WO2010110454A1 - アレルギー疾患の診断方法 - Google Patents

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WO2010110454A1
WO2010110454A1 PCT/JP2010/055456 JP2010055456W WO2010110454A1 WO 2010110454 A1 WO2010110454 A1 WO 2010110454A1 JP 2010055456 W JP2010055456 W JP 2010055456W WO 2010110454 A1 WO2010110454 A1 WO 2010110454A1
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WO
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ige
epitope
igg4
intensity information
peptides
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PCT/JP2010/055456
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English (en)
French (fr)
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裕之 本多
美奈 大河内
竜司 加藤
直樹 松本
勤 川部
充代子 松島
安子 吉田
智和 高瀬
茂樹 吉良
Original Assignee
国立大学法人名古屋大学
日本碍子株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing an allergic disease by analyzing a binding pattern to an epitope peptide obtained from an IgE and IgG4 allergen protein or a part thereof.
  • Patent Document 1 there is a method (Patent Document 1) for measuring the amount and ratio of antibodies such as IgA, IgG and IgE specific to allergens in the blood of a patient.
  • an array of IgG and IgE peptide fragments of the antigen protein can be prepared, and using this peptide array, the IgE epitope and IgG epitope to which IgE and IgG can specifically bind can be identified.
  • Non-Patent Document 1 antigen epitope-specific IgE and IgG4 are measured using a peptide scan array of peanut antigen protein (Ara h2) using a peptide array.
  • Non-Patent Document 1 discloses the reaction intensity (IgE / IgG4) for a specific epitope for sensitive individuals and resistant individuals, but only discloses epitopes specific to sensitive individuals. Furthermore, Non-Patent Document 2 only discloses that it has become clear that there are many specific IgE epitopes in patients with severe symptoms.
  • the symptoms of various allergic diseases change due to changes in the immune system, such as changes in age, season, physical condition, disease, and the like. It is effective for effective treatment to detect the change in reactivity to allergen protein accompanying such a change with time, etc. with high sensitivity, and to prevent allergic diseases, predict the onset, prognosis and predict resistance.
  • no effective method for such diagnosis is currently provided.
  • a method for detecting a difference in reactivity to allergen protein between individuals with high sensitivity has not yet been provided.
  • the present inventors obtain an epitope peptide for an allergen protein, immobilize it on a solid phase carrier, obtain the amount of IgE and IgG4 in a specimen that binds to the epitope peptide as a signal, and obtain these from IgE versus IgG4.
  • a signal scatter plot it was found that the reactivity change of the antigen-antibody reaction can be detected with high sensitivity, and the present invention was completed. According to the disclosure of the present specification, the following means are provided.
  • a method for diagnosing allergic diseases A test sample containing an antibody derived from an individual having a possibility of allergic disease on a solid phase carrier on which a plurality of epitope peptides obtained based on one or two or more types of allergen proteins or a part of the amino acid sequences thereof are immobilized Providing and contacting the epitope peptide with the antibody; Detecting specific binding between the epitope peptide and the antibody; Obtaining, for each epitope peptide, first intensity information based on binding to IgE and second intensity information based on specific binding to IgG4; Detecting the reactivity of the test sample to the one or more allergen proteins using the first intensity information and the second intensity information; Diagnosing a situation related to the allergic disease of the individual based on the reactivity of the detected test sample to the one or more allergen proteins; A method comprising: (2) The detection step includes the one or more types of the test sample based on the number of the epitope peptides in which the first intensity information and
  • the method according to (1) wherein the method is a step of detecting reactivity to allergen protein.
  • the detection step is a step of using a ratio between the first intensity information and the second intensity information.
  • the detection step detects a difference or change in reactivity of the test sample with respect to the one or two or more allergen proteins based on the number of the epitope peptides whose ratio satisfies a predetermined numerical index.
  • the method according to (3) which is a step.
  • the method according to any one of (1) to (5), wherein the solid phase carrier on which the plurality of epitope peptides obtained respectively for two or more types of the allergen proteins are immobilized is prepared.
  • the allergic disease is an allergic disease against milk.
  • the allergen protein is one or more selected from the group consisting of ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -lactoglobulin; The method described.
  • the method according to (8), wherein the allergen protein includes one or more selected from the group consisting of ⁇ s1 -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein.
  • the method according to (9), wherein the allergen protein comprises ⁇ s1 -casein comprises ⁇ s1 -casein .
  • the plurality of epitope peptides includes a plurality of peptides each having two or more amino acid sequences selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 340, according to any one of (7) to (10) The method described.
  • An apparatus for diagnosing allergic diseases to milk An apparatus comprising a solid phase carrier on which a plurality of peptides each having two or more amino acid sequences selected from amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 340 are immobilized.
  • FIG. 6 is a diagram ((a) to (c)) showing distribution diagrams of respective groups in Example 1. The broken line shows the 95th percentile fluorescence intensity value as a cut-off value based on the data of all peptides obtained from the control serum (3 samples).
  • FIG. 7 is a diagram ((a) to (c)) showing distribution maps using epitope peptides that have significant IgE binding in a milk allergic disease positive group.
  • the broken line shows the 95th percentile fluorescence intensity value as a cut-off value based on the data of all peptides obtained from the control serum (3 samples).
  • FIG. 10 is a diagram ((a) to (c)) showing distribution diagrams of each group in Example 2. Based on the data of all peptides obtained from control sera (3 samples), the fluorescence intensity value of the 95th percentile is shown as a cut-off value by a broken line (thin).
  • the ratio of the peptides distributed in the regions (region A and region B) surrounded by the broken line after providing the identification line to the total peptides is shown in each region.
  • category result between groups by the identification line (Signal intensity of IgG4 / Signal intensity of IgE (ratio) 2) in each test sample (serum).
  • FIG. 4 is a diagram ((a) to (d)) showing distribution maps of epitope peptides in regions A and B until a milk allergy individual acquires resistance. It is a table
  • FIG. 13A shows the extraction result of an IgE high expression epitope for a patient (patient number 19), and FIG. 13B shows the extraction result of an IgG4 high expression epitope of the patient.
  • FIG. 14 (a) shows the distribution of data by symptom (the patient with positive load on the left side, the patient with negative on the right side, the same applies hereinafter) for the CAP-RAST patient group
  • FIG. 14 (b) shows the IgE of the patient group.
  • the distribution according to the symptom of the number of highly expressed epitope peptides is shown
  • FIG. 14 (c) shows the distribution according to the symptom of the number of IgG4 highly expressed epitope peptides in the patient group.
  • FIG. 15 (a) shows a plot of the number of high IgE expression epitopes and the number of high IgG4 expression epitopes in the patient group
  • FIG. 15 (a) shows a plot of the number of high IgE expression epitopes and the number of high IgG4 expression epitopes in the patient group
  • FIG. 15 (b) shows a partially enlarged view of the plot of FIG. 15 (a)
  • FIG. c) shows a plot of IgG4 / IgE by symptom (left side positive patient, right side negative patient).
  • Open triangles are spots of positive patients before correction
  • filled triangles are spots of positive patients after correction.
  • Open circles are spots of negative patients before correction, and filled circles are spots of negative patients after correction.
  • FIG. 17 (a) shows a plot of IgG4 / IgE by symptom before the introduction of correction based on the concept of neutralizing antibodies (left side is a positive patient and right side is a negative patient), and FIG. Shows a plot of IgG4 / IgE by symptom after introduction of. It is a figure which shows the fluorescence intensity value when the process time of the contact process with stirring with a test sample is varied from 10 minutes to 60 minutes (a) to (c). It is a figure which shows a fluorescence intensity value when the process time of the detection process stirring with a secondary antibody is 15 minutes (a) and 30 minutes (b). It is a figure which shows the fluorescence intensity value when the process time of the detection process stirring with a secondary antibody is implemented for 1 hour (a) and 3 hours (b).
  • the disclosure of the present specification relates to a method for diagnosing allergic diseases and a method for detecting a difference or change in reactivity to allergen proteins.
  • first intensity information based on specific binding to IgE and second intensity information based on specific binding to IgG4.
  • second intensity information based on specific binding to IgG4.
  • changes or differences in the reactivity of IgE and IgG4 to the allergen protein can be detected with high sensitivity.
  • the antibody binding target is an epitope peptide, so that differences in reactivity and changes are emphasized.
  • the ratio between the first intensity information and the second intensity information it becomes possible to detect a change or difference in reactivity to the allergen protein with higher accuracy. As a result, allergic diseases can be diagnosed with high accuracy.
  • the first intensity information and the second intensity information as a distribution map (scatter plot)
  • a distribution map scatter plot
  • an epitope peptide (epitope) suitable for detecting or diagnosing a difference or change in reactivity to allergen protein can be determined.
  • the allergic disease to which the diagnostic method of the present invention is applied is not particularly limited as long as it is an allergic disease in which an allergen protein is specified.
  • allergic diseases for milk, allergic diseases for various pollens, allergic diseases for eggs, allergic diseases for mite antigens, asthma, etc. Useful. This is because the method disclosed in the present specification can easily detect not only the presence or absence of reactivity to allergen proteins but also the change or difference in reactivity.
  • Antigen-antibody reaction process In the method for diagnosing allergic disease disclosed in the present specification, a test sample containing an antibody derived from an individual with a possibility of allergic disease is supplied to a solid phase carrier on which a predetermined epitope peptide is immobilized. An antigen-antibody reaction is performed. A step of bringing the epitope peptide into contact with the antibody.
  • the test sample contains an antibody derived from an individual who may have an allergic disease.
  • the test sample only needs to contain at least IgE and IgG4, but may contain other immunoglobulins.
  • Such a test sample is not particularly limited.
  • blood or serum collected from an individual who may have an allergic disease is used.
  • An individual who may have an allergic disease may have an allergic disease.
  • the individual may be a human or a non-human animal.
  • the allergen protein is not limited as long as it is considered to be related to the allergic disease, and may be one type or two or more types. Acquiring reactivity to multiple types of allergen proteins may improve sensitivity, and acquiring reactivity to a single allergen protein may ensure sufficient sensitivity. In order to confirm at least the detection performance in the detection method disclosed in the present specification, antibody intensity information is acquired for two or more types of allergen proteins, and then specific allergen proteins are selected and used. It is preferable.
  • allergen proteins used for diagnosis of allergic diseases for milk there are six major milk allergen proteins, ⁇ -lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, ⁇ - The 1 type (s) or 2 or more types selected from casein are mentioned.
  • the allergen protein is one or more selected from the group consisting of ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein and ⁇ -lactoglobulin. These allergen proteins have been found to be more preferable for detecting differences in reactivity and changes according to the study by the present inventors.
  • ⁇ s1 -casein More preferred is one or more selected from the group consisting of ⁇ s1 -casein, ⁇ -casein and ⁇ -casein, and more preferred is ⁇ s1 -casein . This is because the distribution state of ⁇ s1 -casein differs most significantly among allergy positive individuals, tolerance acquired individuals, and sensitized individuals when intensity information is acquired as a distribution map.
  • the epitope peptide is not particularly limited as long as it contains an amino acid sequence of a site considered to be an epitope related to an allergic disease with respect to a potential allergen protein or consists of an amino acid sequence of the site. Based on the amino acid sequence of a potential allergen protein or part thereof, it is necessary to have an appropriate length (for example, about 12 to 20 residues) and an overlap of about 8 to 17 residues with respect to the amino acid sequence. It is preferably selected from a population of several overlapping peptides. More preferably, the necessary number of overlapping peptides are provided over the amino acid sequence covering the primary structure of the allergen protein.
  • the number of overlapping peptides prepared for one allergen protein varies depending on the size of the primary structure to be covered, the length of the overlapping peptide, and the number of overlapping residues.
  • overlapping peptides can be prepared for one or more allergen proteins selected from these plurality of allergen proteins. From the comparison of the test sample (serum etc.) of the allergy positive individual group (sustained sensitivity to a specific antigen) against the prepared overlap peptide and the test sample (serum etc.) of the allergy negative individual group, The determined overlapping peptide that can be characterized is selected as the epitope peptide. The use of epitope peptides selected from such overlapping peptides facilitates characterization for different situations of allergic diseases.
  • the number of amino acid residues in the epitope peptide of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least the amino acid sequence specified by the SEQ ID NO as a partial sequence. Typically, it consists of a specified amino acid sequence.
  • the epitope peptide of the present invention may be modified by amino acid substitution, deletion or addition by a known method. It is also possible to impart solubility and antigen-antibody reactivity suitable for therapeutic use.
  • the epitope peptide of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method such as a fully automatic peptide synthesizer, a method using gene recombination with yeast, Escherichia coli, mammalian cells and the like.
  • the epitope peptide of the present invention may be in the form of a salt, if necessary, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include salts of inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) salts, etc.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanes
  • ⁇ -lactoglobulin ⁇ -lactalbumin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein, which are allergen proteins of human milk allergy
  • SEQ ID NOs: 1 to 51, 52 to Epitope peptides 91, 92-154, 155-220, 221-287 and 288-340 can be used.
  • These epitope peptides are a group of overlapping peptides created for the amino acid sequences of these allergen proteins. All of these may be used, or some of them may be used.
  • 73 kinds of epitope peptides shown in the following table can be used for allergen proteins of human milk allergy.
  • the 73 types of sequences are sequences selected from overlapping peptides as highly relevant epitopes for milk allergy diseases. Some of these 73 species can be used, but all can also be used.
  • the solid phase carrier is not particularly limited as long as it is a carrier insoluble in a solvent in a reaction system for antigen-antibody reaction, and a known solid phase carrier can be used.
  • a known solid phase carrier can be used.
  • the shape of the solid phase carrier an appropriate shape may be selected according to the purpose of use, and examples thereof include a test plate shape, a bead shape, a spherical shape, a disk shape, a tube shape, and a filter shape.
  • the solid phase carrier has a flat plate shape such as a test plate shape, a disk shape, or a filter shape.
  • those used as usual carriers for immunoassays for example, synthetic resins such as polypropylene, polystyrene, polyacrylamide, etc., or reactive properties such as sulfonic acid groups and amino groups by known methods are used. Examples thereof include those having a functional group introduced, glass, polysaccharides, silica gel, porous ceramics, and metal oxides.
  • the method for immobilizing the epitope peptide on the solid phase carrier can be a known method such as a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or a crosslinking method, but is not particularly limited.
  • a person skilled in the art can appropriately select an epitope peptide from a known method and immobilize it on a solid phase carrier.
  • a test sample is supplied to each epitope peptide immobilized on a solid phase carrier, and conditions for causing an antigen-antibody reaction between the epitope peptide and the antibody are given.
  • Conditions for causing an antigen-antibody reaction can be easily set by those skilled in the art.
  • an antigen-antibody reaction can be caused by adjusting the pH with an appropriate buffer and reacting for about an appropriate time.
  • a control experiment for eliminating non-specific binding is performed.
  • an appropriate control solution is prepared, the control solution is also supplied to the same solid phase carrier as that used for the test sample, and the signal intensity is measured for each epitope peptide according to the following procedure. Done.
  • Detection process of antigen-antibody reaction a step of detecting specific binding between each epitope peptide and an antibody (at least IgG4 and IgE) in the test sample is performed.
  • the antigen-antibody reaction on the solid phase carrier can be detected using a labeling substance used for immunoassay.
  • the labeling substance include fluorescent substances, luminescent substances, dyes, enzymes, coenzymes, and radioisotopes.
  • the labeling substance can also be used by directly binding to a secondary antibody against an antibody that binds to the epitope peptide. It can also be used indirectly using an antibody recognizing a labeling substance or an avidin-biotin system.
  • a step of obtaining first intensity information based on specific binding with IgE and second intensity information based on specific binding with IgG4 can be provided.
  • strength information we can use overall information on the specific binding strength of each antibody to the allergen protein and individual information on the specific binding strength of each site (epitope peptide) of the allergen protein.
  • the intensity information based on the specific binding can be acquired as the magnitude of a predetermined signal using a detection device corresponding to the type of signal based on such a labeling substance.
  • the intensity information can be associated with the amount of IgE or IgG4 antibody specifically bound to the epitope peptide in the test sample.
  • the diagnostic method disclosed in the present specification can include a step of detecting the reactivity of the test sample to the allergen protein using the first intensity information and the second intensity information. According to this step, it is possible to obtain the IgE amount, the IgG4 amount, and the magnitude thereof with respect to the epitope peptide in the test sample.
  • the reactivity of a test sample to a predetermined site (epitope) of an allergen protein can be emphasized or manifested. As a result, the reactivity to the allergen protein can be detected with high sensitivity and accuracy.
  • a distribution map may be created for each allergen protein or may be combined into a single distribution map.
  • the display dot color and form
  • distinguishable for each allergen protein may be changed. In this case, it is possible to easily detect changes or differences in the reactivity of each allergen protein.
  • the distribution information for all allergen proteins may be combined into one distribution map, and the dots derived from each allergen protein may be configured to be indistinguishable. By doing so, it becomes easy to visually recognize changes and differences in reactivity to a plurality of allergen proteins.
  • Such a distribution map may be created by causing a CPU such as a computer to execute an appropriate program based on the first intensity information and the second intensity information acquired for each epitope peptide.
  • Such a distribution map can be displayed on display means such as a display held by the computer or display means attached to the computer.
  • a test sample (hereinafter referred to as a negative test sample, preferably a plurality of samples) collected from an individual with a negative diagnosis for the allergic disease. It is preferable to set a boundary value (cutoff value) for determining positive / negative for each of IgE and IgG4 based on the intensity information acquired for each epitope peptide. For example, when the intensity information of IgE of an epitope peptide has a signal intensity higher than such a boundary value, it is IgE positive, and when it has a signal intensity lower than such a boundary value, it is IgE negative. Can be classified as being. The same applies to IgE.
