JP2003129083A - 糖脂質の分離方法 - Google Patents
糖脂質の分離方法Info
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
- C07H13/06—Fatty acids
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡便かつ低コストに多数のサンプルを処理で
き、しかも多種類の糖脂質を回収できるとともにその回
収率が高い、糖脂質（特にガングリオシド）の分離方法
を提供する。 【解決手段】 （ａ）生体サンプルを非極性溶媒と極性
溶媒との混合液で抽出した抽出物に加水分解処理を施し
て得られる試料溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い
溶液に半透膜を介して接触させた後、（ｂ）前記接触
を、前記試料溶液が二層または三層に分かれるまで継続
し、中間層および／または下層を分離する。
き、しかも多種類の糖脂質を回収できるとともにその回
収率が高い、糖脂質（特にガングリオシド）の分離方法
を提供する。 【解決手段】 （ａ）生体サンプルを非極性溶媒と極性
溶媒との混合液で抽出した抽出物に加水分解処理を施し
て得られる試料溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い
溶液に半透膜を介して接触させた後、（ｂ）前記接触
を、前記試料溶液が二層または三層に分かれるまで継続
し、中間層および／または下層を分離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料溶液からの糖
脂質の分離方法に関する。
脂質の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の分化やガン化などに伴って細胞膜
や細胞内に存在している糖脂質の糖鎖構造に変化が見ら
れるという事実は、糖脂質が細胞の分化や増殖などに重
要な役割を果たしていることを示唆しており、糖脂質の
生物学的機能について盛んに研究が行なわれている。糖
脂質の生物学的機能を解明するためには、精製された糖
脂質を取得することが必要となるが、糖鎖を化学合成す
るのは容易なことではない。したがって、生体サンプル
から糖脂質を分離することが必要となる。
や細胞内に存在している糖脂質の糖鎖構造に変化が見ら
れるという事実は、糖脂質が細胞の分化や増殖などに重
要な役割を果たしていることを示唆しており、糖脂質の
生物学的機能について盛んに研究が行なわれている。糖
脂質の生物学的機能を解明するためには、精製された糖
脂質を取得することが必要となるが、糖鎖を化学合成す
るのは容易なことではない。したがって、生体サンプル
から糖脂質を分離することが必要となる。
【０００３】また、糖脂質の分解酵素の遺伝性欠損は、
糖脂質蓄積病の原因となる。例えば、糖脂質の一つであ
るガングリオシドの糖側鎖分解に関与するリソソーム酵
素の遺伝性によってガングリオシドが脳その他の組織に
蓄積する、ＧＭ２ガングリオシド蓄積症（ガングリオシ
ドーシス）などが知られている。ヒトなどの哺乳動物に
おいては、これまでにＧＡ２およびＧＭ２蓄積症が確認
されており、ＧＭ２は欠損酵素により、サンドホフ病、
テイ・サックス病、ＡＢ型ＧＭ２−ガングリオシドーシ
スに分類される。なお、ＧＭ１、ＧＭ２などはSvennerh
olmの命名法に基づく呼び名であり、シアル酸の個数が
１，２，３，４，５個の分子をそれぞれＧＭ，ＧＤ，Ｇ
Ｔ，ＧＱ，ＧＰと呼び、基本糖鎖がＧｇ４Ｃｅｒ，Ｇｇ
３Ｃｅｒ，ＬａｃＣｅｒ，ＧａｌＣｅｒであるものには
１，２，３，４を付ける。このような糖脂質蓄積病の診
断、病態解明などにも、生体サンプルから糖脂質を分離
することが必要となる。
糖脂質蓄積病の原因となる。例えば、糖脂質の一つであ
るガングリオシドの糖側鎖分解に関与するリソソーム酵
素の遺伝性によってガングリオシドが脳その他の組織に
蓄積する、ＧＭ２ガングリオシド蓄積症（ガングリオシ
ドーシス）などが知られている。ヒトなどの哺乳動物に
おいては、これまでにＧＡ２およびＧＭ２蓄積症が確認
されており、ＧＭ２は欠損酵素により、サンドホフ病、
テイ・サックス病、ＡＢ型ＧＭ２−ガングリオシドーシ
スに分類される。なお、ＧＭ１、ＧＭ２などはSvennerh
olmの命名法に基づく呼び名であり、シアル酸の個数が
１，２，３，４，５個の分子をそれぞれＧＭ，ＧＤ，Ｇ
Ｔ，ＧＱ，ＧＰと呼び、基本糖鎖がＧｇ４Ｃｅｒ，Ｇｇ
３Ｃｅｒ，ＬａｃＣｅｒ，ＧａｌＣｅｒであるものには
１，２，３，４を付ける。このような糖脂質蓄積病の診
断、病態解明などにも、生体サンプルから糖脂質を分離
することが必要となる。
