CN115209917A - 用于检测花生过敏的测定法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了花生肽组合物和试剂盒，以及用于诊断花生过敏的方法，用于检测对花生的临床耐受性的发展的方法，以及用于使婴儿对花生过敏原脱敏的方法。

Description

用于检测花生过敏的测定法
技术领域
本公开部分涉及花生肽组合物和试剂盒，以及用于诊断花生过敏的方法，用于检测对花生的临床耐受性的发展的方法，以及用于使婴儿对花生过敏原脱敏的方法。
背景技术
食物过敏是成人和儿童的常见问题，并且症状可以从轻微的口腔瘙痒到可能危及生命的过敏性休克。食物过敏目前通过皮肤点刺测试或口腔激发测试以及特异性IgE和在一些情况下其他血清抗体诸如IgG4的血清水平测量来诊断。虽然这些测试指示临床反应的可能性，但是它们不能区分食物过敏的不同表型或提供预后信息。目前的过敏测试还涉及对患者的某种程度的风险。目前的IgE检测与患者的实际临床灵敏性之间的关系是一种较弱的关系，这种关系通常被定义为反应严重度和引起反应的过敏原的量的组合。目前的测试的另一个局限性是无法确定儿童患者是否会在儿童时期摆脱过敏。在这种情况下，特异性IgE水平与临床过敏的持续时间之间存在正但弱的相关性。
最近，有人提出，对食物过敏原的临床反应性可以与表位识别水平上的过敏原特异性IgE有更好的相关性。据报道，具有持续或更严重过敏反应的患者可识别更大量的IgE表位，这表明表位作图可作为过敏诊断和预测的另外工具。基于点膜的免疫测定法已经被用于表位作图。在该系统中，肽在膜上合成并且与患者的血清一起温育。该过程需要大量肽，并因此是容易出错的、耗时的、需要大量劳动的和昂贵的。这种形式的免疫测定法还需要大体积的患者血清。
食物过敏的临床表现的显著异质性对成功的管理和治疗提出了挑战，因此在食物过敏方面，精准医学策略与改善预防、管理目前病例和启动新疗法高度相关。用于确定食物过敏内型、发生过敏的风险、反应严重度和治疗预后的灵敏和特异性生物标志物是迈向精准医学之路的重要组成部分(Sicherer等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2015,135,357-67)。在过去的十年中，已经有许多研究评价了治疗持续性食物过敏的口服免疫疗法(OIT)的功效(Wood等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2016,137,1103-1110)。在花生过敏中，OIT已经显示出具有可接受的安全性特性并且展示了临床益处(Bird等人,J.AllergyClin.Immunol.Pract.,2017,5,335-344)。虽然临床反应性有所改善，但是OIT与显著的不良反应相关，其中一些人经历了过敏性反应并且15％至20％的人因不良反应而被迫停止治疗(Bird等人,J.Allergy Clin.Immunol.Pract.,2017；Keet等人,J.AllergyClin.Immunol.,2012,129,448-455；Longo等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2008,121,343-7；Meglio等人,Pediatr.Allergy Immunol.,2008,19,412-419；Skripak等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2008,122,1154-60；Staden等人,Allergy,2007,62,1261-1269)。除不良反应之外，一旦停止疗法，通常对OIT的响应不会得以维持，即患者对过敏原暂时脱敏但未达到耐受性(Wood等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2016,137,1103-1110；Burks等人,N.Engl.J.Med.,2012,367,233-243；Burks等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2008,121,1344-1350；Burks,Arb.Paul Ehrlich Inst.Bundesinstitut ImpfstoffeBiomed Arzneim Langen Hess,2013,97,122-123；Gorelik等人,J.AllergyClin.Immunol.,2015,135,1283-1292；和Keet等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2013,132,737-739)。然而，显而易见的是，研究正在取得进展，并且新的食物过敏疗法已接近获得FDA批准。这些治疗方法将受益于诊断和预后测试，这将帮助患者及其医生在进入疗法后了解疾病的严重度，在疗法期间监测患者以在不良反应出现之前评估其进展或发生，并且跟踪停止治疗后的患者状态。
针对花生蛋白的IgE抗体的产生是花生过敏的发病机理的核心。虽然已经生成了识别花生特异性IgE浓度的预测曲线，该预测曲线可预测95％的临床反应性，但是花生-IgE在较低IgE水平下的预测能力较差，而在较高水平下，读数仅仅是二元的，并因此难以用于帮助评估疗法的安全性或功效。这可能是由于测量了与临床无关的针对花生的组分的IgE抗体。针对Ara h 2的IgE预测了对花生的临床反应性(Lieberman等人,J.AllergyClin.Immunol.Pract.,2013,1,75-82)，但是在具有相似Ara h 2水平的个体之间存在大量临床异质性。肽微阵列由覆盖主要过敏原的整个连续表位库的重叠肽组成，已经被开发用于测量表位特异性免疫球蛋白响应(Lin等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2009,124,315-22；和Lin等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2012,129,1321-1328)。Ara h 1、2和3中结合至IgE的花生表位的数量可预测反应严重度(Flinterman等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2008,121,737-743)。作为组分解析诊断方法(ImmunoCAP)，针对花生Ara h1、Ara h2和Arah3的sIgE的存在表示“真正的”花生过敏和严重反应的高风险(例如，sIgE水平≥0.35kUA/L在诊断过敏时显示出75％-95％PPV、90％NPV；Klemans等人,J.Allergy Clin.Immunol.,2013,131,157-163)。
发明内容
本公开提供了用于诊断受试者中的花生过敏的方法，所述方法包括：在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列；使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物；以及测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合；其中当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于阈值时，所述受试者对花生过敏，并且当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合等于或小于阈值时，所述受试者对花生不过敏。
本公开还提供了用于检测对花生过敏的受试者对花生的临床耐受性的发展的方法，所述方法包括：在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成两种AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列；使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物；测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合；以及将所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合与来自此前从所述受试者获得的生物学样品的所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合进行比较；其中当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于或等于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者尚未建立对花生的临床耐受性；并且当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合小于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者已经建立对花生的临床耐受性。
本公开还提供了使婴儿对两种花生过敏原脱敏以诱导对花生的耐受性或不过敏性的方法，所述方法包括将两种花生肽施用于所述婴儿，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
