CN112010947A - 一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方法与应用。本发明的环十六肽包含16个氨基酸残基，分子量为1735.02Da，其氨基酸序列为：LVYPFPGPIPNSLPQN，其中N端亮氨酸的氨基和C端天冬酰胺的羧基以肽键的形式连接形成环状骨架。所述的环十六肽对应的线形肽来源于食用乳酸菌发酵牛奶中的β‑酪蛋白，所述的环十六肽可通过介导环肽合成的酶催化制备得到。本发明的环十六肽具有很强的ACE抑制活性，对ACE的半抑制浓度IC₅₀为52.9μmol/L；具有较好的抗消化稳定性；且对细胞增殖影响小，细胞毒性低，安全性高；可用于降血压功能食品或药品的开发与制备，具有良好的应用前景。

Description

一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方 法与应用

技术领域

本发明属于功能食品及生物医药领域，特别涉及一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方法与应用。

背景技术

高血压是世界上死亡率最高的疾病之一，引起人们的广泛关注。在调节人体血压的众多因素中，血管紧张素转移酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)是影响升压、降压两个系统平衡的主要因素，因此成为治疗高血压、心力衰竭等疾病的理想靶点。对ACE活性进行抑制，可以有效降低人体血压。

人工合成的降血压药物，具有良好的降血压效果，然而其缺点和副作用也不容忽视。如稳定性差，停药后易反弹，引起咳嗽、过敏及血压过低等症状。因此，研发获得具有降压效果更好、稳定性更强的ACE抑制剂，对于高血压疾病的预防和治疗有着迫切的需求。

环肽是指以氨基酸肽键形成的具有环状骨架的多肽类化合物，刚性的环状结构对其内在构象具有一定的约束作用。一般地，环肽的热稳定性、结构稳定性、抗水解能力和生物利用度等比线性多肽更加优越。目前，已发掘很多具有ACE抑制活性的线性多肽化合物，但是，有关ACE活性的环肽则鲜见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的环十六肽。所述的环十六肽可以通过介导环肽合成的酶催化底物十八肽(氨基酸序列为LVYPFPGPIPNSLPQNHV)环化得到，研究发现其对ACE具有很强的抑制活性。所述的环化的形式为，底物十八肽C端的组氨酸-缬氨酸(HV)序列断裂，然后N端和C端首尾以肽键相连即得到环十六肽。

所述的底物十八肽是通过在十六肽(氨基酸序列为LVYPFPGPIPNSLPQN)C端添加组氨酸-缬氨酸(HV)序列得到。所述的十六肽是乳酸菌(Lb.jensenii ATCC 25258)发酵牛奶中β-酪蛋白的11-26片段多肽。

所述的环十六肽是所述的十六肽的环状形式。研究发现所述的环十六肽比所述的十六肽，具有更强的ACE抑制活性和更高的抗消化稳定性。

本发明的另一目的在于提供所述的环十六肽的应用。

本发明的再一目的在于提供一种降血压功能食品、ACE抑制剂或降血压药物。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽，其氨基酸序列为亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺(LVYPFPGPIPNSLPQN，SEQ ID NO.1)，其中N端亮氨酸的氨基和C端天冬酰胺的羧基以肽键的形式连接，使得多肽形成环状。

上述具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、根据介导环肽合成的酶的识别特性，设计并合成所述的环十六肽对应的底物；

S2、将所得底物以及介导环肽合成的酶加入到反应缓冲液中，进行反应，得到反应液；

S3、将所得反应液进行纯化，即获得所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

所述的介导环肽合成的酶优选为蝶豆兰花肽连接酶Butelase 1(Bunga telangplus ligase)，或其具有以下氨基酸突变的突变酶：338位赖氨酸突变为天冬氨酸；358位脯氨酸突变为天冬酰胺；359位谷氨酸突变为天冬氨酸，将1～20位信号肽截短，以及N末端融合有MBP标签。

所述的底物的氨基酸序列为亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸(LVYPFPGPIPNSLPQNHV，SEQ ID NO.2)。

所述的蝶豆兰花肽连接酶Butelase 1可参考文献“Nguyen GKT,Qiu Y,Cao Y,etal.Butelase-mediated cyclization and ligation of peptides and proteins[J].Nature Protocols,2016,11(10):1977-1988.)”记载的方法制备得到。