【０００４】生体サンプルからの糖脂質の分離方法とし
ては、例えば、組織や細胞などから総脂質を抽出した
後、総脂質から単純脂肪およびリン脂質を除いて糖脂質
を分離する方法が一般的に用いられる。そして、総脂質
から単純脂肪およびリン脂質を除いて糖脂質を分離する
ために、二相分配法、クロマトグラフィー法（例えば、
DEAE-Sephadexなどの陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、これとシリカゲルクロマトグラフィーとの組み合わ
せ）、弱アルカリ分解法などが用いられる。
ては、例えば、組織や細胞などから総脂質を抽出した
後、総脂質から単純脂肪およびリン脂質を除いて糖脂質
を分離する方法が一般的に用いられる。そして、総脂質
から単純脂肪およびリン脂質を除いて糖脂質を分離する
ために、二相分配法、クロマトグラフィー法（例えば、
DEAE-Sephadexなどの陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、これとシリカゲルクロマトグラフィーとの組み合わ
せ）、弱アルカリ分解法などが用いられる。
【０００５】二相分配法としては、フォルチ分配法や、
その変法であるブライ・ダイアー抽出法がよく用いられ
る。フォルチ分配法では、クロロホルム−メタノール
（２：１（ｖ／ｖ））による脂質抽出液に１／５倍容の
水または０．７５〜０．９％ＫＣｌ水溶液を加えて攪拌
すると、水−メタノール上層とクロロホルム下層とに分
離する。上層には水溶性のガングリオシドが抽出され、
下層にはそれ以外の総脂質が抽出される。しかしなが
ら、糖鎖の短いガングリオシド（ＧＭ４やＧＭ３など）
は下層に分配される傾向にあるため、現在は二相分配法
よりもクロマトグラフィー法が繁用されている。また、
弱アルカリ分解法によってリン脂質を除いた場合には、
透析などによる脱塩操作が必要となる。
その変法であるブライ・ダイアー抽出法がよく用いられ
る。フォルチ分配法では、クロロホルム−メタノール
（２：１（ｖ／ｖ））による脂質抽出液に１／５倍容の
水または０．７５〜０．９％ＫＣｌ水溶液を加えて攪拌
すると、水−メタノール上層とクロロホルム下層とに分
離する。上層には水溶性のガングリオシドが抽出され、
下層にはそれ以外の総脂質が抽出される。しかしなが
ら、糖鎖の短いガングリオシド（ＧＭ４やＧＭ３など）
は下層に分配される傾向にあるため、現在は二相分配法
よりもクロマトグラフィー法が繁用されている。また、
弱アルカリ分解法によってリン脂質を除いた場合には、
透析などによる脱塩操作が必要となる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上述したように、総脂
質から単純脂肪およびリン脂質を除いて糖脂質を分離す
る方法として種々の方法が開発されているが、それぞれ
の方法は、糖脂質の回収率や精製度（純度）、要する手
間やコストの面から一長一短である。例えば、クロマト
グラフィー法ではサンプルの前処理に手間がかかるとと
もに、コストがかかるため多数のサンプル処理には適し
ない。また、弱アルカリ分解法では、透析による脱塩に
よって、糖脂質の回収率が低下すると考えられている。
質から単純脂肪およびリン脂質を除いて糖脂質を分離す
る方法として種々の方法が開発されているが、それぞれ
の方法は、糖脂質の回収率や精製度（純度）、要する手
間やコストの面から一長一短である。例えば、クロマト
グラフィー法ではサンプルの前処理に手間がかかるとと
もに、コストがかかるため多数のサンプル処理には適し
ない。また、弱アルカリ分解法では、透析による脱塩に
よって、糖脂質の回収率が低下すると考えられている。
【０００７】そこで、本発明は、簡便かつ低コストに多
数のサンプルを処理でき、しかも多種類の糖脂質を回収
できるとともにその回収率が高い、糖脂質（特にガング
リオシド）の分離方法を提供することを目的とする。
数のサンプルを処理でき、しかも多種類の糖脂質を回収
できるとともにその回収率が高い、糖脂質（特にガング
リオシド）の分離方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、下記（１）〜（６）の糖脂質の分離方法
およびガングリオシドの分離方法を提供する。
に、本発明は、下記（１）〜（６）の糖脂質の分離方法
およびガングリオシドの分離方法を提供する。
【０００９】（１）以下の工程：
（ａ）生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒との混合液
で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得られる試料
溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に半透膜を
介して接触させる工程 （ｂ）前記接触を、前記試料溶液が二層または三層に分
かれるまで継続し、中間層および／または下層を分離す
る工程を含むことを特徴とする糖脂質の分離方法。
で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得られる試料
溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に半透膜を
介して接触させる工程 （ｂ）前記接触を、前記試料溶液が二層または三層に分
かれるまで継続し、中間層および／または下層を分離す
る工程を含むことを特徴とする糖脂質の分離方法。
【００１０】（２）前記糖脂質がガングリオシドであっ
て、前記工程（ｂ）において、前記接触を前記試料溶液
が三層に分かれるまで継続し、中間層を分離することを
特徴とする前記（１）記載の分離方法。
て、前記工程（ｂ）において、前記接触を前記試料溶液
が三層に分かれるまで継続し、中間層を分離することを
特徴とする前記（１）記載の分離方法。
【００１１】（３）生体サンプルが、動物若しくは植物
の細胞若しくは組織または微生物の菌体であることを特
徴とする前記（１）または（２）記載の分離方法。
の細胞若しくは組織または微生物の菌体であることを特
徴とする前記（１）または（２）記載の分離方法。
【００１２】（４）前記非極性溶媒がクロロホルム、ピ
リジンまたはこれらの混合物であり、前記極性溶媒が
水、メタノール、酢酸ナトリウムまたはこれらの２種以
上の混合物であることを特徴とする前記（１）〜（３）
のいずれかに記載の分離方法。
リジンまたはこれらの混合物であり、前記極性溶媒が
水、メタノール、酢酸ナトリウムまたはこれらの２種以
上の混合物であることを特徴とする前記（１）〜（３）
のいずれかに記載の分離方法。
【００１３】（５）前記非極性溶媒と極性溶媒との混合
液が、水とメタノールとクロロホルムとピリジンとの混
合物であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいず
れかに記載の分離方法。
液が、水とメタノールとクロロホルムとピリジンとの混
合物であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいず
れかに記載の分離方法。
【００１４】（６）前記試料溶液が、前記抽出物に加水
分解処理を施した後、中和処理を施して得られるもので
あることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに
記載の分離方法。
分解処理を施した後、中和処理を施して得られるもので
あることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに
記載の分離方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の糖脂質の分離方法は、以下の工程： （ａ）生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒との混合液
で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得られる試料
溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に半透膜を
介して接触させる工程 （ｂ）前記接触を、前記試料溶液が二層または三層に分
かれるまで継続し、中間層および／または下層を分離す
る工程を含むことを特徴とする。
する。本発明の糖脂質の分離方法は、以下の工程： （ａ）生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒との混合液
で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得られる試料
溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に半透膜を
介して接触させる工程 （ｂ）前記接触を、前記試料溶液が二層または三層に分
かれるまで継続し、中間層および／または下層を分離す
る工程を含むことを特徴とする。
【００１６】「糖脂質」は、分子内に水溶性糖鎖と脂溶
性基の両者を含む物質の総称であり、脂溶性基によって
スフィンゴ糖脂質とグリセロ糖脂質とに大別されるが、
この他にステロイド、ヒドロキシ脂肪酸等の脂溶性基を
もつグリコシド（例えば、ステリルグリコシド，ステロ
イド配糖体，ラムノリピド等）も広い意味での糖脂質に
含まれる。また、シアル酸、ウロン酸、硫酸、リン酸等
をもつ糖脂質（例えば、ガングリオシド、スルファチ
