CN117203526A

CN117203526A - 用于检测血吸虫感染的蛋白质

Info

Publication number: CN117203526A
Application number: CN202180087590.4A
Authority: CN
Inventors: B·格瑞科; C·欧瑞; A·卢卡斯; M·皮尔逊; J·索提略-嘉乐高
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-12-08
Also published as: US20240011984A1; WO2022090343A1; CA3196094A1; EP4237853A1; IL302404A; AU2021369448A1; JP2023547188A; KR20230092004A

Abstract

本发明涉及用于检测血吸虫感染的诊断工具的领域。本发明涉及能够单独或组合用于检测生物样品中抗血吸虫抗体，从而用于诊断人的血吸虫感染的源自埃及血吸虫抗原的蛋白质。

Description

用于检测血吸虫感染的蛋白质

技术领域

本发明涉及用于检测血吸虫(Schistosoma)感染的诊断工具的领域。本发明涉及能够单独或组合用于检测生物样品中抗血吸虫抗体以及用于诊断人的血吸虫感染的源自埃及血吸虫抗原的蛋白质。

背景技术

由血吸虫属的寄生血吸虫感染引起的血吸虫病的全球负担为186万每伤残调整生命年。埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)是最常见的影响人类的物种，在全世界热带和亚热带地区预估感染的2亿人中，导致约半数人患有泌尿生殖系统血吸虫病(urogenitalschistosomiasis)(Steinmann等Lancet Infect Dis 2006；6(7):411-25)。此外，女性感染埃及血吸虫会极大地增加感染HIV/AIDS的风险(Zirimenya等PLoS Negl Trop Dis 2020；14(6):e0008383)，并且国际癌症研究机构(International Agency for Research onCancer，IARC)将泌尿生殖系统血吸虫病认为是1类致癌物，因为其与膀胱的鳞状细胞癌相关联(Moller等International journal of cancer Journal international du cancer1995；60(5):587-9)。血吸虫病干预议程的重点正从控制发病率转向根除血吸虫病，世界卫生组织(WHO)既定目标是消除血吸虫病这一公共卫生问题并阻断选定地区的传播。因此，检测感染的方法必须在执行时具有适当的灵敏度和快速的速度，从而诊断新病例、评估控制措施的有效性并适用于大规模疾病监测。

虽然目前没有推荐用于检测血吸虫病的金标准，但是广泛使用的诊断感染的方法涉及显微镜检测尿液(泌尿生殖系统血吸虫病)或粪便(肠道血吸虫病)中的寄生虫卵，然而不幸的是，由于该技术依赖于卵排泄率，该方法在低传播区域表现出相对较差的灵敏度(Engels等，Am J Trop Med Hyg 1996；54(4):319-24)，从而限制了其在地方流行性低的区域作为诊断工具的价值。然而，脱落的卵的数量取决于寄生虫负荷以及淡水接触量和强度。此外，卵脱落每天都在变化检测血液或尿液中循环血吸虫抗原的测试通常比传统显微镜检查更敏感，但并非没有局限性。检测尿液中循环阳极抗原(CAA)的测定能够用作即时测试，其具有诊断中度至高水平曼氏血吸虫(S.mansoni)感染的优秀能力，但在检测埃及血吸虫感染中的性能较低(Midzi等Trans R Soc Trop Med Hyg2009；103(1):45-51)。已经证明检测尿液中诸如可溶性卵抗原(SEA)等粗制寄生虫抗体的测定与尿卵和血清阳极抗原水平相关联(de Dood等Frontiers in immunology 2018；9:2635)，但是由于含有数千种血吸虫蛋白的提取物可能与其他蠕虫感染的抗体发生交叉反应，因此可能特异性和再现性较低。已经针对医学上重要的血吸虫开发了基于重组抗原的一系列免疫诊断(Hinz等Mol CellProbes 2017；31:2-21)。然而，现有的免疫诊断通常缺乏足够的特异性来区分不同的血吸虫种。此外，在血吸虫感染的特定情况下，由于一些感染个体只有低水平的抗体反应，这因为感染是最近发生的或者是由于年龄依赖性抗体反应，免疫诊断学达到高水平的灵敏度尤为重要。

因此，仍然需要在所有受感染的个体中，无论其感染的状态如何，具有诊断血吸虫所需的特异性和灵敏度并且可以区分埃及血吸虫感染和其他血吸虫种感染的诊断工具，特别是蛋白质或抗原。

发明内容

本发明提供了至少一种蛋白质用于检测来自人对象的生物样品中抗血吸虫抗体，优选抗埃及血吸虫抗体和/或用于诊断人对象中，优选来自人对象的生物样品中血吸虫感染的用途，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，优选选自下组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。

换言之，本发明提供了至少一种蛋白质在制备用于检测来自人对象的生物样品中抗血吸虫抗体和/或用于诊断来自人对象的生物样品中血吸虫感染的试剂盒中的用途，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

本发明还提供了用于检测来自人对象的生物样品中抗血吸虫抗体，优选抗埃及血吸虫抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使所述生物样品与至少一种蛋白质接触，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

b.确定所述生物样品中能够结合所述至少一种蛋白质的抗体的存在和/或数量。

本发明还提供了用于诊断人对象中的血吸虫感染，优选埃及血吸虫感染的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使来自所述对象的生物样品与至少一种蛋白质接触，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

b.确定来自所述对象的生物样品中能够与所述至少一种蛋白质结合的抗体的数量。

本发明还提供了治疗感染血吸虫，优选埃及血吸虫的对象的方法，其包括以下步骤：

·根据本发明的方法诊断对象中是否存在埃及血吸虫感染，

·向诊断患有埃及血吸虫感染的对象给予适合埃及血吸虫感染的治疗。

本发明还提供了试剂盒，优选用于本文所定义的用途或方法，所述试剂盒包含至少一种蛋白质以及任选地带有关于如何使用所述至少一种蛋白质的说明的说明书，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

定义

“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中指包含通过肽键连接的氨基酸的分子。通常，“肽”用于指20个或更少氨基酸的序列，而“多肽”用于指大于50个氨基酸的序列。然而，在本申请中，为了清楚和便于阅读，本发明中的“蛋白质”、“多肽”和“肽”统称为“蛋白质”。根据本发明的蛋白质、多肽和肽可以通过重组过程纯化、产生(即，在生物体、宿主细胞或无细胞系统中表达编码肽、多肽或蛋白质的外源核酸)或者通过化学合成生产。

就测试、测定或诊断而言，“灵敏度”在本文中指测试检测患有疾病的真阳性对象在患有疾病对象的总组中的比例的能力。因此，其与测试识别患有疾病对象的潜力有关。

就测试、测定或诊断而言，“特异性”在本文中指测试正确检测出测试结果为阴性的未患病对象占未患病对象总数的比例的能力。换言之，特异性代表未患病对象中阴性测试结果的概率。因此，特异性涉及诊断准确性的方面，其描述了识别未患病对象的测试能力，即排除感兴趣的病症。

“抗体”在本文中通常指免疫球蛋白。当述及将根据本发明确定其存在和/或数量的抗体时，术语“抗体”指天然存在的抗体，也就是说来自对象的生物样品中将作为对象的免疫反应产物存在的抗体，与本应添加到生物样品和/或本应注射到患者体内的抗体相反。在本文中，术语抗体是指IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型的抗体。优选地，在本发明的上下文中，将根据本发明确定其存在和/或数量的抗体是IgG同种型的抗体。在本发明的上下文中，术语“抗血吸虫抗体”指能够结合血吸虫抗原的天然存在的抗体。

当述及在测定或测试中用作生物学工具的抗体时，例如作为二抗和/或检测抗体时，术语“抗体”指适合该目的的任何类型的抗体，与来源物种或同种型无关。

序列

SEQ ID NO:1对应于MS3_013701的最小有用序列。

SEQ ID NO:2对应于Sh-TSP-2的最小有用序列。

SEQ ID NO:3对应于MS3_09198的最小有用序列。

SEQ ID NO:4对应于MS3_10385的最小有用序列。

SEQ ID NO:5对应于MS3_10186的最小有用序列。

SEQ ID NO:6对应MS3_013701的序列。

SEQ ID NO:7对应Sh-TSP-2的序列。

SEQ ID NO:8对应MS3_09198的序列。

SEQ ID NO:9对应MS3_10385的序列。

SEQ ID NO:10对应MS3_10186的序列。

附图简要说明

图1：埃及血吸虫(S.haematobium)蛋白阵列探测产生的血清和尿液IgG反应。火山图显示了感染(地方流行性埃及血吸虫(S.haematobium-endemic))和未感染群体之间血清(A)或尿液(B)的IgG反应的倍数变化和显著性。各独立的点表示单个阵列化的抗原。虚线表示不同的概率阈值(从下到上：第一行，p<0.05；第二行，p<0.01；第三行，p<0.001)。显示(C)所有样品(血清，n＝242；尿液，n＝117)和(D)匹配的血清和尿液样品(n＝17)的血清和尿液IgG反应相关性的散点图。