  • the epitope peptides can be classified into four with respect to IgE positive / negative and IgE positive / negative. Based on these classifications, changes in reactivity to allergen proteins And the difference can be judged more clearly.
  • FIG. 2 shows a distribution diagram in which cut-off values of IgE and IgG4 are inserted.
  • the epitope peptide is IgG4 ⁇ IgE double positive and The epitope peptide is IgE positive / IgE negative (IgE single positive) when greater than (or greater than) the cutoff value of the first and second IgE and less than (or less) than the cutoff value of IgG4.
  • IgE negative IgG4 positive (IgG4 single positive) and IgE IgG4 double negative can also be classified.
  • the distribution map is divided into four quadrants of IgE / IgG4 double positive, IgE single positive, IgG4 single positive and IgG4 / IgE double negative. Can be classified. As a result, the difference in reactivity to IgE and IgG4 epitope peptides can be easily understood.
  • the cut-off value can be set in various ways. It is preferable to set a cutoff value for IgE and IgG4 by the same method. For example, standard deviation + 2SD (2 ⁇ standard deviation) may be used based on the average value and standard deviation of signal intensity derived from IgE of a predetermined epitope peptide obtained for a negative test sample. Moreover, it is good also as appropriate percentile values, such as the 90th percentile value or the 95th percentile value of the signal intensity derived from IgE obtained regarding the predetermined epitope peptide per negative test sample.
  • Cut-off values are set for each of IgE and IgG4.
  • a cut-off value common to a plurality of allergen proteins related to one allergic disease may be set, or a cut-off value may be set for each allergen protein.
  • the cut-off value is determined based on the IgE-derived signal intensity of all epitope peptides for the plurality of allergen proteins obtained for a negative test sample.
  • the cut-off value is preferably acquired in advance for the allergic disease to be diagnosed when performing the diagnostic method disclosed in this specification.
  • a total of 340 epitope peptides (SEQ ID NOs: 1 to 340) relating to ⁇ -lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein
  • the 95th percentile value was able to be used as the cut-off value for the IgE-derived signal intensity and the IgG4-derived signal intensity of the negative test sample.
  • the persistent milk allergy group, the sensitization group, and the tolerance acquisition group can be characterized and distinguished from each other.
  • the intensity information (ratio) of IgG4 intensity information / IgE (hereinafter simply referred to as intensity ratio) is based on the ratio between the first intensity information and the second intensity information, and is only classified as positive / negative. This is because the detection of reactivity may not always be easy. In particular, when the reactivity of IgE and IgG4 to the allergen protein changes over time, it is preferable to use the intensity ratio in order to detect the level or progress of the change.
  • the intensity ratio is the signal intensity of the predetermined labeling substance or the like as the first intensity information and the predetermined labeling substance as the second intensity information (the same labeling substance used to acquire the first intensity information) ))))) and the like.
  • the intensity ratio can be determined, for example, by the signal intensity (ratio) of IgG4 signal intensity / IgE to a predetermined numerical value.
  • the used epitope peptide can be classified based on the reactivity (amount) of IgE and IgG4 in the test sample possessed with respect to the epitope peptide. That is, it is possible to classify the used epitope peptides into epitope peptides of a predetermined value or more (or exceeding a predetermined value) and epitope peptides less than a predetermined value (or less than a predetermined value).
  • the classification of epitope peptides using such intensity ratios can be combined with the classification of epitope peptides based on cut-off values. In this way, the reactivity of the test sample to the allergen protein can be more clearly characterized and detected.
  • By further classifying the double positive epitope peptides by the intensity ratio it becomes possible to detect reactivity using quantitative changes in IgE and IgG4 over time.
  • FIG. 3 shows a distribution diagram in which the intensity ratio is inserted.
  • the test peptide is an IgE single positive or an IgE / IgG4 double positive
  • an epitope peptide hereinafter referred to as an epitope peptide
  • intensity ratio IgG4 signal intensity / IgE signal intensity
  • an epitope peptide (hereinafter referred to as an IgG4 single positive or IgE / IgG4 double positive) in which the intensity ratio (IgG4 signal intensity / IgE signal intensity) exceeds (or above) a predetermined value.
  • the intensity ratio IgG4 signal intensity / IgE signal intensity
  • the reactivity can be finely characterized and detected.
  • the distribution state of epitope peptides A and B can be easily grasped by inserting the intensity ratio into the distribution map.
  • the epitope peptides shown in Table 1 for ⁇ -lactalbumin, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein are derived from IgE of the negative test sample.
  • the signal intensity of IgG and the signal intensity derived from IgG4 are characterized by the persistent milk allergy group and the IgE sensitization group within the intensity ratio (IgG4 signal intensity / IgE signal intensity) in the range of 0.6 to 3.2. You can distinguish them. In order to diagnose with higher accuracy, it can be set to 1.0 or more and 3.0 or less.
  • the situation relating to the allergic disease of the individual can be diagnosed.
  • the diagnostic method disclosed in the present specification in advance for any situation of allergic diseases, that is, any situation such as sustained sensitivity state, sensitization state, and acquired resistance state for a specific antigen. It is preferable to use the reactivity characteristics of the test sample with respect to the epitope peptide obtained by the same antigen-antibody reaction step, antigen-antibody reaction detection step, intensity information acquisition step, and reactivity detection step as the reference.
  • the reactivity of the test sample to the allergen protein can be easily and clearly characterized based on the intensity information of IgE and IgG4 against the epitope peptide. And by using these criteria, the situation in which an individual is allergic, ie whether they are in a persistent allergic state, in an IgE sensitized state, in a state of acquired resistance, or in these It can be easily determined whether the state is in an intermediate state.
  • Diagnostic criteria are acquired as follows, for example. That is, prepare a plurality of groups that have been diagnosed for different conditions of allergic diseases, and for each of these groups, the antigen-antibody reaction step, the antigen-antibody reaction detection step, the intensity information acquisition step, and the reactivity A detection step is performed to obtain in advance intensity information of IgE and IgG4 for the epitope peptide. Then, for each group, a reactive feature associated with the confirmed diagnosis is extracted, and this is used as a diagnostic criterion for a specific situation of allergic disease.
  • the diagnostic criteria include, for example, the number, ratio, and / or number of epitope peptides classified into IgE • IgG4 double positive, IgE single positive, and IgG4 single positive, respectively, using cut-off values associated with allergic disease situations. Or large and small.
  • the number, ratio, and / or size of epitope peptide A and epitope peptide B using the cut-off value and the intensity ratio can be mentioned.
  • the diagnostic method disclosed herein can contribute to effective treatment.
  • the following detection process and diagnosis process can be performed after performing the contact process, the detection process, and the intensity information acquisition process as described above. According to such a diagnostic method, a diagnosis according to the situation of IgE or IgG in the allergic disease of each patient can be expected.
  • the number of epitope peptides for which the first intensity information and the second intensity information each satisfy a predetermined numerical index can be used.
  • a predetermined numerical index for example, it can be acquired from these intensity information acquired from a specimen (patient) (1 or more, preferably 2 or more) that can be a negative control.
  • First threshold information can be set as a predetermined numerical index applied to the first intensity information based on the combination with IgE.
  • the first threshold information can include two types of cutoff values. For each specimen, when the first intensity information obtained for each epitope peptide is equal to or greater than and / or exceeds these two types of cut-off values, a significant epitope peptide based on IgE binding (IgE high expression epitope peptide (first It is also referred to as an epitope peptide).
  • the first cut-off value obtains an average value (average intensity information) of intensity information such as a fluorescence intensity value of a negative control obtained in advance for each epitope peptide obtained up to the intensity information obtaining step, It can be acquired based on this average intensity information.
  • the first cutoff value can be average intensity information corresponding to an appropriate significance level (for example, 90% or more, or preferably about 95%) by arranging the average intensity information in descending order. .
  • This first cutoff value is a cutoff value suitable for extracting a significant epitope peptide.
  • the second cutoff value can also be set based on average intensity information acquired for each epitope peptide from a negative control acquired in advance.
  • the second cutoff value is set for each epitope peptide as a product of a predetermined numerical value of the average intensity information for each epitope peptide.
  • Each of the predetermined numerical values that is, the numerical values to be multiplied, is the first intensity information and the second intensity obtained from a group (definite diagnosis group) in which positive diagnosis and negative load are confirmed in advance by other methods. Set based on information.
  • the detection process is performed using numerical values for variously different multiplications, and the diagnosis process described later is further performed.
  • the diagnosis result is compared with the definitive diagnosis result.
  • a multiplication rate that gives a correct diagnosis rate of a certain level or more, for example, 75% or more, preferably 77% or more, more preferably 78% or more, further preferably 79% or more, more preferably 80% or more. Try to set a value.
  • the multiplication value for setting the second cutoff value in this detection step is in the range of about 4 to 15. It is known that a certain level or more, that is, about 80% can be secured.
  • Such a multiplication value is preferably 5 or more and 12 or less, more preferably 5 or more and 10 or less, and further preferably 6 or more and 10 or less.
  • Second threshold information can be set as a predetermined numerical index applied to the second intensity information based on the binding with IgG4.
  • the second threshold information can include two types of cutoff values. For each specimen, when the second intensity information obtained for each epitope peptide is equal to or greater than and / or exceeds these two types of cut-off values, a significant epitope peptide based on IgG4 binding (IgG4 highly expressed epitope peptide (second It is also referred to as an epitope peptide).
  • the first cutoff value and the second cutoff value can be set as in the first threshold information.
  • the first cutoff value in the second threshold information preferably applies a significance level similar to that applied to the first cutoff value of the first intensity information.
  • the second cutoff value in the second threshold information is a multiplication value similar to that applied to the setting of the second cutoff value of the first intensity information.
  • each cut-off value of the second threshold information it is not excluded that a significance level and a multiplication value different from those in the first threshold information are applied.
  • IgE high expression epitope peptide is applied to the first intensity information and the second intensity information by applying the first threshold information and the second threshold information. And an IgG4 high-expressing epitope peptide can be obtained. That is, the reactivity with respect to the target allergen protein can be detected.
  • These highly expressed epitope peptides can themselves characterize reactivity to the allergen protein of interest.
  • the number of high expression epitope peptides extracted in this manner and the ratio thereof can also characterize the reactivity to the target allergen protein. it can.
  • correction based on the concept of neutralizing antibodies can be applied when extracting an IgE highly expressed epitope.
  • the concept of a neutralizing antibody is that it develops when there is a lot of IgE for a specific epitope, but does not lead to the onset if IgG4 that recognizes the same epitope is present at the same time. According to such a concept, such a specific epitope is not counted as an IgE high expression epitope, that is, is removed.
  • the correction method based on the concept of neutralizing antibody is related to a specific epitope peptide, and when extracted as both an IgE high-expression epitope peptide and an IgG4 high-expression epitope peptide, the epitope peptide is regarded as an IgE high-expression epitope peptide. Do not count. According to this correction method, an appropriate IgE highly expressed epitope peptide is extracted, and in addition to the improvement of the correct diagnosis rate in the diagnostic process described later, the setting accuracy of the third cutoff value can be increased.
  • the situation related to allergic diseases can be diagnosed using the information obtained in the detection step described here, that is, the reactivity to the allergen protein. More specifically, the situation regarding allergic diseases can be diagnosed by using IgE high expression epitope peptides, IgG4 high expression epitope peptides, their respective numbers and / or IgG4 / IgE for the comparative test samples. According to this diagnostic process, it is considered that the diagnostic material is more characteristic of the reactivity of the test sample to the allergen protein, so that it is possible to make a more accurate diagnosis for various patients.
  • IgG4 / IgE which is the ratio of the number of epitope peptides with high IgE expression and the number of epitopes with high IgG4 expression, can be used for each comparative test sample. And when IgG4 / IgE exceeds a predetermined numerical index or exceeds the numerical index, it can be diagnosed that the situation is allergen negative or similar.
  • Third threshold information can be set as a numerical index applied to IgG4 / IgE.
  • the third threshold information is a cutoff value (third cutoff value) as described above. This cut-off value is set based on the first intensity information and the second intensity information acquired from a group (definite diagnosis group) in which positive and negative loads are preliminarily diagnosed by another method.
  • the contact process, the detection process, the intensity information acquisition process, and the detection process are performed, and the diagnosis result (correct diagnosis rate) and the definite diagnosis result when the third cut-off value is variously changed. Illuminate. Then, a correct diagnosis rate of a certain level or more, for example, 75% or more, preferably 77% or more, more preferably 78% or more, still more preferably 79% or more, more preferably 80% or more, is obtained. Set the off value.
  • the third cutoff value in this diagnosis step is in the range of about 1.5 to 10 or less, That is, it is known that about 80% can be secured.
  • the third cutoff value changes depending on the second cutoff value, that is, the multiplication value. Therefore, based on the correct diagnosis rate obtained from the diagnosis result and the definite diagnosis result when the third cut-off value is varied at the same time while varying the multiplication value for the second cut-off value. It is preferable to set these numerical values.
  • the preferred third cutoff value may be, for example, about 5 to 12, but more preferably about 5 to 10, although it depends on the multiplication value used for setting the second cutoff value.
  • a method for detecting a difference or change in reactivity to allergen proteins is also provided.
  • the antigen-antibody reaction step, the antigen-antibody reaction detection step, the intensity information acquisition step, and the reactivity detection step of the diagnostic method disclosed in the present specification are not diagnoses of allergic diseases, but merely the reactivity to allergen proteins. Can be used to detect differences or changes. For example, it can be used to detect such differences and changes experimentally or researchally.
  • a method for creating diagnostic criteria for allergic diseases is also provided.
  • the method of creating the disclosure of the present specification prepares a plurality of groups whose diagnosis has been confirmed for different situations of allergic diseases, and for each of these groups, the antigen-antibody reaction step, the antigen-antibody reaction detection step, the strength
  • the information acquisition step, the step of detecting the reactivity, and the step of extracting the characteristic of the reactivity associated with the confirmed diagnosis and using this as a diagnostic criterion for the different situations can be provided. According to such a preparation method, it is possible to easily and clearly characterize different situations of allergic diseases, and thus it is possible to create a clear diagnostic criterion.
  • the diagnostic criteria are created so that the confirmed diagnostic contents can be distinguished from other confirmed diagnostic contents.
  • the diagnostic criteria are created including the first intensity information, the second intensity information, and their distribution, as well as the cut-off value and the intensity ratio as necessary.
  • the above-described antigen-antibody reaction step, antigen-antibody reaction detection step, intensity information acquisition step, and reactivity detection step in the diagnostic criteria creation method disclosed in this specification are the same as the diagnostic method disclosed in this specification. Embodiments of these corresponding steps can be included.
  • examples of different situations of allergic diseases include situations in which current or past allergic symptoms and IgE antibody levels are different. Typically, there are a sustained sensitivity state, a sensitization state, a resistance acquired state, and the like for a specific antigen.
  • the group in which the diagnosis is confirmed in different situations of allergic diseases is preferably a collection of a plurality of test samples.
  • a diagnosis device for milk allergic diseases is also provided. That is, a diagnostic apparatus is also provided that includes a solid phase carrier on which a plurality of peptides each having two or more amino acid sequences selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 340 are immobilized. Examples of such a solid phase carrier include the same aspects as described in the diagnostic method disclosed herein.
  • This population also includes the following milk “super” hypersensitivity individuals. 1-1. Milk “super” hypersensitivity individuals (1) History of milk allergy from childhood (induced symptoms) and diagnosis of milk allergy confirmed (2) Milk intake and contact after age 5 years Or have immediate allergic symptoms by inhalation. Regardless of current age (3) Symptoms include widespread skin symptoms (erythema / wheal / edema), respiratory symptoms (cough, wheezing, dyspnea), digestive symptoms (abdominal pain, vomiting), circulatory system Includes one or more symptoms (excluding exacerbation of eczema, oral mucosal symptoms only, hives and diarrhea limited to contact areas) (4) Symptoms appear within 2 hours after ingestion (5) The milk-containing food that induced the symptoms falls under any of the following (regardless of whether it is a stress test or a misfeed) Milk of 10ml or less or equivalent dairy products, processed products containing a small amount of milk (although allergies to other ingredients (eg eggs and wheat) contained at the same time are denied), contamination of milk ingredients
  • Milk IgE sensitized population (7 samples) (1) Milk IgE (CAP-RAST) class 2 or higher (2) No past history of provoking symptoms suspected of milk allergy (3) Current intake of milk of 30 ml or higher or equivalent dairy products on a daily basis Possible (4) If the first milk load test in a patient who has not ingested in the past was negative (ingestion of 30 ml or more), it was confirmed several times that there was no induction symptom in subsequent intake of dairy products (5 ) Regardless of current age
  • Control serum (3 samples)
  • All of leopard mites, cat dandruff, egg white, wheat, camogaya and cedar IgE antibodies have been measured and all are negative
  • Total IgE value is 30 IU / ml or less
  • Age, gender and underlying disease are not subject Most of the cases were screened for allergies due to complaints of asthma and eczema. Not subject to allergic symptoms.
  • the peptide array has SEQ ID NOs: 6 for allergen proteins of ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactalbumin, ⁇ s1 -casein, ⁇ s2 -casein, ⁇ -casein and ⁇ -casein, respectively.
  • 1 to 51, SEQ ID NOs: 52 to 91, SEQ ID NOs: 92 to 154, SEQ ID NOs: 155 to 220, SEQ ID NOs: 221 to 287, SEQ ID NOs: 288 to 340 were chemically synthesized to prepare peptide arrays. Immobilization to the array to the peptide was as follows. A glass substrate was used as the solid support.