ド、スルホリピド等）は酸性糖脂質と呼ばれ、中性糖脂
質と区別される。本発明において分離対象となる糖脂質
は、これらのうち、何れの種類の糖脂質であってもよい
が、本発明において分離対象となる糖脂質はガングリオ
シドであることが好ましい。本発明の分離方法は、分離
対象をガングリオシドとするとき、特に優れた効果を発
揮する。「ガングリオシド」は、シアル酸を含むスフィ
ンゴ糖脂質の総称であるが、本発明においては、ガング
リオシドからシアル酸残基が外れたもの、すなわちアシ
アロガングリオシドも「ガングリオシド」に含まれるも
のとする。
性基の両者を含む物質の総称であり、脂溶性基によって
スフィンゴ糖脂質とグリセロ糖脂質とに大別されるが、
この他にステロイド、ヒドロキシ脂肪酸等の脂溶性基を
もつグリコシド（例えば、ステリルグリコシド，ステロ
イド配糖体，ラムノリピド等）も広い意味での糖脂質に
含まれる。また、シアル酸、ウロン酸、硫酸、リン酸等
をもつ糖脂質（例えば、ガングリオシド、スルファチ
ド、スルホリピド等）は酸性糖脂質と呼ばれ、中性糖脂
質と区別される。本発明において分離対象となる糖脂質
は、これらのうち、何れの種類の糖脂質であってもよい
が、本発明において分離対象となる糖脂質はガングリオ
シドであることが好ましい。本発明の分離方法は、分離
対象をガングリオシドとするとき、特に優れた効果を発
揮する。「ガングリオシド」は、シアル酸を含むスフィ
ンゴ糖脂質の総称であるが、本発明においては、ガング
リオシドからシアル酸残基が外れたもの、すなわちアシ
アロガングリオシドも「ガングリオシド」に含まれるも
のとする。
【００１７】以下、各工程について説明する。工程（ａ）
工程（ａ）は、生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒と
の混合液で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得ら
れる試料溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に
半透膜を介して接触させる工程である。
の混合液で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得ら
れる試料溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に
半透膜を介して接触させる工程である。
【００１８】「試料溶液」は、生体サンプルを非極性溶
媒と極性溶媒との混合液で抽出して得られる抽出物に、
加水分解処理を施して得られるものである。
媒と極性溶媒との混合液で抽出して得られる抽出物に、
加水分解処理を施して得られるものである。
【００１９】「生体サンプル」は、動物、植物、微生物
などの生体に由来するサンプルであり、分離対象である
糖脂質が含有される限り、その種類は特に限定されるも
のではない。生体サンプルとしては、例えば、動物若し
くは植物の細胞若しくは組織または微生物の菌体が挙げ
られる。動物、植物または微生物の種類や、細胞または
組織の種類は特に限定されるものではない。例えば、ス
フィンゴ糖脂質は動物界や菌界に分布しており、それら
の細胞膜の構成成分となっているので、動物または微生
物由来の生体サンプルに含有される。また、グリセロ糖
脂質はグラム陽性細菌や高等植物葉緑体に存在している
ので、植物または微生物由来の生体サンプルに含有され
る。
などの生体に由来するサンプルであり、分離対象である
糖脂質が含有される限り、その種類は特に限定されるも
のではない。生体サンプルとしては、例えば、動物若し
くは植物の細胞若しくは組織または微生物の菌体が挙げ
られる。動物、植物または微生物の種類や、細胞または
組織の種類は特に限定されるものではない。例えば、ス
フィンゴ糖脂質は動物界や菌界に分布しており、それら
の細胞膜の構成成分となっているので、動物または微生
物由来の生体サンプルに含有される。また、グリセロ糖
脂質はグラム陽性細菌や高等植物葉緑体に存在している
ので、植物または微生物由来の生体サンプルに含有され
る。
【００２０】生体サンプルには、糖脂質の他、単純脂質
やリン脂質（例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴリ
ン脂質等）が含まれており、生体サンプルを非極性溶媒
と極性溶媒との混合液で抽出すると、これらの脂質が混
合物として抽出される。生体サンプルからの脂質の抽出
条件は、非極性溶媒と極性溶媒との混合液を用いて分離
対象となる糖脂質を抽出し得る限り特に限定されるもの
ではなく、常法に基づいて行なえばよい。通常は、生体
サンプルに含有される総脂質（単純脂質と複合脂質）を
