intensity information of a plurality of consecutive overlapping peptides including one specific overlap peptide is higher than the composite control intensity information obtained in the same manner for the control sample.
  • each of these composite intensity information can be a simple average of predetermined average test intensity information and a simple average of average control intensity information.
  • any one selected by any technique is an important epitope or a candidate thereof, but (3) is included in the test sample group. It is suitable for detecting common important epitopes or candidates thereof.
  • other test methods and significance levels than those used in the above description may be applied.
  • an overlapping peptide in which specific binding to an antibody is affirmed can be used as the first epitope in the allergen or a candidate thereof.
  • this step is performed for all overlapping peptides to determine whether each overlapping peptide can affirm specific binding with an antibody of the test sample group and can be the first epitope or a candidate thereof. Determine whether or not.
  • the first epitope thus determined or its candidate is an important epitope that is highly common to the test sample group, that is, allergy positive individuals, and is an important element for determining the set of epitopes.
  • the first epitope or its candidate is basically one specific overlapping peptide, but when it is determined that a plurality of consecutive overlapping peptides are the first epitope or its candidate,
  • the overlapping peptide may be the first epitope or a candidate thereof. This is because each overlapping peptide has an overlap, and if the successive overlapping peptides are different first epitopes, the second epitope may not be determined accurately.
  • the second epitope or its candidate determination step is performed.
  • This step relates to a test sample selected from the test sample group, and the overlap peptide corresponding to the first epitope or the candidate already determined in the previous step is the individual test strength information and the control strength information of the test sample.
  • the determination method a method for determining whether or not the test sample group is the first epitope or a candidate thereof can be applied to each test sample.
  • the above method (3) is adopted.
  • the critical value obtained based on the average control intensity information can be obtained by, for example, increasing or decreasing an appropriate multiple of the standard deviation (SD) with respect to the average control intensity information.
  • the average control intensity information can be ⁇ 1 to 2SD.
  • mean control intensity information ⁇ 2SD can be ⁇ 1 to 2SD.
  • Judgment may be based on the critical value, and is performed based on whether the individual test strength information of the overlapping peptide is equal to or higher than the critical value or exceeds the critical value. “More than” or “exceeds” may be any one, and is appropriately determined according to the type of critical value.
  • the particular overlap peptide When a particular overlap peptide has individual test intensity information that is above or above a critical value, the particular overlap peptide is identified as a second epitope for a particular first epitope or candidate thereof in the allergen or The candidate is determined.
  • the second epitope or the candidate thus determined is an epitope that is highly likely to induce an allergic reaction in a pair or pair with the first epitope or the candidate in the test sample, and thus in the allergy positive individual.
  • the determination of individual epitopes or their candidates for each test sample may be performed in the epitope or candidate determination process for the test sample group of the allergy positive individual group already described. That is, for each test sample, the first epitope or candidate thereof is determined by a method according to the first epitope for the test sample group or its determination step. That is, instead of using the average test intensity information of the test sample group, the first epitope for each test sample or its candidate is determined using the individual test intensity information. And the 2nd epitope which can be combined with this 1st epitope or its candidate, or its candidate is determined like the above.
  • the entire test sample group cannot be determined as the first epitope or a candidate thereof, but can be combined with the unique first epitope or the overlapping peptide determined as a candidate in each test sample.
  • the overlapping peptide which becomes the 2nd epitope can be detected.
  • the number information of the test samples determined to correspond to the second epitope or the candidate is obtained for each overlapping peptide.
  • an overlapping peptide that is determined to be a second epitope or a candidate thereof in a test sample of a predetermined ratio or more with respect to the total number of test samples in the test sample group is a second epitope or a candidate common to the test sample group.
  • the predetermined ratio of the determination criterion can be, for example, preferably 90 percentile or higher, more preferably 95 percentile or higher.
  • the predetermined ratio here is appropriately determined according to the number of overlapping peptides corresponding to the second epitope, the total number of test samples, and the number of test samples.
  • the second epitope or its candidate is determined with respect to the first epitope or its candidate.
  • the first epitope or its candidate and the second epitope or its candidate of the test sample group determined in this way can be said to be an important epitope set that is highly likely to induce an allergic reaction in many allergy positive individuals.
  • the antigen-antibody reaction process and the detection process for the control sample group are performed. However, if standard average control intensity information is already obtained for the control sample group, the actual process is performed. Alternatively, such information can be used to determine the first epitope or candidate and the second epitope or candidate.
  • the first epitope common to the test sample group or candidate thereof and the second epitope or candidate thereof have been mainly described. However, as described later, It can also carry out so that each 1st epitope or its candidate and 2nd epitope or its candidate may be detected about each test sample contained in a sample group.
  • the present invention also relates to a method for detecting allergen epitopes or candidates thereof for individual allergy positive individuals.
  • the first epitope or a candidate thereof and the second epitope or a candidate thereof may be determined for each individual test sample included in the test sample group in the detection method described above.
  • the step of determining the first epitope or its candidate is performed based on the individual test intensity information and the mean control intensity information, and the determined first epitope or its candidate is determined for the test sample.
  • the two epitopes or their candidates may be determined based on the individual test intensity information and the average control intensity information.
  • an antigen antibody reaction and a detection process should just be implemented about an individual test sample, and it is not necessary to implement these processes as a test sample group. By determining such an individual-specific epitope combination, diagnosis with higher accuracy becomes possible.
  • an epitope peptide of an allergen protein such as milk allergy or a set thereof is provided.
  • the epitope peptide and the set thereof are useful for diagnosis and treatment of milk allergy.
  • the set of epitope peptides identified in the present invention is a combination of epitopes closely related to inducing the development of allergic symptoms. By using this set, false positives (allergic symptoms are not expressed but allergens are not expressed). Therefore, it is possible to make a diagnosis with higher accuracy by avoiding the diagnosis result that the sample has a high IgE.
  • a specimen that is positive for a peptide (overlap peptide) detected as a possibility that it corresponds to an epitope peptide or set of epitope peptides of an allergic protein of an allergic disease (especially, a peptide that is positive for both of the epitope peptide sets) can be determined to be an allergy positive sample.
  • the specimen that does not react with these epitopes is negative, and the specimen that reacts with only one of the epitope peptide sets is also negative.
  • a sample that reacts with only one of the epitope peptide sets corresponds to a sample that has been conventionally determined as a false positive (a sample that is positive in a conventional antigen-antibody reaction test but does not develop allergic symptoms). Therefore, according to the epitope peptide of the present invention or a set thereof, false positive specimens that could not be excluded by the conventional testing method can be surely excluded.
  • the epitope peptide of the present invention or a set thereof in the conventional allergy test, a definitive diagnosis could not be made unless a heavy allergen load test was performed on the patient. Moreover, it is possible to avoid or suppress the determination of false positives and false negatives, and to determine with high accuracy.
  • the allergy test method disclosed in the present specification is directed to an individual having a possibility of allergic disease against two or more epitope peptides each containing two or more epitopes related to the expression of allergic reaction.
  • These two or more types of epitope peptides can include a first epitope peptide and a second epitope peptide determined by the determination method described above.
  • an epitope peptide or a peptide that may correspond to a set thereof can be used as an allergy test or a kit thereof in various forms, but preferably has a form immobilized on a solid phase carrier.
  • the solid phase carrier is preferably in the form of a plate such as a plate, and more preferably takes the form of a so-called array (peptide array).
  • array peptide array
  • a preferable form for replacing the food load test is a peptide array in which an epitope peptide detected for all possible allergen proteins for a given allergic disease or an overlapping peptide corresponding to the set is immobilized. Can be mentioned.
  • the epitope peptide of the present invention or a peptide that can be used as a set thereof can have the amino acid sequences shown in Tables 1 and 2, respectively.
  • Table 1 shows preferable examples of the first epitope. These first epitopes or candidates thereof are shown by coloring (lightest gray) in the numbered portions (vertical and horizontal item columns) assigned to each allergen protein in FIGS.
  • a preferable combination of epitope peptide sets includes combinations corresponding to the sections colored in dark gray and medium gray in FIGS. Among them, the combination corresponding to the dark gray colored section is a combination of epitope peptides suitable for use as the epitope set of each allergen protein.
  • the number of amino acid residues in the epitope peptide of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least the amino acid sequence represented by the specified SEQ ID NO as a partial sequence. Typically, it consists of a specified amino acid sequence.
  • the epitope peptide of the present invention may be modified by amino acid substitution, deletion or addition by a known method. It is also possible to impart solubility and antigen-antibody reactivity suitable for therapeutic use.
  • the epitope peptide of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method such as a fully automatic peptide synthesizer, a method using gene recombination with yeast, Escherichia coli, mammalian cells and the like.
  • the epitope peptide of the present invention may be in the form of a salt, if necessary, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include salts of inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) salts, etc.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanes
  • the epitope peptide of the present invention is used for diagnosis of milk allergy
  • various immunoassay forms can be adopted.
  • a method of detecting the antigen-antibody reaction as color development, luminescence, and fluorescence using a labeling substance as is done with a labeled immunoassay reagent, and aggregation of an insoluble carrier as is done with an immunological agglutination reagent
  • an immunoassay such as a method of detecting the antigen-antibody reaction by visual observation or turbidity
  • it can be used by immobilizing on an appropriate solid phase carrier.
  • the solid phase carrier and the immobilization method those already described can be used similarly.
  • a peptide array is preferable.
  • the epitope peptide of the present invention is useful for peptide immunotherapy such as desensitization therapy because when administered to a milk allergy positive individual (human etc.), it can regulate the allergic response of the individual to the milk-derived allergen.
  • the epitope set of the present invention can be used.
  • the epitope peptide of the present invention when used for peptide immunotherapy such as desensitization therapy for a milk allergy positive individual, it can be used in combination with an appropriate pharmaceutically acceptable diluent and carrier.
  • the milk allergy positive individuals include milk allergy positive individuals immunologically cross-reactive with the various allergen proteins described above.
  • the peptide can be administered preferably in an amount of about 1 ⁇ g to 50 mg per dosage unit.
  • the entire amino acid sequences of six major milk allergen proteins ( ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin) are covered.
  • IgE in the serum of cows with milk allergy was analyzed.
  • significant binding of IgE was observed in the milk allergy positive specimen group (61 specimens), the hypersensitivity specimen group (9 specimens), and the milk allergy weak positive group (30 specimens).
  • Identified peptide (IgE binding epitope region). Since the actual allergic manifestation requires a combination of IgE against two epitopes in the patient's serum, analysis of the combination of two peptides involved in the induction of milk allergy in the milk allergy positive sample group (61 samples) did.
  • the peptide array consists of 6 kinds of allergen proteins, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein.