  • FIG. 4 shows the mean fluorescence intensity values for each peptide in the persistent milk allergy group (12 samples).
  • the reactivity with ⁇ s1 -casein and ⁇ -casein-derived peptides is particularly strong, and most ⁇ -lactalbumin, ⁇ s2 -casein and ⁇ -casein have IgE binding to the same peptide. Stronger than IgG4 binding. Almost no reaction was observed with ⁇ -lactalbumin.
  • each peptide in each group (12 samples of the persistent milk allergy group, 7 samples of the milk IgE sensitization group, and 5 samples of the milk resistance acquisition group) was used to see the ratio.
  • a scatter plot of IgE vs. IgG4 signal was generated. These plots are shown in FIGS. 5 (a) to (c).
  • the scatter plots of these groups each showed a unique distribution. Based on the data of all peptides obtained from control sera (3 specimens), the 95th percentile fluorescence intensity value was determined as a cutoff value (broken line in FIG. 5), and a peptide showing higher fluorescence intensity was determined as positive. I saw it.
  • the IgE signal positive / IgG4 signal negative (hereinafter, IgE single positive) peptide accounts for 7.5% of the total peptide (see FIG. 5 (a)), whereas the milk IgE sensitization group, It was 1.2% and 1.8%, respectively, in the milk tolerance acquisition group (see FIGS. 5B and 5C).
  • IgG4 signal positive / IgE signal negative (hereinafter referred to as IgG4 single positive) peptides were 6.7% and 7.5% in the persistent milk allergy group and the milk resistance acquired group, respectively, whereas 21% in the milk IgE sensitized group. It was as high as 5%.
  • the IgE / IgG4 signal double positive (hereinafter referred to as IgE / IgG4 double positive) peptide was 8.0% and 6.1% in the persistent milk allergy group and the milk IgE sensitized group, respectively. 4%. In the milk tolerance group, the overall rate of positive signals was low.
  • the distribution pattern of peptides is relatively high in IgE in the persistent milk allergy group and relatively high in IgG4 in the milk IgE sensitized group, and the distribution patterns of both are different.
  • the groups were classified using the fluorescence intensity ratio of IgE and IgG4 as an identification line. That is, in each plot of FIG.
  • a peptide having a fluorescence intensity ratio lower than the identification line set by IgE and IgG4 double positive and a predetermined fluorescence intensity ratio of IgE and IgG4 is defined as a peptide of region A
  • IgG4 single positive And IgE / IgG4 double positive peptides having a fluorescence intensity ratio higher than the identification line were defined as region B peptides, respectively.
  • the positive peptide obtained when the peptide array of the present example is applied has a serum containing more peptides distributed in the region A than the region B and a serum containing more peptides distributed in the region B than the region A.
  • the proportion of peptides distributed in region A is 35.2% in the persistent milk allergy group and 2.0% in the milk IgE sensitized group, while region B is the persistent milk allergic group. 2.9% and 31.7% in the milk IgE sensitization group.
  • the milk resistant acquired serum is distributed in 5.5% or less in any region, and is considered to be distributed between the persistent milk allergy group and the milk IgE sensitization group.
  • FIG. 9 shows the number of peptides classified into each region by providing an identification line in each serum of each group.
  • persistent milk allergy serum had more peptides distributed in region A than peptides distributed in region B, and vice versa for milk IgE-sensitized serum.
  • the milk-resistant serum was distributed more in region A, more distributed in region B, and varied depending on the specimen.
  • the classification using the identification line was tried by a blind test using 3 samples each of persistent milk allergy serum and milk IgE-sensitized serum that were not used for setting the identification line.
  • the results are shown in FIG.
  • the persistent milk allergy serum had more peptides distributed in the region A
  • the milk IgE-sensitized serum had more peptides distributed in the region B.
  • IgE and IgG4 in serum were analyzed until the milk allergy patient acquired resistance.
  • a scatter plot of IgE vs. IgG4 signal was created and the difference in distribution pattern due to changes over time was evaluated.
  • the requirements for serum collection were as follows.
  • Collection time 4 points from the serum (1 sample) of the same patient until the acquisition of tolerance from milk allergy (3 months, 5 months, 9 months, 1 year and 6 months).
  • the serum collected at 3 months, 5 months, and 9 months corresponds to milk allergy serum
  • the serum collected at 1 year and 6 months corresponds to milk resistance acquired serum.
  • Individuals collecting such sera should meet the following requirements:
  • Each serum was applied to the peptide array in the same manner as in Example 1. After hybridization, immunoassay was performed, the signal was measured with a fluorescence scanner, the fluorescence intensity was digitized, and the IgE vs. IgG4 signal was scanned. A tarp plot was created to evaluate the difference in distribution pattern with time.
  • FIG. 11 A comparison of 61 milk allergy positive groups and 22 milk allergy negative groups revealed that a scatter plot of IgE versus IgG4 signals until a milk allergy patient gains resistance using a peptide with significant IgE binding in positive samples. Changes over time are shown in FIG. 11 (FIG. 11; (a) 3 months, (b) 5 months, (c) 9 months, (d) 1 year and 6 months).
  • the region where the fluorescence intensity ratio of IgE single positive and IgE / IgG4 double positive is lower than that of the identification line, and the region where the fluorescence intensity ratio of IgG4 single positive and IgE / IgG4 double positive is higher than that of the identification line are region A and region, respectively. Displayed as B.
  • the proportion of the peptide occupying the region A with respect to all peptides gradually increased from 34.2% (3 months) to 24.7% (5 months) and 17.8% (9 months). At the age of 1 year and 6 months when resistance was acquired, it decreased rapidly to 2.7%. On the other hand, although the ratio of peptides in region B is 6.8% at 3 months, a slight signal is seen, but from less than 1.4% at 5 months and 9 months, when resistance is acquired (1 year and 6 months), 12. An increase of 3% was observed.
  • FIG. 12 shows the change over time in the number of peptides distributed in regions A and B. At 3 months, 5 months, and 9 months when milk is allergic, the number of peptides distributed in region A is larger than that in region B. Conversely, at 1 year and 6 months when resistance is acquired, peptides are distributed in region B rather than region A. There were more numbers.
  • the diagnostic method based on the intensity information of IgE and IgG4 that reacts specifically with the epitope peptide of each allergen protein confirmed for each individual population is a difference or change in reactivity to the allergen protein in each individual. Has been found to be preferred for detecting.
  • peptides having significant IgE binding in the positive specimens shown in Table 1 were not applied uniformly, but epitope peptides having significant fluorescence intensity values for each patient and IgE binding and IgG4 binding were used. I tried to analyze.
  • Example 1 Extraction of individual highly expressed epitope peptides in each patient 1-1. Acquisition of First Threshold Information and Second Threshold Information on IgE for Extracting Highly Expressed Epitopes
  • a patient group consisting of 65 patients as a whole (including patients of Example 1).
  • samples collected from 37 load-positive patients and 28 load-negative patients) were used in the same manner as in Example 1 to provide a peptide array for IgE binding for each epitope peptide associated with milk allergy. Based fluorescence intensity values were obtained.
  • the patient group included 3 patients who were class 1 (false positive) in the IgE class determination and were negative in the milk allergy load test (hereinafter referred to as class 1 load positive patients).
  • the fluorescence intensity value that is 10 times the average fluorescence intensity value of each epitope peptide was used as the second threshold information regarding IgE. Therefore, the 2nd threshold value information regarding IgE will exist for every epitope peptide.
  • a positive threshold when the threshold is set to 0 times (corresponding to the case where all epitopes with fluorescence intensity equal to or higher than the first threshold information are extracted as highly expressed epitopes) to 20 times is set. It is known from the simulation of the diagnosis rate that this threshold is approximately constant at 5 to 20 times.
  • the IgE high expression epitope extracted from each patient has a fluorescence intensity value equal to or higher than the fluorescence intensity value which is the first threshold information set in common for all epitope peptides, and each epitope
  • the epitope peptide has a fluorescence intensity value equal to or higher than the fluorescence intensity value, which is the second threshold information individually set for the peptide.
  • the IgG4 highly expressed epitope extracted from each patient has a fluorescence intensity value that is at least equal to the fluorescence intensity value that is the first threshold information.
  • the fluorescence intensity value serving as the first threshold information is 567 in this example.
  • a fluorescence intensity value that is 10 times the average fluorescence intensity value of each epitope peptide was used as the second threshold information regarding IgG4.
  • the second threshold information on IgG4 it is known from the simulation of the correct diagnosis rate that this threshold is approximately constant at 5 to 20 times.
  • the IgG4 high expression epitope extracted from each patient has a fluorescence intensity value equal to or higher than the fluorescence intensity value which is the first threshold information set in common for all epitope peptides, and each epitope
  • the epitope peptide has a fluorescence intensity value equal to or higher than the fluorescence intensity value, which is the second threshold information individually set for the peptide.
  • FIG. 13 shows the result of extracting a high expression epitope for a patient (patient number 19).
  • FIG. 13A shows the extraction analysis results of IgE high expression epitopes
  • FIG. 13B shows the extraction analysis results of IgG4 high expression epitopes.
  • the X-axis represents the average fluorescence intensity value obtained for each epitope peptide from the negative control as the X-axis, and the fluorescence intensity value obtained for each epitope peptide of each patient as the Y-axis. Therefore, an epitope peptide that is equal to or greater than the fluorescence intensity value of the first threshold information and equal to or greater than the fluorescence intensity value of the second threshold information is an epitope peptide (spot) in a region equal to or greater than the boundary line indicated by the dotted line in these figures. It becomes.
  • fluorescence intensity values for IgG4 and IgE were obtained in triplicate for each epitope peptide, and these three fluorescence intensity values were used for each epitope peptide.
  • FIG. 15 (a) shows a plot of the number of IgE high expression epitope peptides and the number of IgG4 high expression epitopes for all patients
  • FIG. 15 (b) shows an enlarged part of FIG. 15 (c). Shows a diagram plotting IgG4 / IgE divided into load positive and negative patients.
  • IgG4 / IgE which is the ratio of the number of highly expressed epitopes for discriminating between a load positive patient and a negative patient, can be set within a range where an appropriate correct diagnosis rate can be obtained. For example, when the second threshold information for extracting the highly expressed epitope peptide is relatively low, IgG4 / IgE also tends to be relatively low, and when the second threshold information is relatively high IgG4 / IgE also tends to be relatively high.
  • the inventors have introduced the concept of neutralizing antibodies, that is, allergy develops when IgE against a specific epitope is high, but does not develop when IgG4 that recognizes the same epitope is present at the same time) Went. That is, in an individual patient, when an IgE high-expression epitope peptide and an IgG4 high-expression epitope peptide match, in other words, one epitope peptide shows a fluorescence intensity value higher than a predetermined value based on IgE binding and is based on IgG4 binding. However, IgG4 functions as a neutralizing antibody for the epitope peptide when it shows a high fluorescence intensity value higher than a predetermined value.
  • these epitope peptides were divided from the number of IgE epitope peptides, assuming that they were not actually acting as high IgE epitopes even though they were high IgE epitopes based on the fluorescence intensity values.
  • the correction based on the concept of the neutralizing antibody was applied to the fluorescence intensity value obtained from each patient, and the number of IgE highly expressed epitope peptides was obtained again for each patient.
  • a plot of the number of IgG4 highly expressed epitope peptides and the corrected number of IgE highly expressed epitope peptides is shown in FIG.
  • the correction based on the concept of neutralizing antibodies can appropriately count highly expressed IgE epitope peptides, which may directly contribute to the improvement of the correct diagnosis rate, and in diagnosis depending on the number of highly expressed epitope peptides. A more direct contribution can be expected.
  • the first threshold information on IgE and IgG4 is the 95% significance level of the average fluorescence intensity value of the negative control for each epitope peptide.
  • FIG. 17A shows a plot of IgG4 / IgE for the load positive patient and the negative patient
  • FIG. 17B shows a corrected plot based on the neutralizing antibody concept. . Shown in Also, based on these data, IgG4 / IgE with a correct diagnosis rate of 81.5% was set to 5 before correction and 8 after correction.
  • the range from the maximum IgG4 / IgE in which a positive patient was correctly determined as positive to the minimum IgG4 / IgE in which a negative patient was correctly determined as negative is 3.67-5.46.
  • the threshold range of the correct answer rate is expanded to 7.33-13. That is, it becomes possible to more clearly determine a load positive patient and a negative patient.
  • the correction based on the concept of neutralizing antibodies makes it easier to set the threshold for IgG4 / IgE and allows a more appropriate threshold to be set.
  • the contact process between the epitope peptide immobilized on the solid phase carrier and the test sample and the specific binding detection process for obtaining strength information were evaluated with stirring.
  • the operation procedure was as follows.
  • the patient sera used in the following steps (1) to (5) were all IgE class 6.
  • the fluorescence intensity of the peptide array after draining was measured with a fluorescence scanner (Agilent scanner model G2505B, software G2565BA / DA).
  • a contact process control sample was prepared by operating in the same manner as in the above (1) to (5) except that the contact process of (1) was allowed to stand for 3 hours and overnight without stirring. Further, the detection step (2) was performed in the same manner as (1) to (5) except that the detection step was allowed to stand for 3 hours without stirring, and used as a detection step control sample. The measurement results of the fluorescence intensity obtained from these are shown in FIGS.
  • 19 (a) and 19 (b) show, for each epitope, the fluorescence intensity value when the detection process is allowed to stand for 3 hours without stirring and the fluorescence intensity when the detection process is performed for 15 minutes and 30 minutes with stirring. Plots with values are shown respectively.
  • the fluorescence intensity value is about 0.6 times that when left for 3 hours, and when the detection step is performed with stirring for 30 minutes, 3 It was found that a fluorescence intensity value almost equal to that obtained when left standing for a period of time was obtained.
  • 20 (a) and 20 (b) show, for each epitope, the fluorescence intensity value when the detection process is allowed to stand for 3 hours without stirring and the fluorescence intensity when the detection process is performed for 1 hour and 3 hours with stirring. Plots with values are shown respectively. As can be seen from FIG. 20, when the detection step is carried out with stirring for 1 hour, the fluorescence intensity value is about three times that when left standing for 3 hours, but even when the detection step is carried out with stirring for 3 hours, the detection step is continued. It was found that the fluorescence intensity value did not increase.
  • the required time can be drastically shortened by carrying out the contact process or detecting process while stirring, compared with the case where these processes are carried out by standing without stirring. I understood. It was also found that the fluorescence intensity can be enhanced as compared with the conventional case.