出来る限り多く抽出できるように条件設定を行なう。抽
出の際には、生体サンプルを予めホモジナイズしておく
とよい。
やリン脂質（例えば、グリセロリン脂質、スフィンゴリ
ン脂質等）が含まれており、生体サンプルを非極性溶媒
と極性溶媒との混合液で抽出すると、これらの脂質が混
合物として抽出される。生体サンプルからの脂質の抽出
条件は、非極性溶媒と極性溶媒との混合液を用いて分離
対象となる糖脂質を抽出し得る限り特に限定されるもの
ではなく、常法に基づいて行なえばよい。通常は、生体
サンプルに含有される総脂質（単純脂質と複合脂質）を
出来る限り多く抽出できるように条件設定を行なう。抽
出の際には、生体サンプルを予めホモジナイズしておく
とよい。
【００２１】生体サンプルからの脂質の抽出には、非極
性溶媒と極性溶媒との混合液が用いられるが、それら抽
出溶媒の種類、混合比等は、生体サンプルにおける脂質
の存在状態を考慮して決定される。すなわち、脂質は、
一般的には、ファンデルワールス力による結合、疎水結
合、水素結合、静電結合、共有結合などの結合を介して
生体内高分子（例えばタンパク質や他の脂質）と複合体
を形成しているので、これらの結合を切断し得るように
抽出溶媒の種類、混合比等が決定される。また、非極性
溶媒および極性溶媒の種類、混合比等は、その混合物を
放置したときに非極性溶媒相と極性溶媒相の二相に分離
するように選択される。
性溶媒と極性溶媒との混合液が用いられるが、それら抽
出溶媒の種類、混合比等は、生体サンプルにおける脂質
の存在状態を考慮して決定される。すなわち、脂質は、
一般的には、ファンデルワールス力による結合、疎水結
合、水素結合、静電結合、共有結合などの結合を介して
生体内高分子（例えばタンパク質や他の脂質）と複合体
を形成しているので、これらの結合を切断し得るように
抽出溶媒の種類、混合比等が決定される。また、非極性
溶媒および極性溶媒の種類、混合比等は、その混合物を
放置したときに非極性溶媒相と極性溶媒相の二相に分離
するように選択される。
【００２２】非極性溶媒としては、クロロホルム、ピリ
ジン等の非極性有機溶媒またはこれらの２種以上の混合
物を用いることができる。また、極性溶媒としては、
水、メタノール、酢酸ナトリウム等の極性有機溶媒また
はこれらの２種以上の混合物を用いることができる。
ジン等の非極性有機溶媒またはこれらの２種以上の混合
物を用いることができる。また、極性溶媒としては、
水、メタノール、酢酸ナトリウム等の極性有機溶媒また
はこれらの２種以上の混合物を用いることができる。
【００２３】これらのうち、非極性溶媒としてクロロホ
ルムおよびピリジンを選択し、極性溶媒として水および
メタノールを選択し、水とメタノールとクロロホルムと
ピリジンとの混合物を抽出溶媒として用いることが好ま
しい。
ルムおよびピリジンを選択し、極性溶媒として水および
メタノールを選択し、水とメタノールとクロロホルムと
ピリジンとの混合物を抽出溶媒として用いることが好ま
しい。
【００２４】非極性溶媒と極性溶媒との混合比は、通常
１：１〜１０：１（容量比）、好ましくは１：１〜２：
１（容量比）である。クロロホルムとメタノールと水と
ピリジンとの混合物を抽出溶媒として用いる場合、それ
らの混合比を例えば２：１：１：０．０３〜４：２：
１：０．０３とすることができる。
１：１〜１０：１（容量比）、好ましくは１：１〜２：
１（容量比）である。クロロホルムとメタノールと水と
ピリジンとの混合物を抽出溶媒として用いる場合、それ
らの混合比を例えば２：１：１：０．０３〜４：２：
１：０．０３とすることができる。
【００２５】生体サンプルからの脂質の抽出は、通常常
温で行なわれる。また、植物脂質の抽出の際には、ホス
ホリパーゼやリパーゼ等による脂質の分解を防止するた
めに、アルコールを含む抽出溶媒を用いることが好まし
い。
温で行なわれる。また、植物脂質の抽出の際には、ホス
ホリパーゼやリパーゼ等による脂質の分解を防止するた
めに、アルコールを含む抽出溶媒を用いることが好まし
い。
【００２６】「生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒と
の混合液で抽出して得られる抽出物」には、生体サンプ
ルを非極性溶媒と極性溶媒との混合液で抽出して得られ
た抽出液の他、これに所望の処理を加えた処理物も含ま
れる。抽出液に加える処理としては、例えば、ろ過、濃
縮、希釈、精製（例えばシリカゲルクロマトグラフィ
ー、イオンクロマトグラフィーなどによる精製）等が挙
げられ、これらの処理は、抽出液中に含有される脂質を
分解させない範囲内において行なわれる。また、これら
の処理は、加水分解処理を施した後に行なってもよい。
の混合液で抽出して得られる抽出物」には、生体サンプ