本公开还提供了组合物，所述组合物由第一花生肽和第二花生肽组成：所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
本公开还提供了试剂盒，所述试剂盒包括：固体支持物，所述固体支持物偶联至第一花生肽和第二花生肽，所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸；和过敏相关免疫球蛋白(AAI)特异性标记试剂。
附图说明
图1显示了针对验证队列的测试结果，以及展示为用于比较的其他诊断测试的性能。
具体实施方式
本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在进行限制。
在描述若干示例性实施方案之前，应当理解实施方案不限于以下描述中阐述的构造或过程步骤的细节。本文所述的实施方案能够进行修改并且以各种方式实践或执行。
在整个本公开中对“一些实施方案”或其派生词的提及意味着结合实施方案描述的特定特征部、结构、材料或特征被包括在至少一个实施方案中。因此，诸如“在一些实施方案中”的短语出现在整个本公开各处不一定相同的实施方案，而是可以通常归因于任何其他实施方案。此外，特定特征部、结构、材料或特征可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
如本文所用，术语“过敏相关免疫球蛋白”和“AAI”是指血清中的介导对花生过敏原的超敏性的免疫球蛋白。这些免疫球蛋白包括IgE、IgD、IgA、IgM和IgG(包括IgG4)中的一者或多者。
如本文所用，术语“反应”、“反应性”、“识别”等等是指过敏相关免疫球蛋白结合至含有过敏原表位的肽的能力。反应性水平表示血清或血浆中的AAI的浓度，较高的反应性与较高的AAI浓度相关，而较低的反应性与较低的AAI浓度相关。相对AAI浓度(即，相对血清或血浆反应性)通过在测定法中检测到的信号量确定。AAI对含有过敏原表位的肽的反应性水平也表示过敏反应的强度(即，较高的反应性与更强烈的过敏反应相关)。
如本文所用，术语“临床耐受性”是指对花生过敏原的免疫耐受性，它由过敏受试者由于暴露于过敏原而产生(即，由于免疫疗法产生的耐受性)。
如本文所用，术语“天然耐受性”是指对花生过敏原的免疫耐受性，它由过敏受试者由于在一生中天然暴露于过敏或在未暴露的情况下，随时间推移随生物化学过程而产生。
本公开提供了花生肽组合物。在一些实施方案中，组合物由两种花生肽组成。在一些实施方案中，两种花生肽均来源于ara h 2花生过敏原。
在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(ara h2 2.008；SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQID NO:1的氨基酸序列，但是其中具有一至四个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但是其中具有一个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但是其中具有两个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQID NO:1的氨基酸序列，但是其中具有三个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但是其中具有四个保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，组合物中的第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(ara h2 2.019；SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQID NO:2的氨基酸序列，但是其中具有一至四个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但是其中具有一个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但是其中具有两个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQID NO:2的氨基酸序列，但是其中具有三个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，组合物中的第一花生肽包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但是其中具有四个保守氨基酸取代。
保守氨基酸取代最常根据氨基酸结构及其侧链(R基团)的一般化学特征进行分类。例如，脂族氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，并且这些氨基酸中的每者可以相互替代。含羟基或含硫/硒的氨基酸包括丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸，并且这些氨基酸中的每者可以相互替代。芳族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，并且这些氨基酸中的每者可以相互替代。碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸，并且这些氨基酸中的每者可以相互替代。酸性或含酰胺的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，并且这些氨基酸中的每者可以相互替代。
在一些实施方案中，每种花生肽偶联至固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物是微球珠粒、玻璃阵列、有机硅阵列、膜或微量滴定板。在一些实施方案中，固体支持物是玻璃阵列。在一些实施方案中，固体支持物是有机硅阵列。在一些实施方案中，固体支持物是膜。在一些实施方案中，固体支持物是微量滴定板。在一些实施方案中，固体支持物是微球珠粒。在一些实施方案中，微球珠粒是亲和素偶联的微球珠粒。在一些实施方案中，珠粒是Luminex珠粒，诸如MagTM亲和素珠粒或
Figure BDA0003827773120000081
珠粒。在一些实施方案中，固体支持物中的每者偶联至单个花生肽。
在一些实施方案中，花生肽中的每种通过接头-间隔基偶联至固体支持物。在一些实施方案中，接头-间隔基包含选自生物素、硫醇、肼和胺的接头。在一些实施方案中，接头是生物素。在一些实施方案中，接头是硫醇。在一些实施方案中，接头是肼。在一些实施方案中，接头是胺。在一些实施方案中，接头-间隔基包含选自多肽、寡核苷酸、烷基和聚乙二醇(PEG)基团的间隔基。在一些实施方案中，间隔基是多肽。在一些实施方案中，间隔基是寡核苷酸。在一些实施方案中，间隔基是烷基。在一些实施方案中，烷基是C1-C18烷基或C3-C12烷基。在一些实施方案中，间隔基是PEG基团。在一些实施方案中，PEG基团是PEG1至PEG18。在一些实施方案中，PEG基团是PEG12。在一些实施方案中，间隔基是烷基或PEG基团。在一些实施方案中，花生肽中的每种的C-末端通过接头-间隔基偶联至固体支持物。在一些实施方案中，花生肽中的每种的N-末端通过接头-间隔基偶联至固体支持物。在一些实施方案中，花生肽中的每种的C-末端通过生物素-PEG12接头-间隔基偶联至固体支持物。
在一些实施方案中，花生肽可以偶联至固体支持物，所述固体支持物中的每种组分具有一对点击化学接头的一半。例如，花生肽和固体支持物中的一者可以具有一个点击化学接头，而花生肽和固体支持物中的另一者可以具有对应的点击化学接头。点击化学接头对的实例包括但不限于叠氮化物-DBCO、胺-NHS酯和硫醇-苹果酰胺。
本公开还提供了用于诊断受试者中的花生过敏的方法。所述方法包括使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品。接触在足以允许所述生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与所述两种花生肽结合以形成AAI-肽-固体支持物复合物的条件下发生。所述方法还包括使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物。所述方法还包括测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合。当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于阈值时，所述受试者对花生过敏。当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合等于或小于阈值时，所述受试者对花生不过敏。本文所述的步骤包括用于检测针对两种花生肽的特异性AAI存在于生物学样品中的测定法。
可以使用偶联至本文所述的固体支持物中的任一者的所述两种花生肽中的任一种。例如，在一些实施方案中，所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，这些花生肽偶联至微球珠粒。所述花生肽中的每种可以通过本文所述的接头-间隔基中的任一者偶联至固体支持物。如本文所述，花生肽中的每种可以通过它们的C-末端或N-末端偶联至固体支持物。
