KR102332418B1 - 다수의 식품 항원들 및 c1q-식품 단백질 면역 복합체에 대한 igg 항체 및 iga 항체의 동시 특징분석 - Google Patents

다수의 식품 항원들 및 c1q-식품 단백질 면역 복합체에 대한 igg 항체 및 iga 항체의 동시 특징분석 Download PDF

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Abstract

식품 알레르겐들에 대한 면역 반응성을 정확하게 특징분석하기 위한 조성물들 및 방법들로서, 개개 시험 사이트들에 동일한 식품으로부터 유래된 상이한 식품 항원 제조물들을 도입하는 시험 표면들이 제공되는, 조성물들 및 방법들이 개발되었다. 이러한 코팅된 표면들은 미가공 식품(raw food) 및 조리 식품(cooked food)을 사용하여 생성될 수 있다. 특정 IgG, IgA, 및/또는 C1q 결합을 특징분석하기 위한 이러한 시험 표면들의 패널의 사용은 특정 식품들에 대한 면역 반응성 및 반응을 결정하는데 개선된 감수성 및 정확성을 제공한다.

Description

다수의 식품 항원들 및 C1Q-식품 단백질 면역 복합체에 대한 IGG 항체 및 IGA 항체의 동시 특징분석
본 발명은 식품 알레르기(food allergy), 특히, 식품 항원에 대한 지연성 과민증 반응(delayed hypersensitivity reaction)에 대한 검정(assay)이다.
하기 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공되는 임의 정보가 종래 기술이거나 본원에 청구된 발명과 관련이 있거나, 상세하게 또는 암시적으로 언급된 임의 출판물(publication)이 종래 기술임을 인정하는 것은 아니다.
신경자가면역 질병(neuroautoimmune disease)을 포함하는 자가면역 질환은 세계 인구의 7 내지 10%에 영향을 미치고 있다. 점점 더, 이러한 질환들은 일반적으로 소비되는 식품들에 대한 면역 반응성과 관련이 있다. 일반적으로, 소화관 점막 면역계는 식이 단백질들 및 펩티드들 및 공생 식물군(commensal flora)에서 발견된 항원들에 대한 내성을 유도함으로써 면역 항상성을 유지하면서, 동시에 병원균들에 대한 면역 방어를 수행한다. 그러나, "친화적인" 항원 물질의 신체의 정상적인 내성은 여러 인자들에 의해 혼란을 일으킬 수 있다. 장 장벽 기능부전 및 소화관-관련 장벽의 붕괴는 순환계(circulation)으로의 소화되지 않은 단백질들 및 펩티드들의 진입을 가능하게 할 수 있다. 이러한 환경 하에서, 이러한 식품 물질들의 소화는 다양한 식품 항원들, 뿐만 아니라, 신체 자체의 조직에 대한, IgG 항체 및 IgA 항체의 생성을 야기시킬 수 있다(식품 자가면역 반응성으로서 알려진 현상). 이는 많은 일반적으로 소비되는 식품들의 아미노산 서열들과 신경 세포들을 포함하는 인간 조직에서 자연적으로 발생하는 많은 단백질들의 아미노산 서열들 간의 상동성(homology)(이는 다양한 크기로 존재함)으로 기인한 것이다. 이러한 다양한 식품 단백질들과 상이한 타겟 조직 항원들 사이의 이러한 항원 유사성 또는 분자 모방(molecular mimicry)의 결과로서, 식품 면역 반응성들을 검출하는 것에 대한 실패(failing)는 초기에 자가면역 반응성들의 발달을 야기시킬 수 있고 잠재적으로 자가면역(예를 들어, 신경자가면역) 질병들을 유발할 수 있다[Vojdani, 2014a; Vojdani, 2014b]. 결과적으로, 식품 면역 반응성들은 이의 유병률 증가 및 건강 및 삶의 질에 대한 이의 악영향 둘 모두로 인해, 점점 더 많은 관심을 받고 있다[Johnson et al., 2014; Vojdani et al., 2014c].
본원에서 확인되는 모든 간행물들은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함되도록 명시되는 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다. 도입된 참고문헌에서의 용어의 정의 또는 사용이 본원에 제공된 그러한 용어의 정의와 일치하지 않거나 상반되는 경우에, 본원에 제공된 그러한 용어의 정의가 적용되며, 참고문헌에서의 그러한 용어의 정의가 적용되지 않는다.
면역 반응성의 메카니즘은 일반적으로 이상성(biphasic)으로서, 알레르겐 노출 직후에 급성 반응이 일어나고, 이후에 몇 시간 후에 후기 반응이 일어난다. 급성 반응 동안, 다양한 세포들에 대한 IgE 및/또는 IgG의 결합 및 비만 세포들, 호중구들 및 호염기구들에 의한 히스타민 및 혈소판-활성 인자(PAF; platelet-activating factor)와 같은, 매개체들의 방출로 인해 증상들이 발생한다. 후기 단계(late phase)는 IL-4, IL-9, IL-33, 및 TNF-α와 같은 염증성 시토카인 및 호중구들 및 호산구들과 같은 세포의 유입을 수반한다[Ho et al., 2012]. 전통적인 지연성 식품 면역 반응성에서, 다양한 식품 항원들에 대한 고수준의 IgG, IgM 또는 IgA의 생산은, 면역 복합체들의 형성 및 다양한 조직 사이트에서의 면역 복합체들의 침적과 함께, 항체에 대한 C1q 결합을 야기시킨다. 증상들은 이러한 식품 항원들에 대한 초기 면역 반응 후 수일 동안 또는 심지어 수주 동안 지속할 수 있다.
IgE, IgG, IgA 또는 IgM은 식품 면역 반응성에서 다양한 역할을 한다[Mijayima et al., 1997]. IgE는 이의 고-친화력 수용체, FcεRI을 통해 기능하는데, 이는 비만 세포들 및 호염기구들 상에서 고도로 발현된다. IgG는 고-친화력 FcγRI 및 FcγRIV 수용체들 및 저-친화력 FcγRIIB 및 FcγRIII 수용체들을 포함하는, 여러 수용체들을 갖는다. 이러한 수용체들 모두는 비만 세포, 호염기구, 호중구 및 대식세포를 포함하는, 아나필락시스(anaphylaxis)에 관련된 여러 타입의 세포들 상에서 발현된다.
식품 면역 반응성에서 5개의 상이한 경로가 관련되어 있다[Mancardi et al., 2013; Smit et al, 2011; Strait et al., 2002]:
1. 전통적인 경로 - IgE 및 이의 수용체 FcεRI, 비만 세포들 및 히스타민 관련
2. 대안적인 경로 - IgG1, FcγRIII, 대식세포들 및 PAF 경로에 의해 매개됨
3. IgG-호염기구-PAF 경로
4. FcγRIV를 통한 IgG-호중구-PAF 경로
5. IgG, IgM 또는 IgA-면역 복합체 호중구 경로.
식이성 성분들에 대한 이러한 모든 반응들은 경구 내성(oral tolerance)의 장애(failure)로부터 발생할 수 있다.
상기에서 주지된 바와 같이, 소화관 점막 면역계는 일반적으로, 유해한 병원균들에 대한 효과적이고 적절한 면역 반응들을 형성시키면서(mounting) 소화관에서 무해한 또는 심지어 유익한 분자들에 대한 내성을 유지하는 것으로 이루어진, 면역 항상성을 유지한다[Lim and Rowley, 1982]. 전신 면역 반응의 후속 하향 조절과 함께 식품 항원들에 대한 반응의 결핍(lack)은 경구 내성으로서 특징지워진다. 경구 내성의 장애는 알레르기 및 자가면역과 같은 잠재적으로 생명을 위협하는 결과와 함께, 섭취된 식품에 대한 면역 반응성을 야기시킬 수 있다[Tsuji and Kosaka, 2008].
이러한 상이한 작용 메카니즘들이 섭취된 항원들을 제어하는데 실패할 때, 그 결과는 초기에 식품 항원들에 대한 분비 및 전신 면역 반응들을 활성화시키는 가용성 항원들에 대한 내성의 붕괴(breakdown)일 수 있다. 면역 배제 메카니즘(immune exclusion mechanism)이 기능하지 않는 개체들은 거대 분자들의 만성 과다흡수(chronic hyperabsorption) 및 자가항체들 및 심지어 자가면역 질병을 발달시키는 경향을 경험할 수 있다[Maul and Dichmann, 2008]. 이러한 이유로, IgG, IgM 및 IgA 항체들의 유도 및 실제 식품 항원에 대한 면역 복합체 형성 및 심지어 방관자 항원(bystander antigen)들에 대한 교차-프라이밍(cross-priming)이 임상적으로 중요할 수 있다. 시험관내 및 생체내 실험 연구 모두에서, 점막 IgA 반응에 의해 균형이 이루어지지 않는 IgG 항체들이 방관자 단백질의 상피 침투를 향상시킬 수 있다는 것이 입증되었다[Brandtzaeg and Tolo, 1997]. 상피 세포들을 통한 박테리아 독소들 및 다양한 식품 항원들의 통과는 자가면역을 포함하여, 많은 면역 질환들을 야기시킬 수 있다.
식이성 단백질들 및 펩티드들에 대한 전신 면역 반응의 타입은 항원 구조(예를 들어, 단백질 항원들, 특정 항원들, 다당류들, 당단백질들, 당지질들 또는 효소들) 및 개체들의 유전적 구성(genetic makeup)에 의존한다. 예를 들어, 한 사람은 IgG를 생성시킬 수 있으며, 다른 사람은 식이성 성분들에 대한 IgA 또는 IgM 항체를 생성시킬 수 있다[Barnes, 1995]. 식이성 항원들에 대한 이러한 IgG, IgM 및 IgA 항체들이 검출되지 않게 존재하는 경우에, 그 결과는 자가면역 질병에 뒤따르는 자가면역의 발달일 수 있다.
결과적으로, 최근 수십년 동안, 자가면역 질병과 관련된 자가항원들과 유사성을 공유하는 식품 항원들에서 타겟 펩티드들의 동정에 있어서 상당한 진전이 이루어졌다[Baboonian et al., 1989; Baboonian et al., 1991; Lunardi et al., 1992; Lunardi et al., 2000; Ostenstad et al., 1995; Schrander et al., 1997]. 글리신-풍부 세포벽 단백질 펩티드(GRP; glycine-rich cell wall protein peptide)는 완전히 상이하고 관련이 없는 질병들에서 T- 및 B-세포 면역 반응을 프라이밍할 수 있는 항원 펩티드 서열의 일 예를 나타낸다. GRP는 콩, 과일, 채소 및 젤라틴에서 발견되는 아주 흔한 식품 단백질이다. 이는 리보핵단백질, 원섬유 콜라겐(fibrillar collagen), 시토케라틴 및 자가면역 질환들과 관련된 일반적인 항원들인 EBV 핵 항원-1(EBNA-1; EBV nuclear antigen-1)에 대한 매우 높은 정도의 항원 유사성/상동성을 갖는다.
글리신-풍부 식품 항원 및 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스와 자가면역 질병과 관련된 다양한 조직 항원들 간의 이러한 항원 유사성은 교차-반응성 항원들의 생성을 야기시킬 수 있다. 식품 면역 반응성 및 상이한 자가면역 질환들을 갖는 환자들에서 면역 반응을 유도할 수 있는 일반적인 펩티드 에피토프의 발견은 식품 항원들, 소화관 점막, 및 전신 면역 반응 사이의 가능한 연관성에 대한 의문을 제기한다[Lunardi et al., 1992; Schrander et al., 1997]. GRP 펩티드에 관한 혈청 IgG 항체들은 여러 자가면역 질환들에서 그리고 식품 알레르기 환자들에서 검출되었고, 케라틴, 콜라겐 및 EBNA-1을 포함하는 자가항원들과 교차 반응할 수 있었다[Lunardi et al., 2000]. 이러한 데이타는, 식물 바이러스 및 인간에서의 고도로 계통 발생적으로 보존된 에피토프가 민감한 개체들에서 자가면역 반응의 원인일 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 이는, 분명하게 분기하는 단백질들 사이에서 특정 서열을 확산시키는 항원이 면역 반응을 개시하거나 증폭시키는 것과 관련이 있을 수 있어, 민감한 개체들에서 자가면역을 야기시킨다는 것을 지시한다.
특정 식품 항원 에피토프에 대해 특이적인 T-세포 클론에 의해 매개된 자가면역 반응은 소화관 점막에서 발생할 수 있다. 이러한 T-세포는 특정 부위, 예를 들어, 관절에서 모집될 수 있으며, 여기서, 이러한 것은 활액 단백질들로부터 유래된 상동성 펩티드들에 반응하여 증식한다. 국소적인 염증 및 MHC 분자들의 상향-조절 이후에, 추가적인 자가-항원들의 방출 및/또는 에피토프 전파는 장기 염증 및 파괴의 만성적이고 저절로 계속되는 과정을 야기시켜, 자가면역을 초래할 수 있다[Lunardi et al., 1992; Vojdani, 2014a].