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Abstract

アレルゲンタンパク質に対する反応性を感度よく検出できるアレルギー疾患の診断方法を提供する。このため、本明細書の開示は、１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づいて取得した複数のエピトープペプチドを固定化した固相担体にアレルギー疾患の可能性のある個体由来の抗体を含有する被験試料を供給して前記エピトープペプチドと前記抗体とを接触させ、エピトープペプチドと抗体との特異的結合を検出し、各エピトープペプチドに関し、ＩｇＥとの結合に基づく第１の強度情報と、ＩｇＧ４との特異的結合に基づく第２の強度情報とを取得し、第１の強度情報及び第２の強度情報を利用して被験試料のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出するようにする。

Description

アレルギー疾患の診断方法
　本発明は、ＩｇＥ及びＩｇＧ４のアレルゲンタンパク質又はその一部から得られるエピトープペプチドに対する結合パターンを解析してアレルギー疾患を診断する方法に関する。
　花粉や食品由来のタンパク質に対するアレルギー疾患の診断や治療のため、アレルゲン特異的な抗体量の測定が行われている。例えば、患者の血中のアレルゲンに特異的なＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥなどの抗体量やその比を測定する方法（特許文献１）がある。また、同様の目的のために、抗原タンパク質のうちＩｇＧやＩｇＥのペプチド断片のアレイを作製し、このペプチドアレイを用いて、ＩｇＥ及びＩｇＧがそれぞれ特異的に結合するＩｇＥエピトープ及びＩｇＧエピトープを特定できることも開示されている（非特許文献１）。また、ペプチドアレイを用いたピーナッツ抗原タンパク質（Ara h2）のペプチドスキャンアレイを用いた抗原エピトープ特異的IgEおよびIgG4の測定することが開示されている（非特許文献２）。
特開２００８－１０７１５４
J. Allergy, Clin. Immunol., 122, 589-594 (2008) J. Allergy, Clin. Immunol., 116, 893-899 (2005)
　上記特許文献１に記載の方法ではＩｇＧ４やＩｇＥの量を測定し、その比（ＩｇＥ／ＩｇＧ）をインデックスとして用いるものであり、数値指標であるため簡易かつ明確であるが、その反面、患者毎あるいは患者のアレルゲンタンパク質に対する反応性の変化を検出するのが不可能である。また、非特許文献１は特定のエピトープに対する反応強度（ＩｇＥ／ＩｇＧ４）を感受性個体と耐性個体とについて開示しているものの、感受性個体に特異的なエピトープを開示するに留まっている。さらに、非特許文献２は、重篤な症状をもつ患者において特異的ＩｇＥエピトープ数が多いことが明らかとなったことが開示されているに留まっている。
　各種のアレルギー疾患は、年齢、季節、体調の変化、疾患の罹患等、免疫系の変化によりその症状が変化するものであり、重症化する場合も耐性を獲得する場合もある。このような経時変化等に伴うアレルゲンタンパク質に対する反応性の変化を感度よく検出して、アレルギー疾患の予防、発症予測、予後、耐性獲得予測を行うことが、効果的な治療に有効である。しかしながら、そのような診断のための有効な方法は現状において提供されていない。また、個体間のアレルゲンタンパク質に対する反応性の相違を感度よく検出する方法も未だ提供されていない。
　そこで、本発明は、アレルゲンタンパク質に対する反応性の変化を感度よく検出できるアレルギー疾患の診断方法を提供することを一つの目的とする。また、アレルゲンタンパク質に対する反応性の変化又は相違を検出する方法を提供することを他の一つの目的とする。
　本発明者らは、アレルゲンタンパク質に対してエピトープペプチドを取得して固相担体に固定化して、エピトープペプチドに結合する検体中のＩｇＥ及びＩｇＧ４の量をシグナルとして取得し、これらをＩｇＥ対ＩｇＧ４のシグナルスキャッタープロットを得ることで、抗原抗体反応の反応性の変化を感度よく検出できることを見出し、本発明を完成した。本明細書の開示によれば以下の手段が提供される。
（１）アレルギー疾患の診断方法であって、
　１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づいて取得した複数のエピトープペプチドを固定化した固相担体にアレルギー疾患の可能性のある個体由来の抗体を含有する被験試料を供給して前記エピトープペプチドと前記抗体とを接触させる工程と、
　前記エピトープペプチドと前記抗体との特異的結合を検出する工程と、
　前記各エピトープペプチドに関し、ＩｇＥとの結合に基づく第１の強度情報と、ＩｇＧ４との特異的結合に基づく第２の強度情報とを取得する工程と、
　前記第１の強度情報及び前記第２の強度情報を利用して前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出する工程と、
　検出した前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性に基づいて前記個体の前記アレルギー疾患に関する状況を診断する工程と、
を備える、方法。
（２）前記検出工程は、前記第１の強度情報と前記第２の強度情報とがそれぞれ所定の数値指標を充足する前記エピトープペプチドの個数に基づいて前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出する工程である、（１）に記載の方法。
（３）前記検出工程は、前記第１の強度情報と前記第２の強度情報との比を利用する工程である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）　前記検出工程は、前記比が所定の数値指標を充足する前記エピトープペプチドの個数に基づいて前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性の相違又は変化を検出する工程である、（３）に記載の方法。
（５）　前記検出工程は、前記第１の強度情報及び前記第２の強度情報を用いて得られる分布図を利用する工程である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）　２種類以上の前記アレルゲンタンパク質に対してそれぞれ取得した前記複数のエピトープペプチドを固定化した前記固相担体を準備する、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）　前記アレルギー疾患は、牛乳に対するアレルギー疾患である、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）　前記アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼイン、αs2-カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン及びβ－ラクトグロブリンからなる群から選択される１種又は２種以上である、（７）に記載の方法。
（９）　前記アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼイン、β－カゼイン及びκ－カゼインからなる群から選択される１種又は２種以上を含む、（８）に記載の方法。
（１０）　前記アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼインを含む、（９）に記載の方法。
（１１）　複数のエピトープペプチドは、配列番号１～３４０で表されるアミノ酸配列から選択される２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを含む、（７）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）　前記複数のエピトープペプチドは、以下の表に記載の２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを含む、（１１）に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 （１３）　牛乳に対するアレルギー疾患の診断装置であって、
　配列番号１～３４０で表されるアミノ酸配列から選択される２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを固定化した固相担体を備える、装置。
第１の強度情報及び第２の強度情報に基づく分布図の一例を示す図である。 第１の強度情報及び第２の強度情報に基づく分布図の他の一例を示す図である。 第１の強度情報及び第２の強度情報に基づく分布図の他の一例を示す図である。 実施例１における持続性牛乳アレルギー群、全１２検体において各ペプチドに対する蛍光強度値の平均を示す図である。ペプチドはタンパク配列のＮ末からＣ末の順に並んでいる。ＢＬＧ 、ＡＬＡ 、ａＳ１Ｃ 、ａＳ２Ｃ 、ＢＣ 、ＫＣ はそれぞれb－ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ 、a－ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ 、aｓ１－ｃａｓｅｉｎ、aｓ２－ｃａｓｅｉｎ、b－ｃａｓｅｉｎ、k－ｃａｓｅｉｎを示す。 実施例１における各群の分布図を示す図（（ａ）～（ｃ））である。破線はコントロール血清（３検体）から得られた全ペプチドのデータをもとに９５パーセンタイルの蛍光強度値をカットオフ値として示す。また、カットオフ値によって区画された各象限の、ＩｇＥシグナルポジティブ・ＩｇＧ４シグナルネガティブ、ＩｇＥシグナルネガティブ・ＩｇＧ４シグナルポジティブ、ＩｇＥ・ＩｇＧ４シグナルダブルポジティブのペプチドが全ペプチドに占める割合をそれぞれ示す。 牛乳アレルギー疾患陽性群でＩｇＥ結合性が有意であるエピトープペプチドを用いた分布図を示す図（（ａ）～（ｃ））である。破線はコントロール血清（３検体）から得られた全ペプチドのデータをもとに９５パーセンタイルの蛍光強度値をカットオフ値として示す。また、カットオフ値によって区画された各象限の、ＩｇＥシグナルポジティブ・ＩｇＧ４シグナルネガティブ、ＩｇＥシグナルネガティブ・ＩｇＧ４シグナルポジティブ、ＩｇＥ・ＩｇＧ４シグナルダブルポジティブのペプチドが全ペプチドに占める割合をそれぞれ示す。 ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度（比）を指標とした識別線の設定と判定結果を示す表である。 実施例２における各群の分布図を示す図（（ａ）～（ｃ））である。コントロール血清（３検体）から得られた全ペプチドのデータをもとに９５パーセンタイルの蛍光強度値をカットオフ値として破線（薄）で示す。ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度（比）（強度比＝２）を指標とした識別線を、破線（濃）で示す。識別線を設けた後の破線で囲まれた領域（領域Ａ、領域Ｂ）に分布するペプチドが全ペプチドに占める割合をそれぞれの領域に示した。 個々の被験試料（血清）における識別線（ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度（比）＝２）による群間の分類結果を示す表である。 識別線の設定に用いていない血清の群間分類結果（ブラインド試験）（ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度（比）＝２による）を示す表である。 牛乳アレルギー個体が耐性を獲得するまでの領域Ａ，Ｂにおけるエピトープペプチドの分布図を示す図（（ａ）～（ｄ））である。 牛乳アレルギー個体が耐性を獲得するまでの領域Ａ，Ｂにおけるエピトープペプチド数の経時変化を示す表である。 図１３（ａ）は、ある患者（患者番号１９）についての、ＩｇＥ高発現エピトープの抽出結果を示し、図１３（ｂ）は、前記患者のＩｇＧ４高発現エピトープの抽出結果を示す図である。各図における点線は、２つのカットオフ値に相当している。 図１４（ａ）は、ＣＡＰ－ＲＡＳＴによる患者群について症状（左側が負荷陽性患者、右側が陰性患者、以下同じ。）別のデータの分布を示し、図１４（ｂ）は、患者群のＩｇＥ高発現エピトープペプチド数の症状別の分布を示し、図１４（ｃ）は、患者群のＩｇＧ４高発現エピトープペプチド数の症状別の分布を示す。 図１５（ａ）は、患者群におけるＩｇＥ高発現エピトープ数とＩｇＧ４高発現エピトープ数とのプロットを示し、図１５（ｂ）は、（ａ）のプロットの一部拡大図を示し、図１５（ｃ）は、ＩｇＧ４／ＩｇＥを症状（左側が負荷陽性患者、右側が陰性患者）別にプロットした図を示す。 中和抗体の考え方による補正後のＩｇＥ高発現エピトープペプチド数とＩｇＧ４高発現エピトープペプチド数とによるプロットを示す図である。白抜き三角は補正前の陽性患者のスポットであり、塗りつぶし三角は補正後の陽性患者のスポットである。白抜き円は補正前の陰性患者のスポットであり、塗りつぶし円は補正後の陰性患者のスポットである。 図１７（ａ）は、中和抗体の考え方に基づく補正の導入前の症状（左側が負荷陽性患者、右側が陰性患者）別のＩｇＧ４／ＩｇＥのプロットを示し、図１７（ｂ）は、補正の導入後の症状別のＩｇＧ４／ＩｇＥのプロットを示す。 被験試料との撹拌しながらの接触工程の工程時間を１０分～６０分（ａ）～（ｃ）で異ならせたときの蛍光強度値を示す図である。 二次抗体との撹拌しながらの検出工程の工程時間を、１５分（ａ）及び３０分（ｂ）としたときの蛍光強度値を示す図である。 二次抗体との撹拌しながらの検出工程の工程時間を、１時間（ａ）及び３時間（ｂ）実施したときの蛍光強度値を示す図である。
　本明細書の開示は、アレルギー疾患の診断方法及びアレルゲンタンパク質に対する反応性の相違又は変化を検出する方法に関する。本明細書の開示によれば、固相担体に固定化した各エピトープペプチドに関し、ＩｇＥとの特異的結合に基づく第１の強度情報とＩｇＧ４との特異的結合に基づく第２の強度情報とに基づいて、ＩｇＥ及びＩｇＧ４の前記各エピトープペプチドに対する特異的な結合強度情報を取得することで、アレルゲンタンパク質に対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の反応性の変化や相違を感度よく検出できる。これは、抗体の結合対象がエピトープペプチドであるため、反応性の相違や変化が強調されるからである。加えて、第１の強度情報と第２の強度情報との比を利用することで、さらに精度よくアレルゲンタンパク質に対する反応性の変化や相違を検出できるようになる。この結果、アレルギー疾患の診断を高い確度で行うことができる。
　また、第１の強度情報と第２の強度情報とを分布図（スキャッタープロット）として取得することでより感度よく反応性の相違や変化を確認することができるようになる。さらに、こうした分布図を用いることで、アレルゲンタンパク質に対する反応性の相違や変化を検出したり診断したりするのに好適なエピトープペプチド（エピトープ）を決定することもできる。
　以上のことから、本明細書の開示によれば、各種のアレルギー疾患の予防、発症予測、予後、耐性獲得予測の診断を容易にし、ひいては効果的な予防や治療が可能となる。以下、本明細書の開示を実施するための最良の形態について説明する。
（アレルギー疾患の診断方法）
　本発明の診断方法を適用するアレルギー疾患としては、特に限定されないで、アレルゲンタンパク質が特定されているアレルギー疾患であればよい。例えば、牛乳に対するアレルギー疾患、各種花粉に対するアレルギー疾患、卵に対するアレルギー疾患、ダニ抗原に対するアレルギー疾患、喘息など、年齢や季節的な変化があると考えられるアレルギー疾患について本明細書に開示の診断方法は有用である。本明細書の開示の方法は、アレルゲンタンパク質に対する反応性の有無だけでなく、反応性の変化や相違を容易に検出できるからである。
（抗原抗体反応工程）
　本明細書に開示されるアレルギー疾患の診断方法は、所定のエピトープペプチドが固定化された固相担体に対して、アレルギー疾患の可能性のある個体由来の抗体を含有する被験試料を供給して抗原抗体反応を実施する。エピトープペプチドと前記抗体とを接触させる工程を備えている。
　被験試料は、アレルギー疾患の可能性のある個体に由来する抗体を含有する。被験試料は、少なくともＩｇＥとＩｇＧ４を含んでいればよいが、これら以外の免疫グロブリンを含んでいてもよい。このような被験試料は、特に限定されないが、例えば、アレルギー疾患の可能性のある個体から採取される血液や血清などが用いられる。アレルギー疾患の可能性のある個体は、アレルギー疾患の可能性があればよい。被験試料は、複数であってもよい。すなわち、診断対象となる個体につき２以上の被験試料を本明細書の開示の診断方法に供してもよい。なお、個体は、ヒトの他、非ヒト動物であってよい。
　アレルゲンタンパク質は、当該アレルギー疾患に関連すると考えられるものであればよく、１種類であっても２種類以上であってもよい。複数種類のアレルゲンタンパク質に対する反応性を取得することで、感度が向上する場合もあり、単独のアレルゲンタンパク質に対する反応性を取得することで十分な感度を確保できる場合もある。少なくとも、本明細書に開示の検出方法における検出性能を確認するためには、２種類以上のアレルゲンタンパク質に対して抗体の強度情報を取得し、その上で、特定のアレルゲンタンパク質を選択して用いることが好ましい。
　例えば、牛乳に対するアレルギー疾患の診断にあたって用いるアレルゲンタンパク質としては、主要な６つのミルクアレルゲンタンパク質であるα－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインから選択される１種又は２種以上が挙げられる。好ましくは、アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼイン、αs2-カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン及びβ－ラクトグロブリンからなる群から選択される１種又は２種以上である。これらのアレルゲンタンパク質は、本発明者らの検討によれば、反応性の相違や変化を検出するのにより好ましいことがわかっている。さらに好ましくは、αs1-カゼイン、β－カゼイン及びκ－カゼインからなる群から選択される１種又は２種以上であり、また、一層好ましくは、αs1-カゼインである。αs1-カゼインは、強度情報を分布図として取得したときに、アレルギー陽性個体と、耐性獲得個体と、感作個体との間において、分布状態が最も大きく相違するからである。
　エピトープペプチドは、可能性あるアレルゲンタンパク質に関しアレルギー疾患に関連のあるエピトープと考えられる部位のアミノ酸配列を含むかあるいは当該部位のアミノ酸配列からなっていればよく、特に限定されない。可能性あるアレルゲンタンパク質又はその部分のアミノ酸配列に基づいて、適当な長さ（例えば、１２～２０残基程度）で、そのアミノ酸配列に関しオーバーラップが８～１７残基程度となるような必要な数のオーバーラップペプチドの集団から選択されることが好ましい。より好ましくは、アレルゲンタンパク質の一次構造をカバーするアミノ酸配列にわたって必要数のオーバーラップペプチドを準備する。一つのアレルゲンタンパク質について準備するオーバーラップペプチドの数は、カバーする一次構造の大きさやオーバーラップペプチドの長さ及びオーバーラップ残基数によって異なる。牛乳アレルギーなど複数のタンパク質がアレルゲンとして関与する場合には、これらの複数のアレルゲンタンパク質から選択される１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質につき、オーバーラップペプチドを準備することができる。そして、準備したオーバーラップペプチドに対するアレルギー陽性個体群（特定の抗原に対して感受性持続状態）の被験試料（血清等）とアレルギー陰性個体群の被験試料（血清等）の比較から、アレルギー陽性個体を特徴付けることができる判定されたオーバーラップペプチドがエピトープペプチドとして選択される。こうしたオーバーラップペプチドから選択されるエピトープペプチドを用いることにより、アレルギー疾患の異なる状況に関し特徴付けが容易になる。