  • the overlapping peptides described in 1 to 51, SEQ ID NOs: 52 to 91, SEQ ID NOs: 92 to 154, SEQ ID NOs: 155 to 220, SEQ ID NOs: 221 to 287, and SEQ ID NOs: 288 to 340 were chemically synthesized to prepare peptide arrays. Immobilization to the array to the peptide was as follows. A glass substrate was used as the solid support.
  • the average fluorescence intensity value of the patient group is higher than that of the negative group at a single peak (one overlapping peptide), and p ⁇ 0.05 is satisfied between the patient group and the negative group by performing a two-sided test.
  • the peptides were extracted (group a).
  • the average fluorescence intensity value of the patient group of 5 sequence peaks (5 consecutive overlapping peptides consisting of 2 overlapping peptides before and after including one overlapping peptide) is higher than that of the negative group, and t-test is two-sided.
  • step (b) peptides satisfying p ⁇ 0.05 were extracted in the patient group and the negative group. Overlapping peptides that were a group and b group were extracted. These overlapping peptides correspond to the first epitope or candidate thereof.
  • FIG. 2 shows a scheme for determining a second epitope or a candidate thereof and a combination of two epitopes involved in the induction of a milk allergic reaction.
  • first epitope determined in (a) or a candidate thereof and has significance for the patient group in both five consecutive cases or alone.
  • Overlapping peptide that extracts an overlapping peptide, and shows an intensity that is not equal to the extracted overlapping peptide but is equal to or greater than the value obtained by adding 2SD to the average fluorescence intensity value of the negative group (22 samples) Or candidate).
  • the first epitope is determined for each specimen included in the milk allergy positive specimen group, and the first epitope is determined.
  • the second epitope to be combined with the epitope of the negative group is added with 2SD of the mean fluorescence intensity value of the negative group, and the epitope set is determined as an overlapping peptide having an intensity higher than the value, and counted. did.
  • the patient group is a milk allergy positive sample group (61 samples), a hypersensitivity sample group (9 samples), a milk allergy weak positive group (30 samples), and a milk allergy negative sample group (22).
  • Sample Peptides having a single peak, 5 sequence peaks, single peak and 5 sequence peaks that are significantly different from each other are very important sequence candidates as IgE recognition sites involved in the induction of milk allergy.
  • the IgE-binding region was most widely distributed throughout the protein with respect to ⁇ s1 -casein, which is particularly important as a major allergen in milk, whereas almost no IgE-binding region was found with ⁇ -lactalbumin.
  • the 1st epitope detected about the allergy positive sample group or the overlap peptide which is the candidate was as showing in Table 1.
  • the axis indicates peptide No. in the order of N-terminal to C-terminal amino acid sequence of the same protein.
  • the first epitope detected for an allergy positive specimen group or an overlapping peptide that is a candidate is colored in the lightest gray color in the item column indicating the sequence number for each figure. Showed.
  • the first epitope and the second epitope determined for the sample group in addition to the combination of the first epitope and the second epitope determined for the sample group, the first epitope and the second epitope determined for individual samples included in the sample group The combination is also described.
  • the dark gray compartment and the medium gray compartment are both important combinations, but among the compartments in the figure, the peptide compartment determined to be the first common epitope in the whole allergic positive specimen group ( The section in the lightest gray section) is an important combination in terms of higher commonality, and the section outside the lightest gray section is a more specific but important combination. For example, when an array is produced using these, it is preferable to use a more common and important combination when fewer peptides need to be immobilized.
  • Tables 2 to 11 show preferred sets of epitope peptides for each of ⁇ -lactoglobulin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein obtained from these results.
  • the diagnosis about milk allergy has already been confirmed clinically (Table 12), and based on the confirmed diagnosis, a test group (total of 20; milk allergy positive 10; milk allergy negative) 10) were randomly selected, and the rest were set as a learning group (total 140; milk allergy positive 117, milk allergy negative 23), and multiple epitopes suitable for diagnosis obtained from epitope analysis of the learning group The presence or absence of reactivity to the set (epitope pair) was applied to the test group and the learning group as the basis of diagnosis, and the diagnostic accuracy was evaluated.
  • the presence or absence of reactivity to multiple single epitopes (single epitopes) obtained from epitope analysis of the learning group is applied to the test group and learning group as the basis of diagnosis, and the diagnostic accuracy was also evaluated.
  • a negative patient health person is a patient who was suspected of having milk allergy according to the CAP-RAST class determination but had no symptoms in the milk load test and was negative.
  • patients (positive patients) are load-positive specimens (all may be referred to as negative and positive in the figure) that have allergic reactions when a milk load test is performed, and positive medical history that has symptoms at home. It was set as the sample (it may be called a disease positive in the figure).
  • the average fluorescence intensity value of the learning group is higher than that of the negative group with a single peak (one overlapping peptide) for all overlapping peptides, and the t-test is performed by a two-sided test.
  • the overlapping peptide satisfying p ⁇ 0.01 (P ⁇ 0.05 may be used) was extracted (Condition 1).
  • the two-sided test (Bonferroni)
  • the number of peptide sequences was added to the previous t-test, and at that time, overlapping peptides with p ⁇ 0.01 were extracted (condition 2).
  • the average fluorescence intensity value of the positive patient group / the average fluorescence intensity value of the negative patient was calculated, and the overlapping peptide that became 2.0 or more was extracted (condition 3).
  • the average fluorescence intensity value of the patient group of 5 sequence peaks (5 consecutive overlapping peptides consisting of 2 overlapping peptides before and after including one overlapping peptide) is higher than that of the negative group, and t-test is a two-sided test.
  • a peptide satisfying p ⁇ 0.01 (P ⁇ 0.05 may be used) was extracted in the patient group and the negative group (Condition 4).
  • the two-sided test (Bonferroni)
  • the number of peptide sequences was added to the previous t-test, and at that time, the peptide having p ⁇ 0.01 (P ⁇ 0.05 may be used) was extracted ( Condition 5).
  • the average fluorescence intensity value of the positive patient group / the average fluorescence intensity value of the negative patient was calculated, and peptides having a value of 2.0 or more were extracted (condition 6).
  • the selection criteria for epitope candidates were as follows. (1) In 5 sequence peak analysis, when at least condition 4 is satisfied, it is preferable as one of the epitopes of one epitope pair, more preferably, condition 5 or condition 6 is satisfied, and more preferably conditions 5 and 6 An overlapping peptide satisfying (2) In addition to satisfying the conditions in the 5-sequence peak analysis, it is more preferable to satisfy at least the condition 1 in the single peak analysis. More preferably, an overlapping peptide that satisfies Condition 2 or Condition 3 and more preferably satisfies Conditions 2 and 3 can be used. (3) One candidate of the epitope pair is extracted based on the above (1) and (2).
  • Possible epitope pairs are displayed as one grid or grid on a two-dimensional matrix.
  • the number of positive patients that can be counted in this grid or first is displayed, and when there is a certain count or more, or a certain percentage of the total number of positive patients (for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90%). % Or more)
  • epitope pairs corresponding to the grids or grids can be more preferable epitope pair candidates. That is, for a possible epitope pair, a more preferred epitope pair candidate is selected when the number of positive patients in the learning group meets a certain criterion.
  • Such more preferred epitope pair candidates are usually a grid or grid (region) or a set of two or more of these that displays different epitope pairs on the matrix (a set of such epitope pairs is referred to as an epitope set). It will be found. That is, for example, an epitope pair may be composed of one region (a combination of a pair of epitopes), may be composed of two regions, or may be composed of more regions. Various aspects are mentioned, such as the case where the epitope set corresponding to this region may consist of a region within the range of 2 ⁇ 2 and a region within the range of 3 ⁇ 3.
  • a more preferred epitope pair candidate is an epitope pair that is actually used for diagnosis.
  • the following points can be selected as a reference. (1) Whether one of the epitopes constituting the pair satisfies the requirements of the 5 sequence peak such as Condition 4 at a higher level (2) One of the epitopes constituting the pair satisfies the conditions such as Condition 1 at a higher level Whether the single peak requirement is met (3) Whether more positive patients (absolute number or percentage of all positive patients) are responding to the epitope pair
  • ⁇ S1 casein peak set 1 is composed of a total of nine peptide pairs. That is, the peak numbers 23, 24, and 25 are the first epitopes, 37, 38, and 39 are the second epitopes, respectively, and there are 9 combinations of these first and second epitopes. It is. (9 pairs in total). Therefore, the 10 epitope sets include a total of 80 epitope pairs.
  • any of these epitope pairs is an effective epitope pair for diagnosis of milk allergy.
  • the peak sets 1 to 3 and the peak sets 5 and 6 including epitopes with double circles in the overall determination are preferable for the determination, and more preferably, the double circles are included in the overall determination.
  • An epitope pair containing an epitope marked with is a more preferred epitope pair.
  • the test group (20 samples) and the learning group for each epitope pair of the 10 epitope sets obtained from the learning group as described above. It was examined whether each of (140 specimens) had reactivity. That is, for all patients included in these groups, the reactivity is affirmed when the selected individual epitope pair has a fluorescence intensity value equal to or greater than the average value of healthy subjects + 2SD, and any one of them When the reactivity was positive for the epitope pair, it was determined that the milk allergy was positive.
  • a summary of reactivity for the test group is shown in FIG. 29, and a summary of reactivity for the learning group is shown in FIGS. 30A to 30D.
  • the determination results are shown in Table 13. Note that the coverage was calculated based on the numerical value in the column of “1 if detected even once in all areas covered by the peak set, and 0 otherwise” in the table.
  • Table 15 shows the results of the CAP-RAST method.
  • 8 patients in the learning group had not measured the CAP-RAST method, these patients were excluded from the determination.
  • the false positive rate (coverage rate (healthy person) in the table) that judges the healthy person (negative patient) as positive is the test group and the learning group.
  • the false positive rate (coverage rate in the table (healthy person class 4 or higher) in the table is 0.0% in the test group, which is judged as positive for healthy persons of class 4 or higher by the CAP-RAST method)
  • the rate of positive milk allergy positive patients (coverage rate (patient)) in the test group was 60.0% in the test group and the learning group in the learning group.
  • the rate of positive results for patients of class 4 or higher was 100% in the test group and 91.7% in the learning group. It was.
  • the false positive rate (coverage rate (healthy person) in the table) which erroneously determines the healthy person as positive is tested. It was 80% in the group and 87% in the learning group. Moreover, the false positive rate (coverage rate in the table (healthy person class 4 or higher) in the table) is 100.0% in the test group and 100.0% in the learning group. there were.
  • the determination by the epitope pair can reduce the false positive rate that determines a healthy person as allergy positive.
  • allergic patients can be determined as positive even if the class is low, as determined by non-paired epitopes (single epitopes) by single peak analysis.
  • an allergy diagnosis with a high patient positive rate and a low false positive rate can be performed by combining the epitope pair and the determination by single epitope.