특히 밀 및 우유와 관련하여, 식품 면역 반응성 및 관련된 건강 문제의 인식은 지난 20년에 걸쳐 성장하였다[Bousquet et al., 1998; Lack, 2008; Zuidmeer et al., 2008]. 장내 T-헬퍼 세포들을 자극시키는 능력을 갖는 다수의 글루텐 펩티드는 복강 질병(CD; 복강 질병) 환자들에서 확인되었다[Arentz-Hansen et al., 2000; Arentz-Hansen et al., 2002; Camarca et al., 2009; Tollefsen et al., 2006]. 최근 연구에서는, 비-복강 글루텐 민감성(NCGS; non-celiac gluten sensitivity) 및 크론병(Cohn's disease)을 갖는 환자들이 밀 항원들의 레퍼토리(repertoire)에 반응하고 이에 대해 IgG 및 IgA를 생성시킨다는 것을 나타내었다. 이러한 레퍼토리는 다양한 펩티드들, α-, γ-, ω-글리아딘, 글루테닌, 글루테오모르핀 및 밀 배아 응집소를 포함하였다[Vojdani, 2011]. 밀과 같은 환경적 인자들에 대한 연속 노출은 NCGS 및 복강 질병을 야기시킬 뿐만 아니라, 치료받지 않는 경우에, 염증과 자가면역을 유발할 수 있다[Counsell et al., 1994; De Freitas et al., 2002; Gillett et al., 2001]. 실제로, 복강 질병은 다양한 자가면역 질환들과 관련이 있다. CD 또는 NCGS를 갖는 환자들에서 검출된 자가면역-관련 항체들의 스펙트럼은, 글리아딘과 다양한 조직 항원들 사이에 교차-반응성 및 분자 모방이 일어남을 나타낸다[Alaedini et al., 2007; Collin et al., 2002; Frustaci et al., 2002; Hadjivassiliou et al., 2004; Jacob et al., 2005; Natter et al., 2001; Pratesi et al., 1998; Reinke et al., 2011; Vojdani et al., 2004].
많은 연구들은 다발성 경화증(MS; multiple sclerosis)의 유병률과 유제품 소비 간의 관련에 초점을 맞추고 있고, MS의 발병률이 우유의 소비와 병행한다는 것을 발견하였다[Agranoff and Goldberg, 1974; Butcher, 1976; Kahana et al., 1994; Knox, 1977; Malosse et al, 1992]. 특히, 고도의 서열 상동성이 부티로필린(BTN; butyrophilin)이라 불리워지는 유지방 지방구막의 주요 단백질과 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG; myelin oligodendrocyte glycoprotein) 사이에서 발견된다[Gardinier et al., 1992; Henry et al., 1999; Jack and Mather, 1990].
MOG(미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질)는 MS 및 이의 동물 모델, 실험 자가면역 뇌척수염(EAE; experimental autoimmune encephalomyelitis)의 병리학적 자가면역 반응에서 주요 항원이다[Vojdani et al., 2002]. MOG는 EAE를 갖는 동물들에서 탈미엘린화 자가항체 반응 및 뇌인자유발성(ecephalitogenic) CD4+ T 세포 반응 둘 모두를 유도하는 것으로 알려진 유일한 미엘린 자가항원이다[Amor et al., 1994]. MOG에 대한 뇌인자유발성 T 세포 반응이 우유 단백질 부티로필린(BTN)의 세포외 IgV-유사 도메인과의 면역학적 교차-반응성(또는 "분자 모방")의 결과로서 유도되거나, 대안적으로 억제될 수 있다는 것이 발견되었다. 랫트에서, 본래 BTN으로의 적극적 면역화(active immunization)는 T 세포 및 대식세포의 산발적 뇌막 및 혈관 주위 침윤물의 형성에 의해 특징되는 중추신경계에서의 염증 반응을 촉발시킨다[Vojdani et al., 2002]. 또한, 이러한 병리(pathology)가 MOG 펩티드 서열과 교차-반응하는 BTN의 MHC 클래스 II-제한된 T 세포 반응에 의해 매개된다는 것이 발견되었다[Muthukumar M, et al., 2009].
시신경 척수염(NMO; Neuromyelitis optica)은 뇌 및 척수에서 회백질 및 백질에 영향을 미치는 심각한 신경자가면역 질환으로서, 이는 탈미엘린화, 축삭 손상 및 괴사를 야기시키고, 결국, 병에 걸린 개체에서 마비 및 감각 상실을 야기시킨다[Jarius et al., 2008]. 케이스들 중 75%에서, NMO는 아쿠아포린-4(AQP4)에 선택적으로 결합하는 IgG1 항체의 존재와 관련이 있으며, 이는 아쿠아포린 패밀리에 속하는 수분 채널(water channel)이다[Jarius et al., 2010; Kim et al., 2012]. AQP4는 혈액 뇌 장벽에서 성상 발돌기(astrocytic foot process)에서 발현되며, 이는 뇌 미세혈관 또는 지주막하 공간과 접촉하여 용질 농도, 전기 활성 및 신경 전달 및 흥분도의 조절에 영향을 미친다[Kinoshita et al., 2010]. 결합 후에, AQP4-특이적 IgG1 항체는 성상 세포를 먼저 손상시키고 이후에 척수 및 시신경에서 탈미엘린화를 야기시키는 능력을 갖는다[Bradl and Lassmann, 2008]. AQP4에 대한 IgG1의 결합은 또한, 성상세포 독성의 유도 후에 탈미엘린화 및 조직 파괴를 야기시키는, 보체 캐스케이드 및 염증성 침윤물의 활성화를 유도한다.
최근에, AQP4에 대한 병원성 항체들이 AQP4의 특정 에피토프에 대한 유사성 또는 분자 모방을 갖는 환경 단백질들에 대한 노출에 의해 촉발될 수 있다는 것이 제안되었다[Vaishnav et al., 2013]. 흥미롭게도, 시금치 잎은 내재 막 단백질의 20%를 구성하는 두 개의 열적으로 안정한 아쿠아포린을 발현시킨다[Plasencia et al., 2011]. 유사하게, 대두는 발아 종자들 뿐만 아니라 뿌리 결절들에서 아쿠아포린들을 발현시킨다[Fleurat-Lassard et al., 2005]. 또한, 인간 AQP4가 토마토 및 옥수수 토노플라스트 내재 단백질과 교차-반응할 수 있다는 것이 발견되었다[Vaishnav et al., 2013].
또한, NMO에서 1차 T-세포 에피토프와 상당한 동일성을 갖는 아미노산 서열이 파스닙, 셀러리, 당근, 파슬리, 고수(cilantro), 처빌(chervil) 및 딜(dill)을 감염시키는, 파스닙 옐로우 플렉 바이러스(Parsnip Yellow Fleck Virus)의 잠재적 면역원성 외피 단백질에서 일어난다는 것이 주지되었다. 이러한 에피토프는 또한, 콩과 M. 트룬카툴라(legume M. truncatula)에서 세린-프로테아제 억제제에 존재하는 서열과 상당한 서열 동일성을 공유한다[Vaishnav et al., 2013].
아직 특징분석되지 않은 식품들의 많은 성분들이 또한 자가면역을 촉발시킬 가능성을 지닐 수 있다는 것이 명백하다. 지금까지, 식품 면역 반응성과 관련된 대부분의 연구들은 단지 연구된 식품들에 존재하는 단백질들 및 펩티드들의 수용성 집단을 특징분석하였다. 이러한 것에 대한 예외는 밀인데, 왜냐하면, 글루텐(밀의 알코올-가용성 성분)이 식품 면역 반응성, 교차-반응성, 및 자가면역 연구들에서 사용되었기 때문이다. 또한, 보체의 역할은 아직까지 명확하지 않다.
상기에서 주지된 바와 같이, 지금까지, 식품 알레르겐 연구들은 주로, 특정 항원들에 대한 면역글로불린들의 존재를 검출하는데 초점을 맞추었고, 보체 활성화의 문제를 다루지 않았다. 미국특허출원번호 제2009/0010937호(Chauhan)에는 C1q와 같은 보체 성분들을 포함하는 순환하는 면역 복합체들의 검출이 논의되어 있으나, 논의되어 있는 방법론들은 항-보체 항체들을 사용한 검출을 위해 필요한 고정화를 제공하기 위해 면역 복합체들을 위한 세포 수용체들을 사용한다. 이와 같이, 이러한 것들은 이러한 복합체들의 항원 특이성에 대한 식견을 거의 제공되지 않거나 전혀 제공되지 않는다. 미국특허번호 제8,309,318호(Dorval 및 Dantini)에는 고정된 항원들을 사용하여 결합한 C3b를 함유한 알레르겐-특이적 면역 복합체들의 검출이 논의되어 있다. 그러나, 소위 "순수한 방관자(innocent bystander)" IgG-C3b 부가물들이 보체활성화 동안 형성할 수 있다는 것이 입증되었으며, 이는 항원-특이적 복합체들의 존재를 결정하는데 있어서 이러한 방법의 유용성을 심각하게 제한한다[Fries et al,1984].
이에 따라, 이의 천연 상태의 물-추출 가능한 단백질 및 펩티드에 의해 나타나는 것 보다 식품에서 발견된 보다 광범위한 항원 분자들에 결합하는 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, 및 다른 항체 클래스들)를 특징분석하기 위한 시스템들, 디바이스들, 및 방법들이 요구된다. 또한, 이러한 항체들과 관련된 보체 성분들(예를 들어, C1q)의 존재를 특징분석하는 시스템들, 디바이스들, 및 방법들이 요구된다.
본 발명의 주제는 상이한 그룹의 항원 분자들이 알칼리-가용성 단백질, 알코올-가용성 단백질, 수용성 단백질, 다당류, 당지질, 및 당단백질을 포함하는, 다양한 별개의 물리적/화학적 방법들을 이용하여 식품들로부터 추출되는, 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 이러한 추출물들 각각은 동일한 시험 표면에 특정된 순서로 적용되어 이러한 상이한 추출물들 각각으로부터의 항원들을 포함하는 다중-코팅된 시험 표면을 제공한다. 이러한 항원들에 결합하는 IgG, IgA, 및 C1q(천연 면역글로불린-C1q 복합체들 형태)는, 시험 표면을 샘플에 노출시키고, 세척하여 과량의 샘플을 제거하고, 노출된 시험 표면을 IgG 및/또는 IgA에 대한 종-특이적 항체들과 및 효소와 같은 검출 가능한 태그를 지닌 C1q에 대한 항체들과 접촉시킴으로써 동정된다. 결합된 태그의 특징분석(characterization)은 시험 표면 상에 존재하는 매우 다양한 식품 항원들 중 적어도 하나에 대한 IgG, IgA, 및/또는 C1q 결합 정도를 나타낸다.
본 발명의 주제의 다양한 목적들, 특징들, 양태들, 및 장점들은 동일한 숫자가 동일한 구성요소를 나타내는 첨부된 도면과 함께, 바람직한 구체예의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백하게 될 것이다.
도 1은 본 발명의 개념의 시험 표면을 이용하여 발생된 면역 반응에 대한 보정 곡선을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 개념의 시험 표면에 대한 IgG 결합 연구의 결과를 도시한 것이다. IgG 항체 결합은 제1 개체에 대해 180개의 시험된 식품들로부터의 상이한 항원-함유 추출물들을 포함한 시험 표면들을 사용하여 특징분석되었다. 0.5 OD의 검정 컷오프(assay cutoff) 보다 큰 결과는 바나나, 파인애플, 생강, 바닐라, 아티초크(artichoke), 아스파라거스(asparagus), 양배추, 옥수수, 가지, 올리브, 피클, 감자 튀김, 해초, 렌틸 렉틴(lentil lectin), 피칸, 계란 흰자 및 모방 크랩(imitation crab)에 대한 IgG에서의 유의미한 상승을 지시한다. 나머지 163개의 식품 추출물들에 대한 IgG 면역 반응성은 0.4 OD 미만이었고, 네가티브(negative)인 것으로 여겨졌다.
도 3은 본 발명의 개념의 시험 표면에 대한 C1q 결합(천연 면역글로불린-C1q 복합체를 통한)에 대한 검정 결과를 도시한 것이다. 면역글로불린-C1q 결합은 제1 개체에 대한 180개의 시험된 식품들로부터의 상이한 항원-함유 추출물들을 포함한 시험 표면들을 사용하여 특징분석되었다. 본 실시예에서, C1q 결합(천연 면역글로불린-C1q 복합체를 통한)이 측정될 때, 이러한 복합체의 수준은 IgG가 측정되었을 때 포지티브가 아닌 12개의 상이한 신규한 식품 추출물들에 대해 유의미하게 상승됨을 주지한다. 이러한 추출물들은 라텍스 헤베인(latex hevein), 마늘, 양파, 완두콩 렉틴(pea lectin), 무(radish), 쌀 엔도키티나아제(rice endochitinase), 식품 착색제(food coloring), 참치, 새우, 검(gum) 및 녹차이다. 또한, IgG의 수준이 도 2에 도시된 바와 같이 측정되었을 때, 이러한 동일한 12개의 식품들에 대한 광학 밀도는 0.5 미만이고 네가티브인 것으로 여겨진다는 것이 주지 가능하다.