　本発明のエピトープペプチドは、配列番号で特定されるアミノ酸配列を少なくとも部分配列として含んでいる限り、そのアミノ酸残基数は特に限定されない。典型的には、特定されるアミノ酸配列からなる。なお、本発明のエピトープペプチドは、公知の手法によりアミノ酸置換、欠失あるいは付加などの修飾が加えられていてもよい。治療用途に適した溶解性や抗原抗体反応性を付与することも可能である。
　本発明のエピトープペプチドは公知のペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置、酵母、大腸菌、哺乳動物細胞等による遺伝子組換えを用いた方法により製造することができる。
　本発明のエピトープペプチド、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態であってもよい。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる
　例えば、ヒトの牛乳アレルギーのアレルゲンタンパク質であるβ－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインに関し、それぞれ、配列番号１～５１、５２～９１、９２～１５４、１５５～２２０、２２１～２８７及び２８８～３４０のエピトープペプチドを用いることができる。これらのエピトープペプチドは、これらのアレルゲンタンパク質のアミノ酸配列に対して作製したオーバーラップペプチド群である。これらの全てを用いることもできるし、一部を用いてもよい。一部を用いる場合には、各アレルゲンタンパク質からそれぞれ選択してもよいし、一部のアレルゲンタンパク質のエピトープペプチドを選択してもよい。なかでも、以下の表に示す７３種の配列のエピトープペプチドをヒト牛乳アレルギーのアレルゲンタンパク質に関し用いることができる。７３種の配列は、牛乳アレルギー疾患に関し関連の高いエピトープとしてオーバーラップペプチドから選択された配列である。これらの７３種の一部を用いることもできるが、全てを用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　エピトープペプチドは、適当な固相担体に固定化される。固相担体は、抗原抗体反応の反応系で溶媒に不溶な担体であれば、その材質及び形状は特に制限されず、公知の固相担体が使用できる。固相担体の形状としては、使用目的に応じて適宜の形状を選択すれば良く、例えば、テストプレート状、ビーズ状、球状、ディスク状、チューブ状、フィルター状等が挙げられる。好ましくは、固相担体は、テストプレート状、ディスク状、フィルター状等の平板状である。また、その材質としては、通常の免疫測定法用担体として用いられるもの、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド等の合成樹脂、または、これらに公知の方法によりスルホン酸基、アミノ基などの反応性官能基を導入したもの、ガラス、多糖類、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等が挙げられる。
　固相担体へのエピトープペプチドの固定化方法は、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用できるが、特に限定されない。当業者であれば、公知の方法から適宜選択してエピトープペプチドを固相担体に固定化することができる。
　固相担体に固定化されたエピトープペプチドに対して被験試料をそれぞれ供給して、エピトープペプチドと抗体との抗原抗体反応を生じさせる条件を付与する。抗原抗体反応が生じる条件は、当業者であれば容易に設定でき、例えば、適当な緩衝液でｐＨを調整し、適当な時間程度反応させることで、抗原抗体反応を生じさせることができる。なお、被験試料中の抗体とエピトープペプチドとの特異的結合を検出するには、非特異的な結合を排除するためのコントロール実験を実施する。典型的には、適当なコントロール液を準備し、当該コントロール液も被験試料に用いるのと同様の固相担体に対して供給し、以下の手順に従い、各エピトープペプチドについてシグナル強度を測定することが行われる。
（抗原抗体反応の検出工程）
　次に、各エピトープペプチドと被験試料中の抗体（少なくともＩｇＧ４とＩｇＥ）との特異的結合を検出する工程を実施する。固相担体上の抗原抗体反応は、イムノアッセイに用いられる標識物質を利用して検出することができる。標識物質としては、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が挙げられる。標識物質は、エピトープペプチドに結合する抗体に対する二次抗体に直接結合して用いることもできる。また、標識物質を認識する抗体やアビジン－ビオチン系などを利用して間接的に用いることもできる。
（強度情報の取得工程）
　次いで、各エピトープペプチドに関し、ＩｇＥとの特異的結合に基づく第１の強度情報とＩｇＧ４との特異的結合に基づく第２の強度情報とを取得する工程を備えることができる。こうした強度情報を取得することで、それぞれの抗体のアレルゲンタンパク質に対する特異的結合の強度に関する全体的な情報とアレルゲンタンパク質の個々の部位（エピトープペプチド）に対する特異的結合の強度に関する個別の情報とを利用して、アレルゲンタンパク質に対する反応性の変化や相違を検出できるようになる。
　特異的結合に基づく強度情報は、こうした標識物質に基づくシグナルの種類に応じた検出装置を用いて所定のシグナルの大きさとして取得できる。第１の強度情報及び第２の強度情報は、それぞれ、強度情報は、被験試料中のエピトープペプチドに特異的に結合したＩｇＥやＩｇＧ４の抗体量に関連付けすることができる。
（反応性を検出する工程）
　本明細書に開示の診断方法は、第１の強度情報及び第２の強度情報を利用して被験試料のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出する工程を備えることができる。本工程によれば、被験試料中のエピトープペプチドに対するＩｇＥ量、ＩｇＧ４量及びそれらの大小を得ることができる。オーバーラップペプチドから選択されたエピトープペプチドに対するこれらの情報を得ることができると、被験試料のアレルゲンタンパク質の所定の部位(エピトープ)に対する反応性が強調又は顕在化させることができる。この結果、アレルゲンタンパク質に対する反応性を感度よくまた確度よく検出できる。
（分布図）
　強度情報を利用して反応性を検出するには、以下に示すようなカットオフ値や強度比を利用した数値処理によることができる。しかしながら、例えば、図１に示すように、Ｘ軸及びＹ軸のいずれかにそれぞれＩｇＥ及びＩｇＧ４の強度情報のバーを配したグラフにおいて、各エピトープペプチドについて取得された２つの免疫グロブリンに関する第１の強度情報と第２の強度情報に基づきプロットし、分布図を作製することが好ましい。こうすることで、被験試料のアレルゲンタンパク質とＩｇＥ及びＩｇＧ４との反応性を目視により容易に直感的に把握することができ、また、被験者に状況を容易に説明することができる。また、分布図にカットオフ値や強度比に基づく情報（境界線）を挿入することで、これらの情報を利用したエピトープペプチドの分類を目視で容易に視認でき、反応性の特徴を直感的に把握できるようになる。
　同一個体からの被験試料につき、複数のアレルゲンタンパク質についてのエピトープペプチドについて強度情報を取得した場合には、各アレルゲンタンパク質毎に分布図を作成してもよいし、一つの分布図にまとめてよい。一つの分布図にまとめるときには、アレルゲンタンパク質毎に区別可能な表示（ドットの色や形態）を変化させてもよい。この場合、アレルゲンタンパク質毎の反応性を変化や相違を容易に検出できる。また、全てのアレルゲンタンパク質についての分布情報を一つの分布図にまとめるとともに、各アレルゲンタンパク質に由来するドットを区別不能に構成してもよい。こうすることで、複数のアレルゲンタンパク質に対する反応性の変化や相違を視認しやすくなる。
　このような分布図は、各エピトープペプチドにつき取得された第１の強度情報及び第２の強度情報に基づいて、コンピュータ等のＣＰＵが適当なプログラムを実行させることにより作成してもよい。こうした分布図は、コンピュータが保持するディスプレイ等の表示手段やコンピュータに付属する表示手段において表示させることができる。
（第１の強度情報及び第２の強度情報に関する所定の数値指標：カットオフ値）
　第１の強度情報及び第２の強度情報を利用するには、前記アレルギー疾患に関し陰性の診断が確定している個体から採取した被験試料（以下、陰性被験試料という。好ましくは複数用いる。）につき各エピトープペプチドに関し取得した強度情報に基づき、ＩｇＥ及びＩｇＧ４のそれぞれについてポジティブ／ネガティブを判定するための境界値（カットオフ値）を設定することが好ましい。例えば、あるエピトープペプチドのＩｇＥの強度情報が、このような境界値よりも高いシグナル強度を有するときは、ＩｇＥポジティブであり、このような境界値よりも低いシグナル強度を有するときは、ＩｇＥネガティブであると分類できる。ＩｇＥについても同様である。
　ＩｇＥ及びＩｇＧ４につきそれぞれカットオフ値を定めることで、ＩｇＥポジティブ／ネガティブ、ＩｇＥポジティブ／ネガティブに関して、エピトープペプチドを４つに分類することができ、これらの分類に基づいて、アレルゲンタンパク質に対する反応性の変化や相違をより明確に判断できるようになる。
　以下、カットオフ値の利用に関し、分布図を用いて説明する。たとえば、図２には、ＩｇＥ及びＩｇＧ４のそれぞれのカットオフ値が挿入された分布図を示す。あるエピトープペプチドについての第１及び第２の強度情報がＩｇＥ及びＩｇＧ４についてのそれぞれのカットオフ値以上（又はより大きい）であるとき、当該エピトープペプチドは、ＩｇＧ４・ＩｇＥダブルポジティブであり、また、第１及び第２のＩｇＥのカットオフ値以上（またはより大きい）であり、ＩｇＧ４のカットオフ値よりも小さい（またはそれ以下）であるとき、当該エピトープペプチドは、ＩｇＥポジティブ・ＩｇＥネガティブ（ＩｇＥシングルポジティブ）となる。同様に、ＩｇＥネガティブ・ＩｇＧ４ポジティブ（ＩｇＧ４シングルポジティブ）及びＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルネガティブも分類することができる。
　さらに、カットオフ値に基づいて４つに分類されたエピトープペプチドの各分類(特に、ＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルネガティブを除く３分類)されたエピトープペプチドの個数に基づくことができる。すなわち、当該個数、その大小及び比率を利用して、アレルゲンタンパク質に対する反応性を容易に把握できる。なお、分布図に、ＩｇＥとＩｇＧ４のカットオフ値に相当するシグナル強度を挿入することで、分布図をＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブ、ＩｇＥシングルポジティブ、ＩｇＧ４シングルポジティブ及びＩｇＧ４・ＩｇＥダブルネガティブの４つの象限に分類できる。この結果、ＩｇＥ及びＩｇＧ４のエピトープペプチドに対する反応性の相違を容易に理解できる。
　カットオフ値は種々の方法で設定できる。ＩｇＥとＩｇＧ４について、それぞれ同じ手法でカットオフ値を設定することが好ましい。例えば、陰性被験試料について得られた、所定のエピトープペプチドのＩｇＥに由来するシグナル強度の平均値及び標準偏差に基づき標準偏差＋２ＳＤ（２×標準偏差）等としてもよい。また、陰性被験試料につき所定のエピトープペプチドに関して得られたＩｇＥに由来するシグナル強度の９０パーセンタイル値あるいは９５パーセンタイル値等、適切なパーセンタイル値としてもよい。
　カットオフ値は、ＩｇＥ及びＩｇＧ４のそれぞれにつき設定される。一つのアレルギー疾患に関連する複数のアレルゲンタンパク質に共通のカットオフ値を定めてもよいし、アレルゲンタンパク質毎にカットオフ値を定めてよい。複数のアレルゲンタンパク質に対する反応性を利用して確度高い診断が期待できる場合には、これらアレルゲンタンパク質に共通のカットオフ値を定めることが好ましい。例えば、陰性被験試料に関して取得した、こうした複数のアレルゲンタンパク質についての全てのエピトープペプチドのＩｇＥ由来のシグナル強度に基づいてカットオフ値を決定する。
　カットオフ値は、本明細書の開示の診断方法を実施するにあたり、診断対象とするアレルギー疾患につき、予め取得しておくことが好ましい。
　例えば、ヒトの牛乳アレルギーに関し、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインに関する全部で３４０種（配列番号１～３４０）のエピトープペプチドにつき、陰性被験試料のＩｇＥ由来のシグナル強度及びＩｇＧ４由来のシグナル強度について、それぞれ９５パーセンタイル値をカットオフ値に用いることができた。その場合、ＩｇＥ・ＩｇＧ４ネガティブを利用して、持続性牛乳アレルギー群、感作群、耐性獲得群をそれぞれ特徴付けでき、区別することができる。
（第１の強度情報及び第２の強度情報に関する所定の数値指標：ＩｇＧ４の強度情報／ＩｇＥの強度情報（比））
　ＩｇＧ４の強度情報／ＩｇＥの強度情報（比）（以下、単に、強度比という。）は、第１の強度情報と第２の強度情報との比に基づくものでポジティブ／ネガティブによる分類だけで、常に反応性の検出が容易でない場合もあるからである。特に、経時的に、アレルゲンタンパク質に対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の反応性が変化する場合には、その変化のレベル若しくは途中経過を検出するには、強度比を利用するのが好適である。強度比は、第１の強度情報である所定の標識物質等のシグナル強度と第２の強度情報である所定の標識物質（第１の強度情報の取得に用いたのと同一の標識物質である。）等のシグナル強度から取得できる。
　強度比は、例えば、ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度（比）を所定の数値に定めることができる。この場合、用いたエピトープペプチドを、当該エピトープペプチドに対して有する被験試料中のＩｇＥ及びＩｇＧ４の反応性（量）に基づいて分類することができる。すなわち、用いたエピトープペプチドを、所定数値以上（あるいは所定数値を超える）のエピトープペプチドと所定数値未満（あるいは所定数値以下）のエピトープペプチドとに分類することが可能となる。
　このような強度比を用いたエピトープペプチドの分類は、カットオフ値のよるエピトープペプチドの分類と組み合わせることができる。こうすることで、被験試料のアレルゲンタンパク質に対する反応性をより明確に特徴付けして検出できる。特に、ＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブのエピトープペプチドをさらに分類することも可能となる。ダブルポジティブのエピトープペプチドにつき、強度比でさらに分類することで、経時的なＩｇＥ及びＩｇＧ４の量的変化を利用した反応性の検出が可能となる。
　以下、強度比の利用に関し、分布図を用いて説明する。たとえば、図３には、強度比が挿入された分布図を示す。例えば、被験試料につき、ＩｇＥシングルポジティブ又はＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブであって、強度比（ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度）が所定値以下（又は未満）に該当するエピトープペプチド（以下、エピトープペプチドＡという。）の個数と、ＩｇＧ４シングルポジティブ又はＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブであって、強度比（ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度）が所定値超（又は以上）に該当するエピトープペプチド（以下、エピトープペプチドＢという。）の個数、すなわち、その個数のほか、その個数の大小若しくは個数の比率に基づいて、細かく反応性を特徴付けて検出することができるようになる。なお、分布図に強度比を挿入することで、エピトープペプチドＡ，Ｂの分布状態を容易に把握できる。
　例えば、ヒトの牛乳アレルギーに関し、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼインに関する表１に示すエピトープペプチドにつき、陰性被験試料のＩｇＥ由来のシグナル強度及びＩｇＧ４由来のシグナル強度につき、強度比（ＩｇＧ４のシグナル強度／ＩｇＥのシグナル強度）が０．６以上３．２以下の範囲で持続性牛乳アレルギー群とＩｇＥ感作群とをそれぞれ特徴付けして区別できる。より確度高く診断するには、１．０以上３．０以下とすることができる。
（個体のアレルギー疾患に関する状況を判断する工程）
　上記工程で検出した被験試料のアレルゲンタンパク質に対する反応性に基づいて、個体のアレルギー疾患に関する状況を診断することができる。診断にあたっては、予め、アレルギー疾患のいずれかの状況、すなわち、特定の抗原に対して感受性持続状態、同感作状態及び同耐性獲得状態等のいずれかの状況につき、本明細書の開示の診断方法と同様の抗原抗体反応工程、抗原抗体反応の検出工程、強度情報の取得工程及び反応性を検出する工程により得られたエピトープペプチドに対する被験試料の反応性の特徴を基準として利用することが好ましい。上記のとおり、これらの工程によれば、エピトープペプチドに対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の強度情報等に基づいて被験試料のアレルゲンタンパク質に対する反応性を容易にかつ明確に特徴付けできるからである。そして、こうした基準を用いることで、個体がアレルギー疾患に関してどのような状況、すなわち、持続的なアレルギー状態にあるのか、ＩｇＥ感作状態にあるのか、耐性を獲得した状態にあるのか、あるいはこれらの中間的状態にあるのかを、容易に判断することができる。
　診断基準は、例えば、以下のようにして取得する。すなわち、アレルギー疾患の異なる状況について診断の確定している複数の群を準備し、これらの各群につき、上記した抗原抗体反応工程、抗原抗体反応の検出工程、強度情報の取得工程及び反応性を検出する工程を行い、エピトープペプチドに対するＩｇＥ及びＩｇＧ４の強度情報を予め取得する。そして、各群につき、確定した診断と関連付けられる反応性の特徴を抽出し、これをアレルギー疾患の特定の状況についての診断基準とする。診断基準としては、例えば、アレルギー疾患の各状況と関連付けられたカットオフ値を用いたＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブ、ＩｇＥシングルポジティブ及びＩｇＧ４シングルポジティブのそれぞれに分類されるエピトープペプチドの各個数、比率及び／又は大小が挙げられる。また、カットオフ値と強度比を利用したエピトープペプチドＡ及びエピトープペプチドＢの各個数、比率及び／又は大小が挙げられる。