ルを非極性溶媒と極性溶媒との混合液で抽出して得られ
た抽出液の他、これに所望の処理を加えた処理物も含ま
れる。抽出液に加える処理としては、例えば、ろ過、濃
縮、希釈、精製（例えばシリカゲルクロマトグラフィ
ー、イオンクロマトグラフィーなどによる精製）等が挙
げられ、これらの処理は、抽出液中に含有される脂質を
分解させない範囲内において行なわれる。また、これら
の処理は、加水分解処理を施した後に行なってもよい。
【００２７】生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒との
混合液で抽出して得られる抽出物に対して行なう加水分
解処理は、抽出物に含有される脂質のエステル結合（例
えばリン脂質のエステル結合、生体内高分子と脂質との
複合体のエステル結合）を切断し得るように行なう。加
水分解処理は、アルカリまたは酸を用いて常法に従って
行なうことができる。加水分解処理は、弱アルカリを用
いて行なうことが好ましい。
混合液で抽出して得られる抽出物に対して行なう加水分
解処理は、抽出物に含有される脂質のエステル結合（例
えばリン脂質のエステル結合、生体内高分子と脂質との
複合体のエステル結合）を切断し得るように行なう。加
水分解処理は、アルカリまたは酸を用いて常法に従って
行なうことができる。加水分解処理は、弱アルカリを用
いて行なうことが好ましい。
【００２８】生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒との
混合液で抽出して得られる抽出物には、加水分解処理を
施した後に中和処理を施すことが好ましい。これによっ
て、糖脂質をより高い回収率および精製度（高純度）で
分離することが可能となる。中和処理は、アルカリで加
水分解したときは酸を用いて行なうことができ、酸で加
水分解したときはアルカリを用いて行なうことができ、
その際用いるアルカリおよび酸の種類は特に限定される
ものではない。
混合液で抽出して得られる抽出物には、加水分解処理を
施した後に中和処理を施すことが好ましい。これによっ
て、糖脂質をより高い回収率および精製度（高純度）で
分離することが可能となる。中和処理は、アルカリで加
水分解したときは酸を用いて行なうことができ、酸で加
水分解したときはアルカリを用いて行なうことができ、
その際用いるアルカリおよび酸の種類は特に限定される
ものではない。
【００２９】以上のようにして得られる試料溶液には、
分離対象となる糖脂質の他、単純脂質やリン脂質などが
含まれている。
分離対象となる糖脂質の他、単純脂質やリン脂質などが
含まれている。
【００３０】試料溶液に半透膜を介して接触させる溶液
は、試料溶液よりも浸透圧の低い溶液（以下「低張液」
という。）であり、その種類は特に限定されない。低張
液としては、例えば、水、緩衝液（例えばＴＥ）を用い
ることができる。
は、試料溶液よりも浸透圧の低い溶液（以下「低張液」
という。）であり、その種類は特に限定されない。低張
液としては、例えば、水、緩衝液（例えばＴＥ）を用い
ることができる。
【００３１】半透膜は、低分子は通すが高分子は通さな
い膜である。半透膜としては、透析に一般的に用いられ
る半透膜を用いることができ、その種類は特に限定され
ない。半透膜としては、例えば、セロファン膜、コロジ
オン膜、脱硝コロジオン膜、ゲルセロファン膜、パーチ
メント紙、ポリビニルアルコール膜、天然のぼうこう
膜、うきぶくろ膜、人工の硫酸紙、セルロース透析膜等
が挙げられ、これらのうち特にセルロース透析膜が好ま
しい。
い膜である。半透膜としては、透析に一般的に用いられ
る半透膜を用いることができ、その種類は特に限定され
ない。半透膜としては、例えば、セロファン膜、コロジ
オン膜、脱硝コロジオン膜、ゲルセロファン膜、パーチ
メント紙、ポリビニルアルコール膜、天然のぼうこう
膜、うきぶくろ膜、人工の硫酸紙、セルロース透析膜等
が挙げられ、これらのうち特にセルロース透析膜が好ま
しい。
【００３２】試料溶液が半透膜を介して低張液と接触す
る部分は、試料溶液の全体であってもよいし、一部であ
ってもよい。また、一部である場合には、試料溶液の何
れの部分であってもよい。試料溶液の何れかの部分が半
透膜を介して低張液と接触していれば、試料溶液は二層
または三層になるが、より多くの部分が半透膜を介して
低張液と接触しているほど、試料溶液が二層または三層
になるまでの時間を短縮できるので、出来るだけ多くの
部分を、半透膜を介して低張液と接触させることが好ま
しい。
る部分は、試料溶液の全体であってもよいし、一部であ
ってもよい。また、一部である場合には、試料溶液の何
れの部分であってもよい。試料溶液の何れかの部分が半
透膜を介して低張液と接触していれば、試料溶液は二層
または三層になるが、より多くの部分が半透膜を介して