生物学样品可以是从受试者获得的任何生物学样品。在一些实施方案中，生物学样品选自血清、血浆、唾液或口腔拭子。在一些实施方案中，生物学样品是血清或血浆。在一些实施方案中，生物学样品是血清。在一些实施方案中，生物学样品是血浆。在一些实施方案中，生物学样品是唾液。在一些实施方案中，生物学样品是口腔拭子。
可以存在于来自受试者的生物学样品中的AAI可以包括IgM、IgA、IgD、IgG和/或IgE中的任何一者或多者。在一些实施方案中，生物学样品中的AAI是IgM、IgA和/或IgD。在一些实施方案中，生物学样品中的AAI是IgG和/或IgE。在一些实施方案中，生物学样品中的AAI是IgE。
在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgA抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgD抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgM抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgG抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgE抗体。
在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记选自藻红蛋白(PE)、花青染料、荧光染料、红外染料、显色染料、酶标记和放射性标记。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是PE。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是花青染料。在一些实施方案中，花青染料是Cy3或Cy5。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是荧光染料。在一些实施方案中，荧光染料是德克萨斯红或Alexa-fluor。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是红外(IR)染料。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是显色染料。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是酶标记。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是放射性标记。在一些实施方案中，酶标记是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是HRP。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂是PE标记的抗人IgE抗体。在一些实施方案中，单个可检测标记通常可以用于所有复合物的通用检测。
在一些实施方案中，抗人AAI抗体可以缀合至不可直接检测的报告部分，因此第二可直接检测的报告部分与标记试剂的特异性结合对于结合的分析是必要的。例如，生物素缀合的抗AAI抗体可以与链霉亲和素缀合的荧光染料组合用于检测生物素缀合的抗AAI。可间接检测的报告部分的实例包括生物素、地高辛以及可在二抗(例如，抗地高辛)或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)的后续结合时检测到的其他半抗原，这些报告部分被标记用于直接检测。
在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合的测量通过床旁护理装置进行。在一些实施方案中，床旁护理装置是多重肽-珠粒流式细胞分析装置或侧流测定装置。在一些实施方案中，可检测标记可以通过银染色、量子点或折射方法来观察。
前述实施方案中的任一者可以是微阵列免疫测定法的形式，其中两种花生肽中的每种结合至微量滴定板的单个孔并且与生物学样品反应以结合AAI。花生肽也可以以侧流免疫测定法形式使用，其中每种肽固定在多孔或色谱支持物上的离散区域中，并且血清或血浆通过支持物被芯吸以接触肽从而使AAI结合至肽。在该测定法中，AAI特异性标记试剂可以包含与抗AAI抗体缀合的发色团或染料。标记试剂还通过支持物芯吸以接触肽-AAI复合物从而使标记试剂结合至复合物，这表明在血清或血浆中存在或不存在针对固定在支持物的每个离散位置处的花生肽的抗体。
前述实施方案中的任一者也可以是流式细胞测定法的形式，其中每种花生肽偶联至适用于通过流式细胞分析的可单独识别的固体支持物(诸如珠粒)。在一些实施方案中，具有偶联肽的珠粒接触受试者的生物学样品，以结合任何肽特异性AAI，所述任何肽特异性AAI通过肽结合至珠粒，从而在珠粒上形成肽-AAI复合物。然后使包含例如荧光报告部分的AAI特异性标记试剂结合至肽-AAI复合物，并且通过流式细胞术对珠粒进行定量或定性分析。这检测来自与每个珠粒相关联的结合标记试剂的荧光，所述珠粒与花生肽偶联。
在一些实施方案中，流式细胞测定法可以是多重测定法，诸如由Luminex提供的测定法，它使用微球阵列平台来定量和检测肽和蛋白质。花生肽中的每种结合至一组具有相同或不同光谱性质的珠粒，这些光谱性质可以用于通过流式细胞术定量结合至AAI的相关联的花生肽。然后使该组珠粒接触受试者的生物学样品，以使识别肽的AAI结合至每个珠粒，从而在珠粒上形成肽-AAI复合物，以及包含例如荧光报告部分的AAI特异性标记试剂，所述报告部分结合至复合物的AAI。珠粒通过监测每个珠粒的光谱性质以及来自结合标记试剂的相关联的荧光量来分析。这个过程允许定量珠粒上的肽，以及对肽具有反应性的AAI的存在或不存在。测定法的结果通过本文讨论进行解释。
用于本文所述的方法中的任一种的特别有用的定量测定法是用于流式细胞分析的多重肽-珠粒测定法，诸如LUMINEX exMAP多重珠粒测定法，它是ELISA的高通量替代方案。在该测定法中，使用不同比例的红色和近红外荧光团染色的聚苯乙烯珠粒(微球)作为固体支持物。肽可以化学连接至珠粒或通过涂覆在珠粒上的肽特异性捕获抗体结合至珠粒。荧光团的比例定义了每个珠粒群的“光谱地址”，该光谱地址可以通过流式细胞仪使用数字信号处理来识别。第三荧光颜色的检测用于测量结合至珠粒的标记试剂的报告部分的荧光强度。通过使每种肽结合至具有特定“光谱地址”的珠粒可以同时检测多种分析物。使珠粒接触含有AAI的生物学样品，所述AAI对与其结合的肽具有特异性，然后添加偶联至报告部分的抗人AAI抗体。在一些实施方案中，抗人AAI的报告部分是生物素并且与藻红蛋白(PE)缀合的链霉亲和素的结合提供了用于检测的荧光信号。在标记试剂结合后，在基于双激光流的检测仪器(诸如LUMINEX 200或Bio-Rad BIO-PLEX分析仪)上对珠粒进行分析。一束激光对珠粒进行分类并且识别与珠粒结合的肽。第二束激光确定报告来源信号的大小，该信号的大小与结合的血清或血浆AAI的量成正比。
在一些实施方案中，测量AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合包括测量每种AAI特异性标记试剂的平均荧光强度(MFI)。当AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与AAI特异性标记试剂的组合MFI结合大于阈值时，受试者对花生过敏。当AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与AAI特异性标记试剂的组合MFI结合等于或小于阈值时，受试者对花生不过敏。在一些实施方案中，当h2.008+(h2.019)/20≤0.20时，受试者对花生不过敏。在一些实施方案中，当h2.008+(h2.019)/20>0.20时，受试者对花生过敏。在这些关系式中，h2.008是标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中花生肽包含SEQ ID NO:1，并且h2.019是标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中花生肽包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂是本文所述的可检测标记的抗人抗体中的任一者。在一些实施方案中，每种AAI特异性标记试剂的MFI已消除背景。
在一些实施方案中，方法还包括进行或已经进行皮肤点刺测试(SPT)和/或总花生特异性IgE(sIgE)测试。在一些实施方案中，方法还包括进行或已经进行SPT。在一些实施方案中，方法还包括进行或已经进行sIgE测试。在一些实施方案中，当SPT≤3mm和/或sIgE≤0.10kU/L时，受试者对花生不过敏，并且当SPT≥18mm和/或sIgE≥18kU/L时，受试者对花生过敏。