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Abstract

本明細書の開示は、一つのアレルゲンにおける２箇所以上のエピトープのセットを検出する方法を提供する。本明細書の開示によれば、アレルゲンのエピトープ又はその候補を検出するのにあたり、（ａ）被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記１種又は２種以上の抗体とを接触させ、前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記１種又は２種以上の抗体との特異的結合を検出し、前記複数のオーバーラップペプチドから選択されるオーバーラップペプチドであって、前記対照試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報と前記被験試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均被験強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを、前記アレルゲンにおける第１のエピトープ又はその候補とし、前記被験試料群から選択される被験試料に関し、前記１種又は２種以上の第１のエピトープ又はその候補に相当する前記オーバーラップペプチドの個別の被験強度情報と前記平均対照強度情報とに基づいて、前記オーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とすることができるとき、当該第１のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第２のエピトープ又はその候補とするようにする。

Description

アレルゲンのエピトープ又はその候補の検出方法及びその利用
　本願は、２００８年１１月１０日に出願された日本国特許出願である特願２００８－３１６２１６に対する優先権を主張するものであり、この日本国特許出願の明細書の全内容は参照により本明細書に取り込まれる。
 本発明は、アレルゲンのエピトープを検出する方法に関し、特に、少なくとも２つのエピトープのセットを検出する方法及びその利用に関する。
　花粉や食品由来のタンパク質等に対するアレルギー疾患の診断や治療のため、アレルゲン特異的な抗体量の測定が行われている。例えば、患者の血中のアレルゲンに特異的なＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥなどの抗体量を測定する方法（特許文献１）がある。また、同様の目的のために、抗原タンパク質のうちＩｇＧやＩｇＥのペプチド断片のアレイを作成し、このペプチドアレイを用いて、ＩｇＥ及びＩｇＧがそれぞれ特異的に結合するＩｇＥエピトープ及びＩｇＧエピトープを特定できることも開示されている（非特許文献１）。
特開２００８－１０７１５４ I. Cerecedo et al., J. Allergy, Clin. Immunol., 122, 589-594
　アレルギー症状の発症には好塩基球や肥満細胞が重要な役割を果たしている。アレルギー疾患患者には症状発現にかかわるアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体が産生される。このアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は肥満細胞や好塩基球表面に発現しているＩｇＥのレセプター（ＦｃεＲＩ）に結合した状態でこれらの細胞上に残存する。この後、このＩｇＥに特異的なアレルゲンが結合すると、ＩｇＥレセプターの架橋が起き、このことが引き金となってＩｇＥレセプターからシグナルが伝達され、アレルギー症状を直接引き起こすヒスタミンなどの顆粒の放出（脱顆粒）が起こる。本発明者らによれば、このように脱顆粒が起こるためには単に１つのＩｇＥ抗体がアレルゲンと結合するのみでは不十分であり、少なくとも単一アレルゲンに２箇所以上の脱顆粒を惹起するために有効なアレルゲン特異的ＩｇＥ結合部位（エピトープ）が必要であると考えられる（２ヒット理論）。したがって、アレルゲンの検査においては、脱顆粒を生じるのに必要な少なくとも２箇所のエピトープを検出することが重要である。
　しかしながら、上記特許文献１に記載の方法ではエピトープを識別できず、また、上記非特許文献１の方法は、個々の患者においてエピトープを検出できるものの、脱顆粒を生じさせる２箇所以上のエピトープの組み合わせを検出できない。
　以上のように、現行のアレルゲン検査の問題点は有効に脱顆粒を起こすために必要なエピトープ(IgE結合部位)の組み合わせが存在することまでは検出できず、単にアレルゲン上にIgEの結合部位が存在することのみを検出しているために偽陽性の頻度が高くなっている。
　本発明は、一つのアレルゲンにおける２箇所以上のエピトープのセットを検出する方法を提供すること及びこうして得られたエピトープ及びそのセットの用途を提供することを目的とする。
　本発明者らは、抗原タンパク質につきオーバーラップペプチドを取得してペプチドアレイを作製して、特定の手法により解析を行うことにより、アレルギー反応の誘導や増悪に関連する可能性のあるエピトープセットを検出できることを見出し、本発明を完成した。また、ミルクアレルギーの発症や増悪に関連するエピトープのセットを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
　本明細書の開示によれば、アレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法であって、以下の工程；
（ａ）被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
　可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記１種又は２種以上の抗体とを接触させる工程、
（ｂ）前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記１種又は２種以上の抗体との特異的結合を検出する工程、
（ｃ）前記複数のオーバーラップペプチドから選択されるオーバーラップペプチドであって、前記対照試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報と前記被験試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均被験強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを、前記アレルゲンにおける第１のエピトープ又はその候補とする工程、及び
（ｄ）前記被験試料群から選択される被験試料に関し、前記１種又は２種以上の第１のエピトープ又はその候補に相当する前記オーバーラップペプチドの個別の被験強度情報と前記平均対照強度情報とに基づいて、前記オーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とすることができるとき、当該第１のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第２のエピトープ又はその候補とする工程、
を備える、方法が提供される。
　この検出方法においては、さらに、以下の工程；
（ｅ）前記第１のエピトープ候補のそれぞれにつき、前記オーバーラップペプチド毎に当該オーパーラップペプチドを第２のエピトープ又はその候補とする被験試料の個数情報を取得する工程、を備えることができ、また、さらに、（ｆ）前記第１のエピトープ又はその候補のそれぞれにつき、前記被験試料群中所定割合以上の前記被験試料が特定の前記オーバーラップペプチドを第２のエピトープ又はその候補とするとき、前記第１のエピトープ又はその候補と当該第２のエピトープ又はその候補とを前記アレルゲンにおけるエピトープセット又はその候補とする工程、を備えることができる。
　さらにまた、前記（ｃ）工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドについて得られる平均被験強度情報と、対応する前記オーバーラップペプチドの平均対照強度情報と、に基づいて、前記一つのオーバーラップペプチドの前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とする工程としてもよく、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドを含んで所定数連続する複数のオーバーラップペプチドについて得られる複合被験強度情報と、対応する複数のオーバーラップペプチド毎の対照強度情報から得られる複合対照強度情報と、に基づいて、前記所定数連続する複数のオーバーラップペプチド全体として前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とする工程としてもよく、これら双方の要件を充足するときに、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とする工程としてもよい。
　本明細書の開示によれば、アレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法であって、以下の工程；
（ａ）アレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
　可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記１種又は２種以上の抗体とを接触させる工程、
（ｂ）前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記１種又は２種以上の抗体との特異的結合を検出する工程、及び
（ｃ）前記アレルギー陽性個体につき、
　前記各オーバーラップペプチドについて得られる個別の被験強度情報と、前記対照試料群の前記各オーバーラップペプチドについて得られる前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される１種又は２種以上のオーバーラップペプチドを第１のエピトープ又はその候補とし、当該第１のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第２のエピトープ又はその候補とする工程、
を備える、方法も提供される。
　本明細書の開示によれば、アレルギー疾患の検査方法であって、アレルギー反応の発現に関連する２種以上のエピトープをそれぞれ含む２種以上のエピトープペプチドに対して、アレルギー疾患の可能性のある個体に由来する抗体を含有する被験試料を供給し、前記２種類以上のエピトープペプチドと前記抗体と接触させる工程と、前記２種類以上のエピトープペプチドにつき、前記抗体との特異的結合を検出する工程と、を備える、方法が提供される。
　本検査方法においては、前記接触工程は、前記２種類以上のエピトープペプチドを固定化した固相担体を用いる工程であることが好ましい。また、前記２種類以上のエピトープペプチドは、上記のいずれかのエピトープの検出の方法によって決定された第１のエピトープペプチドと第２のエピトープペプチドとを含むことが好ましい。
　本明細書の開示によれば、アレルギー疾患の検査用のペプチドアレイであって、アレルギー反応の発現に関連する２種以上のエピトープをそれぞれ含む２種以上のエピトープペプチドが固相担体に固定化された、アレイが提供される。