图2：对大肠杆菌表达的排名靠前的蛋白质的重组形式和来自地方流行性埃及血吸虫群体的血清中埃及血吸虫可溶性卵抗原(Sh-SEA)的IgG抗体反应。(A)抗-MS3_10385；(B)抗-MS3_10186；(C)抗-MS3_09198；(D)抗-MS3_01370；(E)抗-Sh-TSP-2；(F)抗-Sh-SEA。卵阳性对象的特征在于(WHO分级)具有高(≥50个卵/10ml尿液)或低(1-49个卵/10ml尿液)强度感染。“egg-ve/CAA+ve”＝通过更敏感的循环阳极抗原(CAA)检测试验分类为阳性(感染)的卵阴性对象。“egg-ve/CAA-ve”＝通过CAA检测试验确认为抗原阴性的卵阴性对象。“non-end.-ve”＝来自非地方流行性区域的对象。绘制的数据代表津巴布韦和加蓬组的反应。确定反应性截止值为非地方流行性阴性组(虚线)值的平均值加上3SD。通过斯氏t检验分析各感染组和未感染组之间抗体水平差异的显著性*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，***p≤0.0001。

图3：对大肠杆菌表达的排名靠前的蛋白质的重组形式和来自地方流行性埃及血吸虫群体的尿液中埃及血吸虫可溶性卵抗原(Sh-SEA)的IgG抗体反应。(A)抗-MS3_10385；(B)抗-MS3_10186；(C)抗-MS3_09198；(D)抗-MS3_01370；(E)抗-Sh-TSP-2；(F)抗-Sh-SEA。卵阳性对象的特征在于(WHO分级)具有高(≥50个卵/10ml尿液)或低(1-49个卵/10ml尿液)强度感染。“egg-ve/CAA+ve”＝通过更敏感的循环阳极抗原(CAA)检测试验分类为阳性(感染)的卵阴性对象。“egg-ve/CAA-ve”＝通过CAA检测试验确认为抗原阴性的卵阴性对象。“non-end.-ve”＝来自非地方流行性区域的对象。绘制的数据代表津巴布韦和桑给巴尔组的反应。确定反应性截止值为非地方流行性阴性组(虚线)值的平均值加上3SD。通过斯氏t检验分析各感染组和未感染组之间抗体水平差异的显著性*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，***p≤0.0001。

图4：试验开发使用血清诊断泌尿生殖系统血吸虫病的护理点免疫层析试验(PoC-ICT)的结果。示意图显示了使用来自加蓬组的经ELISA验证的血清样品针对MS3_01370或Sh-TSP-2ICT的阳性(黑框)和阴性(白框)结果(高，n＝10；低，n＝22；egg-ve/CAA+ve，n＝4；egg-ve/CAA–ve，n＝14；non-end.–ve，n＝10)。样品已通过减少卵负荷从左到右进行了分选，并在图像右侧显示了感染群体中的FoR百分比(灵敏度)。PoC-ICT的简要说明：试纸条在验证线处用MS3_01370或Sh-TSP-2涂覆，以促进对添加到样品容器的血清中抗MS3_01370或抗Sh-TSP-2IgG的捕获和检测。认为在检测线和质控线处出现条带是阳性结果，而认为仅在质控线处出现条带是阴性结果。给予检测条带从最低(+1)到最高(+4)强度评分，0分表示阴性结果。两个独立的读带人必须就测试结果达成一致。所执行的每项测试都是有效的，通过在质控线出现的条带所证实。

图5：散点图显示了埃及血吸虫感染强度(尿液卵负荷)与使用不同诊断液探测埃及血吸虫蛋白阵列所产生的所有点的个体平均SI的相关性。(A)血清，(B)尿液。

图6：接受者操作特征曲线显示了各诊断液中最小抗体特征的诊断性能(曲线下面积-AUC)。(A)血清，(B)尿液。

图7：抗体对通过ELISA生成的排名靠前的蛋白质基于细胞的重组形式和来自地方流行性埃及血吸虫群体的人尿液的组合的反应。(A)抗MS3_10385+抗MS3_10186+抗MS3_09198IgG反应。(B)抗MS3_10385+抗MS3_09198+抗MS3_01370+抗Sh-TSP-2IgG反应。(C)抗MS3_09198+抗MS3_01370+抗Sh-TSP-2IgG反应。(D)抗MS3_01370IgG反应+抗Sh-TSP-2IgG反应。卵阳性对象的特征在于(WHO分级)具有高(≥50个卵/10ml尿液)或低(1-49个卵/10ml尿液)感染。“egg-ve/CAA+ve”＝通过更敏感的循环阳极抗原(CAA)检测试验分类为阳性(感染)的卵阴性对象。“egg-ve/CAA-ve”＝通过CAA检测试验确认为抗原阴性的卵阴性对象。“non-end.-ve”＝来自非地方流行性区域的对象。绘制的数据代表津巴布韦和桑给巴尔组的反应。确定反应性截止值为非地方流行性阴性组(虚线)值的平均值加上3SD。通过斯氏t检验分析各感染组和未感染组之间反应的显著性*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，***p≤0.0001。

图8：使用来自地方流行性埃及血吸虫群体中感染的个体的尿液，基于对排名靠前的蛋白质基于细胞的重组形式和Sh–SEA的组合的IgG ELISA反应的识别频率(FoR)模式。样品已通过减少卵负荷从左到右进行了分选。对于各个抗原，深色条表示被来自津巴布韦组的样品和来自桑给巴尔组的样品识别，而白色条表示不识别(低于ELISA确定的截止值)，与各组无关。“组合1”＝MS3_10385+MS3_10186+MS3_09198，“组合2”＝MS3_10385+MS3_09198+MS3_01370+Sh-TSP-2，“组合3”＝MS3_09198+MS3_01370+Sh-TSP-2，“组合4”＝MS3_01370+Sh-TSP-2。在模式的右侧显示感染群体中的FoR百分比(灵敏度)。“Zim”＝津巴布韦组，“Zan”＝桑给巴尔组，“所有”＝合并来自两个组的样品。为了便于正确比较，数据集已经修剪以排除未针对所有四种重组抗原组合(n＝148)进行测定的任何样品。

图9：血清IgG ELISA显示了其他血吸虫物种对埃及血吸虫诊断抗原的识别。“Sh”＝本研究之前使用的来自加蓬组的埃及血吸虫感染的血清样品。“Sm”＝曼氏血吸虫感染的血清样品。“Sj”＝日本血吸虫(S.japonicum)感染的血清样品。“non-end.-ve”＝本研究之前使用的来自非地方流行性区域的血清样品。

具体实施方式

本发明部分基于发现能够用于检测针对埃及血吸虫的抗体和/或用于诊断生物样品(例如来自人对象的血清或尿液)中血吸虫感染的蛋白质。如实验部分所示，发明人已经证明，使用生物样品，例如尿液或血清，一些特定的蛋白质可以高效地用于检测由对象产生作为埃及血吸虫感染后宿主免疫反应一部分的抗体，特别是IgG。这些蛋白质各自都是埃及血吸虫转录组的部分，其被感染宿主的抗体以高灵敏度和特异性识别，并且即使在尿液中寄生虫卵数量较少的患者中也能够诊断埃及血吸虫感染，从而有助于在感染仍处于早期阶段时发现新病例。此外，这些蛋白质对由于埃及血吸虫感染而在宿主，特别是在人中出现的抗体具有比由于其他血吸虫物种感染而出现的抗体更高的特异性。本文所公开的蛋白质以及基于其的用途、方法和试剂盒使得能够进行特异性和早期诊断，这对该领域从业者特别有用，因为其可以用于设计高效的治疗策略。