本公开还提供了用于检测对花生过敏的受试者对花生的临床耐受性的发展的方法。所述方法包括在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成两种AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品。然后使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物。所述方法包括测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合。所述方法还包括将所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合与来自此前从所述受试者获得的生物学样品的所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合进行比较。当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于或等于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者尚未建立对花生的临床耐受性。当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合小于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者已经建立对花生的临床耐受性。
可以使用偶联至本文所述的固体支持物中的任一者的两种花生肽中的任一种。例如，在一些实施方案中，所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，这些花生肽偶联至微球珠粒。所述花生肽中的每种可以通过本文所述的接头-间隔基中的任一者偶联至固体支持物。如本文所述，花生肽中的每种可以通过它们的C-末端或N-末端偶联至固体支持物。
生物学样品可以是从受试者获得的任何生物学样品。在一些实施方案中，生物学样品选自血清、血浆、唾液或口腔拭子。在一些实施方案中，生物学样品是血清或血浆。在一些实施方案中，生物学样品是血清。在一些实施方案中，生物学样品是血浆。在一些实施方案中，生物学样品是唾液。在一些实施方案中，生物学样品是口腔拭子。
可以存在于来自受试者的生物学样品中的AAI可以包括IgM、IgA、IgD、IgG和/或IgE中的任何一者或多者。在一些实施方案中，生物学样品中的AAI是IgM、IgA和/或IgD。在一些实施方案中，生物学样品中的AAI是IgG和/或IgE。在一些实施方案中，生物学样品中的AAI是IgE。
在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgA抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgD抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgM抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgG抗体。在一些实施方案中，可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgE抗体。
在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记选自藻红蛋白(PE)、花青染料、荧光染料、红外染料、显色染料、酶标记和放射性标记。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是PE。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是花青染料。在一些实施方案中，花青染料是Cy3或Cy5。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是荧光染料。在一些实施方案中，荧光染料是德克萨斯红或Alexa-fluor。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是IR染料。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是显色染料。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是酶标记。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是放射性标记。在一些实施方案中，酶标记是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是HRP。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂的可检测标记是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂是PE标记的抗人IgE抗体。在一些实施方案中，单个可检测标记通常可以用于所有复合物的通用检测。
在一些实施方案中，抗人AAI抗体可以缀合至不可直接检测的报告部分，因此第二可直接检测的报告部分与标记试剂的特异性结合对于结合的分析是必要的。例如，生物素缀合的抗AAI抗体可以与链霉亲和素缀合的荧光染料组合用于检测生物素缀合的抗AAI。可间接检测的报告部分的实例包括生物素、地高辛以及可在二抗(例如，抗地高辛)或其他结合配偶体(例如，链霉亲和素)的后续结合时检测到的其他半抗原，这些报告部分被标记用于直接检测。
在一些实施方案中，AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合的测量通过床旁护理装置进行。在一些实施方案中，床旁护理装置是多重肽-珠粒流式细胞分析装置或侧流测定装置。在一些实施方案中，可检测标记可以通过银染色、量子点或折射方法来观察。
前述实施方案中的任一者可以是微阵列免疫测定法的形式，其中两种花生肽中的每种结合至微量滴定板的单个孔并且与生物学样品反应以结合AAI。花生肽也可以以侧流免疫测定法形式使用，其中每种肽固定在多孔或色谱支持物上的离散区域中，并且血清或血浆通过支持物被芯吸以接触肽从而使AAI结合至肽。在该测定法中，AAI特异性标记试剂可以包含与抗AAI抗体缀合的发色团或染料。标记试剂还通过支持物芯吸以接触肽-AAI复合物从而使标记试剂结合至复合物，这表明在血清或血浆中存在或不存在针对固定在支持物的每个离散位置处的花生肽的抗体。
前述实施方案中的任一者也可以是流式细胞测定法的形式，其中每种花生肽偶联至适用于通过流式细胞分析的可单独识别的固体支持物(诸如珠粒)。在一些实施方案中，具有偶联肽的珠粒接触受试者的生物学样品，以结合任何肽特异性AAI，所述任何肽特异性AAI通过肽结合至珠粒，从而在珠粒上形成肽-AAI复合物。然后使包含例如荧光报告部分的AAI特异性标记试剂结合至肽-AAI复合物，并且通过流式细胞术对珠粒进行定量或定性分析。这检测来自与每个珠粒相关联的结合标记试剂的荧光，所述珠粒与花生肽偶联。
在一些实施方案中，流式细胞测定法可以是多重测定法，诸如由Luminex提供的测定法，它使用微球阵列平台来定量和检测肽和蛋白质。花生肽中的每种结合至一组具有相同或不同光谱性质的珠粒，这些光谱性质可以用于通过流式细胞术定量结合至AAI的相关联的花生肽。然后使该组珠粒接触受试者的生物学样品，以使识别肽的AAI结合至每个珠粒，从而在珠粒上形成肽-AAI复合物，以及包含例如荧光报告部分的AAI特异性标记试剂，所述报告部分结合至复合物的AAI。珠粒通过监测每个珠粒的光谱性质以及来自结合标记试剂的相关联的荧光量来分析。这个过程允许定量珠粒上的肽，以及对肽具有反应性的AAI的存在或不存在。测定法的结果通过本文讨论进行解释。
用于本文所述的方法中的任一种的特别有用的定量测定法是用于流式细胞分析的多重肽-珠粒测定法，诸如LUMINEX exMAP多重珠粒测定法，它是ELISA的高通量替代方案。在该测定法中，使用不同比例的红色和近红外荧光团染色的聚苯乙烯珠粒(微球)作为固体支持物。肽可以化学连接至珠粒或通过涂覆在珠粒上的肽特异性捕获抗体结合至珠粒。荧光团的比例定义了每个珠粒群的“光谱地址”，该光谱地址可以通过流式细胞仪使用数字信号处理来识别。第三荧光颜色的检测用于测量结合至珠粒的标记试剂的报告部分的荧光强度。通过使每种肽结合至具有特定“光谱地址”的珠粒可以同时检测多种分析物。使珠粒接触含有AAI的生物学样品，所述AAI对与其结合的肽具有特异性，然后添加偶联至报告部分的抗人AAI抗体。在一些实施方案中，抗人AAI的报告部分是生物素并且与藻红蛋白(PE)缀合的链霉亲和素的结合提供了用于检测的荧光信号。在标记试剂结合后，在基于双激光流的检测仪器(诸如LUMINEX 200或Bio-Rad BIO-PLEX分析仪)上对珠粒进行分析。一束激光对珠粒进行分类并且识别与珠粒结合的肽。第二束激光确定报告来源信号的大小，该信号的大小与结合的血清或血浆AAI的量成正比。
在一些实施方案中，测量AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合包括测量如本文所述的每种AAI特异性标记试剂的MFI。所述方法还包括将所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合与来自此前从所述受试者获得的生物学样品的所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合进行比较。当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于或等于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者尚未建立对花生的临床耐受性。当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合小于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者已经建立对花生的临床耐受性。在一些实施方案中，每种AAI特异性标记试剂的MFI已扣除背景。