低張液と接触しているほど、試料溶液が二層または三層
になるまでの時間を短縮できるので、出来るだけ多くの
部分を、半透膜を介して低張液と接触させることが好ま
しい。
【００３３】試料溶液を低張液に半透膜を介して接触さ
せる方法は、透析の際に一般的に用いられる方法を用い
ることができる。例えば、一端をくくった半透膜のチュ
ーブに試料溶液を入れ、他端をくくって閉じた後、低張
液に浸すという方法を用いることができる。また、液体
を収容できる容器を半透膜で仕切って２つの部屋を形成
し、それぞれの部屋に試料溶液と低張液とを加えるとい
う方法を用いることもできる。
せる方法は、透析の際に一般的に用いられる方法を用い
ることができる。例えば、一端をくくった半透膜のチュ
ーブに試料溶液を入れ、他端をくくって閉じた後、低張
液に浸すという方法を用いることができる。また、液体
を収容できる容器を半透膜で仕切って２つの部屋を形成
し、それぞれの部屋に試料溶液と低張液とを加えるとい
う方法を用いることもできる。
【００３４】工程（ｂ）
工程（ｂ）は、工程（ａ）における接触を、前記試料溶
液が二層または三層に分かれるまで継続し、中間層およ
び／または下層を分離する工程である。
液が二層または三層に分かれるまで継続し、中間層およ
び／または下層を分離する工程である。
【００３５】試料溶液を低張液に半透膜を介して接触さ
せ、この接触状態を継続すると、試料溶液は二層または
三層になる。接触状態を継続する際には、接触させた後
に放置しておけばよいが、低張液を攪拌したり、低張液
を新しいものに取り換えたりしてもよい。試料溶液が二
層または三層になるまでの時間は、試料溶液と低張液と
の接触面積や低張液の種類などに応じて異なるが、通常
は３〜６時間程度放置しておけばよい。
せ、この接触状態を継続すると、試料溶液は二層または
三層になる。接触状態を継続する際には、接触させた後
に放置しておけばよいが、低張液を攪拌したり、低張液
を新しいものに取り換えたりしてもよい。試料溶液が二
層または三層になるまでの時間は、試料溶液と低張液と
の接触面積や低張液の種類などに応じて異なるが、通常
は３〜６時間程度放置しておけばよい。
【００３６】試料溶液を低張液に半透膜を介して接触さ
せた状態を継続すると、低張液から試料溶液に水が混入
し、混入した水は試料溶液中の極性溶媒とともに、試料
溶液中の非極性溶媒と分離する。すなわち、試料溶液
は、非極性溶媒からなる下層と、極性溶媒からなる上層
とに分離する。試料溶液にガングリオシドが含有されて
いる場合には、上層と下層との間に、薄状（膜状）の中
間層が形成される。このように、試料溶液を低張液に半
透膜を介して接触させた状態を継続すると、試料溶液は
二層（上層および下層）または三層（上層、中間層およ
び下層）になる。そして、上層には糖脂質以外の成分
（例えば、リン脂質、塩など）が分配され、中間層には
ガングリオシドが分配され、下層にはガングリオシド以
外の糖脂質が分配される。したがって、中間層および／
または下層を分離することによって、試料溶液から糖脂
質を含有する画分を分離することができる。また、中間
層を分離することによって、試料溶液からガングリオシ
ドを含有する画分を分離することができる。
せた状態を継続すると、低張液から試料溶液に水が混入
し、混入した水は試料溶液中の極性溶媒とともに、試料
溶液中の非極性溶媒と分離する。すなわち、試料溶液
は、非極性溶媒からなる下層と、極性溶媒からなる上層
とに分離する。試料溶液にガングリオシドが含有されて
いる場合には、上層と下層との間に、薄状（膜状）の中
間層が形成される。このように、試料溶液を低張液に半
透膜を介して接触させた状態を継続すると、試料溶液は
二層（上層および下層）または三層（上層、中間層およ
び下層）になる。そして、上層には糖脂質以外の成分
（例えば、リン脂質、塩など）が分配され、中間層には
ガングリオシドが分配され、下層にはガングリオシド以
外の糖脂質が分配される。したがって、中間層および／
または下層を分離することによって、試料溶液から糖脂
質を含有する画分を分離することができる。また、中間
層を分離することによって、試料溶液からガングリオシ
ドを含有する画分を分離することができる。
【００３７】中間層および下層には、試料溶液中のほと
んどの糖脂質が含有されているので、中間層および下層
を分離することによって、高い回収率で糖脂質を分離す
ることができる。また、中間層には、試料溶液中のほと
んどのガングリオシドが含有されているので、中間層を
分離することによって、高い回収率でガングリオシドを
分離することができる。
んどの糖脂質が含有されているので、中間層および下層
を分離することによって、高い回収率で糖脂質を分離す
ることができる。また、中間層には、試料溶液中のほと