因此，本发明涉及可单独或组合用作抗原以检测来自对象的生物样品中针对埃及血吸虫的抗体的存在并且可用于诊断埃及血吸虫感染的蛋白质。本发明提供了方法和试剂盒，其能够用于实施本发明并且可以用作任何治疗性干预之前的预备步骤，例如针对埃及血吸虫感染或与其相关的感染的治疗性治疗。

c.使所述生物样品与至少一种蛋白质接触，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

d.确定所述生物样品中能够结合所述至少一种蛋白质的抗体的存在和/或数量。

优选地，至少一种蛋白质是分离的蛋白质或重组蛋白质，更优选重组蛋白质。“重组蛋白质”在本文中指通过遗传工程改造和/或重组技术产生的蛋白质。简言之，为了通过重组技术表达蛋白质，将蛋白质编码核苷酸序列置于与启动子或能够在表达系统(例如合适的无细胞系统或细胞系统)中调节表达的其他调节序列可操作的连接中，并且将表达系统置于足以发生表达的时间和条件下。或者，可以使用固相合成来制备分离的蛋白质，例如Merrifield,J.Amer.Chem.Soc,85:2149-54(1963)中所通常描述的那些，虽然也可以使用本领域已知的其他等效的化学合成。通过将受保护的氨基酸与合适的树脂偶联，可以从肽的C端(或N端)开始固相肽合成。

优选地，至少一种蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列，优选由选自下组的序列组成的序列：SEQ ID NO:1SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7。更优选地，至少一种蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列，优选由选自下组的序列组成的序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6。

有利地是，为了增加检测和/或诊断的特异性和灵敏度，在本发明的用途和/或方法中，使用两种或更多种本文定义的蛋白质。优选地，在那些实施方式中，使用具有包含选自下组的序列或由其组成的序列的至少两种蛋白质：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。然而，优选地，在那些实施方式中，使用具有包含或由序列SEQ ID NO:1或序列SEQ ID NO:6组成的序列的至少一种蛋白质和具有包含或由序列SEQ ID NO:2或序列SEQ ID NO:7组成的序列的蛋白质。

可以修饰本发明的蛋白质的序列或结构以促进其在本发明的方法和试剂盒中的应用，例如通过添加N末端或C末端序列，或与感兴趣的分子偶联。有利地是，本发明的蛋白质包含所述序列并且还包含其他N末端肽序列和/或其他C末端序列。在这类实施方式中，其他N末端肽序列和/或其他C末端序列优选包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个氨基酸或由其组成。有利地是，本发明的蛋白质偶联配体或运载体蛋白，例如生物素、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或血清白蛋白。

“生物样品”在本文中指获自人对象的样品。生物样品可以包括组织和/或生物流体。这类样品可体外、离体或体内获得。作为非限制性示例，生物样品可以选自：组织、器官、细胞或人对象的任何分离部分。生物样品还可以选自血液、血浆、淋巴、唾液、尿液、粪便、泪液、汗液、精子或脑脊液、滑液、胸膜、腹膜或心包液，以及它们的任何部分或提取物。优选地，生物样品是包含IgG抗体的生物流体。如本领域已知，在人中，IgG抗体可存在于血液、血清、唾液、尿液、淋巴液、脑脊液和腹膜液中。更优选地，生物样品是血液、血浆、血清和尿液。甚至更优选地，生物样品选自血清和尿液。还优选地，生物样品是血清。

可以通过本领域已知的任何技术获得所述样品。可以对生物样品进行预处理，以保留感兴趣的抗体的完整性和/或使它们更易于进一步分析。例如，生物样品可以经历离心、纯化或其他处理步骤，以促进获得抗体，特别是IgG，和/或将它们浓缩。还可以对生物样品进行预处理，以限制或降低易于以非特异性方式与本发明的蛋白质反应的抗体的存在，特别是IgG。例如，生物样品可以经历预吸收步骤，其中与重组生产本发明蛋白质的生物物种反应的非特异性抗体被从生物样品中去除或阻断。这样的预吸收步骤可以通过使生物样品与来自生物体的样品或提取物接触来实施，所述生物体产生根据本发明的蛋白质。例如，生物样品可以通过与大肠杆菌裂解物接触预吸附抗大肠杆菌抗体，特别是当本发明的蛋白质是在大肠杆菌中产生的重组蛋白质时。

优选地，在根据本发明的方法中，抗体的存在和/或数量指IgG抗体的存在和/或数量。

用于指代抗体时，“能够结合”在本文中指能够在免疫原性测定的通常实验条件下结合定义的蛋白质的抗体。优选地，抗体能够特异性结合本文定义的至少一种蛋白质。在本发明的上下文中，与定义的蛋白质“特异性结合”的抗体以足以允许检测抗体-蛋白质复合物的量和时间与蛋白质形成或经历物理结合。

“特异性地”或“优先地”指抗体对定义的蛋白质的亲和力高于对其他蛋白质的亲和力，例如生物样品中包含的其他蛋白质。在本发明的上下文中，当提及抗体时，术语“亲和力”表示所述抗体结合定义的蛋白质或其部分的强度，并且其通过抗体与其抗原之间的亲和常数来测量(定义为1/K_D，其中K_D是经典定义的解离常数)，反应速率常数的测量可用于定义平衡或亲和常数(1/K_D)。因此，抗体对其靶标的亲和力与解离常数负相关，即K_D值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。例如，抗体对定义的蛋白质的亲和力可以比对样品中其他蛋白质的亲和力高至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍或更高。这种亲和力或特异性程度可以通过多种常规程序来确定，包括竞争性结合测定。应当理解的是，在本发明的上下文中，已经针对特异性结合抗血吸虫抗体的能力选择本发明的蛋白质，也就是说本发明的蛋白质对抗血吸虫抗体，特别是抗埃及血吸虫抗体具有比人生物样品中存在的其他抗体更大的亲和力。

当提及存在于来自对象的生物样品中的抗体时，“确定存在和/或数量”在本文中指在研究中的特定抗体的存在的定性或定量确定。诸如“包含抗体的样品”或“确定样品中抗体的存在和/或数量”等短语并不意味着排除不包含或未检测到抗体的样品或确定。在通常的意义中，本发明涉及确定样品中是否存在作为宿主对血吸虫(特别是埃及血吸虫)感染的免疫反应的一部分的抗体的测定，因此并不假装排除样品中不存在或未检测到这种抗体的情况。在本发明的上下文中，能够结合如本发明所定义的至少一种蛋白质的抗体的存在和/或数量可以使用本领域已知的任何合适的技术确定，包括但不限于蛋白质检测芯片、基于珠的测定、横向流动装置和酶联免疫吸附测试(ELISA)。优选地，生物样品中抗体的存在和/或数量通过免疫分析测定，更优选基于抗原的免疫分析。这类测定通常允许定量检测蛋白质/抗体复合物的形成，此外，可以容易地设置实验条件以确保检测到的蛋白质/抗体复合物形成是由根据本发明的至少一种蛋白质和存在待确定的抗体之间的特异性结合所致。

在本发明的上下文中，术语“免疫测定”应该被解释为本领域通常理解的，也就是说指旨在基于免疫试剂(通常是抗体)和其配体之间的相互作用来检测或测量分析物的测定。为清楚起见，本文中的术语“基于抗原的免疫分析”指这样的免疫分析，其中将一种或多种抗原用作检测和/或定量作为抗体的分析物的试剂。为清楚起见，本文中的术语“基于抗体的免疫分析”指这样的免疫分析，其中将一种或多种抗体用作检测和/或定量作为抗原的分析物的试剂。通常，在基于抗原的免疫分析的情况中，至少一种感兴趣的抗原被固定在固体支持物上，并且待测试的样品在使样品中任何特异性抗体与固定的抗原结合的条件下直接接触。如果样品中存在能够结合感兴趣的抗原的此类特异性抗体，那么形成复合物，其存在和/或数量可通过直接或间接方式检测，例如通过二抗。

例如，标准固相ELISA和横向流动免疫分析是定量免疫分析，可用于执行基于抗原的免疫分析或基于抗体的免疫分析，并且特别适用于确定来自各种患者样品的蛋白质或抗体的数量或浓度。这些技术是众所周知的，并且已在文献中进行了详细描述，例如Engvall等(载于The Journal of Immunology.109(1):129–135(1972))描述了抗原特异性酶联免疫吸附测定(抗原特异性ELISA)和例如Koszula和Gallotta(载于Essays Biochem.60(1):111-20(2016))描述了也称为侧流测试的侧流免疫分析。

优选地，抗体的存在和/或数量通过ELISA或侧流免疫分析来测定。优选地，确定能够结合如本发明所定义的至少一种蛋白质的抗体的存在和/或数量包括检测在本发明的至少一种蛋白质与存在于生物样品中的抗体，优选IgG之间形成的复合物的形成的步骤。