接受临床耐受性发展检查的受试者的年龄可以为约2岁至17岁。在一些实施方案中，受试者小于约一岁、小于约2岁、小于约3岁、小于约4岁、小于约5岁或小于约6岁。
在一些实施方案中，临床耐受性发展的初始检测可以用于预测受试者是否会发展出对过敏的天然耐受性或对疗法具有反应性。在一些实施方案中，过敏受试者在分析初始特征谱之前暴露于免疫原(免疫疗法)。如果在后续时间点，针对本文所述的两种花生肽的所有AAI在初始特征谱中的血清浓度降低至少2倍，则受试者可能会发展出对花生的临床或天然耐受性。
本公开还提供了使婴儿对两种花生过敏原脱敏以诱导对花生的耐受性或不过敏性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将两种花生肽施用于婴儿。所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。可以使用本文所述的花生肽中的任一种。在一些实施方案中，所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。这些肽单独、组合或与其他治疗方法组合可以对花生过敏的脱敏具有一定的效用。
花生肽可以通过口服、舌下、皮内、皮下、吸入或上皮途径施用以诱导脱敏。接受脱敏的受试者的年龄可以小于约一岁、小于约2岁、小于约3岁、小于约4岁、小于约5岁或小于约6岁。总肽或单个肽的量可以为每剂约1克或更少。
本公开还提供了用于进行本文所述的方法中的任一种的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括：固体支持物，所述固体支持物偶联至第一花生肽和第二花生肽，所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸。所述试剂盒还包括过敏相关免疫球蛋白(AAI)特异性标记试剂。
本文所述的试剂盒还可以包括另外的组分。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用说明。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括结合缓冲液、洗涤缓冲液、检测缓冲液、不过敏对照样品、阴性缓冲液对照样品和过敏阳性对照样品中的一者或多者。在一些实施方案中，含有花生蛋白的非反应性表位的肽可以用作阴性对照。
偶联至固体支持物的肽可以是本文所述的花生肽中的任一种，并且可以通过本文所述的方式中的任一者偶联至固体支持物。固体支持物可以是本文所述的固体支持物中的任一者。AAI特异性标记试剂可以是本文所述的AAI特异性标记试剂中的任一者。AAI特异性标记试剂中的任一者的可检测标记可以是本文所述的可检测标记中的任一者。
本文所述的主题具有很多优点。第一，这些方法以一定的置信度识别过敏和不过敏受试者(例如，PPV＝95％和NPV＝92％)。第二，这些方法可以让医疗从业者从现有患者名单中删除可能多达三分之二具有不确定的测试结果和/或不明确的临床病史的患者，通过最大限度地减少假阳性来显著减少过度诊断，并且改善生活质量问题(例如，焦虑、欺凌、需要无花生环境)。第三，这些方法提供了一种更好的方式来监测受试者随时间推移的疾病状态，监测随时间推移的过敏，以及提供随时间推移的疾病状态的定量度量。第四，这些方法可以用于提供更好的治疗指导。例如，这些方法可以用于增强支持或反对口服食物挑战(OFC)或疗法的决定，优化OFC的使用，以及以一定的置信度确定疗法的适当候选者。第五，本文所述的方法降低了成本。例如，这些方法可以减少对另外的测试(例如，OFC、sIgE和组分解析诊断(CRD))的需要，通过取消对误诊者的标记来消除与食物过敏相关的成本，通过取消标记来消除与不必要的免疫疗法相关的成本，被取消标记的受试者将不再需要EpiPens购买和补货，不再需要另外购买非花生食物，以及减少其他成本，例如在工作场所请病假。
提供了以下代表性实施方案：
实施方案1.一种用于诊断受试者中的花生过敏的方法，所述方法包括：在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ IDNO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ IDNO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列；使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物；以及测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合；其中当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于阈值时，所述受试者对花生过敏，并且当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合等于或小于阈值时，所述受试者对花生不过敏。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述生物学样品选自血清、血浆、唾液或口腔拭子。
实施方案3.根据实施方案1所述的方法，其中所述生物学样品是血清或血浆。
实施方案4.根据实施方案1至实施方案3中任一项所述的方法，其中所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施方案5.根据实施方案1至实施方案4中任一项所述的方法，其中所述花生肽中的每种通过接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案6.根据实施方案5所述的方法，其中所述接头-间隔基包含接头和间隔基，所述接头选自生物素、硫醇、肼和胺，并且所述间隔基选自多肽、寡核苷酸、烷基和聚乙二醇(PEG)基团。
实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中所述间隔基是烷基或PEG基团。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述烷基是C1-C18烷基。
实施方案9.根据实施方案7所述的方法，其中所述PEG基团是PEG1至PEG18。
实施方案10.根据实施方案9所述的方法，其中所述PEG基团是PEG12。
实施方案11.根据实施方案5至实施方案10中任一项所述的方法，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案12.根据实施方案5至实施方案10中任一项所述的方法，其中所述花生肽中的每种的N-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案13.根据实施方案5所述的方法，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过生物素-PEG12接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案14.根据实施方案1至实施方案13中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是微球珠粒、玻璃阵列、有机硅阵列、膜或微量滴定板。
实施方案15.根据实施方案14所述的方法，其中所述固体支持物是微球珠粒。
实施方案16.根据实施方案15所述的方法，其中所述微球珠粒是亲和素偶联的微球珠粒。
实施方案17.根据实施方案1至实施方案16中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgM、IgA和/或IgD。
实施方案18.根据实施方案1至实施方案16中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgG和/或IgE。
实施方案19.根据实施方案1至实施方案16中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgE。
实施方案20.根据实施方案1至实施方案19中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
实施方案21.根据实施方案20所述的方法，其中所述可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgE抗体。
实施方案22.根据实施方案20或实施方案21所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂的可检测标记选自藻红蛋白(PE)、花青染料、荧光染料、红外染料、显色染料、酶标记和放射性标记。
实施方案23.根据实施方案22所述的方法，其中所述可检测标记是PE。
实施方案24.根据实施方案20所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂是PE标记的抗人IgE抗体。
实施方案25.根据实施方案1至实施方案24中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合的测量通过床旁护理装置进行。
实施方案26.根据实施方案25所述的方法，其中所述床旁护理装置是多重肽-珠粒流式细胞分析装置或侧流测定装置。