所述的突变酶可参考申请号为202010010362.4的专利记载的方法制备得到。

步骤S2中所述的反应缓冲液，其组成成分优选为20～50mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或Na₂HPO₄-柠檬酸，50～200mmol/L NaCl，1～5mmol/L EDTA，0.5～1mmol/L DTT。

步骤S2中所述的反应的条件优选为：温度为25～60℃，pH为4.5～7。

步骤S3中所述的纯化优选为通过RP-HPLC实现。

所述的RP-HPLC的条件优选设置为：流动相A为超纯水(含0.1％(v/v)三氟乙酸TFA)，流动相B为乙腈(含0.1％(v/v)TFA)，色谱分离程序为0min到28min内乙腈相比例从20线性上升至90％，进样量为500μL，流速为4mL/min，检测波长为214nm，柱温为30℃，色谱柱为phenomenex Jupiter反相C₁₈色谱柱(250×10mm，5μm，300A)。

一种底物十八肽，其氨基酸序列为亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸(LVYPFPGPIPNSLPQNHV)。所述的底物十八肽可通过本领域常规技术手段制备得到，例如通过固相合成制备。

上述具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽在制备血管紧张素转换酶抑制剂中的应用。

上述具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽在降血压功能食品中的应用。

上述具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽在制备降血压药物中的应用。

一种降血压功能食品，含有所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

一种ACE抑制剂，含有上述具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

一种降血压药物，含有上述具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的环十六肽具有良好的ACE抑制活性，其对ACE的半抑制率IC₅₀为52.9μmol/L。

2.本发明的环十六肽是一种小分子环肽，相比于对应的线性十六肽，具有更强的ACE抑制活性和更高的抗消化稳定性，具有明显的应用潜力。

3.本发明制备环十六肽的方法简单高效，可在6h内达到约为80％的产率。

4.本发明制备的环十六肽与来源于食用乳酸菌发酵牛奶酪蛋白中线性十六肽的氨基酸残基组成完全相同，安全性高。

附图说明

图1是固相合成底物十八肽的RP-HPLC图。

图2是固相合成底物十八肽的质谱图。

图3是酶催化底物十八肽环化的RP-HPLC图。

图4是酶催化底物十八肽环化所得产物的MALDI-TOF质谱图，右上方为环十六肽的氨基酸残基组成结构示意图。

图5是不同浓度环十六肽对ACE的抑制率结果分析图。

图6是不同浓度线性十六肽对ACE的抑制率结果分析图。

图7是环十六肽对人脐静脉内皮细胞增殖的影响结果分析图；其中，**与##分别表示培养24小时和48小时后，样品组与对照组相比差异极显著(p<0.01)。

图8是环十六肽和线性十六肽在人工胃液中的稳定性研究实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

采用Fmoc固相合成法人工合成制备底物十八肽。根据底物十八肽的氨基酸残基组成(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，以氨基端具有芴甲氧羰酰基(Fmoc-)保护基团的各种氨基酸(Fmoc-Leu、Fmoc-Val、Fmoc-Tyr、Fmoc-Pro、Fmoc-His等)为原料，将Fmoc-Val的羧基以共价键与高分子树脂(Wang树脂)相连；加入含20％(v/v)的哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)，反应0.5h脱去氨基保护基Fmoc-；加入过量的Fmoc-His，以羟基苯并三唑(HOBT)为缩合剂，在30℃下反应2h，使得Fmoc-His的羧基与树脂上Phe的活性氨基缩合；重复脱保护基和缩合反应，依次连接余下的其它氨基酸后，将十八肽从树脂上裂解，经C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得该底物十八肽。通过RP-HPLC图(图1)分析可知，该法合成的本发明所述底物十八肽，纯度为99.1％。液相色谱-质谱图(图2)证明成功合成了该多肽，序列为LVYPFPGPIPNSLPQNHV。

实施例2

蝶豆兰花肽连接酶Butelase 1的突变酶，即专利(申请号：202010010362.4)中所述的重组多肽连接酶原激活产物，参考该专利进行制备。蝶豆兰花肽连接酶Butelase 1，参考文献(Nguyen GKT,Qiu Y,Cao Y,et al.Butelase-mediated cyclization andligation of peptides and proteins[J].Nature Protocols,2016,11(10):1977-1988.)进行制备。