도 4는 본 발명의 동일한 시험 표면에 대한 천연 면역글로불린-C1q 복합체를 통한 IgG 및 C1q 결합 둘 모두에 대한 검정 결과를 도시한 것이다. IgG 및 C1q 결합은 제1 개체에 대해 180개의 시험된 식품들로부터의 상이한 항원-함유 추출물들을 포함한 시험 표면들을 사용하여 특징분석되었다. IgG 또는 C1q가 측정되었을 때 반응성인 모든 식품 추출물들(도 2 및 도 3에 도시된 바와 같음)은 고도로 반응성이다. 나머지 151개의 식품들에 대하여, 광학 밀도는 0.5 미만이었고, 네가티브인 것으로 여겨진다.
도 5는 본 발명의 개념의 시험 표면에 대한 IgG 결합 연구들의 결과를 도시한 것이다. IgG 항체 결합은 제2 개체에 대한 180개의 시험된 식품들로부터의 상이한 항원-함유 추출물들을 포함한 시험 표면들을 사용하여 특징분석되었다. 0.5 OD의 검정 컷오프 보다 큰 결과들은 IgG의 유의미한 상승을 지시한다. 180개의 식품 항원 추출물들로부터 10에 대한 유의미한 IgG 결합이 확인되었다.
도 6은 본 발명의 개념의 시험 표면에 대한 제2 개체로부터의 (천연 면역글로불린-C1q 복합체를 통한) C1q 결합에 대한 검정 결과를 도시한 것이다. C1q 결합은 180개의 시험된 식품들로부터의 상이한 항원-함유 추출물들을 포함한 시험 표면들을 사용하여 측징분석되었다. 0.5 OD의 검정 컷오프 보다 큰 결과는 C1q의 유의미한 상승을 지시한다. 유의미한 C1q 결합(천연 면역글로불린-C1q 복합체를 통한)은 14개의 식품 항원 추출물들에 대해 확인되었으며, 이러한 것들 중 11개는 C1q에 대해 독특하였다.
도 7은 본 발명의 개념의 동일한 시험 표면에 대한 제2 개체로부터의 천연 면역글로불린-C1q 복합체를 통한 gG 및 C1q 결합 모두에 대한 검정 결과를 도시한 것이다. IgG 및 IgC1q 결합은 제2 개체에 대한 180개의 시험된 식품들로부터의 상이한 항원-함유 추출물들을 포함한 시험 표면들을 사용하여 특징분석되었다. 조합하면, 21개의 식품 항원 추출물들에 대해 상당한 IgG 및 C1q 결합이 확인되었는데, 이는 이러한 개체에 대한 개별적인 IgG 및 C1q 연구에서 확인된 식품 항원 추출물들을 나타낸다.
도 8은 상업적으로 입수 가능한 식품 항원 제조물들을 사용하여 상이한 식품들로부터 제조된 시험 표면들 및 본 발명의 개념의 방법들을 이용하여 제조된 시험 표면들의 패널에 개체로부터의 혈청 IgG 및 IgA의 결합을 나타낸 표를 도시한 것이다. 각 식품에 대한 개별 항원 제조물들, 식품으로부터의 모든 식품 항원 제조물들로 순차적으로 코팅된 시험 표면들, 및 열처리 후 동일한 식품으로부터 유래된 모든 식품 항원 제조물로 순차적으로 코팅된 시험 표면들에 대한 결과들이 도시된 것이다.
도 9는 도 8에 도시된 식품 항원 패널의 확장을 나타낸 표를 도시한 것이다.
도 10은 도 8 및 도 9에 도시된 식품 항원 패널의 확장을 나타낸 표를 도시한 것이다.
도 11은 도 8, 도 9 및 도 10에 도시된 식품 항원 패널의 확장을 나타낸 표를 도시한 것이다.
상세한 설명
식품 항원들에 대한 항체들의 존재 및 식품 항원들에 결합하는 C1q-항체 복합체들의 존재를 특징분석하기 위한 시스템들, 디바이스들, 및 방법들이 제공된다. 식품 항원 추출물들은 다양한 식품들 및 이의 열-변성된 버젼들로부터 수용성 단백질들, 알코올-가용성 단백질들, 알칼리-가용성 단백질들, 당지질들, 다당류들 및 당단백질들의 추출을 위한 방법들을 이용하여 제조된다. 순차적인 방식으로 일반적인 시험 표면에 적용할 때, 이러한 것들은 종래 기술 방법들에 비해 훨씬 더 다양한 식품 항원들을 제공하는 시험 표면을 제공한다. 놀랍게도, 항원 추출물들이 적용되는 순차적인 첨가 및 순서의 이용은 이러한 복합 시험 표면들을 생성시키기 위해 필수적인 것으로 확인되었다.
또한, 각각이 상이한 식품 소스들로부터의 식품 항원 추출물들을 함유한 복수의 시험 표면들에 노출될 때, IgG 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체(즉, 개체 내에서 형성된 면역글로불린-C1q 복합체)가 상이한 결합 프로파일들을 나타냈다는 것이 확인되었다. 또한, 동일한 시험 표면에 동시에 결합하는 IgG/IgA 및 C1q(천연 면역글로불린-C1q 복합체 형태) 둘 모두를 특징분석하는 것이 IgG 및 C1q 결합을 개별적으로 시험하고, 유리하게, 감소된 수의 시험 표면들 및 검정 단계들을 이용하여 식품 항원들에 대한 더욱 완전한 면역반응성 프로파일을 제공하는 것으로부터 얻어진 결과들과 병행한 프로파일을 제공하였다는 것이 발견되었다.
일부 구체예에서, 본 발명의 특정 구체예들을 기술하고 청구하기 위해 사용되는, 구성성분들의 양, 농도, 반응 조건, 등과 같은 성질들을 표현하는 숫자는 일부 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로서 이해되어야 한다. 이에 따라, 일부 구체예에서, 서술된 설명 및 첨부된 청구범위에 기술된 수치 파라미터들은 특정 구체예에 의해 얻어지도록 요구되는 요망되는 성질들에 따라 달라질 수 있는 근사치들이다. 일부 구체예에서, 수치 파라미터들은 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하여 그리고 일반적인 반올림 기술들을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 일부 구체예들의 넓은 범위를 기술하는 수치 범위들 및 파라미터들이 근사치임에도 불구하고, 특정 예들에 기술된 수치 값들은 가능한 한 정확하게 보고된다. 본 발명의 일부 구체예에 제시된 수치 값들은 이의 개개 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정 오차를 포함할 수 있다.
본원의 설명에서 사용되고 하기 청구범위 전반에 걸쳐 사용되는 단수 명사의 의미는 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 복수 참조대상을 포함한다. 또한, 본원의 설명에서 사용되는 바와 같이, "안(in)"의 의미는 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한, "안" 및 "상(on)"을 포함한다.
문맥이 상반되게 명시하지 않는 한, 본원에 기술된 모든 범위들은 이의 종결점들을 포함하는 것으로서 해석되어야 하며, 개방-종결 범위(open-ended range)는 단지 상업적으로 실제 값들을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 모든 값들의 리스트는 문맥이 상반되게 지시하지 않는 한, 중간 값을 포함하는 것으로서 여겨져야 한다.
본원의 값들의 범위의 기술은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 단축 방법으로서 제공하도록 의도된다. 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 범위를 갖는 각 개별 값은 본원에 개별적으로 인용된 것 처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법들은 본원에 달리 지시하지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백하게 반박되지 않는 한, 임의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원의 특정 구체예들과 관련하여 제공된 임의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 나타내도록 의도된 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서에서 어떠한 언어도 본 발명의 실행에서 필수적인 임의 청구되지 않은 구성요소를 지시하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
본원에서 사용되고, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 용어 "에 커플링된(coupled to)"은 직접 커플링(서로 커플링된 두 개의 구성요소들이 서로 접촉함) 및 간접 커플링(적어도 하나의 추가적인 구성요소가 두 개의 구성요소들 사이에 위치됨) 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 이에 따라, 용어 "에 커플링된" 및 "와 커플링된(coupled with)"은 동의어로 사용된다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 구성요소들 또는 구체예들의 그룹핑(grouping)은 제한적인 것으로서 해석되지 않아야 한다. 각 그룹 멤버(group member)는 개별적으로 또는 그러한 그룹의 다른 멤버들 또는 본원에서 확인된 다른 구성요소들과 임의 조합으로 지칭되거나 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버들은 편의성 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 결여될 수 있다. 임의 이러한 포함 또는 삭제가 일어날 때, 명세서는 본원에서, 변형된 바와 같이 그룹을 함유하는 것으로 간주되어, 이에 따라, 첨부된 청구범위에서 사용되는 모든 마쿠시 그룹(Markush group)의 기술된 설명을 충족시킨다.
하기 논의는 본 발명의 주제의 많은 예시적인 구체예들을 제공한다. 각 구체예가 본 발명의 구성요소들의 단일 조합을 나타내지만, 본 발명의 주제는 기재된 구성요소들의 모든 가능한 조합들을 포함하는 것으로 여겨진다. 이에 따라, 하나의 구체예가 구성요소 A, B 및 C를 포함하고 제2 구체예가 구성요소 B 및 D를 포함하는 경우에, 본 발명의 주제가 또한, 명시적으로 개시되어 있지 않더라도, A, B, C, 또는 D의 다른 나머지 조합을 포함하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 식품 성분들은 유제품 및 달걀(변형됨), 곡물(미가공 및 변형됨), 콩류 및 콩과(변형됨), 너트 및 종자(미가공 및 변형됨), 채소(미가공 및 변형됨), 채소(미가공 및 변형됨), 어류 및 해초(미가공 및 변형됨), 육류(변형됨), 허브(미가공), 향료(미가공), 검, 및 양조 음료(brewed beverage) 및 첨가제들을 포함하는 일반적인 그룹들로 분류될 수 있다. 변형된 식품들은 소비 전에 일반적으로 수행되는 제조 단계들, 예를 들어, 비등, 베이킹, 및/또는 프라잉(frying)을 반영할 수 있다.
"유제품 및 달걀"은 요리된(삶은) 계란 흰자, 요리된(삶은) 계란 노른자; 염소 우유; 소프트 치즈 및 하드 치즈; 및 요거트를 포함할 수 있다. "미가공 및 변형된 그레인"은 요리된(삶은) 흰색 및 갈색 쌀; 쌀 케이크; 쌀 단백질; 쌀 엔도키티나아제; 요리된(삶은) 야생 쌀; 및 밀+알파-글리아딘을 포함할 수 있다.
"변형된, 콩 및 콩류"는 요리된 검정콩; 콩 아글루티닌; 다크 초콜렛 및 코코아; 요리된(삶은) 파바 콩; 요리된(삶은) 가르반조 콩; 요리된(삶은) 강남콩; 요리된(삶은) 렌틸; (삶은) 렌틸 렉틴; 요리된(삶은) 리마콩; 요리된(삶은) 핀토 콩; 대두 아글루티닌; 대두 올레오신+아쿠아포린; 간장, 글루텐-부재; 및 두부를 포함할 수 있다.
"미가공 및 변형된, 너트 및 종자"는 아몬드; 로스팅된 아몬드; 미가공 및 로스팅된, 브라질 너트; 로스팅된, 캐슈; 캐슈, 비실린; 치아 종자; 아마 종자; 미가공 및 로스팅된, 헤이즐럿; 미가공 및 로스팅된, 마카다미아 너트; 머스타드 종자; 미가공 및 로스팅된, 피칸; 로스팅된, 피너트; 피너트 버터; 피너트 아글루티닌; 피너트 올레오신; 미가공 및 로스팅된, 피스타치오; 로스팅된, 호박 종자; 참깨 알부민; 참깨 올레오신; 로스팅된, 해바리기 종자; 및 호두를 포함할 수 있다.