优选地，检测在本发明的至少一种蛋白质与存在于生物样品中的抗体，优选IgG之间形成的复合物的形成涉及使用二抗，也称为检测抗体。在本发明的上下文中，术语“二抗”指能够结合生物样品中存在的抗血吸虫抗体的抗体。显而易见的是，抗人IgG抗体可用作二抗并且能够检测本发明的至少一种与待测定的样品中存在的IgG抗血吸虫抗体之间形成的复合物。在本发明的上下文中，术语“抗人IgG抗体”指对人IgG抗体具有特异性的抗体，也就是说能够以比它们对其他人免疫球蛋白的亲和力更大的亲和力结合人IgG抗体的抗体。此类抗人IgG抗体通常用作免疫分析中的二抗，它们的生产和使用是本领域众所周知的并且它们是可商购的。在本发明的上下文中，所述抗人IgG抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且可以源自对象(即人)物种以外的任何物种，例如小鼠、大鼠或山羊。如本领域通常进行的那样，抗人IgG抗体可以与可检测标记物偶联。优选地，二抗是抗人抗体，优选抗人IgG抗体。

优选地，在本发明的方法中，抗体的存在和/或数量通过免疫分析测定，优选通过ELISA或侧向流动免疫分析，并且涉及使用抗人IgG抗体，优选与可检测标记物偶联的抗人IgG抗体。

“可检测标记物”在本文中指与分析物、分析物类似物、检测试剂或结合伴侣结合的分子或组合物，其可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测。例如，US 4,275,149、US 4,313,734、US 4,373,932和US 4,954,452已经公开了标记物的示例，包括酶、胶体金颗粒、有色乳胶颗粒。有用的标记物的其他示例包括但不限于，放射性同位素、辅助因子、配体、化学发光剂或荧光剂、蛋白质吸附的银颗粒、蛋白质吸附的铁颗粒、蛋白质吸附的铜颗粒、蛋白质吸附的硒颗粒、蛋白质-吸附的硫颗粒、蛋白质吸附的碲颗粒、蛋白质吸附的碳颗粒和蛋白质偶联的染料囊。化合物(例如，检测试剂)与标记物的连接可以通过共价键、吸附过程、疏水和/或静电键，如在螯合物等中那样，或这些键和相互作用的组合和/或可能涉及连接基团。优选地，可检测标记物选自荧光团、化学发光和放射性标记物组成的列表。合适的标记物的示例包括胶体金、荧光团(例如荧光染料，例如FITC或德克萨斯红，荧光蛋白，例如GFP，或纳米晶体，例如Qdot探针)或酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))、碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶)，均常用于免疫分析。

在本发明的上下文中，并且如同本领域的惯例，本领域技术人员可以设置免疫分析的条件，以保证或提高免疫分析的选择性和特异性，例如通过使用对抗血吸虫抗体不具有特异性的蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)，并将此类蛋白质与待测定的样品接触。在本发明的上下文中，对抗血吸虫抗体不具有特异性的蛋白质指不太可能特异性结合抗血吸虫抗体的蛋白质，例如来自除了血吸虫属以外物种的蛋白质，优选来自除了吸虫(trematodes)以外的物种的蛋白质。

在本发明的上下文中，应当理解的是，确定抗血吸虫抗体的存在和/或数量的步骤可以包括获取由测定产生的数据的步骤，以及表达和/或计算所述数据成为表示抗血吸虫抗体存在和/或数量的信息的进一步步骤。例如，确定抗血吸虫抗体的存在和/或数量可包括从免疫分析获取数据的步骤，例如与免疫分析完成后样品中检测到的可检测标记物水平相关的数据，以及任选地，由该数据进一步确定生物样品中抗血吸虫抗体的存在和/或数量，例如通过将所述数据与参照值或参照值组进行比较。参照值或参考值组可以是预定的值或值组，例如为校准目的而建立的预定标准值或值组。

如在实验部分所详述的那样，发明人已经确定，来自人对象的生物样品中抗血吸虫IgG的存在和/或数量与血吸虫的诊断相关，特别是所述对象中的埃及血吸虫感染。此外，如本文公开的以及用于本发明检测抗血吸虫抗体的方法中的蛋白质对抗埃及血吸虫IgG的特异性高于对因宿主感染其他种类的血吸虫而天然存在于生物样品中的人IgG的特异性。

显而易见的是，本文所述用于检测抗血吸虫抗体的方法可以用于诊断血吸虫感染，特别是埃及血吸虫感染，而且还可以有利地用于区分人对象中的埃及血吸虫感染和曼氏血吸虫或日本血吸虫(Schistosoma japonicum)感染。

c.使来自所述对象的生物样品与至少一种蛋白质接触，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

d.确定来自所述对象的生物样品中能够与所述至少一种蛋白质结合的抗体的数量。

本文所定义的与如本文所述用于检测抗血吸虫抗体的方法相关的特征适用于诊断血吸虫感染的方法。优选地，用于检测抗血吸虫抗体的方法是体外方法。

优选地，根据本发明的用于诊断血吸虫感染的方法还包括步骤c)，其将步骤b)中确定的数量与参照样品中存在的能够结合所述至少一种蛋白质的抗体的数量进行比较。

在本发明的上下文中，存在于参照样品中能够与所述至少一种蛋白质结合的抗体的量可以是预定的阈值，或者在实施本发明的方法的过程中被确定为所述方法的主动步骤。因此，在一个实施方案中，根据本发明的用于诊断血吸虫感染的方法包括步骤c)，其确定能够与参照样品中存在的所述至少一种蛋白质结合的抗体的数量，以及进一步的步骤d)，其将步骤b)中确定的抗体的数量与步骤c)中确定的抗体的数量进行比较。优选地，参照样品源自来自未感染血吸虫的一名或多名对象的生物样品，优选来自未感染埃及血吸虫的一名或多名对象。在另一个实施方式中，根据本发明的用于诊断血吸虫感染的方法包括将步骤b)中确定的数量与参照阈值进行比较的步骤。在本发明的上下文中，参照阈值优选地是能够结合存在于参照样品中的所述至少一种蛋白质的抗体的数量，其中参照样品源自来自未感染血吸虫的一名或多名对象的生物样品，优选来自未感染埃及血吸虫的一名或多名对象。

优选地，根据本发明的用于诊断血吸虫感染的方法还包括由步骤c)的比较或由步骤d)的比较诊断对象是否存在血吸虫感染的进一步步骤。优选地，在所述诊断步骤中：

-在步骤b)中确定的数量超过在步骤c)中确定的抗体的数量或参照阈值表明对象中存在血吸虫感染，和

-在步骤b)中确定的数量低于或等于在步骤c)中确定的抗体的数量或参照阈值表明对象中不存在血吸虫感染。

更优选地，在用于诊断血吸虫感染的方法中：

-在步骤c)中确定的抗体的数量或参照阈值是能够结合存在于参照样品中所述至少一种蛋白质的抗体的数量，其中参照样品源自来自未感染埃及血吸虫的一名或多名对象的生物样品，

并且，在所述诊断步骤中：

-在步骤b)中确定的数量超过在步骤c)中确定的抗体的数量或参照阈值表明对象中存在埃及血吸虫感染，和

-在步骤b)中确定的数量低于或等于在步骤c)中确定的抗体的数量或参照阈值表明对象中不存在埃及血吸虫感染。

值得注意的是，现有血吸虫病治疗的功效因引起感染的血吸虫种类而异。例如，虽然认为吡喹酮和奥沙尼喹在对抗曼氏血吸虫的功效方面是等效的，但是已证明奥沙米喹对埃及血吸虫引起的泌尿生殖系统形式的疾病缺乏功效。根据本发明的用于诊断埃及血吸虫感染的方法可用作治疗干预之前的预备步骤，从而设计或调整治疗性处理。

因此，本发明还提供了治疗感染血吸虫，优选埃及血吸虫的对象的方法，其包括以下步骤：

·根据本发明的方法诊断对象中是否存在埃及血吸虫感染，

·向诊断患有埃及血吸虫感染的对象给予适合埃及血吸虫感染的治疗性处理。

在本发明的上下文中，适用于埃及血吸虫感染的治疗性处理包括吡喹酮、灭草酯、青蒿琥酯或甲氟喹。优选地，适合于埃及血吸虫感染的治疗性处理选自吡喹酮、甲磺酸以及吡喹酮与甲磺酸、青蒿琥酯或甲氟喹的组合组成的列表。然而优选地，适用于埃及血吸虫感染的治疗性处理包括吡喹酮或由吡喹酮组成。