实施例3

环十六肽的制备。配制反应缓冲液(20mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、50mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.5mmol/L DTT，pH 6.0)，加入100μg/mL蝶豆兰花肽连接酶Butelase 1或其突变酶和100μmol/L底物十八肽，37℃温育6h后。将反应液装于200Da的透析袋中，4℃下在超纯水中透析16h。液氮速冻，真空冷冻干燥48h后。用500μL水复溶，复溶液用0.22μm微滤膜过滤，采用RP-HPLC进行分离纯化。RP-HPLC结果如图3所示，底物十八肽在经过酶催化环化后，所得产物的出峰时间为13.9min，通过液相的峰面积计算，在反应6h后反应产率约为80％。为了鉴定产物的身份，接取产物峰液相的流出液，取1μL点板上样通过MALDI-TOF进行分析鉴定，结果如图4所示，产物的分子量为1735.31Da，与环化产物理论分子量1735.02Da吻合，所以确定该产物是环十六肽。收集产物峰的液相流出液，液氮速冻，真空冷冻干燥，即得到所述的环十六肽，氨基酸残基组成结构示意图如图4右上方所示。

RP-HPLC检测条件：流动相A为超纯水(含0.1％(v/v)三氟乙酸TFA)，流动相B为乙腈(含0.1％(v/v)TFA)，色谱分离程序为0min到28min内乙腈相比例从20线性上升至90％，进样量为500μL，流速为4mL/min，检测波长为214nm，柱温为30℃，色谱柱为phenomenexJupiter反相C₁₈色谱柱(250×10mm，5μm，300A)。

实施例4

用0.1mol/L硼酸盐缓冲液(含300mmol/L NaCl，pH 8.3)将本发明所述的环十六肽和线性十六肽(参考实施例1的Fmoc固相合成法人工合成制备得到，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，分别配制成为10～100μmol/L浓度溶液。分别取50μL不同浓度多肽溶液和25μL1.55mmol/L HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)溶液(溶剂为硼酸盐缓冲液)进行混合，置于37℃下温育5min，随后往混合液中加入5μL 0.1U/mL的ACE溶液(溶剂为硼酸盐缓冲液)混合均匀，37℃保温反应1h后加入40μL 1.0mol/L的HCl终止反应。另外，空白对照组和阳性对照组中用50μL的硼酸盐缓冲液代替待测样品溶液，且空白对照组中不加入ACE溶液。反应液经0.22μm滤膜过滤后用RP-HPLC法检测马尿酸的峰面积，并与标准曲线对比，计算出产物马尿酸的量。

RP-HPLC检测条件：Agilent C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，B为甲醇(含0.1％(v/v)TFA)，流动相A和B的比例为40％比60％，进样量为20μL，流速为0.6mL/min，检测波长为228nm，柱温为25℃。

半抑制浓度(IC₅₀)是当ACE抑制率达到50％时所需样品的浓度。分别配制不同浓度的样品溶液，测定ACE活性抑制率。在线性关系范围内，以ACE抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标绘制曲线，并对曲线进行线性拟合，通过回归方程计算出多肽的IC₅₀值。

从图5和图6可知，本发明所述的环十六肽和线性十六肽在不同浓度下均对ACE具有抑制作用，经计算可知半抑制浓度IC₅₀分别为52.9μmol/L和80.4μmol/L。本发明环十六肽相比于其对应的线性十六肽，具有更强的ACE抑制活性，可用于降血压功能食品及药物开发。

实施例5

取原代人脐静脉内皮细胞(购买于All cells公司，产品编号H-001F-C)，加入5mL内皮细胞完全培养液(含10％胎牛血清、生长因子、双抗，购自All cells公司，产品编号：H-004)，以1.0×10⁵cells/mL密度接入0.25％明胶包被后的T25细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养，每2天换一次培养液，每4天传代一次。取3～5代细胞，培养至对数期后，用0.25％胰酶消化，以1.0×10⁵cells/mL密度加入96孔板，每孔100μL，每组6个复孔，边缘孔及未用孔以等量灭菌PBS填充。待培养至细胞长满孔底80％以上时，吸弃原培养液换以100μL无血清培养液培养12h，使细胞处于同一周期。之后各孔加入100μL不同浓度的环十六肽，对照组加入100μL无血清培养液继续培养，以100μL常见的ACE抑制药物卡托普利(浓度10μmol/L)为阳性对照。于24h和48h时，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，培养4h，吸弃孔中液体，加入150μL DMSO轻微震荡10min，用酶标仪测定570nm处吸光值。以无细胞培养液，加入等量MTT，4h后吸弃培养液，加入150μL DMSO作为调零孔。