"미가공 및 변형된, 채소"는 요리된(삶은) 아티초크; 아스파라거스; 요리된(삶은) 아스파라거스; 요리된(삶은) 사탕무; 피망; 요리된(삶은) 브로콜리; 요리된(삶은) 브뤼셀 콩나물; 양배추, 적색+녹색; 양배추, (삶은) 적색+녹색; 카놀라 올레오신; 당근; 요리된(삶은) 당근; 요리된(삶은) 콜리플라워; 셀러리; 칠리 페퍼; 요리된(삶은) 옥수수; 옥수수 아쿠아포린; 튀긴 옥수수; 옥수수 올레오신; 절인 오이; 요리된(삶은) 가지; 마늘; 요리된(삶은) 마늘; 요리된(삶은) 녹색 콩; 상추; 미가공 및 요리된(삶은) 버섯; 요리된(삶은) 오크라; 절인 올리브, 녹색 및 검정색; 양파 및/또는 염초; 요리된(삶은) 양파 및/또는 염초; 요리된(삶은) 완두; 완두 단백질; 완두 렉틴; 요리된(구운) 감자, 백색; 요리된(튀긴) 감자, 백색; 요리된(구운) 호박 및/또는 스쿼시; 래디시; 홍화 및/또는 해바라기 올레오신; 해초; 시금치; 시금치 아쿠아포린; 토마토; 토마토 아쿠아포린; 토마토 페이스트; 요리된(구운) 참마 및/또는 고구마; 및 요리된(삶은) 주키니를 포함할 수 있다.
"미가공 및 변형된, 과일"은 사과; 사과 사이다; 살구; 아보카도; 바나나; 요리된(삶은) 바나나; 라텍스 헤베인; 블루베리; 멜론 및/또는 감로 멜론; 체리; 코코넛, 미트 및/또는 물 및/또는 밀크; 크랜베리; 데이트; 피그; 포도, 적색+녹색; 레드 와인; 화이트 와인; 그레이프프루트(grapefruit); 키위; 레몬 및/또는 라임; 망고; 오렌지; 오렌지 쥬스; 파파야; 복숭아 및/또는 천도 복숭아; 배; 파인애플; 파인애플 브로멜라인; 자두; 석류나무; 딸기; 및 수박을 포함할 수 있다.
"미가공 및 변형된, 어류 및 해산물"은 요리된(구운) 대구; 요리된(구운) 넙치; 요리된(구운) 고등어; 요리된(구운) 붉은 스냅퍼; 연어; 요리된(구운) 연어; 요리된(구운) 정어리+멸치; 요리된(구운) 농어; 요리된(구운) 틸라피아; 요리된(구운) 송어; 참치; 요리된(구운) 참치; 요리된(구운) 화이트피쉬; 요리된(구운) 크랩+랍스터; 요리된(삶은) 모방 크랩; 요리된(삶은) 대합; 요리된(삶은) 굴; 요리된(삶은) 가리비; 요리된(삶은) 오징어(칼라마리); 요리된(삶은) 새우; 새우 트로포미오신; 및 파르브알부민을 포함할 수 있다.
"변형된, 육류"는 중간 요리된(삶은) 쇠고기; 요리된(삶은) 닭; 요리된(삶은), 양고기; 요리된(삶은), 돼지; 요리된(삶은), 칠면조; 젤라틴; 및 (삶은) 육류 접착제를 포함할 수 있다.
"미가공, 허브"는 바질, 실란트로, 쿠민, 딜, 민트, 오레가노, 파슬리, 로즈마리, 및 백리향을 포함할 수 있다.
"미가공, 향료"는 계피, 정향, 생강, 너트맥, 파프리카, 강황(쿠커민), 및 바닐라를 포함할 수 있다.
"검"은 베타-글루칸, 카라기난, 검 구아, 검 트래거캔스, 로쿠스트 빈 검, 마스틱 검+검 아라빅, 및 잔탐 검을 포함할 수 있다.
"양조된 음료 및 첨가제"는 양조된, 커피콩 단백질; 양조된, 홍차; 양조된, 녹차; 미가공 및 가공된 꿀; 및 인공, 식용 색소를 포함할 수 있다.
추출 이전에, 추출 공정들을 위해 이용 가능한 표면적을 증가하기 위해 식품들은 처리될 수 있다. 예를 들어, 식품 물질들은 해리(maceration), 절단(chopping), 그라인딩(grinding), 밀링(milling), 초음파처리(sonication), 및/또는 압출(extrusion)에 의해 미립자들로 감소될 수 있다. 본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 추출될 식품은 초기에, 예를 들어, 액체 질소를 사용하여 냉동된다. 냉동된 식품은 이후에, 예를 들어, 상업적 블렌더(blender) 또는 그라인더(grinder)를 이용하여 그라인딩되거나 밀링된다.
식품 입자 크기를 감소시키는데 유용할 뿐만 아니라, 세포를 용해시키고 추출 동안 식품 항원들의 방출을 개선시키기 위해 초음파처리가 또한 사용될 수 있다. 이러한 초음파처리는 초음파 베쓰(ultrasonic bath)를사용하거나, 추출 현탁액에 초음파 혼(ultrasonic horn) 또는 프로브의 삽입에 의해, 또는 플로우-쓰루(flow-through) 초음파처리 디바이스를 통한 통과에 의해 적용될 수 있다.
다양한 방법들은 식품들로부터 수용성 단백질들(예를 들어, 알부민들)을 추출하기에 적합하다. 물 또는 본질적으로 중성(즉, 6.5 내지 7.5의 pH)의 완충제들로의 추출 이전에, 식품은 상기에 주지된 바와 같이 미립자들로 감소될 수 있다. 식품은 이후에, 적합한 온도에서 물 또는 본질적으로 중성의 수성 완충제 중에 현탁될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로테아제 활성을 억제하는 화합물들, 예를 들어, EDTA, PMSF, 및/또는 펩스타틴(pepstatin)은 추출을 위해 사용되는 용액에 포함될 수 있다. 다른 구체예에서, 계면활성제들, 예를 들어, 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트, n-도데실-β-D-말토사이드, 알키페놀 에톡실레이트, 및 소듐 도데실 설페이트가 추출을 위해 사용되는 용액에 포함될 수 있다. 적합한 추출 온도는 4℃ 내지 95℃의 범위일 수 있으며, 이는 처리될 특정 식품에 대하여 적절하다. 유사하게, 최적의 추출을 위해 요구되는 시간은 식품, 입자 크기, 및 물-추출 가능한 단백질 항원들의 특성에 의존적일 수 있다. 적합한 추출 시간은 30분 내지 48시간의 범위일 수 있다. 추출 이후에, 잔류 고형물들은 침강(settling) 및 디켄테이션(decantation), 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 추출 및 추출된 고형물들의 제거 이후에, 수용성 단백질 항원 제조물은 적합한 결합 완충제로 전달될 수 있거나, 대안적으로, 사용 전에 저장될 수 있다. 수용성 단백질 항원 제조물들은 저장을 위해 동결건조되거나, 감소된 온도에서 액체 형태로 저장되거나, 사용 전에 냉동된 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 글리세롤과 같은 첨가제는 0℃ 미만의 온도에서 액체 저장을 가능하게 하기 위해 수용성 단백질 항원 제조물에 첨가될 수 있다.
식품들로부터 알칼리 가용성 단백질들을 추출하기 위해 다양한 방법들이 적합하다. 알칼리성 용액으로 추출하기 전에, 식품은 상기에 주지된 바와 같이 미립자들로 감소될 수 있다. 식품은 이후에, 적합한 온도에서 염기성(즉, 약 8 또는 그 보다 높은 pH) 용액에서 현탁될 수 있다. 본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 이러한 알칼리성 용액은 약 10 또는 그 보다 높은 pH를 가질 수 있다. 이러한 알칼리성 용액들은 염기성 염들을 물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 적합한 염기성 염들은 NaOH, KOH, Ca(OH)2, Na2CO3, NaHCO3, Na2HPO4, K2CO3, KHCO3, Ca(HCO3)2, CaCO3, 및 이들의 조합들을 포함한다. 대안적으로, 적합한 알칼리성 완충제들은 완충제들, 예를 들어, CAPS, CAPSO, 트리스(Tris), 및/또는 글리신을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 개념의 다른 구체예에서, 이러한 알칼리성 용액은 약 9 또는 그 보다 높은 pH를 가질 수 있다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 이러한 알칼리성 용액은 8 또는 그 보다 높은 pH를 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 프로테아제 활성을 억제하는 화합물들, 예를 들어, EDTA, PMSF, 및/또는 펩스타틴이 추출을 위해 사용되는 알칼리성 용액에 포함될 수 있다. 다른 구체예에서, 계면활성제들, 예를 들어, 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트, 및 소듐 도데실 설페이트는 추출을 위해 사용되는 알칼리성 용액에 포함될 수 있다. 적합한 추출 온도는 4℃ 내지 95℃의 범위일 수 있으며, 이는 처리될 특정 식품을 위해 적절하다. 유사하게, 최적의 추출을 위해 요구되는 시간은 식품, 입자 크기, 및 알칼리-추출 가능한 단백질 항원들의 특성에 의존할 수 있다. 적합한 추출 시간은 30분 내지 48시간의 범위일 수 있다. 추출 후에, 잔류 고형물들은 침강 및 디켄테이션, 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 추출 및 추출된 고형물들의 제거 이후에, 알칼리 가용성 단백질 항원 제조물은 적합한 결합 완충제로 전달될 수 있거나, 대안적으로, 사용 전에 저장될 수 있다. 알칼리 가용성 단백질 항원 제조물들은 저장을 위해 동결건조되거나, 감소된 온도에서 액체 형태로 저장되거나, 사용 전에 냉동된 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 글리세롤과 같은 첨가제는 0℃ 미만의 온도에서 액체 저장을 가능하게 하기 위해 수용성 단백질 항원 제조물에 첨가될 수 있다.
식품들로부터 알코올/유기 가용성 단백질들을 추출하기 위한 다양한 방법들이 적합하다. 알코올 또는 다른 유기 용매로의 추출 이전에, 식품은 상기에 주지된 바와 같이 미립자들로 감소될 수 있다. 식품은 이후에, 알코올 또는 다른 적합한 유기 용매의 수용액 중에 현탁될 수 있다. 적합한 알코올들은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 이들의 혼합물들을 포함한다. 다른 적합한 유기 용매들은 물과 적어도 혼화 가능하고, DMSO, DMF, 및 글리세롤을 포함한다. 적합한 추출 온도는 4℃ 내지 95℃의 범위일 수 있으며, 이는 처리될 특정 식품에 대하여 적절하다. 유사하게, 최적의 추출을 위해 요구되는 시간은 식품, 입자 크기, 및 물-추출 가능한 단백질 항원들의 특성에 의존할 수 있다. 적합한 추출 시간은 30분 내지 48시간의 범위일 수 있다. 추출 이후에, 잔류 고형물들은 침강 및 디켄테이션, 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 추출 및 추출된 고형물들의 제거 이후에, 알코올/유기 가용성 단백질 항원 제조물은 적합한 결합 완충제로 전달될 수 있거나, 대안적으로, 사용 전에 저장될 수 있다. 알코올/유기 가용성 단백질 항원 제조물들은 저장을 위해 동결건조되거나, 감소된 온도에서 액체 형태로 저장되거나, 사용 전에 냉동된 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 글리세롤과 같은 첨가제는 0℃ 미만의 온도에서 액체 저장을 가능하게 하기 위해 수용성 단백질 항원 제조물에 첨가될 수 있다.
다양한 방법들은 식품들로부터 당지질들을 추출하는데 적합하다. 추출 이전에, 식품은 상기에 주지된 바와 같이 미립자들로 감소될 수 있다. 지질 함유 분획은 유기 용매 또는 유기 용매 혼합물, 예를 들어, 클로로포름, 메탄올, 피리딘, 또는 이들의 혼합물을 사용하여 식품으로부터 추출될 수 있다. 당지질들은 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여, 예를 들어, DEAE 치환된 크로마토그래피 매질을 이용하여 추출된 지질 혼합물로부터 분리되고, 유기 용매/염 수용액 혼합물(예를 들어, 클로로포름/메탄올 혼합물과 혼합된 소듐 아세테이트)로 용리될 수 있다. 일부 구체예에서, 초음파처리는 이러한 추출 동안 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 용리된 당지질들은 염기성 용액을 사용하여 가수분해되고, 이후에 중화될 수 있다. 얻어진 염들은 적합한 탈염화 공정, 예를 들어, 겔 여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및/또는 역상 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 적합한 추출 온도는 4℃ 내지 95℃의 범위일 수 있는데, 왜냐하면, 이러한 온도는 처리될 특정 식품에 대해 적절하기 때문이다. 유사하게, 최적의 추출을 위해 요구되는 시간은 식품 및 입자 크기에 의존적일 수 있다. 적합한 추출 시간은 30분 내지 48시간의 범위일 수 있다. 추출 이후에, 잔류 고형물들은 침강 및 디켄테이션, 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 추출 및 추출된 고형물들의 제거 이후에, 당지질 항원 제조물은 적합한 결합 완충제로 옮겨질 수 있거나, 대안적으로, 사용 전에 저장될 수 있다. 당지질들은 건조상태로 증발되거나, 동결건조되거나, 저온에서 액체 형태로 저장되거나, 사용 전에 냉동 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃ 미만의 온도에서 액체 저장을 가능하게 하기 위해 글리세롤과 같은 첨가제가 당지질 제조물에 첨가될 수 있다.