個体群の判別に有用な第１のエピトープの決定方法の概要を示す図である。 個体群の判別に有用なエピトープのペアの決定方法の概要を示す図である。 牛乳アレルギー陽性検体群についてβ－ラクトグロブリンタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。なお、図３～図５における配列Ｎｏ．１～５１は、配列番号１～５１のアミノ酸配列に対応している。 牛乳アレルギー過敏症検体群についてβ－ラクトグロブリンタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー弱陽性検体群についてβ－ラクトグロブリンタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー陽性検体群についてα－ラクトアルブミンタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。なお、図６～図８における配列Ｎｏ．１～４０は、配列番号５２～９１のアミノ酸配列に対応している。 牛乳アレルギー過敏症検体群についてα－ラクトアルブミンタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー弱陽性検体群についてα－ラクトアルブミンタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー陽性検体群についてαs1－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。なお、図９～図１１における配列Ｎｏ．１～６３は、配列番号９２～１５４に対応している。 牛乳アレルギー過敏症検体群についてαs1－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー弱陽性検体群についてαs1－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図 牛乳アレルギー陽性検体群についてαs2－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。なお、図１２～図１４における配列Ｎｏ．１～６６は、配列番号１５５～２２０に対応している。 牛乳アレルギー過敏症検体群についてαs2－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー弱陽性検体群についてαs2－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー陽性検体群についてβ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。なお、図１５～図１７における配列Ｎｏ．１～６７は、配列番号２２１～２８７に対応している。 牛乳アレルギー過敏症検体群についてβ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー弱陽性検体群についてβ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー陽性検体群についてκ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。なお、図１８～図２０における配列Ｎｏ．１～５３は、、配列番号２８８～３４０に対応している。 牛乳アレルギー過敏症検体群についてκ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 牛乳アレルギー弱陽性検体群についてκ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の決定に用いたオーバーラップペプチドの番号、個々の識別番号、アミノ酸配列等を示す図である。 β－ラクトグロブリンタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図３に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 β－ラクトグロブリンタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図３に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 α－ラクトグロブリンタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図６に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 αs1－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図９に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 αs1－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図９に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 αs2－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図１２に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 αs2－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図１２に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 β－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図１５に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 β－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図１５に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 κ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図１８に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 κ－カゼインタンパク質のエピトープ又はその候補の解析結果を示す図であり、濃グレーの区画は、該当患者数が９５パーセンタイル以上の組合わせを示し、中濃グレーの区画は、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組合わせを示す。縦及び横の項目欄には、図１８に示すオーバーラップペプチドの番号を示す。 患者番号８において、アレルギー反応の誘発に関与すると考えられる２つＩｇＥの組み合わせを示す。 実施例２のペプチドアレイの解析によって得られた１０個のエピトープせットナーのうち、５個のエピトープセットの内容を示す図である。 実施例２のペプチドアレイの解析によって得られた１０個のエピトープせットナーのうち、残り５個のエピトープセットの内容を示す図である。 実施例２のテスト群についてのピークセットに含まれるエピトープペアに対する反応性の表を示す図である。 実施例２の学習群についてのピークセットに含まれるエピトープペアに対する反応性の表を示す図である。 実施例２の学習群についてのピークセットに含まれるエピトープペアに対する反応性の表を示す図である。 実施例２の学習群についてのピークセットに含まれるエピトープペアに対する反応性の表を示す図である。 実施例２の学習群についてのピークセットに含まれるエピトープペアに対する反応性の表を示す図である。
　本発明は、アレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法に関する。本発明によれば、アレルギー症状の発現に重要なエピトープ又はその候補の組み合わせを取得できる。本検出方法によって決定される第１のエピトープ又はその候補は、被験試料群、すなわち、アレルギー陽性個体に共通性の高い重要なエピトープであるとともに、エピトープのセットを決定するのに重要な要素である。また、本検出方法によって決定される第２のエピトープ又はその候補は、多くのアレルギー陽性個体においてアレルギー反応を誘起する可能性の高い重要なエピトープセットであるといえる。
　また、こうして取得したエピトープ又はその候補の組み合わせを取得することで、偽陽性結果を抑制又は回避したアレルギー疾患の診断法を提供できるほか、アレルギー疾患の予防及び治療に役立てることができる。
（アレルゲンのエピトープ又はその候補の検出方法）
（抗原抗体反応実施工程）
　本発明のエピトープ又はその候補の検出方法は、まず、（ａ）被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化された固相担体に、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと抗体とを接触させる工程を実施する。この工程により、オーバーラップペプチドと試料に含まれる抗体とを接触させて、抗原－抗体反応を生じさせることができる。
　被験試料は、アレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する。被験試料は、抗体を含んでいればよく、特に限定されないが、例えば、アレルギー陽性個体から採取される血液や血清などが用いられる。アレルギー陽性個体は、ヒトの他、非ヒト動物であってよい。アレルギー陽性個体は、同一のアレルゲンに対するアレルギー陽性個体とする。例えば、牛乳、卵など個々の食品に対するアレルギー陽性個体、スギ花粉、ヒノキ花粉等、植物又はその部分に対するアレルギー陽性個体、ダニなど動物又はその部分に対するアレルギー陽性個体、真菌に対するアレルギー陽性個体等は、それぞれ同一のアレルゲンに対する陽性個体である。なお、同一のアレルゲンは、同一のタンパク質にまで限定されていてもよい。
　被験試料群は、複数の被験試料の集合である。被験試料群を構成する被験試料の数は特に限定されない。また、被験試料群を構成する被験試料の採取源であるアレルギー陽性個体は、アレルギー症状の程度やＩｇＥ抗体レベルが一定範囲に限定されていることが好ましい。アレルギー症状の程度等が大きく異なる場合、抗体が認識するエピトープも相違する可能性があり、重要なエピトープ及びセットを決定するのが困難になる場合もあるからである。したがって、所定のアレルギー症状やＩｇＥ抗体レベルの範囲のアレルギー陽性個体由来の被験試料からなる複数の被験試料群を準備してもよい。
　対照試料群は、複数の対照試料の集合である。対照試料の数は特に限定されない。対照資料の採取源であるアレルギー陰性個体は、少なくともアレルギー陽性個体のアレルゲンに対するアレルギー陰性個体である。アレルギー陰性個体は、例えば、アレルギー症状やＩｇＥ抗体レベルで決定することができる。
　オーバーラップペプチドは、可能性あるアレルゲンタンパク質又はその部分のアミノ酸配列に基づいて、適当な長さ（例えば、１２～２５残基程度）で、オーバーラップ（配列の重複領域）が、例えば、８～１７残基程度となるように設計する。好ましくは、アレルゲンタンパク質の一次構造を全てカバーするアミノ酸配列にわたってオーバーラップペプチドを準備する。オーバーラップペプチドの各アミノ酸配列は、例えば、アレルゲンタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端の方向に向かって所定長さのアミノ酸配列を、所定の残基づつずらして、所定残基数が重複することとなるように順次決定していくことができる。一定長さの重複領域を一つのアレルゲンタンパク質について準備するオーバーラップペプチドの数は、カバーする一次構造の大きさやオーバーラップペプチドの長さ及びオーバーラップ残基数によって異なる。牛乳アレルギーなど複数のタンパク質がアレルゲンとして関与する場合には、これらの複数のアレルゲンタンパク質から選択される１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質につき、オーバーラップペプチドを準備することができる。
　例えば、牛乳アレルギーについてのエピトープを検出する場合には、アレルゲンタンパク質としては、主要な６つのミルクアレルゲンタンパク質であるα－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインから選択される１種又は２種以上が挙げられる。エピトープの検出にあたっては、これら全てのアレルゲンタンパク質について、オーバーラップペプチドをそれぞれ取得してもよいし、一部であってもよい。
　オーバーラップペプチドは、適当な固相担体に固定化される。固相担体は、抗原抗体反応の反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、球状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。好ましくは、固相担体は、テストプレート状、ディスク状、フィルター状等の平板状である。また、その材質としては、通常の免疫測定法用担体として用いられるもの、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が挙げられる。
　固相担体へのエピトープポリペプチドの固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できるが、特に限定されない。当業者であれば、公知の方法から適宜選択してオーバーラップペプチドを固相担体に固定化することができる。
　固相担体に固定化されたオーバーラップペプチドに対して被験試料群の各被験試料及び対象試料群の各対照試料をそれぞれ供給して、オーバーラップペプチドと抗体との抗原抗体反応を生じさせる条件を付与する。かかる条件は、適宜決定される。
（抗原抗体反応の検出工程）