细胞存活率(％)＝实验组吸光值/对照组吸光值

从图7可知，环十六肽加入人脐静脉内皮细胞培养24h后低剂量组(100μg/mL)的细胞存活率与对照组无显著性差异。高剂量组(300μg/mL)细胞存活率为对照组的92.2±3.2％。培养48h后，环十六肽低剂量组与高剂量组和对照组无显著差异。而阳性对照卡托普利当浓度为10μmol/L时，细胞培养24h和48h的存活率有极显著降低。可见与常用药物卡托普利相比，环十六肽对人脐静脉内皮细胞增殖的影响较小，安全性更高。

实施例6

对环十六肽和线性十六肽进行抗消化实验，模拟体内胃液环境，测定多肽对胃液环境的抗性。配制人工胃液：稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，室温贮存备用。取100μL含1.0mg/mL环十六肽或线性十六肽的多肽原液，加入900μL人工胃液，置于37℃水浴中，分别于0、0.5、1、1.5和2h取40μL多肽液，加入0.5mol/L NaOH中和至pH 7.0。采用RP-HPLC测定各样品的环十六肽或线性十六肽的含量，按照式(1)计算多肽含量保存率，考察在人工胃液环境中环十六肽或十六肽损失率随时间的变化。

多肽含量保存率(％)＝处理后多肽含量/未处理多肽含量式(1)

RP-HPLC检测条件：流动相A为超纯水(含0.1％(v/v)TFA)，流动相B为乙腈(含0.1％(v/v)TFA)，色谱分离程序为0min到20min内乙腈相比例从20％线性上升至70％，进样量为20μL，流速为0.8mL/min，检测波长为214nm，柱温为25℃，色谱柱为Waters反相C18色谱柱(XBridgeTM BEH130 5μm)。

从图8可知，在人工胃液中，环十六肽具有良好的抗胃蛋白酶消化性，反应2h后，多肽含量保存率为91.3％。但是线性十六肽极易被胃蛋白酶水解，反应2h后，多肽含量保存率仅为4.1％。所以可以看出，环十六肽相比于其对应的线性十六肽，具有更高的抗消化稳定性，具有明显的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中新国际联合研究院

<120> 一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn

1 5 10 15

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn

1 5 10 15

His Val

Claims (10)

1.一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽，其特征在于：氨基酸序列为亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺，其中N端亮氨酸的氨基和C端天冬酰胺的羧基以肽键的形式连接，使得多肽形成环状。

2.权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、根据介导环肽合成的酶的识别特性，设计并合成所述的环十六肽对应的底物；

S2、将所得底物以及介导环肽合成的酶加入到反应缓冲液中，进行反应，得到反应液；

S3、对所得反应液进行纯化，即获得所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

3.根据权利要求2所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽的制备方法，其特征在于：

所述的介导环肽合成的酶为蝶豆兰花肽连接酶Butelase 1，或其具有以下氨基酸突变的突变酶：338位赖氨酸突变为天冬氨酸；358位脯氨酸突变为天冬酰胺；359位谷氨酸突变为天冬氨酸，将1～20位信号肽截短，以及N末端融合有MBP标签；

所述的底物的氨基酸序列为亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸。

4.根据权利要求2所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽的制备方法，其特征在于：

步骤S2中所述的反应缓冲液，其组成成分为20～50mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或Na₂HPO₄-柠檬酸，50～200mmol/L NaCl，1～5mmol/L EDTA，0.5～1mmol/L DTT；

步骤S2中所述的反应的条件为：温度为25～60℃，pH为4.5～7。

5.权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽在降血压功能食品中的应用。

6.权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽在制备血管紧张素转换酶抑制剂中的应用。

7.权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽在制备降血压药物中的应用。

8.一种降血压功能食品，其特征在于：

含有权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

9.一种ACE抑制剂，其特征在于：

含有权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

10.一种降血压药物，其特征在于：

含有权利要求1所述的具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽。

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