优选地，根据本发明的试剂盒还包含与可检测标记物偶联的抗人IgG抗体。

优选地，在根据本发明的试剂盒中，将所述至少一种蛋白质固定在固体支持物上。

“固体支持物”在本文中指是不溶的或可以通过后续反应变得不溶的材料。许多和不同的固体支持物是本领域技术人员已知的并且包括但不限于硝酸纤维素、反应盘的孔壁、多孔板、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、膜、微粒(例如乳胶颗粒)和绵羊(或其他动物)红细胞。该术语涵盖具有足够孔隙率以允许检测试剂进入并且具有合适的表面亲和力以固定捕获试剂的任何合适的多孔材料。例如，硝化纤维素的多孔结构对多种试剂(例如捕获剂)具有优异的吸收和吸附性能。尼龙具有相似的特性并且也是合适的。微孔结构是有用的，以及在水合状态下具有凝胶结构的材料。

有用的固体支持物的其他示例包括：天然聚合碳水化合物及其合成改性、交联或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯，尤其是与硝酸和羧酸的纤维素酯、混合纤维素酯和纤维素醚；含氮天然聚合物，例如蛋白质和衍生物，包括交联或改性明胶；天然碳氢化合物聚合物，例如乳胶和橡胶；可以制备具有适当多孔结构的合成聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺，和其他聚合物，例如聚氨酯或聚环氧化物；多孔无机材料，例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱和碱土金属的硅酸盐、铝和镁；和铝或硅的氧化物或水合物，例如粘土、氧化铝、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃(这些材料可与上述聚合材料一起用作过滤器)；以及上述类别的混合物或共聚物，例如通过在预先存在的天然聚合物上引发合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。

蛋白质可以通过离子相互作用、疏水相互作用、共价键或通过吸附到本领域已知的任何底物例如聚赖氨酸上而固定在固体支持物上。固体支持物的表面可以通过导致试剂(例如捕获试剂)与支持物共价连接的化学过程来活化。

除非另有物理限制，固体支持物可以任何合适的形状使用，例如薄膜、片材、条或板，或者可以将其涂覆或粘合或层压到适当的惰性运载体上，例如纸、玻璃、塑料薄膜或织物。

本发明的范围通过以下具体实施例的描述也将变得显而易见。

实施例

材料和方法

研究设计和组

本研究中使用的所有样品借鉴了先前经伦理批准的研究，并根据通过尿液样品的显微镜分析确定的卵负荷进行了分层(高：≥50个卵/10ml尿液；或低：1-49个卵/10ml尿液)。使用上转换磷侧向流动CAA测定法进一步测试卵阴性样品中循环阳极抗原(CAA)的存在(de Dood等Frontiers in immunology2018；9:2635)，并分类为卵阴性/CAA阳性或卵阴性/CAA阴性。使用来自津巴布韦和加蓬的地方流行性埃及血吸虫的血清和尿液样品探测蛋白质阵列。使用来自津巴布韦和加蓬的血清样品的相同组以及来自仅津巴布韦的尿液样品的相同组进行ELISA(已将加蓬尿液组从阵列探测中耗尽)。使用来自坦桑尼亚联合共和国桑给巴尔消除环境的尿液样品进行额外的ELISA验证。使用来自菲律宾的日本血吸虫感染样品和来自埃塞俄比亚的曼氏血吸虫感染样品进行物种特异性分析。使用来自加蓬组的血清样品进行ICT评估(表1)。

用人血清和尿液探测埃及血吸虫蛋白阵列

如先前所述(Ochodo等Cochrane Database Syst Rev 2015；(3):CD009579)通过用人血清探测来确定与阵列化的抗原的血清IgG反应，除了将抗人IgG-Qdot偶联物(在阵列封闭缓冲液中为1:100)用作二抗/检测抗体并因此不需要与单独的检测试剂进行三级孵育。尿液IgG反应以相同的方式通过探测阵列确定，不同之处在于首先将人尿液样品浓缩15倍并缓冲液交换到PBS中，然后在阵列封闭缓冲液/10％大肠杆菌裂解物中以1:5稀释并应用于阵列。

埃及血吸虫蛋白质阵列构建、探测和分析

选择蛋白质用于打印在阵列上，所述蛋白质存在于成年埃及血吸虫外皮，可溶性排泄/分泌物(ES)和EV，以及来自卵期的ES(Sotillo等PLoS Negl Trop Dis 2019；13(5):e0007362)，和曼氏血吸虫表层蛋白质组的埃及血吸虫直系同源物¹⁷。其余蛋白质由来自曼氏血吸虫蛋白质组阵列的选定的蛋白质的埃及血吸虫直向同源物组成(阵列构建与之前描述的相同，除了阵列化的蛋白质的开放阅读框是商业合成的，而不是使用PCR扩增寄生虫cDNA中的每个基因。寄生虫提取物作为阳性对照包含在阵列中。

如先前所述(Gaze等PLoS Pathog 2014；10(3):e1004033)通过用人血清(在阵列封闭缓冲液/10％大肠杆菌裂解物中为1:50)探测来确定与阵列化的抗原的血清IgG反应，除了将抗人IgG-Qdot偶联物(在阵列封闭缓冲液中为1:100)用作二抗/检测抗体。尿液IgG反应以相同的方式通过探测阵列确定，不同之处在于首先将人尿液样品浓缩15倍并缓冲液交换到PBS中，然后在阵列封闭缓冲液/10％大肠杆菌裂解物中以1:5稀释。

埃及血吸虫蛋白质阵列数据分析和生物信息学

分别分析了用血清和尿液探测阵列产生的数据集。使用方差稳定标准化(vsn)方法在使用VSN Bioconductor包的GMine(Proietti等Sci Rep 2016；6:38178)中对各点的信号强度(SI)进行背景校正和转换。如果所有感染个体的该蛋白质的平均SI大于所有非地方流行性阴性的SI的平均值+1.5个标准差(SD)，那么认为抗体反应具有反应性。通过斯氏t检验确定感染组与未感染组中抗体反应之间的显著差异。使用ROCR R包生成各抗体反应的接受者操作特征(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)值，并按照反应显著性对这些反应的蛋白质靶标排序。

使用血清或尿液作为诊断液，确定产生可以最有效地区分受感染和未感染的个体的抗体特征的抗原组。首先，对于各数据集，选择在感染群体中显著高于未感染群体中抗体反应的靶标的所有抗原。从这些抗原中，还排除了在小于30％感染群体和超过30％未感染群体中具有阳性(反应性)频率的反应的抗原靶点。这些经修剪的数据集中的抗原按感染和未感染群体之间的平均SI的最大到最小倍数变化以及在感染群体中的反应性频率进行分选。将各数据集中的前5个抗原用于构建支持向量机分类器，其性能通过蒙特卡罗交叉验证进行评估(Proietti等Sci Rep 2016；6:38178)。

抗体特征鉴定

使用血清或尿液作为诊断液，确定能够产生可以最有效地区分受感染和未感染的个体的抗体特征的抗原组。首先，对于各数据集，选择在感染群体和未感染群体之间诱导抗体反应显著上调(多次测试校正后)的所有抗原(血清，n＝208；尿液，n＝45)。从这些抗原中，还排除了在小于30％感染群体(血清，n＝178；尿液，n＝7)和超过30％未感染群体(血清，n＝9；尿液，n＝13)中诱导具有阳性(反应性)频率的抗体反应的抗原。这些经修剪的数据集中的抗原(血清，n＝21；尿液，n＝25)按感染和未感染群体之间的平均SI的最大到最小倍数变化以及在感染群体中的反应性频率进行分选。将各数据集中的前5个抗原用于构建支持向量机分类器，其性能通过蒙特卡罗交叉验证进行评估。反复地，随机选取15个样品作为训练集，其余样品作为测试集。然后，将该模型与训练数据进行拟合，并使用测试集评估模型在将样品分类为感染或未感染中的预测准确性。该过程重复4次。然后通过对所有4个蒙特卡洛交叉验证运行的ROC曲线进行平均来评估模型的预测性能。