实施方案27.根据实施方案1至实施方案26中任一项所述的方法，其中测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合包括测量每种AAI特异性标记试剂的平均荧光强度(MFI)，其中：当h2.008+(h2.019)/20≤0.20时，所述受试者对花生不过敏；并且当h2.008+(h2.019)/20>0.20时，所述受试者对花生过敏；其中h2.008是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQ ID NO:1，并且h2.019是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQID NO:2；并且其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
实施方案28.根据实施方案27所述的方法，其中每种AAI特异性标记试剂的MFI已消除背景。
实施方案29.根据实施方案1至实施方案28中任一项所述的方法，还包括进行或已经进行皮肤点刺测试(SPT)和/或总花生特异性IgE(sIgE)测试。
实施方案30.根据实施方案29所述的方法，其中当SPT≤3mm和/或sIgE≤0.10kU/L时，所述受试者对花生不过敏，并且当SPT≥18mm和/或sIgE≥18kU/L时，所述受试者对花生过敏。
实施方案31.一种用于检测对花生过敏的受试者对花生的临床耐受性的发展的方法，所述方法包括：在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成两种AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列；使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物；测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合；以及将所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合与来自此前从所述受试者获得的生物学样品的所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合进行比较；其中当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于或等于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者尚未建立对花生的临床耐受性；并且当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合小于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者已经建立对花生的临床耐受性。
实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中所述生物学样品选自血清、血浆、唾液或口腔拭子。
实施方案33.根据实施方案31所述的方法，其中所述生物学样品是血清或血浆。
实施方案34.根据实施方案31至实施方案33中任一项所述的方法，其中所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施方案35.根据实施方案31至实施方案34中任一项所述的方法，其中所述花生肽中的每种通过接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案36.根据实施方案35所述的方法，其中所述接头-间隔基包含接头和间隔基，所述接头选自生物素、硫醇、肼和胺，并且所述间隔基选自多肽、寡核苷酸、烷基和聚乙二醇(PEG)基团。
实施方案37.根据实施方案36所述的方法，其中所述间隔基是烷基或PEG基团。
实施方案38.根据实施方案37所述的方法，其中所述烷基是C1-C18烷基。
实施方案39.根据实施方案37所述的方法，其中所述PEG基团是PEG1至PEG18。
实施方案40.根据实施方案39所述的方法，其中所述PEG基团是PEG12。
实施方案41.根据实施方案35至实施方案40中任一项所述的方法，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案42.根据实施方案35至实施方案40中任一项所述的方法，其中所述花生肽中的每种的N-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案43.根据实施方案35所述的方法，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过生物素-PEG12接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案44.根据实施方案31至实施方案43中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是微球珠粒、玻璃阵列、有机硅阵列、膜或微量滴定板。
实施方案45.根据实施方案44所述的方法，其中所述固体支持物是微球珠粒。
实施方案46.根据实施方案45所述的方法，其中所述微球珠粒是亲和素偶联的微球珠粒。
实施方案47.根据实施方案31至实施方案46中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgM、IgA和/或IgD。
实施方案48.根据实施方案31至实施方案46中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgG和/或IgE。
实施方案49.根据实施方案31至实施方案46中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgE。
实施方案50.根据实施方案31至实施方案49中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
实施方案51.根据实施方案50所述的方法，其中所述可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgE抗体。
实施方案52.根据实施方案50或实施方案51所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂的可检测标记选自藻红蛋白(PE)、花青染料、荧光染料、红外染料、显色染料、酶标记和放射性标记。
实施方案53.根据实施方案52所述的方法，其中所述可检测标记是PE。
实施方案54.根据实施方案50所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂是PE标记的抗人IgE抗体。
实施方案55.根据实施方案31至实施方案54中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合的测量通过床旁护理装置进行。
实施方案56.根据实施方案55所述的方法，其中所述床旁护理装置是多重肽-珠粒流式细胞分析装置或侧流测定装置。
实施方案57.根据实施方案31至实施方案56中任一项所述的方法，其中测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合包括测量每种AAI特异性标记试剂的平均荧光强度(MFI)，其中：当h2.008+(h2.019)/20≤0.20时，所述受试者对花生不过敏；并且当h2.008+(h2.019)/20>0.20时，所述受试者对花生过敏；其中h2.008是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQ ID NO:1，并且h2.019是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQID NO:2；并且其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
实施方案58.根据实施方案57所述的方法，其中每种AAI特异性标记试剂的MFI已消除背景。
实施方案59.一种使婴儿对两种花生过敏原脱敏以诱导对花生的耐受性或不过敏性的方法，所述方法包括将两种花生肽施用于所述婴儿，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施方案61.一种组合物，所述组合物由第一花生肽和第二花生肽组成：所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
实施方案62.根据实施方案61所述的组合物，其中所述第一花生肽包含根据SEQID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二花生肽包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
实施方案63.根据实施方案61或实施方案62所述的组合物，其中每种花生肽偶联至固体支持物。
实施方案64.根据实施方案61至实施方案63中任一项所述的组合物，其中所述花生肽中的每种通过接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案65.根据实施方案64所述的组合物，其中所述接头-间隔基包含接头和间隔基，所述接头选自生物素、硫醇、肼和胺，并且所述间隔基选自多肽、寡核苷酸、烷基和聚乙二醇(PEG)基团。