다양한 방법들이 식품들로부터 다당류들을 추출하는데 적합하다. 추출 전에, 식품은 상기에 주지된 바와 같이 미립자들로 감소될 수 있다. 다당류 함유 분획은 예를 들어, 셀룰라아제를 사용하여, 효소적 소화(enzymatic digestion)에 의해 식품으로부터 추출될 수 있다. 적합한 시간 이후에, 효소 활성은 예를 들어, 추출 혼합물을 비등시킴으로써 정지될 수 있다. 그러한 후에, 단백질들(첨가된 효소를 포함함)은 침전에 의해 다당류 항원 제조물로부터 제거될 수 있다. 단백질들은 휘발성 유기 용매, 예를 들어, 클로로포름, 부탄올, 또는 이들의 혼합물들을 사용하여 편리하게 침전될 수 있다. 적합한 추출 온도는 4℃ 내지 100℃의 범위일 수 있는데, 왜냐하면, 이러한 온도가 처리될 특정 식품에 대해 적절하기 때문이다. 유사하게, 최적의 추출을 위해 요구되는 시간은 식품 및 입자 크기에 의존적일 수 있다. 적합한 추출 시간은 30분 내지 48시간의 범위일 수 있다. 추출 후에, 잔류 고형물들은 침강 및 디켄테이션, 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 추출 및 추출된 고형물의 제거 후에, 다당류 항원 제조물은 적합한 결합 완충제로 옮겨질 수 있거나, 대안적으로, 사용 전에 저장될 수 있다. 다당류들은 건조상태로 증발되거나, 동결건조되거나, 저온에서 액체 형태로 저장되거나, 사용 전에 냉동 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃ 미만의 온도에서 액체 저장을 가능하게 하기 위해 글리세롤과 같은 첨가제가 다당류 제조물에 첨가될 수 있다.
본 출원의 목적을 위하여 당들에 대한 친화력을 갖는 단백질들인 것으로 이해되는 당단백질 항원들은 다양한 방법들에 의해 식품들로부터 추출될 수 있다. 추출 이전에, 식품은 상기에 주지된 바와 같이 미립자들로 감소될 수 있다. 당단백질 함유 분획은 예를 들어, 친화력 크로마토그래피 또는 특정 침전제들에 의해 식품으로부터 추출될 수 있다. 친화력 크로마토그래피 방법들에서, 식품으로부터 얻어진 단백질 분획은 당단백질과 상호작용할 수 있는 고정된 사카라이드(fixed saccharide) 또는 다당류 그룹들을 포함하는 크로마토그래픽 매질(chromatographic media)에 적용된다. 결합된 당단백질들은 후속하여, 적절한 당, 예를 들어, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 또는 이들의 유도체들의 용액을 적용함으로써 매질로부터 용리될 수 있다. 특정 침전제들은 당 모이어티 및 난용성 유기 모이어티를 포함하는 화합물들을 포함할 수 있다. 이러한 화합물들의 결합은 적절한 완충제 조건들 하에서(예를 들어, 2가 양이온들의 존재 하에) 당단백질들을 침전시킬 수 있다. 이러한 침전된 당단백질들은 예를 들어, 침전 시약을 분해시켜 난용성 유기 모이어티를 방출시킨 후에 탈염화 단계(이의 여러 예들은 상기에 제공되어 있음)에 의해, 회수될 수 있다. 적합한 추출 온도는 4℃ 내지 95℃의 범위일 수 있는데, 왜냐하면, 이러한 온도가 처리될 특정 식품에 대해 적절하기 때문이다. 유사하게, 최적의 추출을 위해 요구되는 시간은 식품 및 입자 크기에 의존적일 수 있다. 적합한 추출 시간은 30분 내지 48시간의 범위일 수 있다. 추출 후에, 잔류 고형물들은 침강 및 디켄테이션, 원심분리, 여과, 또는 이들의 조합에 의해 제거될 수 있다. 추출 및 추출된 고형물의 제거 후에, 당단백질 항원 제조물은 적합한 결합 완충제로 옮겨질 수 있거나, 대안적으로, 사용 전에 저장될 수 있다. 당단백질들은 동결건조되거나, 저온에서 액체 형태로 저장되거나, 사용 전에 냉동 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃ 미만의 온도에서 액체 저장을 가능하게 하기 위하여 글리세롤과 같은 첨가제가 당단백질 제조물에 첨가될 수 있다.
상기에서 주지된 바와 같이, 일부 구체예에서, 추출된 항원 제조물을 하나의 완충제에서 다른 완충제로, 예를 들어, 하나의 가공 완충제에서 다른 가공 완충제로, 또는 저장 완충제에서 고체상에 항원을 부착시키기에 적합한 완충제로 이동시키는 것이 요망될 수 있다. 이러한 완충제 이동은 추출된 항원을 보유하는 배제 한계를 갖는 투석막을 사용하여 신규한 완충제에 대한 투석에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 완충제들은 적절한 크로마토그래피 매질 상에서의 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 변경될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 완충제들은 휘발성 첨가제를 사용한 침전, 침전물의 수집 및 건조, 및 요망되는 완충제 중에 재용해에 의해 교환될 수 있다.
항체 및/또는 C1q 결합 검정에서 사용하기 위하여, 추출된 항원들은 고체상에 커플링된다. 본 출원의 문맥 내에서, 용어 "고체상"은 불용성의 현탁된 상들, 예를 들어, 입자들 및 마이크로입자들을 포함한다. 이러한 마이크로입자들은 입자 집단들(예를 들어, 특정 식품으로부터 유래된 항원들과 관련된 입자들)의 분화를 가능하게 하기 위해, 예를 들어, 입자 크기 및/또는 염료의 도입에 의해 엔코딩될 수 있다. 이러한 엔코딩은 단일의, 멀티플렉스 검정(single, multiplexed assay) 내에서 동시 결정을 가능할 수 있다. 통상적인 고체상들은 마이크로웰 플레이트, 마이크로웰 스트립, 마이크로어레이, 다공성 또는 섬유상 물질, 피펫 팁, 비드, 및 마이크로입자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 커플링은 공유 결합(즉, 추출된 항원의 분자와 고체상 간의 공유 결합을 사용함), 또는 비-공유 결합일 수 있다. 본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 고체상은 마이크로웰 플레이트 또는 마이크로웰 스트립의 웰의 내부 표면의 적어도 일부이다. 이러한 마이크로웰들은 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 및 폴리에틸렌을 포함하는, 임의 적합한 물질로 구성될 수 있다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 마이크로웰 표면은 결합을 향상시키기 위해 (예를 들어, 텍스쳐링(texturing)에 의해) 화학적으로 또는 물리적으로 개질되었다.
샘플로부터의 항체 및/또는 C1q와 고정화된 식품 항원 간의 복합체들의 형성을 검출하기 위해 사용되는 검정들은 면역검정들일 수 있다. 이러한 면역검정들은 간접(즉, 경쟁적) 또는 직접(즉, "샌드위치" 검정들)일 수 있고, 임의 적합한 검출 가능한 라벨(예를 들어, 형광 모이어티들, 발색 모이어티들(chromogenic moieties), 메스 라벨(mass label)들, 방사성 모이어티들, 및/또는 효소들)을 사용할 수 있다. 본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 검정은 알칼리성 포스파타아제 또는 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)와 같은 효소 라벨을 사용하는 직접 면역검정이다. 하나 초과의 특정 항체(예를 들어, 항-종 IgG, 항-종 IgA, 및/또는 항-C1q)가 단일 시험 표면에 적용될 수 있는 동안, 공통 라벨이 모두에 대해 사용될 수 있다는 것으로 인식되어야 한다.
본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 상기에 기술된 바와 같은 항원 제조물들로부터의 항원들은 흡착에 의해 고체 시험 표면에 부착된다. 본 발명의 개념의 시험 표면은 상이한 방법들에 의해 단일 식품 소스로부터 제조된, 적어도 두 개의 상이한 항원 추출물들로부터 얻어진 항원들을 포함한다. 일부 구체예에서, 시험 표면은 상이한 방법들에 의해 단일 식품 소스로부터 제조된, 적어도 세 개의 상이한 항원 추출물들을 포함한다. 다른 구체예에서, 시험 표면은 상이한 방법들에 의해 단일 식품 소스로부터 제조된, 적어도 네 개의 상이한 항원 추출물들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 시험 표면은 상이한 방법들에 의해 단일 식품 소스로부터 제조된, 적어도 5개의 상이한 항원 추출물들을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 시험 표면은 상이한 방법들에 의해 단일 식품 소스로부터 제조된, 적어도 6개의 상이한 항원 추출물들을 포함한다.
본 발명의 개념의 바람직한 구체예에서, 상기에 기술된 바와 같이 제조된 항원 제조물들은 순차적 단계별 방식으로 시험 표면에 흡착되며, 결합되지 않은 물질은 첨가들 사이에서 제거된다. 예를 들어, 식품으로부터 제조된 항원 제조물은 흡착을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 시험 표면에 적용될 수 있다. 이러한 기간은 0.5 내지 48시간의 범위일 수 있고, 4℃ 내지 50℃의 온도 범위에서 수행될 수 있다. 결합되지 않은 물질은 이후에, 동일한 식품으로부터 유래된 제2의 상이한 항원 제조물의 흡착 이전에, 예를 들어, 피펫팅(pipetting)에 의해 제거된다. 임의적으로, 시험 표면은 이를 제2 및/또는 후속 항원 제조물과 접촉하기 전에 세척될 수 있다. 이러한 세척은 계면활성제를 포함할 수 있는 세척 완충제를 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 계면활성제들은 폴리에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Tween 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween 80), 4-(1,1,3,3-트테라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜(Triton X-100), 및/또는 옥틸페녹시 폴리(에틸렌옥시)에탄올(Nonidet P40)을 포함한다. 이러한 공정은 순차적으로 코팅된 시험 표면을 생성시키기 위해 동일한 식품으로부터의 추가적인(예를 들어, 제3, 제4, 제5 및 또는 제6) 식품 항원 제조물들로 반복될 수 있다.
놀랍게도, 항원 제조물들에 및 계면활성제-함유 세척 완충제들에 대한 사전 노출에도 불구하고, 추가적인 항원성 물질을 흡착시키는 능력을 보유하기 위한 많은 통상적인 시험 표면들(예를 들어, 폴리스티렌 마이크로웰들)이 발견되었다. 최종 항원 제조물의 적용 후에, 시험 표면의 나머지 흡착 사이트들은 차단 완충제의 적용에 의해 차단될 수 있다. 이러한 차단 완충제들은 시험 표면의 잔류 흡착 또는 커플링 사이트들을 점유하지만 다른 검정 성분들과 상당한 상호작용을 제공하지 않는, 하나 이상의 단백질들(즉, 차단 단백질들)을 함유할 수 있다. 적합한 차단 단백질들의 예는 혈청 알부민들, 난백알부민들, 젤라틴, 우유 단백질들, 및 적합한 종들로부터의 비특이적 면역글로불린들을 포함한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 다수의 항원 추출물들을 포함하는 시험 표면들이, 시험 표면에 적용 전에 이러한 항원 추출물들을 혼합함으로써 효과적으로 생성되지 못할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 혼합물은 불안정한 것으로 입증되어, 시험 표면에 적용 전에 적어도 일부 항원성 화합물들을 제거한 침전물들의 형성을 야기시킨다. 이러한 항원들의 손실이 그러한 특정 식품에 대한 위음성 결과(false negative result)를 야기시킬 수 있고, 즉, 매우 요망되지 않을 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은, 시험 표면에 식품 항원 제조물들을 적용하는 것이 보다 광범위한 식품 항원들이 존재하는 시험 표면을 순차적으로 발생시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 식품 항원들 제조물들은 특정 순서로 첨가된다. 예를 들어, 다수의 식품 항원 제조물들은 하기 순서로 연속적으로 적용될 수 있다: 제1 알칼리 가용성 단백질들, 이후 알코올 가용성 단백질들, 이후 수용성 단백질들, 이후 다당류들, 이후 당지질들, 및 마지막으로 당단백질들. 본 발명의 개념의 다른 구체예에서, 상이한 첨가 순서가 적합할 수 있으며, 단, 상이한 항원 제조물들은 별도의 별개 단계들에서 시험 표면에 적용된다. 또한, 일부 구체예에서, 상기에서 논의된 식품 항원 제조물들 중 하나 이상이 코팅 공정으로부터 생략될 수 있다는 것이 인식되어야 한다.