　次に、複数のオーバーラップペプチドにつき、各試料中の抗体との特異的結合を検出する工程を実施する。固相担体上での抗原抗体反応は、従来のイムノアッセイに用いられる標識物質を用いて検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。標識物質は、エピトープポリペプチドや該エピトープポリペプチドに結合する抗体に対する二次抗体に直接結合して標識することができる。あるいは標識物質を認識する抗体やアビジン－ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。特異的結合は、こうした標識物質に基づくシグナルの種類に応じた検出装置を用いて検出する。検出したシグナル強度は、特異的結合した抗体量に関連付けすることができる。
（第１のエピトープ又はその候補の決定工程）
　次に、第１のエピトープ又はその候補を決定する工程を実施する。第１のエピトープ又はその候補は、オーバーラップペプチドから選択される。各被験試料につき得られる固相担体上のオーバーラップペプチドについての個別のシグナル強度情報（以下、個別被験強度情報という。）が得られる。これらの個別被験情報から、被験試料群につき、同一のオーバーラップペプチドについての全ての個別被験強度情報の平均化したシグナル強度情報（平均被験強度情報という。）を得ることができる。平均被験強度情報は、例えば、全ての個別被験強度情報の単純平均とすることができる。
　一方、各対照試料につき得られる固相担体上のオーバーラップペプチドについての個別のシグナル強度情報（以下、個別対照強度情報という。）が得られる。これらの個別対照情報から、対照試料群につき、同一のオーバーラップペプチドについての全ての個別対照強度情報を平均化したシグナル強度情報（平均対照強度情報という。）を得ることができる。例えば、平均対照強度情報は、例えば、全ての個別対照強度情報の単純平均とすることができる。
　そして、個々のオーバーラップペプチドについて、得られた平均被験強度情報と平均対照強度情報とに基づいて、被験試料の抗体との特異的結合が肯定されるかどうかを判定する。具体的には、特定のオーバーラップペプチドについて得られる平均被験強度情報が平均対照強度情報に対して有意に高いといえるかどうかを判定する。判定方法としては例えば、以下の方法（１）～（３）が挙げられる。
（１）特定の一つのオーバーラップペプチドにつき、平均被験強度情報が平均対照強度情報よりも高く、t検定を両側検定で行うことより被験試料群と対照試料群で、例えば、p<0.05を充足するかどうかを判定し、p<0.05を充足するとき、特定の一つのオーバーラップペプチドと被験試料群の抗体との特異的結合を肯定する。
（２）特定の一つのオーバーラップペプチを含む複数の連続するオーバーラップペプチドの平均被験強度情報を平均化した複合被験強度情報が、対照試料についても同様にして得られる複合対照強度情報よりも高く、t検定を両側検定で行うことより被験試料群と対照試料群で、例えば、p<0.05を充足するかどうかを判定し、p<0.05を充足するとき、特定の一つのオーバーラップペプチドと被験試料群の抗体との特異的結合を肯定する。
　なお、上記（２）において、特定の一つのオーバーラップペプチドを中心として前後所定の配列を含んで連続するオーバーラップペプチドとしては、例えば、前後２配列づつあるいは前後３配列づつを含む５連続又は７連続のオーバーラップペプチドとしてもよい。複合対照強度情報についても、同様である。また、これらの複合強度情報は、それぞれ、所定の平均被験強度情報の単純平均及び平均対照強度情報の単純平均とすることができる。
（３）上記（１）かつ上記（２）を充足するとき、特定の一つのオーバーラップペプチドと被験試料群の抗体との特異的結合を肯定する。
　上記（１）～（３）を適宜選択して用いることができるが、いずれの手法によって選択されるものであっても、重要なエピトープ又はその候補であるが、（３）が被験試料群に共通する重要なエピトープ又はその候補を検出するのに適している。なお、上記（１）～（３）においては、上記説明で用いた以外の検定手法や有意水準を適用してもよい。
　以上のようにして、抗体との特異的結合が肯定されたオーバーラップペプチドを、アレルゲンにおける第１のエピトープ又はその候補とすることができる。好ましくは、全てのオーバーラップペプチドにつき、この工程を実施し、個々のオーバーラップペプチドが、被験試料群の抗体と特異的結合が肯定できるかどうかを判定し、第１のエピトープ又はその候補となりえるかどうかを判定する。こうして決定した第１のエピトープ又はその候補は、被験試料群、すなわち、アレルギー陽性個体に共通性の高い重要なエピトープであるとともに、エピトープのセットを決定するのに重要な要素である。
　第１のエピトープ又はその候補は、基本的には、特定の一つのオーバーラップペプチドであるが、連続する複数のオーバーラップペプチドが第１のエピトープ又はその候補であると決定されたときには、これら一連のオーバーラップペプチドを第１のエピトープ又はその候補としてもよい。オーバーラップペプチドはそれぞれオーバーラップを有しており、連続するオーバーラップペプチドを異なる第１のエピトープとすると、第２のエピトープを正確に決定できない場合もあるからである。
（第２のエピトープ又はその候補の決定工程）
　さらに本検出方法では、第２のエピトープ又はその候補の決定工程を実施する。この工程は、被験試料群から選択される被験試料に関し、既に前段の工程で決定した第１のエピトープ又はその候補に相当するオーバーラップペプチドが、当該被験試料の個別被験強度情報と対照強度情報とに基づいて、被験試料中の抗体との特異的結合が肯定されるかどうかを判定する。換言すれば、被験試料群において決定された第１のエピトープ又はその候補が、個別の被験試料においても第１のエピトープ又はその候補とすることができるかどうかを判定する。判定方法は、被験試料群について第１のエピトープ又はその候補となるかどうかの判定手法を、個々の被験試料につき適用することができる。好ましくは、上記（３）の手法を採用する。
　個々の被験試料につき、被験試料群について予め決定された第１のエピトープ又はその候補が存在すると判定できたとき、当該第１のエピトープ又はその候補以外の他のオーバーラップペプチドから、これらの平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有するオーバーラップペプチドがあるかどうかを判定する。ここで、平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値は、例えば、平均対照強度情報に対して標準偏差（ＳＤ）の適当な倍数を増減したものとすることができる。具体的には、平均対照強度情報±１～２ＳＤ等とすることができる。典型的には、平均対照強度情報±２ＳＤである。
　判定は、臨界値を基準とすればよく、オーバーラップペプチドの個別被験強度情報が臨界値以上あるいは臨界値を超えるかどうかで行う。「以上」か「超える」かは、いずれかとすればよく、臨界値の種類等に応じて適宜決定される。
　特定のオーバーラップペプチドが臨界値以上又は臨界値を超える個別被験強度情報を有しているとき、当該特定オーバーラップペプチドを、アレルゲンにおける特定の第１のエピトープ又はその候補についての第２のエピトープ又はその候補と決定する。こうして決定された第２のエピトープ又はその候補は、その被験試料、ひいてはアレルギー陽性個体において、第１のエピトープ又はその候補と対又は対となってアレルギー反応を誘起する可能性の高いエピトープである。
　また、被験試料毎についての個別のエピトープ又はその候補の決定を、既に説明したアレルギー陽性個体群の被験試料群についてのエピトープ又はその候補の決定工程において併せて行ってもよい。すなわち、被験試料毎につき、上記被験試料群についての第１のエピトープ又はその決定工程に準じた方法で第１のエピトープ又はその候補を決定する。すなわち、被験試料群の平均被験強度情報を用いるのでなく、個別被験強度情報を用いて被験試料毎の第１のエピトープ又はその候補を決定する。そして、この第１のエピトープ又はその候補に組み合わせできる第２のエピトープ又はその候補を、上記と同様にして決定する。
　こうすることで、被験試料群全体としては、第１のエピトープ又はその候補としては決定できないが、個別の被験試料において固有の第１のエピトープ又はその候補として決定したオーバーラップペプチドに対して組み合わせ可能な第２のエピトープとなるオーバーラップペプチドを検出できる。こうした個体特異的なエピトープの組み合わせの存在が、より多くの個体において肯定されるときには、診断に有用であると考えられる。
　被験試料群につき、第２のエピトープ又はその候補を決定するには、オーバーラップペプチド毎に、第２のエピトープ又はその候補に該当すると判定された被験試料の個数情報を取得し、これらの個数情報を利用することが好ましい。個数情報が大きい、すなわち、第２のエピトープ又はその候補とする被験試料が多いオーバーラップペプチドは、被験試料群に共通する第２のエピトープといえるからである。
　例えば、被験試料群の被験試料の総数に対して所定割合以上の被験試料において第２のエピトープ又はその候補に該当するとされたオーバーラップペプチドを、被験試料群に共通の第２のエピトープ又はその候補とすることができる。判定基準の所定割合とは、例えば、好ましくは９０パーセンタイル以上、より好ましくは、９５パーセンタイル以上等とすることができる。ここでいう所定割合は、第２のエピトープに該当するオーバーラップペプチドの数や被験試料総数及び被験試料数に応じて適宜決定される。
　このようにして、第１のエピトープ又はその候補に対して第２のエピトープ又はその候補が決定される。こうして決定された被験試料群の第１のエピトープ又はその候補と第２のエピトープ又はその候補は、多くのアレルギー陽性個体においてアレルギー反応を誘起する可能性の高い重要なエピトープセットであるといえる。
　以上の説明においては、対照試料群についての抗原抗体反応工程及び検出工程を行うものとしたが、対照試料群につき標準的な平均対照強度情報等が既に得られていれば、実際の工程実施に替えて、こうした情報を用いて第１のエピトープ又はその候補及び第２のエピトープ又はその候補を決定することができる。
　また、以上の説明においては、被験試料群に共通する第１のエピトープ又はその候補と第２のエピトープ又はその候補を検出することを重点的に説明したが、後段にて説明するように、被験試料群に含まれる個々の被験試料につき、個々の第１のエピトープ又はその候補と第２のエピトープ又はその候補を検出するように実施することもできる。
（アレルギー陽性個体のエピトープ又はその候補を検出する方法）
　本発明は、個々のアレルギー陽性個体についてのアレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法にも関する。検出方法は、既に説明した検出方法において、被験試料群に含まれる個別の被験試料につき、第１のエピトープ又はその候補及び第２のエピトープ又はその候補を決定するものとしてもよい。具体的には、第１のエピトープ又はその候補の決定工程を、個別の被験強度情報と平均対照強度情報に基づいて実施し、決定された第１のエピトープ又はその候補について、被験試料についての第２のエピトープ又はその候補を、個別被験強度情報と平均対照強度情報とに基づいて決定すればよい。また、アレルギー陽性個体のエピトープ又はその候補を検出するには、個別の被験試料について抗原抗体反応及び検出工程を実施すればよく、被験試料群としてこれらの工程を実施しなくてもよい。こうした個体特異的なエピトープの組み合わせを決定することで、より確度の高い診断が可能となる。
（エピトープペプチド）
　本発明によれば、牛乳アレルギー等のアレルゲンタンパク質のエピトープペプチド又はそのセットが提供される。エピトープペプチド及びそのセットは、牛乳アレルギーの診断、治療等に有用である。特に、本発明で特定されたエピトープペプチドのセットは、アレルギー症状の発現を誘発するのに関連が深いエピトープの組み合わせであるため、このセットを用いることで、偽陽性（アレルギー症状は発現しないがアレルゲンに対してＩｇＥが高い検体）であるとの診断結果を回避してより確度の高い診断が可能である。
　例えば、アレルギー疾患のアレルゲンタンパク質のエピトープペプチド又はエピトープペプチドのセットに該当する可能性として検出されたペプチド(オーバーラップペプチド)に対して陽性（特に、エピトープペプチドセットの双方にペプチドに陽性）である検体（血清）は、アレルギー陽性検体であると判定できる。また、これらのエピトープに反応しない検体は陰性であり、エピトープペプチドセットの一方にしか反応しない検体も陰性であると判定できる。エピトープペプチドセットの一方にしか反応しない検体は、従来偽陽性として判断されていた検体（従来の抗原抗体反応による検査においては陽性であるがアレルギー症状が発現しない検体）に相当する。したがって、本発明のエピトープペプチド又はそのセットによれば、従来の検査方法では排除できなかった偽陽性検体を確実に排除できることになる。