　診断基準を、アレルギー疾患の各種状況、例えば、特定の抗原に対して感受性持続状態、同感作状態及び同耐性獲得状態等につき取得しておくことで、各種のアレルギー疾患の予防、発症予測、予後、耐性獲得予測の診断が容易になる。したがって、本明細書の開示の診断方法は、効果的な治療に貢献することができる。
　なお、本明細書の開示によれば、上記のようにして接触工程、検出工程、強度情報取得工程を実施後、以下のような検出工程、診断工程を実施することができる。こうした診断方法によれば、各患者のアレルギー疾患におけるＩｇＥやＩｇＧの状況に応じた診断が期待できる。
　検出工程は、第１の強度情報と第２の強度情報とがそれぞれ所定の数値指標を充足するエピトープペプチドの個数を利用することができる。所定の数値指標としては、例えば、ネガティブコントロールとなりうる検体（患者）（１又は２以上、このましくは２以上）から取得されたこれらの強度情報から取得できる。
　ＩｇＥとの結合に基づく第１の強度情報に適用する所定の数値指標として、第１の閾値情報を設定することができる。第１の閾値情報は、２種類のカットオフ値を含むことができる。各検体につき、各エピトープペプチドについて得られる第１の強度情報はこれらの２種類のカットオフ値と同値以上及び／又は超えるとき、ＩｇＥ結合に基づく有意なエピトープペプチド（ＩｇＥ高発現エピトープペプチド（第１のエピトープペプチド）ともいう。）として抽出される。
　第１のカットオフ値は、強度情報取得工程までにおいて得られている各エピトープペプチドについて、予め取得されているネガティブコントロールの蛍光強度値などの強度情報の平均値(平均強度情報)を取得し、この平均強度情報に基づいて取得できる。第１のカットオフ値は、これらの平均強度情報を降順に配列して、適切な有意水準(例えば、９０％以上、このましくは９５％程度)に相当する平均強度情報とすることができる。この第１のカットオフ値は、有意なエピトープペプチドを抽出するのに好適なカットオフ値である。
　第２のカットオフ値も、予め取得されているネガティブコントロールから各エピトープペプチド毎に取得した平均強度情報に基づいて設定することができる。第２のカットオフ値は、エピトープペプチド毎の平均強度情報の所定の数値を乗算したものとしてエピトープペプチド毎に設定される。個々で所定の数値、すなわち、乗算される数値は、負荷陽性及び陰性が予め他の方法で確定診断がついている群（確定診断群）から取得された、第１の強度情報及び第２の強度情報に基づいて設定される。
　例えば、確定診断群につき、接触工程、検出工程、強度情報取得工程を実施するとともに、種々に異ならせた乗算のための数値を用いて検出工程を実施し、さらに後述する診断工程を実施し、その診断結果と確定診断結果とを照らし合わせる。そして、一定以上の正診率、例えば、７５％以上、好ましくは７７％以上、より好ましくは７８％以上、さらに好ましくは７９％以上、一層好ましくは８０％以上の正診率が得られる、乗算値を設定するようにする。本明細書に開示する実施例によれば、牛乳アレルギーに関するエピトープペプチドを用いた診断においては、この検出工程における第２のカットオフ値を設定するための乗算値は、４以上１５以下程度の範囲において、一定以上、すなわち、８０％程度を確保できることがわかっている。かかる乗算値は、好ましくは、５以上１２以下であり、より好ましくは５以上１０以下であり、さらに好ましくは６以上１０以下である。
　ＩｇＧ４との結合に基づく第２の強度情報に適用する所定の数値指標として、第２の閾値情報を設定することができる。第２の閾値情報は、２種類のカットオフ値を含むことができる。各検体につき、各エピトープペプチドについて得られる第２の強度情報はこれらの２種類のカットオフ値と同値以上及び／又は超えるとき、ＩｇＧ４結合に基づく有意なエピトープペプチド（ＩｇＧ４高発現エピトープペプチド（第２のエピトープペプチド）ともいう。）として抽出される。
　第２の閾値情報としても、第１の閾値情報と同様に、第１のカットオフ値と第２のカットオフ値とを設定することができる。第２の閾値情報における第１のカットオフ値は、第１の強度情報の第１のカットオフ値に適用されたのと同様の有意水準を適用することが好ましい。また、第２の閾値情報における第２のカットオフ値は、第１の強度情報の第２のカットオフ値の設定に適用されたのと同様の乗算値を適用することが好ましい。なお、第２の閾値情報の各カットオフ値に関し、それぞれ第１の閾値情報におけるのと異なる有意水準及び乗算値が適用されることを排除するものではない。
　以上説明したように、この検出工程では、第１の強度情報及び第２の強度情報に対して、これらの第１の閾値情報及び第２の閾値情報を適用することで、ＩｇＥ高発現エピトープペプチド及びＩｇＧ４高発現エピトープペプチドを得ることができる。すなわち、目的とするアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出することができる。これらの高発現エピトープペプチドは、それ自体、目的のアレルゲンタンパク質に対する反応性を特徴付けることができる。
　また、こうして抽出された高発現エピトープペプチドの個数やその比（ＩｇＧ４高発現エピトープ数／ＩｇＥ高発現エピトープペプチド数（以下、ＩｇＧ４／ＩｇＥともいう。）も目的のアレルゲンタンパク質に対する反応性を特徴付けることができる。
　なお、ＩｇＥ高発現エピトープの抽出に際しては、中和抗体の考え方に基づく補正を適用することができる。中和抗体の考え方とは、特定のエピトープに対するＩｇＥが多いとき発症するが、同時に同じエピトープを認識するＩｇＧ４が存在すると発症に至らない、という考え方である。こうした考え方によれば、このような特定エピトープをＩｇＥ高発現エピトープとしてカウントしない、すなわち、除することになる。したがって、中和抗体の考え方に基づく補正方法は、特定のエピトープペプチドに関し、ＩｇＥ高発現エピトープペプチドでもありＩｇＧ４高発現エピトープペプチドでもあるとして抽出されたときには、そのエピトープペプチドをＩｇＥ高発現エピトープペプチドとしてはカウントしないようにする。この補正方法によれば、適切なＩｇＥ高発現エピトープペプチドが抽出されることになり、後述する診断工程における正診率の向上のほか、第３のカットオフ値の設定精度を高めることができる。
（診断工程）
　この診断工程では、ここで説明した検出工程において得られた情報、すなわち、アレルゲンタンパク質に対する反応性を利用してアレルギー疾患に関する状況を診断することができる。より具体的には、比験試料についての、ＩｇＥ高発現エピトープペプチド、ＩｇＧ４高発現エピトープペプチド、これらの各個数及び／又はＩｇＧ４／ＩｇＥを利用してアレルギー疾患に関する状況を診断できる。この診断工程によれば、診断材料が、比験試料のアレルゲンタンパク質に対する反応性がより特徴的であると考えられるため、多様な患者に対してより確度の高い診断が可能になると考えられる。
　この診断工程では、例えば、比験試料につき、ＩｇＥ高発現エピトープペプチド数とＩｇＧ４高発現エピトープ数との比であるＩｇＧ４／ＩｇＥを用いることができる。そしてＩｇＧ４／ＩｇＥが所定の数値指標以上又は当該数値指標を超えるとき、アレルゲン陰性又はこれに類した状況であると診断できる。
　ＩｇＧ４／ＩｇＥに適用する数値指標として、第３の閾値情報を設定できる。第３の閾値情報は、上記のとおりのカットオフ値（第３のカットオフ値）である。このカットオフ値は、負荷陽性及び陰性が予め他の方法で確定診断がついている群（確定診断群）から取得された、第１の強度情報及び第２の強度情報に基づいて設定される。
　例えば、確定診断群につき、接触工程、検出工程、強度情報取得工程及び検出工程を実施し、種々に第３のカットオフ値を異ならせたときの診断結果（正診率）と確定診断結果とを照らし合わせる。そして、一定以上の正診率、例えば、７５％以上、好ましくは７７％以上、より好ましくは７８％以上、さらに好ましくは７９％以上、一層好ましくは８０％以上の正診率が得られる、カットオフ値を設定するようにする。本明細書に開示する実施例によれば、牛乳アレルギーに関するエピトープペプチドを用いた診断においては、この診断工程における第３のカットオフ値は、１．５～１０以下程度の範囲で、一定以上、すなわち、８０％程度を確保できることがわかっている。
　なお、本発明者らによれば、第３のカットオフ値は、第２のカットオフ値、すなわち、乗算値によって変化することもわかっている。したがって、第２のカットオフ値のための乗算値を種々に異ならせつつ、同時に第３のカットオフ値を種々に異ならせたときの診断結果と確定診断結果から得られる正診率に基づいて、これらの数値を設定することが好ましい。
　好ましい第３のカットオフ値としては、例えば、第２のカットオフ値の設定に用いる乗算値にもよるが、５以上１２以下程度、より好ましくは、５以上１０以下程度とすることができる。
　本明細書の開示によれば、また、アレルゲンタンパク質に対する反応性の相違又は変化を検出する方法も提供される。本明細書に開示の診断方法の抗原抗体反応工程、抗原抗体反応の検出工程、強度情報の取得工程及び反応性を検出する工程は、アレルギー疾患の診断でなく、単に、アレルゲンタンパク質に対する反応性の相違又は変化を検出するのに用いることができる。例えば、実験的にあるいは研究的にこのような相違や変化を検出するのにも用いることができる。
　本明細書の開示によれば、アレルギー疾患の診断基準の作成方法も提供される。本明細書の開示の作成方法は、アレルギー疾患の異なる状況に関し診断の確定している複数の群を準備し、これらの各群につき、上記した抗原抗体反応工程、抗原抗体反応の検出工程、強度情報の取得工程、反応性を検出する工程及び確定した診断と関連付けられる反応性の特徴を抽出し、これを前記異なる状況についての診断基準とする工程を備えることができる。こうした作成方法によれば、アレルギー疾患の異なる状況に関し、容易にかつ明確な特徴付けが可能であるため、明確な診断基準を作成することができる。診断基準は、確定した診断内容を他の確定した診断内容を区別可能に作成される。診断基準は、第１の強度情報及び第２の強度情報並びにその分布のほか、必要に応じてカットオフ値や強度比を含んで作成する。なお、本明細書の開示の診断基準の作成方法における上記した抗原抗体反応工程、抗原抗体反応の検出工程、強度情報の取得工程、反応性を検出する工程は、本明細書の開示の診断方法のこれら対応する工程の実施態様を含むことができる。
　なお、本明細書の開示の作成方法においては、アレルギー疾患の異なる状況としては、現在又は既往のアレルギー症状やＩｇＥ抗体レベルが、異なる状況が挙げられる。典型的には、特定の抗原に対して感受性持続状態、同感作状態及び同耐性獲得状態等が挙げられる。アレルギー疾患の異なる状況に診断が確定している群は、複数の被験試料の集合であることが好ましい。
　本明細書の開示によれば、牛乳アレルギー疾患の診断装置も提供される。すなわち、配列番号１～３４０で表されるアミノ酸配列から選択される２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを固定化した固相担体を備える診断装置も提供される。こうした固相担体としては、本明細書の開示の診断方法において記載したのと同様の態様が挙げられる。
　以下、本発明を、具体例を挙げて説明するが、以下の実施例は、本発明を説明するものであって本発明を限定するものではない。
　主要な６つのミルクアレルゲン蛋白（αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン、α－ラクトアルブミン、β－ラクトグロブリン）の全アミノ酸配列を網羅した１６残基、３－オフセットからなるペプチドをガラス基板に固定化したペプチドアレイを準備した。このペプチドアレイを用いて、持続性牛乳アレルギー個体から採取した血清、牛乳ＩｇＥ感作個体から採取した血清及び牛乳耐性獲得個体から採取した血清中のＩｇＥ、ＩｇＧ４の分析を行った。グループ毎にＩｇＥ対ＩｇＧ４シグナルのスキャッタープロットを作成し、パターンの違いを評価した。各群を構成する個体の要件は以下の通りとした。
１．持続性牛乳アレルギー陽性個体群（１２検体）
（１）採血時年齢が４歳以上
（２）牛乳ＩｇＥ（ＣＡＰ－ＲＡＳＴ）クラス５以上
（３）過去に、以下に定義される「牛乳アレルギー症状」が確認されていること
       （ｉ）牛乳負荷試験で、３０ｍｌ以下の牛乳摂取で即時型反応陽性
（ii）３０ｍｌ以下の牛乳又はそれに相当する乳製品（育児用ミルクでは、６０ｍｌに該当）摂取で即時型反応
（iii）牛乳を含む加工品で即時型反応あり、そこに含まれる他の成分のアレルギーが否定されている
（iv）いずれの場合も、摂取から２時間以内に症状が確認されていること
　なお、本個体群には、以下の牛乳「超」過敏症個体も含んでいる。
１－１．牛乳「超」過敏症個体
（１）乳幼児期から牛乳アレルギーの既往（誘発症状）があって牛乳アレルギーの診断が確定している
（２）年齢が５歳を超えてから、牛乳の摂取・接触又は吸入によって即時型のアレルギー症状の経験がある。現在の年齢は問わない
（３）症状は、体の広範囲に及ぶ皮膚症状（紅斑・膨疹・浮腫）、呼吸器症状（咳、喘鳴、呼吸困難）、消化器症状（腹痛、嘔吐）、循環器症状の一つ以上を含む（湿疹の悪化、口腔粘膜症状のみ、接触部位に限定した蕁麻疹、下痢のみ、は除く）
（４）摂取から２時間以内に症状が出現している
（５）症状を誘発した牛乳含有食品が、以下のいずれかに該当する（負荷試験か誤食かは問わない）
　１０ｍｌ以下の牛乳又はそれに相当する乳製品、牛乳をわずかに含む加工品（ただし、同時に含まれる他の成分（卵や小麦など）のアレルギーが否定されていること）、乳成分のコンタミネーションや牛乳との接触・乳製品を加熱した水蒸気の吸入、乳成分を含有することがわかっている医薬品（ラックＢ、エンテロノン、メイアクト）（いずれも商品名である。）
（６）牛乳特異的ＩｇＥ抗体陽性（クラス１以上）
（７）乳幼児期から現在まで、牛乳完全除去を継続している。ただし、乳糖と治療用加水分解乳（ミルフィー、ＭＡ－１、ＭＡ－ｍｉ、ペプディエット）（いずれも商品名である。）は摂取可能であってもよい
２．牛乳ＩｇＥ感作個体群（７検体）
（１）牛乳ＩｇＥ（ＣＡＰ－ＲＡＳＴ）クラス２以上
（２）過去に、牛乳アレルギーを疑わせる誘発症状の既往がない
（３）現在、３０ｍｌ以上の牛乳又はそれに相当する乳製品が日常的に摂取可能
（４）過去に未摂取の患児で初めての牛乳負荷試験が陰性（３０ｍｌ以上摂取）であった場合は、その後の乳製品摂取で誘発症状のないことが複数回確認されていること
（５）現在の年齢は問わない
３．牛乳耐性獲得個体群（５検体）
（１）過去に「牛乳アレルギー症状」に該当する既往がある
（２）現在は「牛乳ＩｇＥ感作血清」の定義を満たす
４．コントロール血清（３検体）
（１）牛乳ＩｇＥ（ＣＡＰ－ＲＡＳＴ）陰性（クラス０）
（２）ヤケヒョウヒダニ、ネコノフケ、卵白、小麦、カモガヤ、スギＩｇＥ抗体がすべて測定されていて、すべて陰性
（３）総ＩｇＥ値が３０ＩＵ／ｍｌ以下
（４）年齢、性別、基礎疾患は問わない
　対象者の多くは喘息や湿疹の訴えがあってアレルギーのスクリーニングをした症例。アレルギーらしい症状が全くない対象者ではない。
（１）ペプチドアレイの作製
　ペプチドアレイは、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、αs1－カゼイン、αs2－カゼイン、β－カゼイン及びκ－カゼインの６種のアレルゲンタンパク質につき、それぞれ、配列番号１～５１、配列番号５２～９１、配列番号９２～１５４、配列番号１５５～２２０、配列番号２２１～２８７、配列番号２８８～３４０に記載のペプチドを化学合成し、ペプチドアレイを作製した。ペプチドへのアレイへの固定化は以下の通りとした。なお、固相担体としては、ガラス基板を用いた。その後、イムノアッセイ（検体の供給及び蛍光検出）を行い、検出した蛍光強度を数値化した。なお、蛍光スキャナーは、Agilent社製scanner model G2505B, software G2565BA/DAを用い、数値解析ソフトとしては、Axon社製Gene Pix.Proを用いた。
（２）ペプチドの固定化
ａ）８０℃で１時間加熱処理をした
ｂ）（２×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ）溶液に１５分間浸漬した（室温）
ｃ）（２×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳ）溶液に５分間浸漬した（９５℃）
ｄ）滅菌水中で１０回程度振とうした（３回）
ｅ）遠心乾燥する
（３）イムノアッセイ
ａ）（５０ｍＭ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，０．１％ ＳＤＳ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）溶液に９０分間浸漬した（室温）
ｂ）ＰＢＳ－Ｔ（１×ＰＢＳ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に５分間浸漬した（室温、３回）
ｃ）（１％ ＯＶＡ，ＰＢＳ－Ｔ）溶液で希釈した患者血清（１：１０）２００μＬをアプライした担体をマイクロカバーガラス（松浪ガラス社製ｓｉｚｅ２４×６０ｍｍ、ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ Ｎｏ．４）で覆い、Ｈｕｍｉｄ ｃｈａｍｂｅｒ（Ｓｉｇｍａ社）内で１時間静置した（３７℃）
ｄ）ｃ）で反応中の担体を４℃の環境下に移し、一晩静置した
ｅ）ＰＢＳ－Ｔ溶液中でマイクロカバーガラスを外した。
ｆ）ＰＢＳ－Ｔ溶液に５分間浸漬した（室温、３回）
ｇ）（１％ＯＶＡ、ＰＢＳ－Ｔ）溶液で希釈したGoat anti-human IgE-Alexa647 polyclonal antibodiesとMouse anti-human IgG4-Alexa555 monoclonal antibodiesの混合液（１：１：５００）２００μｌをｃ）と同様の手順で反応させ、暗所にて３時間静置した（室温）
ｈ）ＰＢＳ－Ｔ溶液中でマイクロカバーガラスを外す
ｉ）ＰＢＳ－Ｔ溶液に５分間浸漬した（室温、３回）
ｊ）滅菌水中で１０回程度振とうした（３回）
（４）各群毎に、ＩｇＥ対ＩｇＧ４のシグナル強度のスキャッタープロット（分布図）を作成し、その各ドットの分布状態（分布パターン）の相違を評価した。
　持続性牛乳アレルギー群（１２検体）の各ペプチドにおける平均蛍光強度値を図４に示す。図４に示すように、αｓ１－カゼイン、β－カゼイン由来のペプチドに対する反応性が特に強く、β－ラクトアルブミン、αｓ２－カゼイン、κ－カゼインに関してはほとんどのペプチドで同一ペプチドに対するＩｇＥ結合がＩｇＧ４結合より強かった。α－ラクトアルブミンに関してはほとんど反応がみられなかった。
　ペプチドによりＩｇＧ４／ＩｇＥ蛍光強度比が様々であることから、その割合を見るためグループ毎（持続性牛乳アレルギー群１２検体、牛乳ＩｇＥ感作群７検体、牛乳耐性獲得群５検体）における各ペプチドのＩｇＥ対ＩｇＧ４シグナルのスキャッタープロットを作製した。これらのプロットを図５（ａ）～（ｃ）に示す。
　図５に示すように、これらの群のスキャッタープロットはそれぞれ特有の分布を示した。コントロール血清（３検体）から得られた全ペプチドのデータをもとに９５パーセンタイルの蛍光強度値をカットオフ値と定めて（図５中の破線）、それ以上の蛍光強度を示すペプチドをポジティブとみなした。持続性牛乳アレルギー群でＩｇＥシグナルポジティブ・ＩｇＧ４シグナルネガティブ（以下、ＩｇＥシングルポジティブ）のペプチドが全ペプチドの７．５％を占めるのに対し（図５（ａ）参照）、牛乳ＩｇＥ感作群、牛乳耐性獲得群ではそれぞれ１．２％、１．８％であった（図５（ｂ）及び（ｃ）参照）。また、ＩｇＧ４シグナルポジティブ・ＩｇＥシグナルネガティブ（以下、ＩｇＧ４シングルポジティブ）のペプチドは持続性牛乳アレルギー群、牛乳耐性獲得群でそれぞれ６．７％、７．５％に対し、牛乳ＩｇＥ感作群では２１．５％と高値であった。ＩｇＥ・ＩｇＧ４シグナルダブルポジティブ（以下、ＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブ）のペプチドは持続性牛乳アレルギー群、牛乳ＩｇＥ感作群でそれぞれ８．０％、６．１％であり、牛乳耐性獲得群は２．４％であった。牛乳耐性獲得群はポジティブシグナルの割合が全体的に低かった。