실시예
실시예 1: 다양한 식품들로부터의 단백질들의 추출
다양한 식품 소스들로부터 수용성, 알코올-가용성, 및 알칼리성-가용성 단백질들의 추출을 위한 적합한 방법들은 하기와 같다:
단계 1 - 각 단백질 항원 제조물을 위하여, 3개의 상이한 용매들/완충제들(A, B 및 C로 명명됨) 중 하나 중에서 2 그램의 건조 콩들, 너트들, 종자들(seeds) 및 향료들 또는 20 그램의 습윤 과일들 또는 채소들을 그라인딩하거나 밀링하였다:
A. 수용성 단백질들에 대하여 100 mL의 0.1 M PBS(pH 7.2)
B. 알코올 가용성 단백질들에 대하여 100 mL의 70% 에탄올
C. 알칼리 가용성 단백질들에 대하여 100 mL의 0.1 M KOH(pH 10.0).
단계 2 - 세포를 용해하기 위하여 2 내지 5분의 초음파처리를 적용하였다. 2 mL의 세제(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 또는 n-도데실-β-D-말토사이드)를 첨가하고, 추가 2 내지 5분 동안 초음파처리를 반복하였다.
단계 3 - 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 이후에, 각 제조물을 15분 동안 10,000 g에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다.
단계 4 - 별도의 투석 백(6,000 달톤 MW 제거)에 각 상청액을 이동시키고, 특정 용매에 대해 투석하였다. 예를 들어, PBS 중에 용해된 단백질 항원의 용액에 대하여, 투석은 PBS에 대해 수행되어야 한다. 유사하게, KOH로 추출된 단백질 항원에 대하여, 투석은 0.1M KOH에 대해 수행되어야 한다.
단계 5 - 48시간의 투석 후에, 투석된 용액들을 수집하고 15분 동안 14,000 g에서 원심분리하였다. 샘플은 단백질 농도의 측정을 위해 제거될 수 있다. 나머지 단백질 항원 제조물들은, 면역학적 검정들에서 사용하기 위해 요구될 때까지 -20℃에서 저장될 수 있다.
실시예 2: 다양한 식품들로부터 당지질들의 추출
다양한 식품 소스들로부터 당지질들을 추출하기 위한 적합한 방법은 하기와 같다.
단계 1 - 100 mL의 물 중에서 2 그램의 건조 콩들, 너트들, 종자들, 및 향료들 또는 20 그램의 습윤 과일들 또는 채소들을 그라인딩하거나 밀링하였다.
단계 2 - 세포들을 용해시키기 위해 2 내지 5분의 초음파처리를 적용하였다.
단계 3 - 120 mL의 클로로포름:메탄올(2:1, v:v)을 첨가하고, 초음파처리를 반복하였다.
단계 4 - 600 ㎕의 피리딘을 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 단순한 지질들, 인지질들 및 당지지들을 추출하였다.
단계 5 - DEAE-기반 이온 교환 배지에 클로로포름:메탄올 추출물을 적용하고, 이후에, 클로로포름:메탄올:소듐 아세테이트(1:2:1, v:v:v)로 컬럼으로부터 당지질들을 용리시켰다.
단계 6 - 용리된 당지질들을 0.1N 소듐 하이드록사이드/메탄올 용액으로 가수분해하고, 아세트산을 사용하여 중화시키고, 이후에, C-18 역상 컬럼에 대한 결합 및 이로부터의 후속 용리에 의해 탈염화시켰다.
단계 7 - 클로로포름:메탄올(2:1, v:v) 중에 탈염화된 당지질들을 용해시켰다.
단계 8 - 회전 증발기를 이용하여 55℃에서 용해된 당지질로부터 유기 용매들을 제거하였다. 이러한 건조된 물질은 -20℃에서 저장될 수 있다.
단계 9 - 사용하기 위하여, 70% 메탄올 중에서 당지질들을 현탁시키고, 실온에서 2분 동안 초음파처리하였다.
실시예 3 - 다양한 식품들로부터 다당류들의 제조
과일들, 채소들, 또는 콩들로부터 다당류들을 생성시키기 위한 적합한 방법은 하기와 같다.
단계 1 - 100 mL의 물 중에서 2 그램의 건조 콩들, 너트들, 종자들, 및 향료들 또는 20 그램의 습윤 과일들 또는 채소들을 그라인딩하거나 밀링하였다.
단계 2 - 세포들을 용해하기 위해 2 내지 5분의 초음파처리를 적용하였다.
단계 3 - 100 mg의 셀룰라아제를 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
단계 4 - 온도를 100℃로 상승시키고, 60분 동안 인큐베이션하였다.
단계 5 - 15분 동안 10,000 g으로 원심분리하고, 상청액을 보유하였다.
단계 6 - 4:1 클로로포름:부틸 알코올(4:1, v:v)을 첨가하여 셀룰라아제를 포함하는 자유 단백질들을 제거하였다.
단계 7 - 4 부피의 95% 에탄올을 첨가함으로써 탈단백질화된 용액으로부터 다당류들을 침전시키고, 이후에, 100 mL의 물 중에 침전물을 다시 용해시켰다.
단계 8 - 표준물로서 글루코오스를 사용하여 (예를 들어, 둘비오스(Dubois) 등(1956)의 페놀-황산 비색법에 의해) 중성 당 함량을 결정하고, (예를 들어, 생(Sheng) 등(2007)의 방법에 의해) 단당류 조성물을 추가로 특징분석하였다. 다당류 제조물들은 면역학적 검정들에서 사용하기 위해 요구될 때까지 -20℃에서 저장될 수 있다.
실시예 4 - 다양한 식품들로부터 당단백질들의 추출
다양한 식품 소스들로부터 당단백질들의 추출을 위한 적합한 방법은 하기와 같다.
단계 1 - 블렌더(blender)에서 100 그램의 과일들, 채소들, 콩들, 레귐(legume)들, 너트들, 종자들, 향료들, 허브들, 유제품, 달걀들, 육류, 해산물, 검(gum) 또는 음료(beverage)들을 그라인딩하거나 밀링하였다.
단계 2 - 100 mL의 2%(w/v) CaCl2를 첨가하고, 5분 동안 균질화하였다.
단계 3 - 세포들을 용해하기 위해 3분의 초음파처리를 적용하였다.
단계 4 - 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이후에, 용액을 30분 동안 10,000 g으로 원심분리하였다. 상청액을 보유하였다.
단계 5 - 120 mg의 1,3,5-P-β-D-갈락토실-옥시펜아조) 2,4,6-트리하이드록시벤젠을 함유한 120 mL의 2%(w/v) CaCl2를 첨가하고, 1시간 동안 교반하여 당단백질들을 침전시켰다.
단계 6 - 10분 동안 2,000 g에서 원심분리함으로써 당단백질들을 함유한 침전물을 수집하였다.
단계 7 - 15 mL의 증류수 중에 침전물을 용해시켰다.
단계 8 - 5 mL의 증류수 중에 용해된 250 mg의 소듐 메타바이설파이트를 첨가하여 디아조 연결을 감소시켰다.
단계 9 - 당단백질들을 함유한 튜브를 기밀하게 캡핑하고 50℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
단계 10 - 3일 동안 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)를 갖는 투석막을 이용하고 매일 물을 교체하여 3 리터의 증류수에 대해 감소된 당단백질 용액을 투석하였다.
단계 11 - 15분 동안 14,000 g에서 투석된 물질을 원심분리하였다. 당단백질 농도를 Roche Life Sciences(Indianapolis, Indiana)로부터의 DIG GLYCAN DETECTION KIT®를 이용하여 측정할 수 있다. 제조물은 면역학적 검정에서 사용할 때까지 -20℃에서 저장될 수 있다.
실시예 5 - 항체들의 측정을 위한 고체 매트릭스에 대한 다양한 식품 추출물들의 결합
동일한 시험 표면에 대해 상기에 기술된 바와 같이 추출된 항원 제조물들을 사용한 성공적인 플레이트 코팅에서, 상이한 추출물들을 동일한 시험 표면에 순차적으로 첨가하였으며, 결합되지 않은 물질들을 제거하여 순차적인 첨가들 사이에 세척 단계들이 제공되었다. 마이크로웰 플레이트의 웰들에 대한 첨가를 위한 적합한 순서는 하기와 같다.
단계 1 - 플레이트에 알칼리-가용성 단백질들을 첨가하고, 이후에, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, PBS/Tween 20으로 세척하였다.
단계 2 - 플레이트에 알코올-가용성 단백질들을 첨가하고, 이후에, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, PBS/Tween 20으로 세척하였다.
단계 3 - 플레이트에 수용성 단백질들을 첨가하고, 이후에, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, PBS/Tween 20으로 세척하였다.
단계 4 - 플레이트에 다당류들을 첨가하고, 이후에, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, PBS/Tween 20으로 세척하였다.
단계 5 - 플레이트 당지질들을 첨가하고, 이후에, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, PBS/Tween 20으로 세척하였다.
단계 6 - 플레이트에 당단백질들을 첨가하고, 이후에, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이후에, PBS/Tween 20으로 세척하였다.
단계 7 - 모두 6개의 항원 제조물들을 플레이트 첨가하고, 여기에 함유된 항원들을 고체 매트릭스에 결합시킨 후에, 2%(w/v) 소혈청 알부민, 2%(w/v) 난백 알부민, 2%(w/v) 건조 우유, 2%(w/v) 젤라틴, 또는 2%(w/v) 경골어류 젤라틴(teleost gelatin)을 첨가함으로써, 잔류 비-특이적 결합 사이트를 포화시켰다. PBS/Tween 20으로의 최종 세척 후에, 플레이트를 항체 및/또는 C1q 측정을 위해 사용될 때까지 4℃에서 저장할 수 있다.
실시예 6 - 다양한 식품들의 추출물들의 조합에 대한 혈액 중의 IgG, IgA 항체 및 면역글로불린-C1q 복합체의 검출을 위한 검정 절차
하기 절차는 실시예 5에 따른 식품 추출물들의 조합으로 코팅된 마이크로웰 플레이트들의 사용을 기술한다. 시험관들, 니트로셀룰로오스 페이퍼, 마이크로입자 현탁액들, 및 다른 매트릭스들이 사용될 수 있다는 것이 인식되어야 한다.
혈청 샘플들을 정맥천자(venipunture)에 의해 개체들로부터 수집하고, 실온에서 20분 동안 잔류시켰다. 혈장, 전혈, 타액, 점액, 윤활액(synovial fluid), 및/또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함하는, 다른 샘플 타입들이 또한 적합하다. 800 g에서 10분 동안 원심분리 후에, 혈청을 제거하고, -40℃에서 저장하였다.
세척 완충제를 하기와 같이 제조하였다: 500 mL 눈금 실린더에서, 450 mL의 물을 50 mL의 10x 세척 완충제(3.0L 증류되거나 탈이온화된 H2O로 희석된 1.0L 1x PBS; 1.5 mL의 Tween 20; 400 mg 소듐 아지드)에 첨가하였다. 용액을 혼합하고, 500 mL 스퀴즈 병(squeeze bottle)으로 옮기고, 2 내지 8℃에서 사용할 때까지 저장하였다.
항-면역글로불린 및 항-C1q 항체들을 하기와 같이 제조하였다: 100 ㎕의 효소-라벨링된 항-인간 IgG, 항-인간 IgA, 항-인간 IgG 플러스(plus) 항-C1q 보체, 또는 항-인간 IgA 플러스 항-C1q 보체를 0.1 M PBS/Tween 20 및 2% BSA를 함유한 20 내지 50 mL의 콘주게이트 희석액에 첨가하고, 혈청 중에 항체들 및/또는 C1q 항체 콘주게이트들의 검출을 위해 사용하였다.
빈 폴리프로필렌 튜브에서 5 mg의 기질 정제 당 5 mL의 기질 완충제를 첨가함으로써 기질 용액을 사용 직전에 제조하였다. 튜브를 캡핑하고, 혼합하여 정제를 용해시키고, 이후에, 용액을 바로 사용하였다. 마이크로웰 스트립 당 대략 1 mL의 기질 용액을 사용하였다.
항체 및 C1q 프로파일 특징분석을 위하여, 40 ㎕의 혈청을 0.1 M PBS/Tween 20 플러스 2% BSA를 함유한 4 mL의 희석 완충제에 첨가함으로써 혈청을 1:100(v/v)으로 희석시켰다. 이러한 희석이 필요한 경우 조정될 수 있고, 1:20(v/v) 내지 1:400(v/v)의 범위일 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 희석된 혈청을 각 식품에 대해 제조된 튜플리케이트 웰(duplicate well)에 첨가하고, 4℃ 내지 25℃에서 30 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션은 15분 정도로 짧을 수 있고, 24시간 정도로 길 수 있다. 인큐베이션 후에, 플레이트들을 세척 완충제, 예를 들어, 0.1 M PBS/Tween 20, 이후, 100 ㎕의 적절하게 희석된 항-인간 IgG, 항-인간 IgA 또는 항-인간 IgG 플러스 항-인간 C1q를 사용하여 3 내지 6회 세척하였으며, 모든 것은 알칼리성 포스파타아제와 같은 효소로 라벨링되어 있고, 시험된 웰들에 첨가하였다. 이러한 항-면역글로불린 및 항-C1q 콘주게이트들에 대한 적합한 희석을 약 1:200 내지 약 1:1000(v/v)의 범위일 수 있다.