　また、本発明のエピトープペプチド又はそのセットを用いることにより、従来のアレルギー検査においては患者に負担の大きいアレルゲン負荷試験をしなければ確定診断ができなかったところ、そのような負荷試験を回避して、しかも、偽陽性及び偽陰性の判定を回避又は抑制し、確度の高い判定が可能となっている。
　以上のことから、本明細書の開示におけるアレルギー検査方法は、アレルギー反応の発現に関連する２種以上のエピトープをそれぞれ含む２種以上のエピトープペプチドに対して、アレルギー疾患の可能性のある個体に由来する抗体を含有する被験試料を供給し、前記２種類以上のエピトープペプチドと前記抗体と接触させる工程と、前記２種類以上のエピトープペプチドにつき、前記抗体との特異的結合を検出する工程と、を備えることができる。これら２種類以上のエピトープペプチドは、上記の決定方法によって決定された第１のエピトープペプチドと第２のエピトープペプチドとを含むことができる。
　後述するように、エピトープペプチド又はそのセットに該当する可能性のペプチドを、各種形態でアレルギー検査又はそのキットとすることができるが、好ましくは、固相担体に固定化された形態を備える。固相担体は、好ましくはプレート等の平板状であり、いわゆるアレイ（ペプチドアレイ）の形態を採ることがより好ましい。例えば、食物負荷試験を代替するのに好ましい形態としては、所定のアレルギー疾患に関して可能性ある全てのアレルゲンタンパク質について検出されたエピトープペプチド又はそのセットに該当するオーバーラップペプチドが固定化されたペプチドアレイが挙げられる。
　本発明のエピトープペプチド又はそのセットとして用いることができるペプチドは、表１及び２に示すアミノ酸配列をそれぞれ有することができる。第１のエピトープとして好ましいものを表１に示す。これらの第１のエピトープ又はその候補は、図２１～２６において、各アレルゲンタンパク質毎に付けられた番号部分（縦及び横の項目欄）において色付け（最淡グレー色）して示した。また、好ましい組み合わせのエピトープペプチドのセットは、図２１～図２６における濃グレー及び中濃グレーで着色した区画に相当する組み合わせが挙げられる。なかでも、濃グレーで着色した区画に相当する組み合わせが各アレルゲンタンパク質のエピトープセットとして用いるのに好適なエピトープペプチドの組み合わせである。また、これらの好ましい組み合わせの区画(濃グレー区画及び中濃グレー区画)であって、好ましい第１のエピトープをあわせ有する区画（最淡グレーで特定した領域内にある区画）がより多くの陽性患者において共通性があり重要な組み合わせである。一方、最淡グレー領域外にある濃グレー区画及び中濃グレー区画は、より個体特異的であるが重要な組み合わせである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のエピトープペプチドは、特定される配列番号で表されるアミノ酸配列を少なくとも部分配列として含んでいる限り、そのアミノ酸残基数は特に限定されない。典型的には、特定されるアミノ酸配列からなる。なお、本発明のエピトープペプチドは、公知の手法によりアミノ酸置換、欠失あるいは付加などの修飾が加えられていてもよい。治療用途に適した溶解性や抗原抗体反応性を付与することも可能である。
　本発明のエピトープペプチドは公知のペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置、酵母、大腸菌、哺乳動物細胞等による遺伝子組換えを用いた方法により製造することができる。
　本発明のエピトープペプチド、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態であってもよい。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる
　本発明のエピトープペプチドを牛乳アレルギーの診断に用いる場合、各種のイムノアッセイの形態を採ることができる。例えば、標識免疫測定試薬で行われているように標識物質を利用して発色、発光、蛍光として上記抗原抗体反応を検出する方法、免疫学的凝集試薬で行われているように不溶性担体の凝集として目視や濁度により上記抗原抗体反応を検出する方法などのイムノアッセイが採用できる他、適当な固相担体に固定して用いることもできる。固相担体及び固定化方法としては既に説明したものを同様に用いることができる。好ましくはペプチドアレイの形態である。
　本発明のエピトープペプチドは牛乳アレルギー陽性個体（ヒトなど）に投与したとき、その個体の牛乳由来のアレルゲンに対するアレルギー応答を調節することができるので、減感作療法等のペプチド免疫療法に有用である。特に本発明のエピトープセットを用いることができる。
　本発明のエピトープペプチドを、牛乳アレルギー陽性個体に対する減感作療法等のペプチド免疫療法に使用する場合は、製薬上許容しうる適当な希釈剤、担体と組み合わせて使用することができる。牛乳アレルギー陽性個体としては、上記した各種アレルゲンタンパク質をと免疫学的に交差反応性を示す牛乳アレルギー陽性個体を含んでいる。
　投与方法には、注射（皮下、静脈注射等）、点眼、点鼻、経口、吸入、経皮などの簡便な方法を用いることができ、投与量としては、個体の年齢、体重、感作程度により、適宜決定されるが、注射による場合は、当該ペプチドを1投与量単位当たり、好ましくは約１μg～５０mg程度を投与することができる。経口投与の場合にはそのままあるいは必要に応じＤＤＳの手法を用いてペプチドとして吸収されるようにすることが好ましい。
　以下、本発明を具体例を挙げて説明するが、以下の実施例は、本発明を説明するものであって本発明を限定するものではない。
　本実施例では、主要な６つのミルクアレルゲンタンパク質（αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン）の全アミノ酸配列を網羅した１６-残基、３-オフセット（オーバーラップ１３残基）からなるペプチドアレイを用いて、牛乳アレルギー患者の血清中のＩｇＥの分析を行った。牛乳アレルギー陰性検体群（２２検体）と比較し、牛乳アレルギー陽性検体群（６１検体）、超過敏症検体群（９検体）、牛乳アレルギー弱陽性群（３０検体）で有意にＩｇＥの結合が認められるペプチド（ＩｇＥ結合エピトープ領域）を特定した。実際のアレルギー症状の発現には患者血清中の２つのエピトープに対するＩｇＥの組み合わせが必要であるため、牛乳アレルギー陽性検体群（６１検体）に関しては牛乳アレルギーの誘発に関与する２つのペプチドの組み合わせを解析した。
　各群を構成する個体の要件は以下の通りとした。
１．牛乳アレルギー陽性検体（６１検体）
　過去に以下に定義される“牛乳アレルギー症状”が確認されていること
（１）牛乳負荷試験で、３０ｍｌ以下の牛乳摂取で即時型反応陽性
（２）３０ｍｌ以下の牛乳又はそれに相当する乳製品（育児用ミルクでは、６０ｍｌに該当）摂取で即時型反応
（３）牛乳を含む加工品で即時型反応あり、そこに含まれる他の成分のアレルギーが否定されている
（４）いずれの場合も、摂取から２時間以内に症状が確認されていること
２．牛乳「超」過敏症検体（９検体）
（１）乳幼児期から牛乳アレルギーの既往（誘発症状）があって牛乳アレルギーの診断が確定している
（２）年齢が５歳を超えてから、牛乳の摂取・接触又は吸入によって即時型のアレルギー症状の経験がある。現在の年齢は問わない
（３）症状は、体の広範囲に及ぶ皮膚症状（紅斑・膨疹・浮腫）、呼吸器症状（咳、喘鳴、呼吸困難）、消化器症状（腹痛、嘔吐）、循環器症状の一つ以上を含む（湿疹の悪化、口腔粘膜症状のみ、接触部位に限定した蕁麻疹、下痢のみ、は除く）
（４）摂取から２時間以内に症状が出現している
（５）症状を誘発した牛乳含有食品が、以下のいずれかに該当する（負荷試験か誤食かは問わない）
　１０ｍｌ以下の牛乳又はそれに相当する乳製品、牛乳をわずかに含む加工品（ただし、同時に含まれる他の成分（卵や小麦など）のアレルギーが否定されていること）、乳成分のコンタミネーションや牛乳との接触・乳製品を加熱した水蒸気の吸入、乳成分を含有することがわかっている医薬品（ラックＢ、エンテロノン、メイアクト）
（６）牛乳特異的ＩｇＥ抗体陽性（クラス１以上）
（７）乳幼児期から現在まで、牛乳完全除去を継続している。ただし、乳糖と治療用加水分解乳（ミルフィー、ＭＡ－１、ＭＡ－ｍｉ、ペプディエット）は摂取可能であってもよい
３．牛乳アレルギー弱陽性群（３０検体）
（１）牛乳アレルギー陽性検体」の定義を満たす
（２）牛乳ＩｇＥ（ＣＡＰ－ＲＡＳＴ）クラス３以下
（１）ペプチドアレイの作製
　ペプチドアレイは、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインの６種のアレルゲンタンパク質につき、それぞれ、配列番号１～５１、配列番号５２～９１、配列番号９２～１５４、配列番号１５５～２２０、配列番号２２１～２８７、配列番号２８８～３４０に記載のオーバーラップペプチドを化学合成し、ペプチドアレイを作製した。ペプチドへのアレイへの固定化は以下の通りとした。なお、固相担体としては、ガラス基板を用いた。その後、イムノアッセイ（検体の供給及び蛍光検出）を行い、検出した蛍光強度を数値化した。なお、蛍光スキャナーは、Agilent社製scanner model G2505B, software G2565BA/DAを用い、数値解析ソフトとしては、Axon社製Gene Pix.Proを用いた。
（２）ペプチドの固定化
ａ）８０℃で１時間加熱処理をした
ｂ）（２×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ）溶液に１５分間浸漬した（室温）
ｃ）（２×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ）溶液に５分間浸漬した（９５℃）
ｄ）滅菌水中で１０回程度振とうした（３回）
ｅ）遠心乾燥する
（３）イムノアッセイ
ａ）（５０ｍＭＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，０．１％ ＳＤＳ，０．１ＭＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）溶液に９０分間浸漬した（室温）
ｂ）ＰＢＳ－Ｔ（１×ＰＢＳ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に５分間浸漬した（室温、３回）
ｃ）（１％ ＯＶＡ，ＰＢＳ－Ｔ）溶液で希釈した患者血清（１：１０）２００μＬアプライした担体をマイクロカバーガラス（松浪ガラス社製ｓｉｚｅ２４×６０ｍｍ、ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ Ｎｏ．４）で覆い、Ｈｕｍｉｄ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｓｉｇｍａ社）内で１時間静置した（３７℃）
ｄ）ｃ）で反応中の担体を４℃の環境下に移し、一晩静置した
ｅ）ＰＢＳ－Ｔ溶液中でマイクロカバーガラスを外した。
ｆ）ＰＢＳ－Ｔ溶液に５分間浸漬した（室温、３回）
ｇ）（１％ＯＶＡ、ＰＢＳ－Ｔ）溶液で希釈したＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＥ－Ａｌｅｘａ６４７ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１：５００）２００μＬをｃ）と同様の手順で反応させ、暗所にて３時間静置した（室温）
ｈ）ＰＢＳ－Ｔ溶液中でマイクロカバーガラスを外す
ｉ）ＰＢＳ－Ｔ溶液に５分間浸漬した（室温、３回）
ｊ）滅菌水中で１０回程度振とうした（３回）
（４）エピトープ解析
（ａ）第１のエピトープ又はその候補の決定
　得られた蛍光強度情報を用いて、牛乳アレルギー陰性検体群と比較し、牛乳アレルギー陽性検体群（６１検体）、超過敏症検体群（９検体）、牛乳アレルギー弱陽性群（３０検体）で有意にＩｇＥの結合が認められるエピトープ領域を下記の手順（図１参照）で特定した。
　まず、最初に、シングルピーク（一つのオーバーラップペプチド）で患者群の平均蛍光強度値が陰性群より高く、ｔ検定を両側検定で行うことより患者群と陰性群でｐ＜０．０５を満すペプチドを抽出した（ａ群）。次に、５配列ピーク（一つのオーバーラップペプチドを含む前後２個づつのオーバーラップペプチドからなる５連続のオーバーラップペプチド）の患者群の平均蛍光強度値が陰性群より高く、ｔ検定を両側検定で行うことより患者群と陰性群でｐ＜０．０５を満たすペプチドを抽出した（ｂ群）。ａ群でありかつｂ群であるオーバーラップペプチドを抽出した。これらのオーバーラップペプチドは、第１のエピトープ又はその候補に相当する。