实施方案66.根据实施方案65所述的组合物，其中所述间隔基是烷基或PEG基团。
实施方案67.根据实施方案66所述的组合物，其中所述烷基是C1-C18烷基。
实施方案68.根据实施方案66所述的组合物，其中所述PEG基团是PEG1至PEG18。
实施方案69.根据实施方案68所述的组合物，其中所述PEG基团是PEG12。
实施方案70.根据实施方案64至实施方案69中任一项所述的组合物，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案71.根据实施方案64至实施方案69中任一项所述的组合物，其中所述花生肽中的每种的N-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案72.根据实施方案64所述的组合物，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过生物素-PEG12接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案73.根据实施方案60至实施方案72中任一项所述的组合物，其中所述固体支持物是微球珠粒、玻璃阵列、有机硅阵列、膜或微量滴定板。
实施方案74.根据实施方案73所述的组合物，其中所述固体支持物是微球珠粒。
实施方案75.根据实施方案74所述的组合物，其中所述微球珠粒是亲和素偶联的微球珠粒。
实施方案76.一种试剂盒，所述试剂盒包括：固体支持物，所述固体支持物偶联至第一花生肽和第二花生肽，所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸；和过敏相关免疫球蛋白(AAI)特异性标记试剂。
实施方案77.根据实施方案76所述的试剂盒，还包括使用说明。
实施方案78.根据实施方案76或实施方案77所述的试剂盒，还包括结合缓冲液、洗涤缓冲液、检测缓冲液、不过敏对照样品、阴性缓冲液对照样品和过敏阳性对照样品中的一者或多者。
实施方案79.根据实施方案76至实施方案78中任一项所述的试剂盒，其中所述花生肽中的每种通过接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案80.根据实施方案79所述的试剂盒，其中所述接头-间隔基包含接头和间隔基，所述接头选自生物素、硫醇、肼和胺，并且所述间隔基选自多肽、寡核苷酸、烷基和聚乙二醇(PEG)基团。
实施方案81.根据实施方案80所述的试剂盒，其中所述间隔基是烷基或PEG基团。
实施方案82.根据实施方案81所述的试剂盒，其中所述烷基是C1-C18烷基。
实施方案83.根据实施方案81所述的试剂盒，其中所述PEG基团是PEG1至PEG18。
实施方案84.根据实施方案83所述的试剂盒，其中所述PEG基团是PEG12。
实施方案85.根据实施方案79至实施方案84中任一项所述的试剂盒，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案86.根据实施方案79至实施方案84中任一项所述的试剂盒，其中所述花生肽中的每种的N-末端通过所述接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案87.根据实施方案79所述的试剂盒，其中所述花生肽中的每种的C-末端通过生物素-PEG12接头-间隔基偶联至所述固体支持物。
实施方案88.根据实施方案75至实施方案87中任一项所述的试剂盒，其中所述固体支持物是微球珠粒、玻璃阵列、有机硅阵列、膜或微量滴定板。
实施方案89.根据实施方案88所述的试剂盒，其中所述固体支持物是微球珠粒。
实施方案90.根据实施方案89所述的试剂盒，其中所述微球珠粒是亲和素偶联的微球珠粒。
实施方案91.根据实施方案75至实施方案90中任一项所述的试剂盒，其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
实施方案92.根据实施方案91所述的试剂盒，其中所述可检测标记的抗人抗体是可检测标记的抗人IgE抗体。
实施方案93.根据实施方案91或实施方案92所述的试剂盒，其中所述AAI特异性标记试剂的可检测标记选自藻红蛋白(PE)、花青染料、荧光染料、红外染料、显色染料、酶标记和放射性标记。
实施方案94.根据实施方案93所述的试剂盒，其中所述可检测标记是PE。
实施方案95.根据实施方案91所述的试剂盒，其中所述AAI特异性标记试剂是PE标记的抗人IgE抗体。
实施方案96.根据实施方案75至实施方案95中任一项所述的试剂盒，还包括特异性结合至所述AAI特异性标记试剂的报告部分。
为了可以更有效地理解本文公开的主题，提供了以下实施例。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，并且不应被解释为以任何方式限制所要求保护的主题。
实施例
实施例1：花生过敏诊断的验证
算法
以下是将两个表位集成到分类器中的算法实例：
如果h2.008+(h2.019)/20≤.20，则“不过敏”，否则“过敏”。
对于该算法，h2.008和h2.019表示为校准的净MFI，并且使用以下列出的等式确定。
缓冲液NetMFI＝log2(中位数(Br1，Br2，Br3)+1) 等式1
Bm是从Luminex系统报告的缓冲液对照的NetMFI，用于在给定批次中重复n次缓冲液对照。
阳性对照NetMFI＝log2(中位数(Pr1，Pr2，Pr3)+1)-缓冲液NetMFI 等式2
Prn是从Luminex系统报告的阳性对照的NetMFI，用于在给定批次中重复n次阳性对照。
NetMFI＝log2(中位数(Sr1，Sr2，Sr3)+1)-缓冲液NetMFI 等式3
Srn是从Luminex系统报告的样品的NetMFI，用于在给定批次中重复n次样品。
Figure BDA0003827773120000331
常数是表位特异性校正常数。
Figure BDA0003827773120000341
Figure BDA0003827773120000342
另外的SPT和/或sIgE测试也可以集成到算法中，据此三个测试中的任一个都可以确认受试者对花生的过敏状态。
如果SPT≤3mm或sIgE≤0.10kU/L，则“不过敏”。停止。
如果SPT≥18mm或sIgE≥18kU/L，则“过敏”。停止。
对于SPT，单位为mm。对于sIgE，单位为kU/L。
方法
该测试对来自LEAP研究的回避实验组的133名受试者(31名过敏，102名不过敏)进行。所有诊断均在5岁时通过OFC确定。获得每名受试者在第2.5年和第5年的血浆样品。使用BBEA方法分析这些样品以获得每名受试者在第2.5年和第5年的IgE和IgG4表位水平。每名受试者的IgE(IgG4)表位水平通过所有IgE(IgG4)表位测量的中位数值进行归一化。
在第5年分析数据以确定用于区分过敏和不过敏受试者的表现最佳的IgE或IgG4表位。具体而言，表现最佳的IgE或IgG4表位是在通过小于0.1kU/L的花生特异性IgE(sIgE)水平对受试者进行初步筛选之后，将那些受试者分类为过敏或不过敏的最佳AUC的表位。随后证实，这种相同的IgE或IgG4表位也是在第2.5年表现最佳。在确定表现最佳的表位和决定阈值之后，完成诊断测试，然后进行验证。
简而言之，将花生肽(CS Bio,Menlo Park,CA,USA)与LumAvidin珠粒(LuminexCorporation,Austin,TX)偶联并且储存在PBS-TBN缓冲液(1x PBS+0.02％Tween20+0.1％BSA)中。在PBS-TBN缓冲液中制备肽偶联的珠粒的主混合物，并且将100μL珠粒主混合物添加至过滤板中。在洗涤珠粒后，将100μL 1:10稀释的受试者血浆添加至一式三份的孔中。将板在室温下在振荡器上以300rpm温育2小时。除去过量的血浆并且洗涤板。添加50μL/孔小鼠抗人IgE-PE(Thermo-Pierce Antibodies,Clone BE5，在PBS-TBN中1:50稀释)或小鼠抗人IgG4 Fc-PE(SouthernBiotech,Clone HP6025，在PBS-TBN中1:400稀释)二抗并且将板温育30分钟。在最后一次洗涤后，将100μL PBS-TBN缓冲液添加至每个孔中以重悬珠粒，然后将其转移至底部固定的96孔读取板上，并且在Luminex 200仪器(
Figure BDA0003827773120000351
100/200TMSystem,Luminex Corporation,Austin,TX)上进行定量。
所有样品一式三份处理。为了消除背景强度，还将缓冲液样品(PBS-TBN缓冲液)在每个板中一式三份处理。每个表位和样品的MFI直接从Luminex读取器的输出中获得。
验证
对来自CoFAR2研究的81名受试者(23名过敏，58名不过敏)进行测试验证。所有诊断均在5岁时通过OFC确定。获得每名受试者在第2年和第5年的血浆样品。使用BBEA方法分析这些样品以获得每名受试者在第2年和第5年的IgE和IgG4表位水平。针对所有受试者样品以及阴性(缓冲液)和阳性对照一式三份收集Luminex数据。
数据按以下方式进行处理：
1)使用中位数函数将重复合并为单个值；
2)对受试者、缓冲液和阳性对照值全部进行对数转换；
3)通过从所有受试者和阳性对照值中减去缓冲液值来进行背景消除；以及