EV衍生的TSP的选择

埃及血吸虫EV蛋白质组中存在的TSP通过丰度(蛋白质谱计数)进行分选，并选择具有文献中报道的诊断功效的同源物的丰度最高的TSP(n＝3)进行进一步评估。

大肠杆菌中的重组蛋白生产

如先前所述(Pearson等PLoS Negl Trop Dis 2012；6(X):e1564)，在大肠杆菌中表达选自免疫特征和EV蛋白质组学集合中的8个抗原(MS3_10385、MS3_10186、MS3_06193、MS3_01466、MS3_05950、MS3_09198、MS3_013701和Sh-TSP-2)。MS3_06193、MS3_01466和MS3_05950的表达产量水平太低，无法保证进一步开发。

血清和尿液IgG反应的ELISA验证

通过ELISA测量对各生物流体中大肠杆菌表达和纯化的重组蛋白的IgG反应。板(Greiner)用抗原涂覆，封闭并用血清(1:50)探测，然后用山羊抗人IgG-HRP(西格玛公司(Sigma)，1:5000)探测，并用TMB显色。以类似的方式测量对各种抗原的尿液IgG反应，不同之处在于尿液样品1:10稀释。以相同的方式进行对多种抗原的尿液IgG反应，并将板用稀释至2μg/ml的抗原涂覆。对血清ELISA进行物种特异性分析。一式三份进行测定，并使用Graphpad Prism 7绘制空白校正值。反应性截止值确定为非地方流行性阴性组的平均值+3SD。使用Graphpad Prism 7生成ROC曲线。

PoC-ICT的试验开发

对于PoC测试开发，设计了侧向流ICT(Serve Science公司，泰国曼谷)。偶联垫用10OD金偶联的小鼠抗人IgG涂覆，重组(1.0mg/ml)MS3_01370.1或Sh-TSP-2喷洒在检测线，1.0mg/ml抗小鼠IgG喷洒在质控线。将血清(5μl，在缓冲液BS-007中1:10稀释)施加于样品池，将3滴缓冲液BS-007施加于样品池，15分钟后读取测试结果。对于各试纸条，检测线和质控线处的条带为阳性，仅质控线处的条带为阴性，如果质控线处无条带，那么试验无效。阳性测试的条带强度按四分制从最高(+4)到最低(+1)强度评分。阴性结果为0分。测试结果由两名独立且不知情的检查员确认。

结果

相比未感染群体，感染群体中对多种阵列化的抗原的血清和尿液IgG反应显著升高(血清，n＝208；尿液，n＝45)(图1A和B)。列出了产生前20个最显著反应的抗原(表2)，它们中的大部分在蛋白质组学研究中检测到，并且各数据集中的大部分(至少一半)鉴定自寄生虫蛋白质组的EV部分。这些前20个抗原中的7个(35％)在两个数据集之间共有。用于探测阵列的所有样品(血清，n＝243；尿液，n＝117)的血清和尿液IgG反应之间存在显著的相关性(R²＝0.651，p<0.0001)，这得到了匹配的(n＝17)血清和尿液样品子集的反应之间显著的相关性的支持(R²＝0.613，p<0.0001)(图1C和D)。对于尿液，IgG SI与感染强度显著相关(R²＝0.234，p<0.05)，但感染强度与血清IgG SI之间没有相关性(R²＝0.087，p>0.05)(图5)。

/>

鉴定可以通过使用血清或尿液作为诊断液最有效地区分感染和未感染群体的抗体特征(表3)。由该组中，确定最少四种抗原能够在任一诊断样品中产生诊断准确度(AUC)为0.98的抗体特征(图6)。作为该反应靶标的抗原包括IPSE(MS3_10186)、丝抑蛋白(MS3_10385)、两个CD63样TSP(MS3_09198和MS3_01370)和16kDa钙结合蛋白(MS3_05950)。这些抗原中的大多数鉴定自埃及血吸虫EV蛋白质组。

为了验证鉴定自蛋白质阵列探测的抗原的诊断表现，使用来自免疫特征或EV蛋白质组学组的五种抗原(MS3_10385、MS3_10186、MS3_09198、MS3_01370和Sh-TSP-2)通过ELISA测量IgG反应。使用来自埃及血吸虫低传播区域的样品进一步评估尿液IgG反应(Knopp等Lancet Glob Health 2019；7(8):e1118-e29)。除了MS3_10186.1和MS3_09198.1外，对所有重组抗原的血清抗体反应在所有感染组中都具有显著反应性，其中只有对高和中感染强度组的反应达到显著性。在重组抗原中，在卵阴性/CAA阳性组(感染水平最低的组)中反应最显著的抗体反应是对Sh-TSP-2。在对纯化的重组抗原的抗体反应中，最能区分感染和未感染群体(津巴布韦和加蓬组两者)的那些针对MS3_0371和Sh-TSP-2，分别产生0.93和0.97的AUC(表4)。在感染群体之间的识别频率(FoR)模式分析表明，与这些分子的高AUC值一致，MS3_0170和Sh-TSP-2是最常被识别的两种重组抗原，特别是在Sh-TSP-2的情况中，这是由于感染强度较低的个体的识别度更高(数据未显示)。由于所有测定严格的反应性截止值集合(所有非地方流行性阴性样品的平均值+3SD)，所有重组抗原的特异性在测试的所有组中均为100％。

表4：通过ELISA确定的使用来自地方流行性埃及血吸虫群体的个体的血清的抗原的诊断准确性

相较于对照，高和中感染强度组中对所有重组抗原的尿液IgG反应具有显著的反应性。此外，相较于对照，低和卵阴性/CAA阳性感染强度组中的抗Sh-TSP-2反应也显著升高(图3)。所有重组抗原的抗体反应的AUC值在津巴布韦组中都很高(>0.89)，而在桑给巴尔消除设置的组中对于除了Sh-TSP-2(0.93)之外的所有重组抗原的AUC值适中(0.57-0.69)(表5)。

表5：通过ELISA确定的使用来自地方流行性埃及血吸虫群体的个体的尿液的抗原的诊断准确性

对于尿液，Sh-TSP-2的高诊断性能反映在FoR模式分析中，这表明，至于血清组，在低感染强度组中，该抗原的识别高于测试的所有其他(数据未示)。考虑到所测试的分子的FoR模式中的差异，对抗原的各种组合进行了测试，以查看这些混合物是否会在感染群体中引起更高的阳性率并提高诊断性能。相较于对照，所有抗原组合导致所有感染组产生显著反应(图7)。然而，相较于单独使用Sh-TSP-2，这些组合的使用并未导致感染群体中的AUC或FoR值增加(表6，图8)。与血清ELISA一样，在所有测试的组中对所有重组抗原的特异性是绝对的。

表6：通过ELISA确定的使用来自地方流行性埃及血吸虫群体的个体的尿液的抗原组合的诊断准确性

Sh-TSP-2和MS3_01370(两种性能最高的抗原)在来自单一感染曼氏血吸虫或日本血吸虫的个体的血清中识别的程度。来自日本血吸虫感染的血清抗体识别两种抗原的程度显著较低，以及在Sh-TSP-2的情况下，来自曼氏血吸虫感染的血清抗体识别程度较低(图9)。

最终，评估了Sh-TSP-2和MS3_01370的诊断性能是否可以转化为现场兼容格式。设计PoC–ICT，其中各种抗原涂覆于检测线，以捕获和检测感染的人血清中存在的同源抗体(ICT设计已根据制造商的建议针对这种液体进行了优化)。用Sh-TSP-2或MS3_01370涂覆的ICT由取样的组检测每个感染强度水平的抗体(分别为89％和75％的灵敏度)，即使是在通过尿液过滤呈卵阴性且仅对CAA阳性的个体中。两组ICT显示出100％特异性，对经测试的各个非地方流行性样品都返回阴性结果。

序列表

<110> 阿雷斯贸易股份有限公司（ARES TRADING S.A.）

<120> 用于检测血吸虫感染的蛋白质

<130> P20-121 WO-PCT

<150> EP20204189.3

<151> 2020 10 27

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）

<400> 1

Arg Thr Gly Tyr Gln Ile Gly Lys Thr Met Arg Leu Lys Ser Thr Ser

1 5 10 15

Ser Ser Trp Asn Ser Ser Glu Ala Gln Gln Glu Met Lys Ser Leu Tyr

20 25 30

Gln Glu Leu Asn Asn Ser Leu Thr Ser Glu Lys Thr Phe Leu Asn Glu

35 40 45

Lys Glu Glu Asn Val Val Arg Ile Ser Thr Gly Ile Phe Val Gln Lys

50 55 60

Thr Tyr Glu Val Glu Arg Arg Phe Thr Glu Ser Ile Ala Asn Asp Phe

65 70 75 80

Glu Gly Glu Leu Lys Gln Val Asp Phe Ser Gln Arg Thr Ser Ala Thr

85 90 95

Val Asp Ile Asn Asp Trp Val Asp Gln Gln Ser Asn Gly Leu Leu Glu

100 105 110

Lys Phe Phe Thr Asp Asp Ile Pro Asp Asp Thr Ala Met Ile Leu Val

115 120 125

Asn Val Phe Tyr Phe Arg Asp Phe Trp Gln Ser Pro Phe Glu Pro His

130 135 140

Tyr Thr Arg Met Glu Asn Phe Asp Ile Ser Ser Asp His Gln Ile Thr

145 150 155 160

Val His Met Met Thr Gln Glu Gly Val Met Lys Tyr Gly Lys Phe Glu

165 170 175

Asp Glu Gly Phe Glu Ile Val Ser Lys Pro Leu Asn Asn Thr Arg Phe

180 185 190

Thr Phe Val Ile Val Leu Pro Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asn Gly Ala