마이크로웰 플레이트들 또는 스트립들을 이후에, 커버링하고, 실온(즉, 22℃ 내지 25℃)에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 액체를 이후에, 모든 웰들로부터 제거하고, 웰들을 약 200 ㎕의 세척 완충제로 4회 세척하였다. 100 ㎕의 p-NPP 기질 용액을 이후에, 웰들에, 반응들을 판독하기 위해 사용되는 기기의 판독 시간에 해당하는 이격된 간격으로 첨가하였다(예를 들어, 단일 웰로부터 데이타를 획득하기 위해 기기가 30초를 요구하는 경우에, 기질은 30초 간격으로 웰들에 첨가된다). 각 웰에서 기질의 인큐베이션 시간은 22℃ 내지 25℃의 온도에서 45분 내지 60분이다. 기질 인큐베이션 단계가 보다 높은 온도에서 수행되는 경우에 이러한 시간이 줄어들 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 50 ㎕의 3N NaOH를 웰들에 p-NPP가 첨가된 동일한 이격된 간격으로 첨가함으로써 효소 반응을 중지시켰다. 마이크로웰 플레이트를 이후에, 1 내지 2분 동안 흔들어주었다. 마이크로웰 플레이트의 바닥을 판독 이전에 비-연마성 페이퍼 타월로 블롯팅하고, 기기는 블랭크 웰에서 0으로 맞추었다. 광학 밀도(OD; optical density)를 405 nm ± 5 nm에서 효소 반응을 정지시키는 30분 이내에 판독하고, 수치를 기록하였다.
적가 또는 항체 수준은 하기 수학식들을 이용하여 컴퓨터-실행된 프로그램으로 결정될 수 있다:
1) IgG, IgA 또는 IgG + C1q 지수 =
(시험 시편의 흡광도)/(보정물(calibrator)의 흡광도)
2) IgG, IgA 또는 IgG + C1q 수준 =
((보정물들의 값들) X (시험 시편의 흡광도))/(보정물들의 흡광도)
정밀한 결정을 위하여, 흡광도는 포인트-대-포인트 데이타 감소 방법(point-to-point data reduction method)을 이용하여 농도 값들로 변환될 수 있다. 대안적으로, 최적선 선형 회귀법(best-fit linear regression)이 값들을 얻기 위해 사용될 수 있다.
값들을 자동화된 ELISA 판독기를 이용하여 얻었다. x-축은 각 보정물의 농도 값이다. Y-축은 광학 밀도(OD)로서 표현되는 상응하는 중간 흡광도 값이다. 최적선이 유도되었다. Y-축 상에 이의 흡광도를 위치시키고 X-축 상의 상응하는 농도 값을 확인함으로써 각 환자의 타액 또는 혈청의 농도를 얻었다. 통상적인 보정 곡선의 예는 도 1에 도시되어 있다. 농도는 상대 단위로 표현되는데, 이는 실제적으로, 보정 종들의 특성에 의존적이다.
제1 환자로부터 얻어진 혈청을 사용하여 얻어진 결과들은 도 2에 도시되어 있다. 도 2는 상기에 기술된 바와 같이 순차적으로 코팅된 마이크로웰 플레이트들의 웰을 사용하여 특징되고 항-인간 IgG로만 프로빙된, 180개의 시험된 식품들로부터 제조된 항원들에 대한 IgG 항체 상승을 나타낸다. 0.5 O.D.의 제거 광학 밀도(cutoff optical density) 값은 비-상승된 값들의 분포를 기초로 하여 선택되었으며, 이러한 값 보다 높은 광학 밀도는 포지티브 반응을 나타낸다. 0.5의 컷오프를 갖는 본 실시예에서, 유의미한 상승이 바나나, 파인애플, 생강, 바닐라, 아티초크, 아스파라거스, 양배추, 옥수수, 가지, 올리브, 피클, 감자 튀김, 해초, 렌틸 렉틴, 피칸, 계란 흰자 및 모방 크랩에 대해 관찰된다는 것에 주목한다. 다른 163개의 식품 추출물들에 대한 IgG 면역 반응성은 0.5 OD 미만 또는 네가티브였다.
마이크로웰 플레이트의 웰들이 항-C1q 항체로만으로 프로빙되는 것을 제외하고, 동일한 샘플에 대한 결과가 도 3에 도시되어 있다. 도 3은 180개의 시험된 식품들로부터 제조된 항원 혼합물에 대한 C1q 결합(천연 면역글로불린-C1q 복합체 형태)의 상승을 도시한 것이다. C1q가 이러한 방식으로 측정하면, 이러한 복합체의 농도가 단지 IgG가 측정될 때 포지티브가 아닌 12개의 상이한 신규한 식품 추출물들에 대해 유의미하게 상승된다는 것이 주목된다. 이러한 추출물들에는 라텍스 헤베인, 마늘, 양파, 완두콩 렉틴, 무, 쌀 엔도키티나아제, 식용 색소, 참치, 새우, 검들 및 녹차가 있다. 또한, 이러한 12개의 식품들에 대하여, 유사한 웰들이 항-인간 IgG로 프로빙될 때 IgG의 농도가 0.5 미만 또는 네가티브라는 것이 주목된다(도 2 참조).
마이크로웰 플레이트의 웰들 각각이 항-인간 IgG 및 항-C1q 항체 둘 모두로 프로빙되는 경우를 제외하고 동일한 샘플에 대한 결과들은 도 4에 도시되어 있다. 도 4에서는 IgG 및 C1q-IgG 복합체의 조합이 항-인간 IgG 및 항-인간 C1q 둘 모두를 동시에 적용함으로써 측정되었을 때, (도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이) IgG 또는 C1q-IgG 중 어느 하나가 측정될 때 반응성인 모든 식품 추출물들이 고도로 반응성임을 도시하고 있다. 다른 151개의 식품들에 대하여, 광학 밀도는 0.5 미만 또는 네가티브였다.
이러한 발견들은 단지 IgG 항체 결합이 이러한 개체의 혈청에 대해 특징된 경우에, 단지 17개의 식품 추출물들에 대한 반응성이 검출될 것임을 입증한다. 유사하게, 단지 천연 면역글로불린-C1q 복합체가 측정되는 경우에, 환자의 C1q 프로파일은 IgG 단독 측정에 의해 검출되지 않은 12개의 식품 추출물들에 대한 반응을 나타낸다. 그러나, IgG 및 C1q-IgG 둘 모두가 동시에 측정될 때, 모두 29개의 식품 추출물들에 대한 반응성을 나타내는 프로파일이 발생되는데(도 4에 도시됨), 이는 17개가 IgG에 의해 검출되고(도 2에 도시됨) 추가적인 12개가 C1q-IgG 평가에 의해 검출되는 것(도 3에 도시됨) 둘 모두를 조합한 것이다.
도 5, 도 6 및 도 7에는 상이한 개체와 유사한 연구들의 결과들을 도시한 것이다(즉, 180개의 식푸 추출물들에 대한 IgG, 천연 면역글로불린-C1q 복합체, 및 IgG + 천연 면역글로불린-C1q 항체 프로파일들). IgG 측정에 대하여, 180개의 식품 추출물들 중 단지 10개가 반응성을 나타내고(도 5), 천연 면역글로불린-C1q 복합체가 측정될 때, 14개의 식품들이 반응성을 나타낸다는 것(이들 중 11개는 천연 면역글로불린-프로파일에 대해 독특하였다. 도 6 참조)에 주목한다. IgG 및 천연 면역글로불린-C1q 둘 모두가 특징분석되었을 때, 조합된 프로파일은 21개의 식품 추출물들에 대한 반응성이 상승됨을 나타낸다(도 7에 도시된 바와 같음). 이러한 조합된 프로파일은 IgG에 의해 검출된 10개의 식품 항원들(도 5에 도시됨) 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체에 대해 검출된 추가적인 11개(도 6에 도시됨)의 조합을 나타낸다.
이는, 식품 면역 반응성의 최적의 검출을 위해, 시험된 각 식품으로부터 유래된 상이한 항원 제조물들의 조합으로 코팅된 시험 표면들을 사용하여, IgG 플러스(plus) 천연 면역글로불린-C1q 복합체 프로파일의 조합이 발생될 것이라는 것을 나타낸다.
도 8, 도 9, 도 10, 및 도 11은 상이한 세트의 식품들로부터 유래된 항원들로 코팅된 혈청-처리된 시험 표면들에 대한 항-IgG 플러스 항-C1q 항체 결합의 연구들의 표 결과를 각각 도시한 것이다. 시험 표면들은 주로 수용성 성분들을 함유한 상업적 식품 항원 제조물들, 상기에 기술된 바와 같이 추출된 비-상업적 수용성 단백질들, 상기에 기술된 바와 같이 추출된 비-상업적 알코올-가용성 단백질들, 상기에 기술된 바와 같이 추출된 비-상업적 알칼리-가용성 단백질들, 상기에 기술된 바와 같이 추출된 비-상업적 당지질들, 상기에 기술된 바와 같이 추출된 비-상업적 다당류들, 및 상기에 기술된 바와 같이 추출된 비-상업적 당단백질들을 포함하는, 상이한 항원 제조물들로 코팅되었다. 결과는, 개별적인 항원 제조물들로 코팅된 시험 표면들, 및 모둔 6개의 비-상업적 항원 제조물들의 조합으로 코팅된 시험 표면들에 대해 나타낸 것이다. 또한, 열처리된/조리 식품들로부터의 비-상업적 항원 제조물들의 조합으로 처리된 표면들로부터의 결과를 나타내었다. 0.5 보다 큰 광학 밀도를 나타낸 결과들은 이러한 데이타 세트에 대해 포지티브인 것으로 여겨졌다.
상업적 식품 항원 제조물들 및 수용성 식품 성분들에 대한 항체 검출 사이에 양호한 상관관계가 존재하지만, 이러한 측정들이 알코올-가용성, 알칼리-가용성, 당지질, 다당류 및 당단백질 성분들로 얻어진 것들과 비교할 때 면역 반응성에 있어서의 유의미한 차이들이 발견되었다. 유사한 차이들은 이러한 식품 항원 제조물들로 연속적으로 코팅된 시험 표면들과 비교하여 나타났다.
예를 들어, IgG 및 천연 IgG-Cq 복합체 결합이 상업적 바나나 추출물에 대해 특징분석되었을 때(도 8 참조), 결과는 0.58, 또는 아주 약간의 포지티브의 광학 밀도(OD)이다. 상기와 같이 제조된 수용성 추출물을 사용하여, OD는 0.65가 되었는데, 이는 약간 포지티브(또는 "+")이다. 그러나, 바나나 다당류들에 대해 특징분석되었을 때, O.D.는 0.98 또는 (++)로 상승하였으며, 6개 추출물들 모두의 혼합물의 경우에, OD는 1.73(++++)으로 상승하였다. 유사하게, 바나나 항원들의 열-변성된 혼합물을 사용하여, 얻어진 OD는 1.48(+++)이었다. 이러한 발견들은, 단지 상업적 항원들이 검정에서 사용된 경우에, 바나나에 대한 강한 면역 반응성이 검출되지 않을 것임을 나타낸다.
유사한 패턴은 옥수수에서 나타났다(도 8 참조). IgG 플러스 천연 면역글로불린-C1q 복합체가 측정되었을 때, 결과는 상업적 옥수수 추출물에 대하여 0.48 또는 (±), 수용성 추출물에 대하여 0.56 또는 (+), 또는 알코올-가용성 추출물에 대하여 1.4 또는 (+++), 알칼리-가용성 추출물에 대하여 0.93 또는 (++), 당지질 제조물에 대하여 0.72 또는 (+), 및 다당류 제조물에 대하여 0.86 또는 (++)의 O.D.이었다. 이러한 6개의 추출물들로 순차적으로 코팅된 시험 표면에 대해 측정하였을 때, O.D.는 2.84 또는 (+++++)이었는데, 이는 높은 정도의 면역 반응성을 나타내는 것이다.
버섯(도 9 참조)은 다른 양호한 예로서, 이의 면역 반응성은 상업적 추출물에 대하여 0.45 또는 (±)에서 , 수용성 추출물에 대하여 3.11(+++++)로, 심지어 모든 열-변성된 항원 제조물들로 순차적으로 처리된 시험 표면을 이용하여 3.52(++++++)로 사승하였다. 마찬가지로, 완두콩(도 9), 감자(도 9), 쌀(도 10), 참깨(도 10), 시금치(도 10), 토마토(도 10), 밀(도 10), 및 난황(도 10)에 대한 O.D.가 시험할 만하다. 난황에 대하여, 수용성 추출물 성분들에서는 실제적으로 IgG 또는 천연 면역글로불린-C1q 복합체가 거의 검출되지 않았으나(-), O.D.는 알코올-가용성 성분들에 대하여 0.36으로 그리고, 모든 항원 제조물로 순차적으로 코팅된 시험 표면이 사용되었을 때 3.31(+++++)로 상승하였다. 수용성 단백질들을 갖는 계란 흰자(도 10)에 대하여, (++++)의 유사한 반응성이 관찰되었다. 유사한 결과들은 또한, 새우(도 11), 아몬드(도 11), 브라질 너트(도 11), 땅콩(도 11), 및 밀에 대해 검출되었다.