4)确定每个板的中位数阳性对照值，并将该值用于根据其自身的阳性对照值校准每个板上的所有受试者值。
使用预定义的假设和阈值对诊断测试进行验证。首先，使用阈值0.1Ku/L(针对sIgE)和阈值0.30(针对最佳IgE(IgG4)表位)进行的诊断测试的性能在第5年使用针对受试者的关联的卡方检验评估为具有统计学显著性。类似地，还评估了在第2年的受试者的诊断测试的性能。所有数据分析均使用Matlab R2015b进行。
结果
针对验证队列的测试结果显示于图1中。还显示了其他诊断测试的性能以进行比较。来自验证队列的10名过敏和10名不过敏受试者的结果显示于下表1中。
表1
Figure BDA0003827773120000361
Figure BDA0003827773120000371
从表位测定法获得的原始数据报告为MFI。如上文所述处理所有数据。
根据前述描述，除本文所述的那些修改之外，所描述的主题的各种修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求的范围内。本申请中引用的每篇参考文献(包括但不限于期刊文章、美国和非美国专利、专利申请公开、国际专利申请公开、基因库登录号等等)均以引用方式整体并入本文。
序列表
<110> R·C·盖茨 (GETTS, Robert C.)
P·科尔尼(KEARNEY, Paul)
<120> 用于检测花生过敏的测定法
<130> 189698.00902 (3027)
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 花生肽
<400> 1
Trp Glu Leu Gln Gly Asp Arg Arg Cys Gln Ser Gln Leu Glu Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 花生肽
<400> 2
Asp Ser Tyr Glu Arg Asp Pro Tyr Ser Pro Ser Gln Asp Pro Tyr
1 5 10 15

Claims (20)

1.一种用于诊断受试者中的花生过敏的方法，所述方法包括：
在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列；
使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物；以及
测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合；
其中当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于阈值时，所述受试者对花生过敏，并且当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合等于或小于阈值时，所述受试者对花生不过敏。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述固体支持物是微球珠粒、玻璃阵列、有机硅阵列、膜或微量滴定板。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述AAI是IgG和/或IgE。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合的测量通过床旁护理装置进行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合包括测量每种AAI特异性标记试剂的平均荧光强度(MFI)，其中：
当h2.008+(h2.019)/20≤0.20时，所述受试者对花生不过敏；和
当h2.008+(h2.019)/20>0.20时，所述受试者对花生过敏；
其中h2.008是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQ ID NO:1，并且h2.019是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQ ID NO:2；并且
其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其还包括进行或已经进行皮肤点刺测试(SPT)和/或总花生特异性IgE(sIgE)测试。
9.根据权利要求8所述的方法，其中当SPT≤3mm和/或sIgE≤0.10kU/L时，则所述受试者对花生不过敏，并且当SPT≥18mm和/或sIgE≥18kU/L时，则所述受试者对花生过敏。
10.一种用于检测对花生过敏的受试者中对花生的临床耐受性的发展的方法，所述方法包括：
在足以允许生物学样品中的一种或多种过敏相关免疫球蛋白(AAI)与两种花生肽结合以形成两种AAI-肽-固体支持物复合物的条件下，使偶联至固体支持物的两种花生肽接触从所述受试者获得的生物学样品，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列；
使所述AAI-肽-固体支持物复合物接触AAI特异性标记试剂，以形成标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物；
测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合；以及
将所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合与来自此前从所述受试者获得的生物学样品的所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合进行比较；
其中当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合大于或等于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者尚未建立对花生的临床耐受性；并且当所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合小于此前获得的生物学样品的所述AAI-肽固体支持物复合物中的每种花生肽与所述AAI特异性标记试剂的组合结合时，所述受试者已经建立对花生的临床耐受性。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述AAI是IgG和/或IgE。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合的测量通过床旁护理装置进行。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中测量所述AAI特异性标记试剂与每种AAI-肽-固体支持物复合物的结合包括测量每种AAI特异性标记试剂的平均荧光强度(MFI)，其中：
当h2.008+(h2.019)/20≤0.20时，所述受试者对花生不过敏；以及
当h2.008+(h2.019)/20>0.20时，所述受试者对花生过敏；
其中h2.008是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQ ID NO:1，并且h2.019是所述标记试剂-AAI-肽-固体支持物复合物的校准净MFI，其中所述花生肽包含SEQ ID NO:2；并且
其中所述AAI特异性标记试剂是可检测标记的抗人抗体。
16.一种使婴儿对两种花生过敏原脱敏以诱导对花生的耐受性或不过敏性的方法，所述方法包括将两种花生肽施用于所述婴儿，其中所述两种花生肽中的一种包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述两种花生肽中的一种包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述两种花生肽中的另一种包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
18.一种组合物，所述组合物由第一花生肽和第二花生肽组成：所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ ID NO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述第一花生肽包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且所述第二花生肽包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
20.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
固体支持物，所述固体支持物偶联至第一花生肽和第二花生肽，所述第一花生肽包含氨基酸序列WELQGDRRCQSQLER(SEQ ID NO:1)或者含SEQ ID NO:1但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸序列，所述第二花生肽包含氨基酸序列DSYERDPYSPSQDPY(SEQ IDNO:2)或者含SEQ ID NO:2但是其中具有一至四个保守氨基酸取代的氨基酸；和
过敏相关免疫球蛋白(AAI)特异性标记试剂。
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