195 200 205

Thr Glu Leu Leu Asn Gly Asn Lys Val Leu Ser Glu Tyr Val Lys Asn

210 215 220

Leu Lys Glu Thr Thr Val Ser Leu Arg Leu Pro Lys Phe Thr Leu Lys

225 230 235 240

Asn Thr Leu Asp Leu Val Pro Thr Leu Lys Ser Ile Gly Val Val Asp

245 250 255

Leu Phe Asp Pro Val Lys Ser Asp Leu Ser Gly Ile Thr Pro Asn His

260 265 270

Asn Leu Tyr Val Asn Lys Phe Ile Gln Thr Asn Val Phe Lys Leu Asn

275 280 285

Glu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Thr Val Thr Ser Pro Ile Phe Val Pro

290 295 300

Ile Ser Ala Ile Ile Pro Glu Val Asp Phe His Val Thr His Pro Phe

305 310 315 320

Ile Cys Phe Ile Tyr Asp Gln Gln Leu Thr Met Pro Ile Met Ala Ala

325 330 335

Lys Val Met Asn Pro Ile Leu Gln Ser

340 345

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 2

Cys Lys Tyr Cys Leu Arg Leu Tyr Asp Gly Thr Tyr Glu Asn Gly Ser

1 5 10 15

Tyr Thr Asp Val Tyr Lys Ser Val Gly Ser Leu Ser Pro Pro Trp Ile

20 25 30

Pro Gly Ser Val Cys Val Pro Leu Ile His Asp Ser Lys Arg Gln Pro

35 40 45

Pro Tyr Trp Arg Leu Tyr Glu Asp Val Asn Tyr Ser Gly Lys Asp Thr

50 55 60

Ala Ile Gly His Gly Ala Cys Ile Asp Asp Phe Thr Lys Ser Gly Leu

65 70 75 80

Lys Arg Ile Ser Ser Ile Gln Lys Cys Val Tyr Gly Glu Asn Gly Met

85 90 95

Val Gln Cys Ile Ser Glu Ser Lys Arg Gly Arg Lys Tyr Cys Arg Tyr

100 105 110

<210> 3

<211> 74

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 3

Lys Asp Arg Ile Asp Ser Glu Ile Asp Ala Leu Met Thr Gly Ala Leu

1 5 10 15

Asp Lys Pro Thr Pro Glu Ile Thr Glu Phe Met Asp Leu Ile Gln Ser

20 25 30

Ser Phe His Cys Cys Gly Ala Lys Gly Pro Gln Asp Tyr Gly Pro Asn

35 40 45

Ile Pro Ala Ser Cys Arg Gly Glu Thr Thr Val Tyr His Glu Gly Cys

50 55 60

Val Pro Val Phe Gly Ala Phe Leu Lys Arg

65 70

<210> 4

<211> 81

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 4

Arg Asp Glu Val Lys Ser Gln Phe Leu Ser Leu Val Lys Ser Ser Val

1 5 10 15

Asn Glu Tyr Ser Lys Asn Pro Asp Phe Lys Asn Phe Leu Asp Lys Ile

20 25 30

Gln Gln Glu Phe Gln Cys Cys Gly Ser Glu Ser Ser Ser Asp Tyr Thr

35 40 45

Ser Ser Gly Gln Thr Val Pro Asp Ser Cys Lys Asp Thr Lys Thr Lys

50 55 60

Ala Ile Tyr Ser Asp Gly Cys Ser Tyr Lys Val Ile Ser Phe Phe Glu

65 70 75 80

Lys

<210> 5

<211> 78

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 5

Glu Lys Pro Lys Val Lys Lys His Val Thr Asp Ala Leu Arg Glu Phe

1 5 10 15

Val Lys Glu Tyr Ser His Asp Glu His Val Ser Lys Val Leu Asp Glu

20 25 30

Val Gln Gln Lys Leu Gln Cys Cys Gly Ala Asp Ser Ser Lys Asp Tyr

35 40 45

Val Thr Pro Pro Pro Glu Ser Cys Phe Lys Asp Gly Gln Ile Phe Lys

50 55 60

Glu Gly Cys Val Lys Lys Val Ser Asp Leu Ser Lys Met His

65 70 75

<210> 6

<211> 225

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 6

Met Ala Ser Leu Ser Cys Gly Tyr Lys Cys Leu Gln Ile Leu Leu Val

1 5 10 15

Ile Phe Asn Ile Leu Val Phe Ala Cys Gly Ile Ala Leu Ile Val Ile

20 25 30

Gly Ser Leu Ser Gln Val Ala Ile Asn Asn Tyr Ser Ser Gly Ile Asp

35 40 45

Ser Ser Ile Lys Gly Leu Val Ile Phe Val Ile Val Leu Gly Cys Phe

50 55 60

Leu Phe Leu Leu Gly Phe Leu Gly Phe Cys Gly Ala Cys Thr Lys Asn

65 70 75 80

Thr Cys Cys Leu Ile Leu Tyr Ala Ile Leu Leu Ser Ile Met Val Ala

85 90 95

Ala Glu Ile Ala Ala Gly Ile Thr Ala Ala Val Leu Arg Asp Glu Val

100 105 110

Lys Ser Gln Phe Leu Ser Leu Val Lys Ser Ser Val Asn Glu Tyr Ser

115 120 125

Lys Asn Pro Asp Phe Lys Asn Phe Leu Asp Lys Ile Gln Gln Glu Phe

130 135 140

Gln Cys Cys Gly Ser Glu Ser Ser Ser Asp Tyr Thr Ser Ser Gly Gln

145 150 155 160

Thr Val Pro Asp Ser Cys Lys Asp Thr Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Ser

165 170 175

Asp Gly Cys Ser Tyr Lys Val Ile Ser Phe Phe Glu Lys Tyr Ile Val

180 185 190

Ala Val Leu Val Ala Ala Phe Val Phe Ala Ile Leu Gln Leu Leu Cys

195 200 205

Ile Val Phe Ala Ile Cys Val Ile Arg Ala Ile Lys Ser Gly Asp Ser

210 215 220

Asp

225

<210> 7

<211> 219

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 7

Met Ala Leu Gly Cys Gly Tyr Lys Cys Ser Gln Cys Leu Leu Val Ile

1 5 10 15

Phe Asn Cys Gly Ala Phe Ile Cys Gly Leu Gly Leu Ile Val Val Gly

20 25 30

Ala Leu Gly Leu His Ser Val Val Asn His Trp Lys Asp Ile Glu Pro

35 40 45

Pro Leu Gln Ser Leu Ile Ile Phe Ile Ile Val Leu Gly Cys Phe Leu

50 55 60

Phe Val Leu Gly Ala Leu Gly Met Phe Gly Ala Cys Thr Lys Asn Val

65 70 75 80

Cys Leu Leu Thr Thr Tyr Cys Ile Leu Leu Ser Ile Leu Ile Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ala Ala Gly Ile Phe Ala Ile Leu Glu Lys Pro Lys Val Lys