　これらの差をより明確にするため、別に準備した牛乳アレルギー陰性群（２２検体）と比較して、牛乳アレルギー陽性群（６１検体）で有意にＩｇＥの結合が認められたエピトープペプチド（表１参照）のみで同様のスキャッタープロットを作成した。このプロットを図６（ａ）～（ｃ）に示す。図６（ａ）に示すように、ＩｇＥシングルポジティブは持続性牛乳アレルギー群で７．５％から１６．２％に上昇した。ＩｇＧ４シングルポジティブは牛乳ＩｇＥ感作群で２１．５％から２３．１％とあまり変わらなかったものの（図６（ｂ）参照）、持続性牛乳アレルギー群、牛乳耐性獲得群ではそれぞれ６．７％、７．５％から１．５％、３．３％に減少し（図６（ａ）及び（ｂ）参照）、その差はより顕著になった。図６（ａ）～（ｃ）に示すように、ＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブは持続性牛乳アレルギー群、牛乳ＩｇＥ感作群でそれぞれ２０．４％、１０．０％であった。
　図６（ａ）～（ｃ）から、ペプチドの分布パターンが持続性牛乳アレルギー群ではＩｇＥに、牛乳ＩｇＥ感作群ではＩｇＧ４における蛍光強度値が相対的に高く、両者の分布パターンが異なることから、ＩｇＥとＩｇＧ４の蛍光強度比を識別線として用いて群間を分類した。
　すなわち、図６の各プロットにおいて、ＩｇＥシングルポジティブとＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブでＩｇＥとＩｇＧ４の所定の蛍光強度比で設定した識別線より蛍光強度比が低いペプチドを領域Ａのペプチドとし、ＩｇＧ４シングルポジティブとＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブで識別線より蛍光強度比が高いペプチドを領域Ｂのペプチドとそれぞれ定めた。本実施例のペプチドアレイを適用したときに得られるポジティブなペプチドが領域Ｂより領域Ａに分布するペプチドを多く含む血清を持続性牛乳アレルギー群、領域Ａより領域Ｂに分布するペプチドを多く含む血清を牛乳ＩｇＥ感作群と分類した。これらの分類結果を図７及び図８に示す。
　図７に示すように、ＩｇＧ４／ＩｇＥ＝０．６～３．２の識別線（ＩｇＥとＩｇＧ４の蛍光強度比）を用いることで偽陽性も偽陰性も排除して分類をすることが可能であった。一例として、ＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブの領域を、一例としてＩｇＧ４／ＩｇＥ＝２で分割したときのスキャッタープロット図を図８に示す。図８に示すように、領域Ａに分布するペプチドの割合は持続性牛乳アレルギー群で３５．２％、牛乳ＩｇＥ感作群で２．０％であり、一方、領域Ｂは持続性牛乳アレルギー群で２．９％、牛乳ＩｇＥ感作群で３１．７％と最もよく分類することが可能となった。牛乳耐性獲得血清はいずれの領域も５．５％以下に分布し、持続性牛乳アレルギー群、牛乳ＩｇＥ感作群の中間に分布するものと考えられる。
　次に各グループの個々の血清において識別線を設けることにより、各領域に分類されるペプチドの数を図９に示す。図９に示すように、個体差はあるものの、持続性牛乳アレルギー血清では領域Ａに分布するペプチドが領域Ｂに分布するペプチドより多く、牛乳ＩｇＥ感作血清ではその逆であった。牛乳耐性獲得血清は領域Ａにより多く分布するもの、領域Ｂにより多く分布するものと検体により様々であった。
　さらに、識別線の設定に用いていない持続性牛乳アレルギー血清、牛乳ＩｇＥ感作血清をそれぞれ３検体ずつ用いて、ブラインド試験により識別線を利用した分類を試みた。結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、持続性牛乳アレルギー血清は領域Ａにより多くのペプチドが分布し、牛乳ＩｇＥ感作血清は領域Ｂにより多くのペプチドが分布した。
　以上の結果から持続性牛乳アレルギー血清と牛乳ＩｇＥ感作血清をＩｇＥ対ＩｇＧ４シグナルのスキャッタープロットのパターンの違いから蛍光強度比による識別線を設けることにより、これらのアレルギー群を明確に分類することが可能であることがわかった。牛乳耐性獲得血清はその中間に位置するものと考えられた。
　実施例１で用いたのと同一のペプチドアレイを用いて、牛乳アレルギー患者が耐性を獲得するまでの血清中ＩｇＥ、ＩｇＧ４の分析を行った。ＩｇＥ対ＩｇＧ４シグナルのスキャッタープロットを作成し、経時変化による分布パターンの違いを評価した。血清の採取の要件は以下の通りとした。
　採取時期：同一患者の血清（１検体）で牛乳アレルギーから耐性を獲得するまで（３ヵ月、５ヵ月、９ヵ月、１歳６ヶ月）の４点。なお、３ヵ月、５ヵ月及び９ヵ月の各採取血清は、牛乳アレルギー血清に相当し、１歳６ヶ月採取血清は、牛乳耐性獲得血清に相当する。こうした血清を採取する個体は次の要件を充足するものとした。
１．牛乳アレルギー血清採取個体
　実施例１における「１．持続性牛乳アレルギー陽性個体群の（３）に記載の要件の全てを充足する個体から採取されるものとした。
２．牛乳耐性獲得血清採取個体
（１）過去に「牛乳アレルギー症状」に該当する既往がある
（２）現在は３０ｍｌ以上の牛乳又はそれに相当する乳製品が日常的に摂取可能
（３）牛乳ＩｇＥ（ＣＡＰ－ＲＡＳＴ）クラス２以上
（４）現在の年齢は問わない
　各血清を、実施例１と同様の方法でペプチドアレイに適用し、ハイブリダイゼーション実施後、イムノアッセイを行い、シグナルを蛍光スキャナーで測定し蛍光強度の数値化を実施し、ＩｇＥ対ＩｇＧ４シグナルのスキャッタープロットを作成し、経時変化による分布パターンの違いを評価した。
　牛乳アレルギー陽性群６１例と牛乳アレルギー陰性群２２例の比較により、陽性検体でＩｇＥ結合が有意なペプチドを用いて、牛乳アレルギー患者が耐性を獲得するまでのＩｇＥ対ＩｇＧ４シグナルのスキャッタープロットの経時変化を図１１（図１１；（ａ）３ヵ月、（ｂ）５ヵ月、（ｃ）９ヵ月、（ｄ）１歳６ヵ月）に示す。図１１では、実施例１で示したカットオフ値（コントロール血清３検体から得られた全ペプチドのデータによる９５パーセンタイルの蛍光強度値）とＩｇＧ４／ＩｇＥ蛍光強度比（一例としてＩｇＧ４／ＩｇＥ＝２）の識別線より、ＩｇＥシングルポジティブとＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブで識別線より蛍光強度比が低い領域、ＩｇＧ４シングルポジティブとＩｇＥ・ＩｇＧ４ダブルポジティブで識別線より蛍光強度比が高い領域をそれぞれ領域Ａ、領域Ｂとして表示されている。
　図１１に示すように、経過とともに全ペプチドに対し領域Ａに占めるペプチドの割合は３４．２％（３ヵ月）から２４．７％（５ヵ月）、１７．８％（９ヵ月）と徐々に減少し、耐性獲得が判明した１歳６ヵ月時には２．７％と急激に減少した。一方、領域Ｂに占めるペプチドの割合は３ヵ月で６．８％と若干のシグナルがみられるものの、５ヵ月、９ヵ月の１．４％以下から耐性獲得時（１歳６ヵ月）で１２．３％と増加が観察された。
　図１２に領域Ａ及びＢに分布するペプチド数の経時変化を示した。牛乳アレルギー時である３ヵ月、５ヵ月、９ヵ月では領域Ｂより領域Ａに分布するペプチド数の方が多く、逆に耐性獲得時である１歳６ヵ月では領域Ａより領域Ｂに分布するペプチド数の方が多かった。
　以上の結果から、所定のＩｇＧ４／ＩｇＥ蛍光強度比（識別線）を指標として、領域Ａ、Ｂに分布するペプチド数の変遷により牛乳アレルギー患者の耐性獲得を推定できることがわかった。
　以上の実施例によれば、個体群につき確認された各アレルゲンタンパク質のエピトープペプチドと特異的に反応するＩｇＥ及びＩｇＧ４の強度情報に基づく診断手法は、各個体におけるアレルゲンタンパク質に対する反応性の相違や変化を検出するのに好ましいことがわかった。
　また、以上の実施例によれば、エピトープペプチドについて得られるＩｇＥ及びＩｇＧ４の強度情報を利用して各種の指標を設定してエピトープペプチドを分類することで、アレルギー疾患において異なる症状レベルにある個体及び個体群の反応性をそれぞれ明確に特徴付けできることがわかった。したがって、こうした手法によれば、偽陽性や偽陰性の診断結果を排除できるとともに、アレルギー患者が耐性獲得していく傾向など、従来は判断が困難であった状況も判断できるようになる。
　本実施例では、表１に示す陽性検体でＩｇＥ結合が有意なペプチドを一様に適用するのではなく、各患者ごとの蛍光強度値の大きいＩｇＥ結合及びＩｇＧ４結合が有意なエピトープペプチドを利用した解析を試みた。
１．各患者における個別の高発現エピトープペプチドの抽出
１－１．高発現エピトープ抽出のためのＩｇＥに関する第１の閾値情報及び第２の閾値情報の取得
　まず、実施例１と同様に、患者として全体で６５名からなる患者群（実施例１の患者を含む。また、負荷陽性患者３７名及び負荷陰性患者２８名を含む。）から採取した検体を、実施例１と同様に操作してペプチドアレイに供して、牛乳アレルギーに関連するエピトープペプチド毎のＩｇＥ結合に基づく蛍光強度値を取得した。なお、患者群には、ＩｇＥクラス判定においてクラス１（偽陽性）であって、牛乳アレルギー負荷試験における陰性患者（以下、クラス１負荷陽性患者という。）を３名含んでいた。これらのクラス１負荷陽性患者をネガティブコントロールとし、全エピトープペプチドに対する蛍光強度値を、エピトープペプチド毎に平均化し、各エピトープペプチドにつき、平均蛍光強度値を取得した。すべての平均蛍光強度値を降順し配列して９５％有意水準に該当した平均蛍光強度値を、高発現エピトープ抽出用のＩｇＥに関する第１の閾値情報とした。すなわち、各患者から抽出されるＩｇＥ高発現エピトープは、少なくとも第１の閾値情報である蛍光強度値以上の蛍光強度値を有することとなる。第１の閾値情報となる蛍光強度値は、本実施例においては、１８９であった。
　次に、各エピトープペプチドの平均蛍光強度値の１０倍となる蛍光強度値をＩｇＥに関する第２の閾値情報とした。したがって、ＩｇＥに関する第２の閾値情報は、エピトープペプチド毎に存在することとなる。
　なお、本実施例の患者群につき、閾値を０倍（第１の閾値情報である蛍光強度以上のエピトープをすべて高発現エピトープとして抽出した場合に相当する）～２０倍にまで設定したときの正診率のシミュレーションにより、この閾値が５倍～２０倍においておおよそ一定であることがわかっている。
　以上のことから、各患者から抽出されるＩｇＥ高発現エピトープは、全エピトープペプチドに共通して設定された第１の閾値情報である蛍光強度値以上の蛍光強度値を有し、かつ、各エピトープペプチドに個別に設定された第２の閾値情報である蛍光強度値以上の蛍光強度値を有するエピトープペプチドとなる。
１－２．高発現エピトープ抽出のためのＩｇＧに関する第１の閾値情報及び第２の閾値情報の取得
　１－１．と同様に、患者群中のクラス１負荷陽性患者をネガティブコントロールとし、全エピトープペプチドに対するＩｇＧ結合に基づく蛍光強度値をエピトープペプチド毎に平均化し、各エピトープペプチドにつき、平均蛍光強度値を取得した。すべての平均蛍光強度値を降順し配列して９５％有意水準に該当した平均蛍光強度値を、高発現エピトープ抽出用のＩｇＧ４に関する第１の閾値情報とした。すなわち、各患者から抽出されるＩｇＧ４高発現エピトープは、少なくとも第１の閾値情報である蛍光強度値以上の蛍光強度値を有することとなる。第１の閾値情報となる蛍光強度値は、本実施例においては、５６７であった。また、ＩｇＥに関する第２の閾値情報と同様、各エピトープペプチドの平均蛍光強度値の１０倍となる蛍光強度値をＩｇＧ４に関する第２の閾値情報とした。なお、ＩｇＧ４に関する第２の閾値情報についても、正診率のシミュレーションにより、この閾値が５倍～２０倍においておおよそ一定であることがわかっている。
　以上のことから、各患者から抽出されるＩｇＧ４高発現エピトープは、全エピトープペプチドに共通して設定された第１の閾値情報である蛍光強度値以上の蛍光強度値を有し、かつ、各エピトープペプチドに個別に設定された第２の閾値情報である蛍光強度値以上の蛍光強度値を有するエピトープペプチドとなる。
　１－３．ＩｇＥ及びＩｇＧ４についての高発現エピトープの取得
　ＩｇＥ及びＩｇＧ４のそれぞれについて設定した第１の閾値情報と第２の閾値情報とに基づき、全患者６５名のそれぞれにつきＩｇＥ及びＩｇＧ４高発現エピトープを抽出した。ある患者（患者番号１９）についての、高発現エピトープの抽出結果を図１３に示す。図１３（ａ）には、ＩｇＥの高発現エピトープの抽出解析結果を示し、図１３（ｂ）には、ＩｇＧ４の高発現エピトープの抽出解析結果を示す。これらの図においては、Ｘ軸は、ネガティブコントロールからエピトープペプチド毎に取得された平均蛍光強度値をＸ軸とし、各患者のエピトープペプチド毎に取得された蛍光強度値をＹ軸としている。したがって、第１の閾値情報の蛍光強度値以上であり第２の閾値情報の蛍光強度値以上となるエピトープペプチドは、これらの図において点線で示される境界線以上の領域にあるエピトープペプチド（スポット）となる。
　なお、以上の解析にあたり、各患者においては、各エピトープペプチドにつき３連でＩｇＧ４及びＩｇＥにつき蛍光強度値を取得し、各エピトープペプチド毎にこれらの３つの蛍光強度値を用いた。
２．ＩｇＥ及びＩｇＧ４高発現エピトープペプチドによる診断解析
２－１．高発現エピトープペプチド数の分布解析
　患者群のうち負荷陽性患者と陰性患者のそれぞれについてのＩｇＥ高発現エピトープペプチド数をプロットした（ＩｇＥ高発現エピトープペプチド数をＹ軸とした。）。また、同様にして、ＩｇＧ４高発現エピトープペプチド数をプロットした。これらの結果を図１４に示す。なお、図１４には、ＣＡＰ－ＲＡＳＴによる患者群の評価結果を併せて示す。
　図１４に示すように、負荷陽性患者では、ＩｇＥ高発現エピトープペプチド数が多く、陰性患者では、ＩｇＧ４高発現エピトープペプチド数が多いことがわかった。これらのことから、これらのエピトープペプチド数の比（ＩｇＧ４／ＩｇＥ：ＩｇＧ４高発現エピトープペプチド数／ＩｇＥ高発現エピトープペプチド数
）を用いた解析を行うこととした。
２－２．高発現エピトープペプチド数の比による解析
　次に、患者群のうち、負荷陽性患者と陰性患者のそれぞれについてのＩｇＥ高発現エピトープペプチド数をＸ軸に、ＩｇＧ４の高発現エピトープ数をＹ軸に取ってプロットした。これらのプロットを、図１５に示す。図１５（ａ）は、全患者についてのＩｇＥ高発現エピトープペプチド数とＩｇＧ４高発現エピトープ数とのプロットを示し、図１５（ｂ）は、その一部を拡大して示し、図１５（ｃ）は、負荷陽性患者と陰性患者に分けてＩｇＧ４／ＩｇＥをプロットした図を示す。
　図１５に示すように、陰性患者は、傾き（ＩｇＧ４／ＩｇＥ）が大きく、負荷陽性患者は傾きが小さい傾向があることがわかった。この傾きを利用して正診率を検証した。検証の結果、ＩｇＧ４／ＩｇＥを１０以上とし、ＩｇＧ４／ＩｇＥが１０以上を陰性患者とし、１０未満を負荷陽性患者とし、さらに、０／０も陽性（陰性でない）として判定したとき、擬陰性１名、擬陽性１０名であった。患者群は、陽性患者は３７名、陰性患者２８名であるから、擬陰性率(負荷陽性であるのに陰性と判定された率)、擬陽性率（陰性であるのに陽性と判定された率）及び正診率は以下のとおりとなった。
　擬陰性率＝２．７％（１／３７：負荷陽性患者３７名中、３６名正解、１名不正解）
　擬陽性率＝４３％（１２／２８：陰性患者２８名中、１６名正解、１２名不正解）
　正診率＝８０．０％（５２／６５：全患者数６５名中、５２名正解）
　以上のように、患者個別にＩｇＥ及びＩｇＧ４高発現エピトープペプチドを抽出することによっても、高い正診率を得られることがわかった。
　なお、負荷陽性患者と陰性患者とを識別するための高発現エピトープ数の比である「ＩｇＧ４／ＩｇＥ」は、適正な正診率が得られる範囲で設定することができる。例えば、高発現エピトープペプチドを抽出するための第２の閾値情報が相対的に低い場合には、ＩｇＧ４／ＩｇＥも相対的に低くなる傾向があり、第２の閾値情報が相対的に高い場合には、ＩｇＧ４／ＩｇＥも相対的に高くなる傾向がある。
　さらに、本発明者らは、中和抗体という考え方、すなわち、特定のエピトープに対するＩｇＥが高いときにアレルギーが発症するが、同時に同じエピトープを認識するＩｇＧ４が存在すると発症に至らない）を導入した補正を行った。すなわち、個々の患者において、ＩｇＥ高発現エピトープペプチドとＩｇＧ４高発現エピトープペプチドとが一致するとき、換言すれば、一つのエピトープペプチドにＩｇＥ結合に基づいて所定以上の蛍光強度値を示しＩｇＧ４結合に基づいても高い所定以上の蛍光強度値を示すとき、当該エピトープペプチドに関しては、ＩｇＧ４が中和抗体として機能しているものとした。すなわち、これらのエピトープペプチドは、蛍光強度値からしてＩｇＥ高発現エピトープであっても実際にはＩｇＥ高発現エピトープとして作用していないものとして、その数をＩｇＥエピトープペプチド数から除した。こうした中和抗体の考え方に基づく補正を各患者から取得した蛍光強度値に適用して、各患者について、改めてＩｇＥ高発現エピトープペプチド数を取得した。ＩｇＧ４高発現エピトープペプチド数と補正後のＩｇＥ高発現エピトープペプチド数とによるプロットを図１６に示す。
　こうした補正の結果、補正前の判定では、擬陽性（陰性患者であるのに陽性患者として判定）であった患者が陰性として正しく判定された。一方、補正前の判定において、陽性患者として正しく判定された負荷陽性患者が、擬陰性（負荷陽性患者であるのに陰性患者として判定）として判定された。結果として、正診率は、８３．１％（５４／６５：全患者数６５名中、５４名正解）となった。
　なお、中和抗体の考え方による補正は、高発現ＩｇＥエピトープペプチドを適切にカウントすることができるため、直接正診率の向上に寄与する場合があるほか、高発現エピトープペプチド数に依存する診断においてより直接的な貢献が期待できる。
　例えば、適切にカウントされたＩｇＥ高発現エピトープペプチド数を取得できることで、ＩｇＧ４／ＩｇＥは、陰性患者はより陰性側にシフトするため、より精度の高い判定が可能となる。より具体的には、本実施例での患者群から取得された蛍光強度値データに関し、ＩｇＥ及びＩｇＧ４に関する第１の閾値情報を各エピトープペプチドについてのネガティブコントロールの平均蛍光強度値の９５％有意水準に想到する平均蛍光強度値とし、第２の閾値情報を各エピトープペプチドについてのネガティブコントロールの平均蛍光強度値の８倍以上の蛍光強度値として抽出されるＩｇＥ高発現エピトープペプチドとＩｇＧ４高発現エピトープペプチドを抽出し、この結果得られる、負荷陽性患者及び陰性患者についてのＩｇＧ４／ＩｇＥのプロットを図１７（ａ）に示し、中和抗体の考え方に基づく補正後のプロットを図１７（ｂ）に示す。に示す。また、これらのデータに基づいて、正診率８１．５％となるＩｇＧ４／ＩｇＥを、補正前は５、補正後は８と設定した。
　図１７（ａ）に示すように、負荷陽性患者を正しく陽性と判定できた最大のＩｇＧ４／ＩｇＥ～陰性患者を正しく陰性と判定できた最小のＩｇＧ４／ＩｇＥの範囲（正答率の閾値範囲）は、３．６７～５．４６であった。一方、図１７（ｂ）に示すように、中和抗体の考え方による補正後においては、当該正答率の閾値範囲は、７．３３～１３にまで拡大する。すなわち、より明確に負荷陽性患者と陰性患者とを判定できるようになる。このように、中和抗体の考え方に基づく補正によって、ＩｇＧ４／ＩｇＥに関する閾値がより設定しやすくかつより適切な閾値設定ができるようになることがわかった。