（ｂ）牛乳アレルギー陽性検体群（６１検体）に関して、第２のエピトープ又はその候補の決定及び牛乳アレルギー反応の誘発に関与する２つのエピトープの組み合わせの決定
　スキームを図２に示す。まず、陽性検体群の各検体につき、（ａ）で決定した第１のエピトープ又はその候補であって、５連続であっても、単独であっても双方において患者群に対して有意性を持つオーバーラップペプチドを抽出し、さらに、抽出したオーバーラップペプチド以外であって、陰性群（２２検体）の平均蛍光強度値にその２ＳＤを加えた値以上の強度を示すオーバーラップペプチド（第２のエピトープ又はその候補）を抽出した。陽性検体群の全ての検体についてこの作業を繰り返して、特定の第１のエピトープ又はその候補に対する第２のエピトープ又はその候補となるオーバーラップを有する検体数をオーバーラップペプチド毎に集計した。そして、該当検体数の９０パーセンタイル以上で認められた２つのペプチドの組み合わせを抽出した。
　また、第１のエピトープの上記決定方法に準じて検体個別の蛍光強度値に基づき、牛乳アレルギー陽性検体群に含まれる検体毎にも行って検体個別の第１のエピトープを決定し、当該第１のエピトープに対して組合わせられる第２のエピトープを、上記と同様、陰性群の平均蛍光強度値の２ＳＤを加えて値以上の強度を有するオーバーラップペプチドとしてエピトープのセットを決定し、これをカウントした。
（結果）
（１）上記（ａ）の結果
　主要な６つのミルクアレルゲン蛋白（β－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ、α－ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，αｓ１－ｃａｓｅｉｎ，αｓ２－ｃａｓｅｉｎ，β－ｃａｓｅｉｎ，κ－ｃａｓｅｉｎ）の全アミノ酸配列を網羅した１６－ｍｅｒ、３－ｏｆｆｓｅｔからなるオーバーラップペプチドに対し、患者群と陰性群で平均蛍光強度値の比較、ｔ検定の両側検定、患者群で有意にＩｇＥの結合が認められたペプチドの抽出をした結果を図３～図２０に示す。
　図３～図２０に示すように、患者群は牛乳アレルギー陽性検体群（６１検体）、超過敏症検体群（９検体）、牛乳アレルギー弱陽性群（３０検体）を牛乳アレルギー陰性検体群（２２検体）と比較した。シングルピーク、５配列のピーク、シングルピークかつ５配列のピークで有意差のあるペプチドは牛乳アレルギーの誘発に関与するＩｇＥ認識部位として非常に重要な配列候補である。タンパク別で比較すると、牛乳の主要アレルゲンとして特に重要なαｓ１－ｃａｓｅｉｎに関してはＩｇＥ結合領域がタンパク全体に最も広域に分布するのに対し、α－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎではほとんどＩｇＥ結合領域が認められなかった。なお、アレルギー陽性検体群につき検出した第１のエピトープ又はその候補であるオーバーラップペプチドは、表１に示す通りであった。
（２）上記（ｂ）の結果
　実際のアレルギー症状の発現には患者血清中の２つのエピトープに対するＩｇＥの組み合わせが必要であるため、次に牛乳アレルギー陽性検体中（６１例）で認識される２つのＩｇＥ結合ペプチドの組み合わせを解析した。２つのＩｇＥ結合ペプチドの組み合わせをもつ陽性患者数をカウントした結果を図２１～図２６に示す。なお、図２１～図２６では、縦軸と横軸に示したそれぞれ、２つのペプチドを認識するＩｇＥの組み合わせをもつ牛乳アレルギー陽性検体の数を交差するマス目に表示した。カットオフ値は牛乳アレルギー陰性検体群（２２例）の平均蛍光強度値にその２ＳＤを加えた値である。また、軸は同一タンパクのアミノ酸シークエンスのＮ末からＣ末の順にペプチドＮｏ．を表記した。これらの図においては、アレルギー陽性検体群につき検出した第１のエピトープ又はその候補（表１参照）であるオーバーラップペプチドを、図毎の配列番号を示した項目欄において最淡グレー色で着色して示した。また、これらの図においては、検体群につき決定した第１のエピトープと第２のエピトープとの組合せのほか、検体群に含まれる個別の検体について決定した第１のエピトープと第２のエピトープとの組み合わせについても併せて記載している。
　図２１～図２６に示すように、本解析により、アレルゲンタンパク質毎に、患者群で重要性の高いエピトープの分布及びその組み合わせを判定できることがわかった（これらの図において最も濃い濃グレー区画及びそれよりも薄い中濃グレー区画で示す。）。しかも、二次元的に表示することでこれら容易に視覚的に把握できることもわかった。また、５配列と１配列の両方で有意性を持つ第１のエピトープ又はその候補と、カットオフ値以上のピークをもつ第２のエピトープ又はその候補を有する陽性検体カウント数は、患者ｖｓ非患者での結合に有意差あり（１ｓｅｑ ｗｉｎｄｏｗ，５ｓｅｑ ｗｉｎｄｏｗ）の領域でカウントした結果によく対応していた。以上のことから、該当患者数が９０パーセンタイル以上の組み合わせに関してはより多くの患者で牛乳アレルギーの誘発を説明しうるＩｇＥ認識部位の組み合わせとして特に重要な候補であることがわかった。また、これらの特定のエピトープを選択して診断や治療に用いることができることも容易に理解された。
　濃グレー区画及び中濃グレー区画は、いずれも重要な組み合わせであるが、図中の区画のうち、アレルギー陽性検体群全体において共通性の高い第１のエピトープであると決定されたペプチドの区画（最淡グレー区画）にある区画は、より共通性が高いという点で重要な組み合わせであり、最淡グレー区画外にある区画は、より個体に特異的であるが重要な組み合わせである。例えば、これらを用いてアレイを作成する場合には、より少ないペプチドを固定する必要があるときには、より共通性の高くて重要な組み合わせを用いることが好ましい。表２～表１１にこれらの結果から得られるβ－ラクトグロブリン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインのそれぞれについて好ましいエピトープペプチドのセットを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（３）患者個人レベルでの解析
　最後に患者個人で見た場合、アレルギー反応の誘発に関与すると考えられる２つＩｇＥの組み合わせを示す（図２７）。患者８番の血清中に存在するαｓ１－ｃａｓｅｉｎのペプチドＩＤ（Ｎ→Ｃ末の順：横軸）を認識するＩｇＥ（蛍光強度値：縦軸）の組み合わせを示す。この患者ではαｓ１－ｃａｓｅｉｎ中、５配列と１配列の両方で有意性を持つペプチド（Ｎｏ．５２－５６）と陰性群（２２検体）の平均蛍光強度値にその２ＳＤを加えた値以上のピークもつペプチド（Ｎｏ．２）との組み合わせが、アレルギー症状の誘発に関与している可能性が最も高いことがわかった。
　以上の結果からペプチドアレイを用いて、血清中ＩｇＥが結合する２つのペプチド（エピトープ）の組み合わせを解析することより、牛乳アレルギー症状の誘発を予測することが可能であり、かつこれらを診断及び治療に有用であることがわかった。
 
　本実施例では、１６０人の牛乳アレルギーの疑いの患者につき、実施例１と同様にして作製した、６種のミルクアレルゲンタンパク質の全アミノ酸配列を網羅した１６－残基、３－オフセットからなるペプチドアレイ及びイムノアッセイを用いて、血清中のＩｇＥのエピトープ解析を行った。これらの患者については、既に臨床において牛乳アレルギーに関する診断が確定しているところ（表１２）、その確定診断に基づき、これらの患者からテスト群（合計２０名；牛乳アレルギー陽性１０名、牛乳アレルギー陰性１０名）を無作為に選別するとともに、残りを学習群（合計１４０名；牛乳アレルギー陽性１１７名、牛乳アレルギー陰性２３名）とし、学習群のエピトープ解析から得られた診断に適した複数のエピトープセット（エピトープペア）に対する反応性の有無を診断の基礎として、テスト群及び学習群に適用して、診断確度を評価した。また、こうしたエピトープセットでなく、学習群のエピトープ解析から得られた複数個の単独のエピトープ（シングルエピトープ）に対する反応性の有無を診断の基礎としてテスト群及び学習群に適用して、その診断確度も併せて評価した。なお、陰性患者（健常者）とは、ＣＡＰ－ＲＡＳＴのクラス判定によれば牛乳アレルギーの疑いはあったが、牛乳負荷試験で症状がでず、陰性が確定した患者である。また、患者（陽性患者）とは、牛乳負荷試験を行ったときアレルギー反応が出た負荷陽性検体（図中、負陽と称するときがある。）及び家庭で症状がでたことがある病歴陽性検体（図中、病陽と称するときがある。）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　なお、エピトープ解析は、全てのオーバーラップペプチドにつき、シングルピーク（一つのオーバーラップペプチド）で学習群の平均蛍光強度値が陰性群より高く、ｔ検定を両側検定で行うことより患者群と陰性群でｐ＜０．０１（Ｐ＜０．０５を用いてもよい）を満すオーバーラップペプチドを抽出した（条件１）。また、両側検定（Bonferroni）は、ペプチド配列数を先のｔ－検定に積算し、そのとき、ｐ＜０．０１となったオーバーラップペプチドを抽出した（条件２）。さらに、陽性患者群の平均蛍光強度値／陰性患者の平均蛍光強度値を算出し、２．０以上となったオーバーラップペプチドを抽出した（条件３）。
　また、５配列ピーク（一つのオーバーラップペプチドを含む前後２個づつのオーバーラップペプチドからなる５連続のオーバーラップペプチド）の患者群の平均蛍光強度値が陰性群より高く、ｔ検定を両側検定で行うことより患者群と陰性群でｐ＜０．０１（Ｐ＜０．０５を用いてもよい）を満たすペプチドを抽出した（条件４）。また、両側検定（Bonferroni）は、ペプチド配列数を先のｔ－検定に積算し、そのとき、ｐ＜０．０１（Ｐ＜０．０５を用いてもよい）となったペプチドを抽出した（条件５）。さらに、陽性患者群の平均蛍光強度値／陰性患者の平均蛍光強度値を算出し、２．０以上となったペプチドを抽出した（条件６）。
　エピトープ候補の選択基準は、以下のとおりとした。
（１）５配列ピーク解析において、少なくとも条件４を充足するとき、一つのエピトープペア片方のエピトープの一つとして好ましく、より好ましくは、条件５又は条件６を充足し、さらに好ましくは条件５及び６を充足するオーバーラップペプチドが挙げられる。
（２）５配列ピーク解析における条件を充足するのに加えて、シングルピーク解析において、少なくとも条件１を充足するものがさらに好ましい。一層好ましくは、条件２又は条件３を充足し、さらに好ましくは条件２及び３を充足するオーバーラップペプチドが挙げられる。
（３）上記（１）、（２）に基づいて、エピトープペアの片方の候補が抽出される。
（４）次に、少なくとも、こうして選択されたエピトープペアの片側候補の各オーバーラップペプチドにつき、当該オーバーラップペプチドと、当該オーバーラップペプチド以外のオーバーラップペプチドの双方について、平均蛍光強度値＋２ＳＤ以上の蛍光値を有するとき、その陽性患者をカウントした。こうして学習群の全ての陽性患者につき、可能性あるエピトープペアに反応性がある陽性患者数を取得した。
（５）可能性あるエピトープペアは、２次元のマトリックス上において一つのグリッドあるいはマス目として表示される。このグリッド又はます目にカウントできた陽性患者数を表示し、一定以上のカウントがある場合、あるいは、全陽性患者数の一定割合（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）以上のカウント数があるとき、そのグリッド又はマス目に対応するエピトープペアをより好ましいエピトープペア候補とすることできる。すなわち、可能性あるエピトープペアに関し、学習群の陽性患者数がより高い一定基準を満たすとき、より好ましいエピトープペア候補が選択される。
　こうしたより好ましいエピトープペア候補は、通常、マトリックス上において異なるエピトープのペアを表示する１のグリッドあるいはマス目（領域）又はこれらの２以上の集合（こうしたエピトープペアの集合を、エピトープセットという。）となって見出される。すなわち、例えば、エピトープペアは、一つの領域（一対のエピトープの組み合わせ）からなる場合もあり、２つの領域からなる場合もあり、さらに多くの領域から構成される場合もある。ここの領域に対応するエピトープセットが２×２の範囲内の領域、３×３の範囲内の領域からなる場合もあるなど、各種の態様が挙げられる。
　好ましいエピトープペア候補のなかでも、より好ましいエピトープペア候補を、実際に診断に用いるエピトープペアとする。例えば、以下のような点を基準に選択できる。
（１）ペアを構成する片方のエピトープがより高いレベルで条件４等の５配列ピークの要件を充足しているかどうか
（２）ペアを構成する片方のエピトープが、より高いレベルで条件１等のシングルピークの要件を充足しているかどうか
（３）そのエピトープペアに、より多くの陽性患者（絶対数又は全陽性患者に対する割合）が反応しているかどうか