새우 및 아몬드의 경우에, 모든 항원 제조물들로 순차적으로 코팅된 시험 표면들을 사용하여 측정할 때, IgG 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체의 결합이 유의미하게 변경되었다는 것에 주목할 만하다. 또한, 추출물 혼합물이 새우에 대해 사용되었을 때 열 변성이 2.76 (+++++)에서 1.2 (++)로의 O.D.의 감소를 야기시켰지만, 혼합물의 열 변성이 아몬드의 경우 0.5에서 1.6으로, 그리고 브라질 너트의 경우 1.36에서 2.49로 향상된 면역 반응성을 야기시켰다는 것이 주지되어야 한다. 최종 예로서, 땅콩에 대한 IgG 플러스 천연 면역글로불린-C1q 복합체의 O.D.가 상업적 추출물의 경우 1.51에서 모든 추출물들로 순차적으로 코팅된 시험 표면들이 사용되었을 때 2.18로 상승하였고, 혼합물이 열-변성되었을 때 3.98로 추가로 상승하였다.
이는, IgG 및/또는 C1q 함유 면역 복합체들의 보다 정확한 특징분석을 위하여, 이의 미가공 형태의, 및 적용 가능할 수 있을 때 열변성되거나 요리된 형태의 식품들로부터 제조된 수용성 성분들, 알코올-가용성 성분들, 알칼리-가용성 성분들, 당지질들, 다당류들, 당단백질들이 가장 완전한 결합 프로파일을 형성시키기 위해 사용되어야 한다는 것을 나타낸다.
샘플들로부터의 IgG에 대한 결과가 상기에 언급되어 있지만, 유사하게 개선된 결과들이 본 발명의 개념의 시험 표면들에 대한 IgA 결합에 대한 시험으로부터 예상되는 것으로 인식되어야 한다. 또한, 본 발명의 개념의 시험 표면들에 대한 IgE, IgM, 및/또는 IgD의 특징분석이 각 식품으로부터의 단일 항원 추출 또는 제조 방법을 이용하여 제조된 시험 표면들로부터 얻어진 것 보다 더욱 완전한, 민감한, 및/또는 정확한, 식품 항원들에 대한 항체 반응의 평가를 제공하기 위해 예상된다는 것이 인식되어야 한다. 본 발명의 개념의 일부 구체예에서, 상이한 항체 종들은 동일한 시험 표면을 사용하여 조합하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 동일한 시험 표면에 대한 IgG 및 IgA 결합 둘 모두는 동시에 결정될 수 있다. 유사하게, 동일한 시험 표면에 대한 IgG, IgA, 및 IgE는 동시에 결정될 수 있다. 본 발명의 개념의 다른 구체예에서, 동일한 시험 표면에 대한 IgG 및 IgE 결합은 동시에 결정될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 동일한 시험 표면에 대한 IgA 및 IgE 결합은 동시에 결정될 수 있다.
또한, C1q가 상기에서 상세하게 인용되었지만, 유사하게 개선된 결과들이 IgG, IgA, IgM, IgE, 및/또는 IgD 중 하나 이상과 함께 다른 보체 종들에 대한 시험으로부터 예상된다는 것이 인식되어야 한다. 적합한 보체 성분들은 C1r 및/또는 C1s를 포함하는, 전통적인 보체 경로에서의 참가자를 포함한다. 일부 구체예에서, C1q, C1r, 및/또는 C1s는 동일한 시험 표면을 사용하여 IgG, IgA, IgE, IgM, 및/또는 IgD 중 하나 이상과 함께(즉, 동시에) 특징분석된다. 유사하게, C4, C2, C4a, C4b, C2a, C2b C3, C3a, 및 C3b 중 하나 이상은 동일한 시험 표면을 사용하여 C1q, C1r, C1s, IgG, IgA, IgE, IgM, 및/또는 IgD 중 하나 이상과 함께 특징분석될 수 있다.
참조문헌:
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이미 기술된 것 이외의 많은 변경들이 본원의 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않으면서 가능한 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이에 따라, 본 발명의 주제는 첨부된 청구범위의 사상을 제외하고 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 청구범위 둘 모두를 해석함에 있어서, 모든 용어들은 문맥과 일치하는 가장 넓게 가능한 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 비-배타적인 방식으로 구성요소들, 성분들, 또는 단계들을 지칭하는 것으로서 해석되어야 하며, 이는 언급된 구성요소들, 성분들, 또는 단계들이 명확하게 언급되지 않은 다른 구성요소들, 성분들, 또는 단계들과 함께 존재하거나 사용되거나, 조합될 수 있음을 지시하는 것이다. 명세서 및 청구범위가 A, B, C … 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 것들 중 적어도 하나를 지칭하는 경우에, 텍스트는 A 플러스 N, 또는 B 플러스 N, 등이 아닌 군으로부터의 단지 하나의 구성요소를 필요로 하는 것으로서 해석되어야 한다.

Claims (22)

  1. 항체 및 보체 프로파일(complement profile)을 특징분석하는(characterizing) 방법으로서,
    하나 이상의 면역글로불린들 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체를 포함하는 샘플을 획득하고;
    식품 항원 코팅(food antigen coating)을 포함하는 시험 표면을 제공하되, 식품 항원 코팅이 시험 표면에 순차적인 방식으로 적용된, 제1 식품 항원, 제2 식품 항원, 및 제3 식품 항원을 포함하고;
    시험 표면을 샘플의 적어도 일부와 접촉시키고;
    시험 표면을 항체 혼합물과 접촉시키되, 항체 혼합물이 C1q에 대한 제1 항체, 및 샘플 종들의 하나 이상의 면역글로불린들 중 적어도 하나에 대한 제2 항체를 포함하고;
    시험 표면에 대한 샘플로부터의 면역글로불린들 중 적어도 하나 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체 둘 모두의 결합의 특징적인 신호를 획득하되, 백그라운드 컷오프(background cutoff)를 초과하는 신호 강도가 포지티브 결과(positive result)로서 특징되는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 면역글로불린들 중 적어도 하나가 IgG인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 면역글로불린들 중 적어도 하나가 IgA인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제1 식품 항원, 제2 식품 항원, 및 제3 식품 항원이 상이한 추출 방법들에 의해 동일한 식품으로부터 획득되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체에 대한 항체를 포함하는 제3 항체와 시험 표면을 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 제3 항체가 검출 가능한 태그(detectable tag)를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제2 항체에 대한 항체를 포함하는 제4 항체와 시험 표면을 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 제4 항체가 검출 가능한 태그를 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체 및 제2 항체 둘 모두에 대한 항체를 포함하는 제5 항체와 시험 표면을 접촉시키는 것을 추가로 포함하며, 제5 항체가 검출 가능한 태그를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체가 제1 검출 가능한 태그를 추가로 포함하며, 제2 항체가 제2 검출 가능한 태그를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제1 검출 가능한 태그 및 제2 검출 가능한 태그가 구별 가능하지 않은 방법.
  10. 항체 및 보체 프로파일을 특징분석하는 방법으로서,
    하나 이상의 면역글로불린들 및 하나 이상의 천연 면역글로불린-C1q 복합체들을 포함하는 샘플을 획득하고;
    제1 식품 항원 코팅을 포함하는 제1 시험 표면을 제공하되, 제1 식품 항원 코팅이 시험 표면에 순차적인 방식으로 적용된, 제1 식품 항원, 제2 식품 항원, 및 제3 식품 항원을 포함하고;
    제2 식품 항원 코팅을 포함하는 제2 시험 표면을 제공하되, 제2 식품 항원 코팅이 제2 시험 표면에 순차적인 방식으로 적용된, 제4 식품 항원, 제5 식품 항원, 및 제6 식품 항원을 포함하고;
    제1 시험 표면 및 제2 시험 표면을 샘플의 제1 부분 및 제2 부분과 각각 접촉시키고;
    제1 시험 표면 및 제2 시험 표면을 항체 혼합물과 접촉시키되, 항체 혼합물이 C1q에 대한 제1 항체, 및 샘플 종들의 면역글로불린들 중 적어도 하나에 대한 제2 항체를 포함하고;
    제1 시험 표면으로부터, 제1 시험 표면에 대한 샘플로부터의 면역글로불린들 중 적어도 하나 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체들 중 적어도 하나의 둘 모두의 결합의 특징적인 제1 신호를 획득하되, 백그라운드 컷오프를 초과하는 제1 신호 강도가 제1 시험 표면에 대한 포지티브 결과로서 특징되고;
    제2 시험 표면으로부터, 제2 시험 표면에 대한 샘플로부터의 면역글로불린들 중 적어도 하나 및 천연 면역글로불린-C1q 복합체들 중 적어도 하나의 둘 모두의 결합의 특징적인 제2 신호를 획득하되, 백그라운드 컷오프를 초과하는 제2 신호 강도가 제2 시험 표면에 대한 포지티브 결과로서 특징되는 것을 포함하는 방법.
  11. 항체 및 C1q 프로파일을 특징분석하기 위한 시험 표면으로서,
    공통 시험 표면(common test surface);
    공통 시험 표면 상의, 제1 공정에 의해 식품으로부터 추출된 제1 식품 항원을 포함하는 제1 코팅;
    공통 시험 표면 상의, 제2 공정에 의해 식품으로부터 추출된 제2 식품 항원을 포함하는 제2 코팅; 및
    공통 시험 표면 상의, 제3 공정에 의해 식품으로부터 추출된 제3 식품 항원을 포함하는 제3 코팅을 포함하며,
    제1 코팅의 적용 이후에 제2 코팅이 공통 시험 표면에 적용되고, 제2 코팅의 적용 이후에 제3 코팅이 공통 시험 표면에 적용된, 시험 표면.
  12. 제11항에 있어서, 제1 식품 항원이 수용성 단백질, 알코올 가용성 단백질, 알칼리 가용성 단백질, 당지질, 다당류, 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 시험 표면.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제2 식품 항원이 수용성 단백질, 알코올 가용성 단백질, 알칼리 가용성 단백질, 당지질, 다당류, 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 시험 표면.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제3 식품 항원이 수용성 단백질, 알코올 가용성 단백질, 알칼리 가용성 단백질, 당지질, 다당류, 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 시험 표면.
  15. 식품 감수성(food sensitivity)을 특징분석하기 위한 시험 표면을 제작하는 방법으로서,
    공통 시험 표면을 제공하고;
    제1 식품 항원 제조물(first food antigen preparation)의 제1 식품 항원들 중 적어도 일부가 공통 시험 표면에 복합체화하기에 충분한 시간 동안, 제1 식품 항원 제조물을 공통 시험 표면과 접촉시키고;
    제1 식품 항원 제조물과의 접촉에 후속하여, 제2 식품 항원 제조물의 제2 식품 항원들 중 적어도 일부가 공통 시험 표면에 복합체화하기에 충분한 시간 동안, 제2 식품 항원 제조물을 공통 시험 표면과 접촉시키고;
    제2 식품 항원 제조물과 접촉에 후속하여, 제3 식품 항원 제조물의 제3 식품 항원들 중 적어도 일부가 공통 시험 표면에 복합체화하기에 충분한 시간 동안, 제3 식품 항원 제조물을 공통 시험 표면과 접촉시키는 것을 포함하며,
    제1 식품 항원 제조물, 제2 식품 항원 제조물, 및 제3 식품 항원 제조물이 동일한 식품으로부터 제조되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 공통 시험 표면을 제2 식품 항원 제조물과 접촉시키기 전에, 제1 식품 항원 제조물로부터 복합체화되지 않은 물질(uncomplexed material)을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 제거 단계가 공통 시험 표면을, 계면활성제를 함유한 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 공통 시험 표면을 제3 식품 항원 제조물과 접촉시키기 전에, 제2 항원 제조물로부터 복합체화되지 않은 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제거 단계가 공통 시험 표면을, 계면활성제를 함유한 용액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 공통 시험 표면을 차단 용액(blocking solution)과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제11항의 복수의 공통 시험 표면들을 포함하는 시험판(test plate)을 포함하는, 항체 및 C1q 결합 프로파일들을 특징분석하기 위한 시험 키트.
  22. 제21항에 있어서, 복수의 공통 시험 표면들이 제1 식품으로부터의 항원들을 포함하는 제1 시험 표면, 및 제2 식품으로부터의 항원들을 포함하는 제2 시험 표면을 포함하는 시험 키트.
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