100 105 110

Lys His Val Thr Asp Ala Leu Arg Glu Phe Val Lys Glu Tyr Ser His

115 120 125

Asp Glu His Val Ser Lys Val Leu Asp Glu Val Gln Gln Lys Leu Gln

130 135 140

Cys Cys Gly Ala Asp Ser Ser Lys Asp Tyr Val Thr Pro Pro Pro Glu

145 150 155 160

Ser Cys Phe Lys Asp Gly Gln Ile Phe Lys Glu Gly Cys Val Lys Lys

165 170 175

Val Ser Asp Leu Ser Lys Met His Leu Asn Ala Ile Ile Ile Ser Val

180 185 190

Phe Leu Phe Ser Leu Val Gln Met Ile Cys Leu Val Phe Ala Val Cys

195 200 205

Val Leu Leu Ala Val Lys Arg Gly Asp Asp Glu

210 215

<210> 8

<211> 218

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 8

Met Ala Thr Leu Gly Thr Gly Met Arg Cys Leu Lys Ser Cys Val Phe

1 5 10 15

Val Leu Asn Ile Ile Cys Leu Leu Cys Ser Leu Val Leu Ile Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Tyr Val Glu Val Lys Phe Ser Gln Tyr Gly Asp Asn Leu His

35 40 45

Lys Val Trp Gln Ala Ala Pro Ile Ala Ile Ile Val Val Gly Val Ile

50 55 60

Ile Leu Ile Val Ser Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala Ile Lys Glu Asn

65 70 75 80

Val Cys Met Leu Tyr Met Tyr Ala Phe Phe Leu Ile Ile Leu Leu Ile

85 90 95

Ala Glu Leu Ala Ala Ala Ile Val Ala Val Val Tyr Lys Asp Arg Ile

100 105 110

Asp Ser Glu Ile Asp Ala Leu Met Thr Gly Ala Leu Asp Lys Pro Thr

115 120 125

Pro Glu Ile Thr Glu Phe Met Asp Leu Ile Gln Ser Ser Phe His Cys

130 135 140

Cys Gly Ala Lys Gly Pro Gln Asp Tyr Gly Pro Asn Ile Pro Ala Ser

145 150 155 160

Cys Arg Gly Glu Thr Thr Val Tyr His Glu Gly Cys Val Pro Val Phe

165 170 175

Gly Ala Phe Leu Lys Arg Asn Leu Val Ile Val Ala Cys Val Ala Phe

180 185 190

Gly Val Cys Phe Phe Gln Leu Leu Ser Ile Val Ile Ala Cys Cys Leu

195 200 205

Gly Arg Gln Ile Lys Glu Tyr Glu Asn Val

210 215

<210> 9

<211> 372

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 9

Gly Gly Asp Asn Phe Leu Thr Cys Pro Leu Gly Ile Leu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Gly Ile Leu Leu Gly Ser Gly Gly Ala Gln Gly Arg Thr Gly Tyr Gln

20 25 30

Ile Gly Lys Thr Met Arg Leu Lys Ser Thr Ser Ser Ser Trp Asn Ser

35 40 45

Ser Glu Ala Gln Gln Glu Met Lys Ser Leu Tyr Gln Glu Leu Asn Asn

50 55 60

Ser Leu Thr Ser Glu Lys Thr Phe Leu Asn Glu Lys Glu Glu Asn Val

65 70 75 80

Val Arg Ile Ser Thr Gly Ile Phe Val Gln Lys Thr Tyr Glu Val Glu

85 90 95

Arg Arg Phe Thr Glu Ser Ile Ala Asn Asp Phe Glu Gly Glu Leu Lys

100 105 110

Gln Val Asp Phe Ser Gln Arg Thr Ser Ala Thr Val Asp Ile Asn Asp

115 120 125

Trp Val Asp Gln Gln Ser Asn Gly Leu Leu Glu Lys Phe Phe Thr Asp

130 135 140

Asp Ile Pro Asp Asp Thr Ala Met Ile Leu Val Asn Val Phe Tyr Phe

145 150 155 160

Arg Asp Phe Trp Gln Ser Pro Phe Glu Pro His Tyr Thr Arg Met Glu

165 170 175

Asn Phe Asp Ile Ser Ser Asp His Gln Ile Thr Val His Met Met Thr

180 185 190

Gln Glu Gly Val Met Lys Tyr Gly Lys Phe Glu Asp Glu Gly Phe Glu

195 200 205

Ile Val Ser Lys Pro Leu Asn Asn Thr Arg Phe Thr Phe Val Ile Val

210 215 220

Leu Pro Leu Glu Lys Trp Ser Leu Asn Gly Ala Thr Glu Leu Leu Asn

225 230 235 240

Gly Asn Lys Val Leu Ser Glu Tyr Val Lys Asn Leu Lys Glu Thr Thr

245 250 255

Val Ser Leu Arg Leu Pro Lys Phe Thr Leu Lys Asn Thr Leu Asp Leu

260 265 270

Val Pro Thr Leu Lys Ser Ile Gly Val Val Asp Leu Phe Asp Pro Val

275 280 285

Lys Ser Asp Leu Ser Gly Ile Thr Pro Asn His Asn Leu Tyr Val Asn

290 295 300

Lys Phe Ile Gln Thr Asn Val Phe Lys Leu Asn Glu Ser Gly Ile Glu

305 310 315 320

Ala Thr Thr Val Thr Ser Pro Ile Phe Val Pro Ile Ser Ala Ile Ile

325 330 335

Pro Glu Val Asp Phe His Val Thr His Pro Phe Ile Cys Phe Ile Tyr

340 345 350

Asp Gln Gln Leu Thr Met Pro Ile Met Ala Ala Lys Val Met Asn Pro

355 360 365

Ile Leu Gln Ser

370

<210> 10

<211> 134

<212> PRT

<213> 埃及血吸虫

<400> 10

Met Phe Leu Ile Ala Leu Leu Ser Tyr Thr Leu Ile Asn Gln Leu Gly

1 5 10 15

Ile Thr Lys Ser Asn Pro Cys Lys Tyr Cys Leu Arg Leu Tyr Asp Gly

20 25 30

Thr Tyr Glu Asn Gly Ser Tyr Thr Asp Val Tyr Lys Ser Val Gly Ser

35 40 45

Leu Ser Pro Pro Trp Ile Pro Gly Ser Val Cys Val Pro Leu Ile His

50 55 60

Asp Ser Lys Arg Gln Pro Pro Tyr Trp Arg Leu Tyr Glu Asp Val Asn

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Lys Asp Thr Ala Ile Gly His Gly Ala Cys Ile Asp Asp

85 90 95

Phe Thr Lys Ser Gly Leu Lys Arg Ile Ser Ser Ile Gln Lys Cys Val

100 105 110

Tyr Gly Glu Asn Gly Met Val Gln Cys Ile Ser Glu Ser Lys Arg Gly

115 120 125

Arg Lys Tyr Cys Arg Tyr

130

Claims

1.至少一种蛋白质用于检测来自人对象的生物样品中抗血吸虫抗体或用于诊断人对象中血吸虫感染的用途，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

2.用于检测来自人对象的生物样品中抗血吸虫抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a.使所述生物样品与至少一种蛋白质接触，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:

3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

3.用于诊断人对象中血吸虫感染的方法，所述方法包括以下步骤：

e.使来自所述对象的生物样品与至少一种蛋白质接触，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,

SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID

NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

f.确定来自所述对象的生物样品中能够与所述至少一种蛋白质结合的抗

体的数量。

4.如权利要求1所述的用途或权利要求2所述的方法，其中，所述抗血吸虫抗体是抗埃及血吸虫抗体。

5.如权利要求1所述的用途或权利要求3所述的方法，其中，所述血吸虫感染是埃及血吸虫感染。

6.如权利要求1、4或5所述的用途或权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述至少一种蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。

7.如权利要求1、4或5所述的用途或权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，使用具有包含选自下组的序列或由其组成的序列的至少两种蛋白质：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10。

8.如权利要求1、4或5所述的用途或权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，至少使用：

-具有包含序列SEQ ID NO:1或序列SEQ ID NO:6的序列或由其组成的序列的蛋白质，和

-具有包含序列SEQ ID NO:2或序列SEQ ID NO:7的序列或由其组成的序列的蛋白质。

9.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其还包括步骤c)和步骤d)，所述步骤c)确定能够与参照样品中存在的所述至少一种蛋白质结合的抗体的数量，所述步骤d)将步骤b)中确定的抗体的数量与步骤c)中确定的抗体的数量进行比较。

10.如权利要求3-8中任一项所述的方法，其还包括将步骤b)中确定的数量与参照阈值进行比较的步骤。

11.一种试剂盒，优选用于本文所定义的用途或方法，所述试剂盒包含至少一种蛋白质以及任选地带有关于如何使用所述至少一种蛋白质的说明的说明书，所述蛋白质具有包含选自下组的序列或由其组成的序列：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其中，所述至少一种蛋白质固定在固体支持物上。

13.如权利要求11或12所述的试剂盒，其还包含与可检测标记物偶联的抗人IgG抗体。