　以上の選択基準に基づいてエピトープペアを探索したところ、αS1－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインにつき、他のアレルゲンタンパク質より多くのエピトープペアを見出した。
　こうした作業を経て、本実施例では、図２８Ａ及び図２８Ｂに示す１０個のエピトープセットを選択した。αｓ１カゼインにつき３セット、βカゼインにつき５セット及びκカゼインにつき２セットであった。それぞれのペプチド番号の右側には、シングルピーク解析及び５配列ピーク解析の各結果を示す。図２８Ａ中、例えば、αＳ１カゼインのピークセット１は、合計９個のペプチドペアから構成されている。すなわち、ピークナンバーが２３、２４及び２５がそれぞれ第１のエピトープであり、同３７、３８及び３９がそれぞれ第２のエピトープであり、これらの第１のエピトープ及び第２のエピトープの組み合わせは９個である。（合計９ペア）から構成されている。したがって、１０個のエピトープセットは、合計８０個のエピトープペアを含んでいる。これらのエピトープペアはいずれも、牛乳アレルギーであるかどうかの診断に有効なエピトープペアである。なかでも、図２８Ａ及び図２８Ｂにおいて、総合判定において二重丸が付されたエピトープを含むピークセット１～３、ピークセット５、６は判定に好ましく、より好ましくは、総合判定において前記二重丸が付されたエピトープを含むエピトープペアがより好ましいエピトープペアである。
　以上のようにして学習群から得られた１０個のエピトープセット（これらのセットには合計８０個のエピトープペアが含まれている。）の各エピトープペアについて、テスト群（２０検体）及び学習群（１４０検体）の各患者が、反応性を有しているかどうかを調べた。すなわち、これらの群に含まれる全ての患者につき、選択された個々のエピトープペアに関して健常者の平均値＋２ＳＤ以上の蛍光強度値を有しているときに、反応性を肯定し、いずれか一つのエピトープペアにつき反応性が肯定されたとき、牛乳アレルギー陽性と判定することとした。テスト群についての反応性のまとめを図２９に示し、学習群についての反応性のまとめを図３０Ａ～図３０Ｄに示す。また、判定結果を表１３に示す。なお、カバー率は、表中の「ピークセットのカバーする全領域内で一回でも検出されれば１とし、されなければ０とする」の欄の数値に基づいて算出した。
 
　また、学習群の陽性患者において、上記したシングルピーク及び５配列ピークの双方の条件を充足するオーバーラップペプチドを４７個選択した。これらの４７個のオーバーラップペプチドにつき、テスト群（２０検体）及び学習群（１４０検体）の各患者が、反応性を有しているかどうかを調べた。すなわち、これらの群に含まれる全ての患者につき、選択されたエピトープのペプチドに関して健常者の平均値＋２ＳＤ以上の蛍光強度値を有しているときに、反応性を肯定した。シングルピーク解析によって得られたエピトープによる判定結果を表１４に示す。
　さらに、ＣＡＰ－ＲＡＳＴ法による結果を合わせて表１５に示す。なお、学習群の患者において８名がＣＡＰ－ＲＡＳＴ法が未測定であったため、これらの患者を判定から排除した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１３に示すように、ペプチドペアによる判定では、健常者（陰性患者）を陽性として判定してしまう偽陽性率（表中のカバー率（健常者））が、テスト群及び学習群のいずれについても低かった（テスト群：４０．０％、学習群：１７．４％）。また、ＣＡＰ－ＲＡＳＴ法でクラス４以上の健常者を陽性として判定してしまう偽陽性率（表中のカバー率（健常者クラス４以上）は、テスト群では０．０％であり、学習群では５０．０％であった。一方、ペプチドペアを用いたとき牛乳アレルギー陽性患者を陽性となる率（表中カバー率（患者））は、テスト群で６０．０％であり、学習群で７４．４％であった。また、クラス４以上の患者が陽性となる率（表中、カバー率（クラス４以上））はテスト群で１００％であり、学習群で９１．７％であった。
　これに対して、シングルピーク解析によって得られたエピトープによる判定結果を示す表１４に示すように、健常者を誤って陽性として判定しまう偽陽性率（表中のカバー率（健常者））がテスト群で８０％、学習群で８７％であった。また、クラス４以上の健常者を陽性と判定ししまう偽陽性率（表中のカバー率（健常者クラス４以上）は、テスト群では１００．０％であり、学習群では１００．０％であった。
　また、表１５に示すように、ＣＡＰ－ＲＡＳＴ法によると、クラス１以上を陽性と判断したとすると、テスト群及び学習群につき、陰性であるのに陽性との判定がなされるのがそれぞれ１００％、９５．７％であった。
　以上のことから、エピトープペアによる判定は、健常者をアレルギー陽性として判定しまう偽陽性率を低下させることができることがわかった。また、シングルピーク解析によるペアでないエピトープ（シングルエピトープ）による判定は、クラスが低くてもアレルギー患者を陽性として判定できることがわかった。さらに、エピトープペアとシングルエピトープによる判定とを組み合わせると、患者陽性率が高く、偽陽性率の低いアレルギー診断ができるといえる。

Claims (11)

  1. 　アレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法であって、以下の工程；
    （ａ）被験試料として、複数のアレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料群と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
    　可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記１種又は２種以上の抗体とを接触させる工程、
    （ｂ）前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記１種又は２種以上の抗体との特異的結合を検出する工程、
    （ｃ）前記複数のオーバーラップペプチドから選択されるオーバーラップペプチドであって、前記対照試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報と前記被験試料群から得られる前記オーバーラップペプチドの前記特異的結合の強度に関する平均被験強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを、前記アレルゲンにおける第１のエピトープ又はその候補とする工程、及び
    （ｄ）前記被験試料群から選択される被験試料に関し、前記１種又は２種以上の第１のエピトープ又はその候補に相当する前記オーバーラップペプチドの個別の被験強度情報と前記平均対照強度情報とに基づいて、前記オーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とすることができるとき、当該第１のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第２のエピトープ又はその候補とする工程、
    を備える、方法。
  2. 　さらに、以下の工程；
    （ｅ）前記第１のエピトープ候補のそれぞれにつき、前記オーバーラップペプチド毎に当該オーパーラップペプチドを第２のエピトープ又はその候補とする被験試料の個数情報を取得する工程、
    を備える、請求項１に記載の方法。
  3. 　さらに、以下の工程；
    （ｆ）前記第１のエピトープ又はその候補のそれぞれにつき、前記被験試料群中所定割合以上の前記被験試料が特定の前記オーバーラップペプチドを第２のエピトープ又はその候補とするとき、前記第１のエピトープ又はその候補と当該第２のエピトープ又はその候補とを前記アレルゲンにおけるエピトープセット又はその候補とする工程、
    を備える、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記（ｃ）工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドについて得られる平均被験強度情報と、対応する前記オーバーラップペプチドの平均対照強度情報と、に基づいて、前記一つのオーバーラップペプチドの前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とする工程である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記（ｃ）工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドを含んで所定数連続する複数のオーバーラップペプチドについて得られる複合被験強度情報と、対応する複数のオーバーラップペプチド毎の対照強度情報から得られる複合対照強度情報と、に基づいて、前記所定数連続する複数のオーバーラップペプチド全体として前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とする工程である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記（ｃ）工程は、前記被験試料群の一つの前記オーバーラップペプチドについて得られる平均被験強度情報と、対応する前記オーバーラップペプチドの平均対照強度情報と、に基づいて、前記一つのオーバーラップペプチドの前記特異的結合が肯定され、かつ、
    　前記一つのオーバーラップペプチドを含んで所定数連続する複数のオーバーラップペプチドについて得られる複合被験強度情報と、対応する前記複数のオーバーラップペプチド毎の平均対照強度情報から得られる複合対照強度情報と、に基づいて、前記所定数連続する複数のオーバーラップペプチド全体として前記特異的結合が肯定されるとき、前記一つのオーバーラップペプチドを前記第１のエピトープ又はその候補とする工程である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  7. 　アレルゲンのエピトープ又はその候補を検出する方法であって、以下の工程；
    （ａ）アレルギー陽性個体に由来する抗体を含有する被験試料と、複数のアレルギー陰性個体に由来する抗体を含有する対照試料群とのそれぞれにつき、
    　可能性あるアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づく所定長の複数のオーバーラップペプチドが固定化されたアレイに、前記各群の試料をそれぞれ供給し、前記複数のオーバーラップペプチドと前記１種又は２種以上の抗体とを接触させる工程、
    （ｂ）前記複数のオーバーラップペプチドにつき、前記１種又は２種以上の抗体との特異的結合を検出する工程、及び
    （ｃ）前記アレルギー陽性個体につき、
    　前記各オーバーラップペプチドについて得られる個別の被験強度情報と、前記対照試料群の前記各オーバーラップペプチドについて得られる前記特異的結合の強度に関する平均対照強度情報とに基づいて、前記特異的結合が肯定される１種又は２種以上のオーバーラップペプチドを第１のエピトープ又はその候補とし、当該第１のエピトープ又はその候補以外の他の前記オーバーラップペプチドから、前記平均対照強度情報に基づいて得られる臨界値以上あるいは当該臨界値を超える個別被験強度情報を有する１種又は２種以上の前記オーバーラップペプチドを前記アレルゲンにおける第２のエピトープ又はその候補とする工程、
    を備える、方法。
  8. 　アレルギー疾患の検査方法であって、
    　アレルギー反応の発現に関連する２種以上のエピトープをそれぞれ含む２種以上のエピトープペプチドに対して、アレルギー疾患の可能性のある個体に由来する抗体を含有する被験試料を供給し、前記２種類以上のエピトープペプチドと前記抗体と接触させる工程と、
    　前記２種類以上のエピトープペプチドにつき、前記抗体との特異的結合を検出する工程と、
    を備える、方法。
  9. 　前記接触工程は、前記２種類以上のエピトープペプチドを固定化した固相担体を用いる工程である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記２種類以上のエピトープペプチドは、請求項１～７のいずれかに記載の方法によって決定された第１のエピトープペプチドと第２のエピトープペプチドとを含む、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　アレルギー疾患の検査用のペプチドアレイであって、
    　アレルギー反応の発現に関連する２種以上のエピトープをそれぞれ含む２種以上のエピトープペプチドが固相担体に固定化された、アレイ。
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