　本実施例では、固相担体に固定化されたエピトープペプチドと被験試料との接触工程及び強度情報取得のための特異的結合の検出工程を、撹拌を伴って実施することについて評価した。操作手順は以下の通りとした。下記（１）～（５）の工程で用いた患者血清は、いずれも、ＩｇＥクラス６であった。
（１）1％OVA（ovalbumin）、PBS-T)溶液で希釈した患者血清(1:10) 100mlを、撹拌用マイクロカバーガラス（Agilent社製 Hybridization Gasket Slide G2534--60013）の1ブロックに滴下し、このカバーガラスと１ブロックに実施例１で用いたエピトープペプチドを３個づつ固定化したスポットを備えるペプチドアレイを張り合わせ、撹拌用チャンバー（Agilent社製 Hybridization Chamber G2534A）にセットし３７℃、１０分間、３０分間及び６０分間それぞれ撹拌した（接触工程の実施）。
（２）PBS-T溶液中でマイクロカバーガラスを外し、PBS-T溶液に５分間浸漬（室温、３回）し、（1％OVA、PBS-T)溶液で希釈したGoat anti-human IgE-Alexa647 polyclonal antibodiesとｋMouse anti-human IgG4-Alexa555 monoclonal antibodiesの混合液(1:1:500) 200μlを（１）と同様の手順で、３７℃で１５分間、３０分間、１時間及び３時間それぞれ撹拌をした（検出工程の実施）。
（３）次に、PBS-T溶液中でマイクロカバーガラスを外し、PBS-T溶液に５分間浸漬（室温、3回）し、さらに、滅菌水中で１０回程振とうすることを３回繰り返した。その後、遠心分離（９００ｒｐｍ、３分）で液切りした。
（４）液切り後のペプチドアレイを蛍光スキャナー(Agilent社製 scanner model G2505B,software G2565BA/DA)で蛍光強度を測定した。
（５）数値解析ソフト(Axon社製 Gene Pix.Pro)にて蛍光強度の数値化を実施し、n=3の平均蛍光強度をペプチドに対する蛍光強度値として評価に用いた。
　対照として、上記（１）の接触工程を、撹拌なしで３時間と一晩の間静置する以外は上記（１）～（５）と同様に操作して接触工程対照試料を作製した。また、上記（２）の検出工程を、撹拌なしで３時間静置する以外は上記（１）～（５）と同様に操作して検出工程対照試料とした。これらから得られる蛍光強度の測定結果を図１８～図２０に示す。
　図１８（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）には、各エピトープペプチドにつき、接触工程を撹拌なしで３時間と一晩静置したときに得られた蛍光強度値と接触工程で１０分、３０分及び６０分の範囲で撹拌して行ったときの蛍光強度値とのプロットをそれぞれ示す。図１８（ａ）～（ｃ）に示すように、３０分間撹拌しながら接触工程を実施することで、３時間と一晩静置したのと同様の効果が得られることがわかった。さらに、６０分間撹拌しながら接触工程を実施することで、３時間と一晩静置したときよりも高い蛍光強度値が得られることがわかった。
　図１９（ａ）、（ｂ）には、各エピトープにつき、検出工程を撹拌なしで３時間静置したときの蛍光強度値と検出工程を撹拌しながら１５分間及び３０分間実施したときの蛍光強度値とのプロットをそれぞれ示す。図１９から明らかなように、１５分間撹拌しながら検出工程を実施すると、３時間静置したときの約０．６倍の蛍光強度値を示し、３０分間撹拌しながら検出工程を実施すると、３時間静置したときとほぼ同等の蛍光強度値が得られることがわかった。
　図２０（ａ）、（ｂ）には、各エピトープにつき、検出工程を撹拌なしで３時間静置したときの蛍光強度値と検出工程を撹拌しながら１時間及び３時間実施したときの蛍光強度値とのプロットをそれぞれ示す。図２０から明らかなように、１時間撹拌しながら検出工程を実施すると、３時間静置したときの約３倍の蛍光強度値を示す一方、３時間撹拌しながら検出工程しても、それ以上蛍光強度値が増大しないことがわかった。
　以上のことから、撹拌しながら接触工程を実施したり検出工程を実施したりすることで、撹拌しないで静置してこれらの工程を実施したときに比べて、飛躍的に所要時間を短縮できることがわかった。また、従来よりも、蛍光強度を増強できることがわかった。

Claims (17)

  1. 　アレルギー疾患の診断方法であって、
    　１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質又はその一部のアミノ酸配列に基づいて取得した複数のエピトープペプチドを固定化した固相担体にアレルギー疾患の可能性のある個体由来の抗体を含有する被験試料を供給して前記エピトープペプチドと前記抗体とを接触させる工程と、
    　前記エピトープペプチドと前記抗体との特異的結合を検出する工程と、
    　前記各エピトープペプチドに関し、ＩｇＥとの結合に基づく第１の強度情報と、ＩｇＧ４との特異的結合に基づく第２の強度情報とを取得する工程と、
    　前記第１の強度情報及び前記第２の強度情報を利用して前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出する工程と、
    　検出した前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性に基づいて前記個体の前記アレルギー疾患に関する状況を診断する工程と、
    を備える、方法。
  2. 　前記検出工程は、前記第１の強度情報と前記第２の強度情報とがそれぞれ所定の数値指標を充足する前記エピトープペプチドの個数に基づいて前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記検出工程は、前記第１の強度情報が所定の数値指標を充足する第１のエピトープペプチドの個数と前記第２の強度情報が所定の数値指標を充足する第２のエピトープペプチドの個数とに基づいて前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性を検出する工程である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記第１の強度情報に適用される前記所定の数値指標は、前記エピトープペプチドに共通の第１のカットオフ値と前記エピトープペプチド毎の第２のカットオフ値であり、
    　前記第２の強度情報に適用される前記所定の数値指標は、前記エピトープペプチドに共通の第１のカットオフ値と前記エピトープペプチド毎の第２のカットオフ値である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記第１の強度情報についての前記第２のカットオフ値は、前記エピトープペプチド毎に得られる１又は２以上のネガティブコントロールのＩｇＥとの結合に基づく強度情報に基づいて取得され、
    　前記第２の強度情報についての前記第２のカットオフ値は、前記エピトープペプチド毎に得られる１又は２以上のネガティブコントロールのＩｇＧ４との結合に基づく強度情報に基づいて取得される、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記診断工程は、前記第１のエピトープペプチドの個数と前記第２のエピトープペプチドの個数のとの比に基づいて前記個体の前記アレルギー疾患に関する状況を診断する工程である、請求項３～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記検出工程は、前記第１の強度情報と前記第２の強度情報との比を利用する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 　前記検出工程は、前記比が所定の数値指標を充足する前記エピトープペプチドの個数に基づいて前記被験試料の前記１種又は２種以上のアレルゲンタンパク質に対する反応性の相違又は変化を検出する工程である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記検出工程は、前記第１の強度情報及び前記第２の強度情報を用いて得られる分布図を利用する工程である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　２種類以上の前記アレルゲンタンパク質に対してそれぞれ取得した前記複数のエピトープペプチドを固定化した前記固相担体を準備する、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　前記アレルギー疾患は、牛乳に対するアレルギー疾患である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　前記アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼイン、αs2-カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン及びβ－ラクトグロブリンからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼイン、β－カゼイン及びκ－カゼインからなる群から選択される１種又は２種以上を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記アレルゲンタンパク質は、αs1-カゼインを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 　複数のエピトープペプチドは、配列番号１～３４０で表されるアミノ酸配列から選択される２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを含む、請求項８～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　前記複数のエピトープペプチドは、以下の表に記載のアミノ酸配列から選択される２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  17. 　牛乳に対するアレルギー疾患の診断装置であって、
    　配列番号１～３４０で表されるアミノ酸配列から選択される２種以上のアミノ酸配列をそれぞれ有する複数のペプチドを固定化した固相担体を備える、装置。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015121495A (ja) * 2013-12-24 2015-07-02 国立大学法人名古屋大学 ミルクアレルギー個体の属性の予測方法
KR20160114412A (ko) * 2015-03-24 2016-10-05 엘지전자 주식회사 인플루엔자 검출용 센서
JP2017511478A (ja) * 2014-04-03 2017-04-20 ジェニスフィア・エルエルシー 食物アレルギーを検出するためのペプチド、試薬及び方法
KR20170129712A (ko) * 2015-01-30 2017-11-27 사이렉스 래보라토리즈 엘엘씨 다수의 식품 항원들 및 c1q-식품 단백질 면역 복합체에 대한 igg 항체 및 iga 항체의 동시 특징분석
JPWO2017195871A1 (ja) * 2016-05-13 2019-03-14 応用酵素医学研究所株式会社 アレルギー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法
CN110763835A (zh) * 2019-09-11 2020-02-07 天津医科大学 过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试剂盒中的应用
CN112010947A (zh) * 2020-09-10 2020-12-01 中新国际联合研究院 一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方法与应用
WO2021015123A1 (ja) * 2019-07-25 2021-01-28 東レ株式会社 アレルゲン固定化担体の製造方法及びアレルゲン特異的抗体の検出方法
WO2022050416A1 (ja) 2020-09-07 2022-03-10 三菱瓦斯化学株式会社 アレルギー疾患の判定方法及び判定システム
EP4126928A4 (en) * 2020-03-23 2024-05-01 Cdi Laboratories Inc PAN-ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN FINGERPRINT

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008107154A (ja) * 2006-10-24 2008-05-08 Green Peptide Co Ltd スギ花粉症の診断方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7923209B2 (en) * 2003-03-14 2011-04-12 Anergis, S.A. Allergen peptide fragments and use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008107154A (ja) * 2006-10-24 2008-05-08 Green Peptide Co Ltd スギ花粉症の診断方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Abstracts of 40th Autumn Meeting of the Society of Chemical Engineers, Japan, 2008", 24 February 2009, article HIROYUKI HONDA ET AL.: "Milk Alergy Shindan no Tameno Koshumitsu Peptide Array no Sakusei to Kaiseki" *
FLINTERMAN AE ET AL.: "Peanut epitopes for IgE and IgG4 in peanut-sensitized children in relation to severity of peanut allergy.", J ALLERGY CLIN IMMUNOL., vol. 121, no. 3, March 2008 (2008-03-01), pages 737 - 743 *
MATSUMOTO N ET AL.: "Peptide array-based analysis of the specific IgE and IgG4 in cow's milk allergens and its use in allergy evaluation.", PEPTIDES, vol. 30, no. 10, 18 July 2009 (2009-07-18), pages 1840 - 7, XP026653308, DOI: doi:10.1016/j.peptides.2009.07.005 *
SHREFFLER WG ET AL.: "IgE and IgG4 epitope mapping by microarray immunoassay reveals the diversity of immune response to the peanut allergen", ARA H 2., J ALLERGY CLIN IMMUNOL., vol. 116, no. 4, October 2005 (2005-10-01), pages 893 - 9, XP005094484, DOI: doi:10.1016/j.jaci.2005.06.033 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015121495A (ja) * 2013-12-24 2015-07-02 国立大学法人名古屋大学 ミルクアレルギー個体の属性の予測方法
US11215615B2 (en) 2014-04-03 2022-01-04 AllerGenis LLC Peptides, reagents and methods for detecting food allergy
JP2017511478A (ja) * 2014-04-03 2017-04-20 ジェニスフィア・エルエルシー 食物アレルギーを検出するためのペプチド、試薬及び方法
CN106662578A (zh) * 2014-04-03 2017-05-10 詹尼斯费尔公司 用于检测食物变态反应的肽、试剂和方法
KR20170129712A (ko) * 2015-01-30 2017-11-27 사이렉스 래보라토리즈 엘엘씨 다수의 식품 항원들 및 c1q-식품 단백질 면역 복합체에 대한 igg 항체 및 iga 항체의 동시 특징분석
JP2018504602A (ja) * 2015-01-30 2018-02-15 サイレックス ラボラトリーズ，エルエルシー 多重の食物抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体、およびＣ１Ｑ―食物タンパク質免疫複合体の同時の特性評価
KR102332418B1 (ko) 2015-01-30 2021-11-26 사이렉스 래보라토리즈 엘엘씨 다수의 식품 항원들 및 c1q-식품 단백질 면역 복합체에 대한 igg 항체 및 iga 항체의 동시 특징분석
KR102316324B1 (ko) 2015-03-24 2021-10-22 엘지전자 주식회사 인플루엔자 검출용 센서
KR20160114412A (ko) * 2015-03-24 2016-10-05 엘지전자 주식회사 인플루엔자 검출용 센서
JPWO2017195871A1 (ja) * 2016-05-13 2019-03-14 応用酵素医学研究所株式会社 アレルギー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法
JP7062291B2 (ja) 2016-05-13 2022-05-16 応用酵素医学研究所株式会社 アレルギー発症リスクを予測するためのデータを収集する方法
US11686733B2 (en) 2016-05-13 2023-06-27 Applied Medical Enzyme Research Institute Corporation Method for collecting data to predict risk of developing allergies
WO2021015123A1 (ja) * 2019-07-25 2021-01-28 東レ株式会社 アレルゲン固定化担体の製造方法及びアレルゲン特異的抗体の検出方法
CN110763835A (zh) * 2019-09-11 2020-02-07 天津医科大学 过敏原特异性IgE抗体独特型异质性强度在过敏原检测用试剂盒中的应用
EP4126928A4 (en) * 2020-03-23 2024-05-01 Cdi Laboratories Inc PAN-ISOTYPE IMMUNOGLOBULIN FINGERPRINT
WO2022050416A1 (ja) 2020-09-07 2022-03-10 三菱瓦斯化学株式会社 アレルギー疾患の判定方法及び判定システム
CN112010947A (zh) * 2020-09-10 2020-12-01 中新国际联合研究院 一种具有血管紧张素转换酶抑制活性的环十六肽及其制备方法与应用

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