んどのガングリオシドが含有されているので、中間層を
分離することによって、高い回収率でガングリオシドを
分離することができる。
【００３８】また、中間層には、シアル酸残基を有する
ガングリオシドの他、ガングリオシドからシアル酸残基
が外れたアシアロガングリオシドも含まれるので、中間
層および下層を分離することによって、分離条件を変え
ることなく、多種類の糖脂質を回収することができる。
ガングリオシドの他、ガングリオシドからシアル酸残基
が外れたアシアロガングリオシドも含まれるので、中間
層および下層を分離することによって、分離条件を変え
ることなく、多種類の糖脂質を回収することができる。
【００３９】また、中間層に含有されるガングリオシ
ド、中間層および／または下層に含有される糖脂質は、
高い精製度（純度）であるが、必要に応じて、薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）、高性能薄層クロマトグラフ
ィー（ＨＰＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）で処理してさらに精製することができる。
ド、中間層および／または下層に含有される糖脂質は、
高い精製度（純度）であるが、必要に応じて、薄層クロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）、高性能薄層クロマトグラフ
ィー（ＨＰＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）で処理してさらに精製することができる。
【００４０】
【実施例】〔実施例１〕以下の方法１、方法２および方
法３によって、生体サンプルから糖脂質を分離した。な
お、方法１は本発明に係る糖脂質の分離方法であり、方
法３は従来法である。
法３によって、生体サンプルから糖脂質を分離した。な
お、方法１は本発明に係る糖脂質の分離方法であり、方
法３は従来法である。
【００４１】［方法１］Sandhoff病モデルマウス（ジャ
クソンラボラトリー）の脳の半球（２００〜２６０ｍ
ｇ）を蒸留水１ｍｌでホモジナイズした後、クロロホル
ム：メタノール（２：１（容量比））１２ｍｌを加え、
さらにホモジナイズした。次いで、ピリジン６０μｌを
加え、５０℃で２日間インキュベートすることにより、
総脂質（単純脂質、リン脂質および糖脂質）を含む抽出
液を得た。この抽出液をろ過してタンパク質と残渣を除
いた後、５０ｍＭの水酸化ナトリウム・メタノール溶液
４ｍｌを加えて加水分解し、リン脂質のエステル結合を
加水分解し、次いで１Ｎの酢酸ナトリウム・メタノール
溶液４０μｌを加えて中和し、試料溶液を得た。試料溶
液をセロファンチューブに収容し、これを蒸留水に浸し
て放置した。平衡化現象によってセロファンチューブ内
に蒸留水が混入し、約２時間後に試料溶液は、上層、中
間層および下層の三層に分かれた。上層、中間層および
下層を分離して、それぞれ乾固させた。
クソンラボラトリー）の脳の半球（２００〜２６０ｍ
ｇ）を蒸留水１ｍｌでホモジナイズした後、クロロホル
ム：メタノール（２：１（容量比））１２ｍｌを加え、
さらにホモジナイズした。次いで、ピリジン６０μｌを
加え、５０℃で２日間インキュベートすることにより、
総脂質（単純脂質、リン脂質および糖脂質）を含む抽出
液を得た。この抽出液をろ過してタンパク質と残渣を除
いた後、５０ｍＭの水酸化ナトリウム・メタノール溶液
４ｍｌを加えて加水分解し、リン脂質のエステル結合を
加水分解し、次いで１Ｎの酢酸ナトリウム・メタノール
溶液４０μｌを加えて中和し、試料溶液を得た。試料溶
液をセロファンチューブに収容し、これを蒸留水に浸し
て放置した。平衡化現象によってセロファンチューブ内
に蒸留水が混入し、約２時間後に試料溶液は、上層、中
間層および下層の三層に分かれた。上層、中間層および
下層を分離して、それぞれ乾固させた。
【００４２】［方法２］方法１で調製した試料溶液に含
有される糖脂質を薄層クロマトグラフィーによって分離
した。
有される糖脂質を薄層クロマトグラフィーによって分離
した。
【００４３】［方法３］Sandhoff病モデルマウスの脳の
半球（２００〜２６０ｍｇ）をクロロホルム：メタノー
ル（２：１（容量比））およびクロロホルム：メタノー
ル：蒸留水（１：２：０．８（容量比））で抽出し、総
脂質（単純脂質、リン脂質および糖脂質）を含む抽出液
を得た。この抽出液をDEAE-Sephadexカラムに通した
後、クロロホルム：メタノール：0.8N 酢酸ナトリウム
（１：２：０．８）で酸性糖脂質を溶出した。０．１Ｎ
の水酸化ナトリウム・メタノール溶液で加水分解した
後、１Ｎ酢酸で中和し、逆相カラム（SeppackC18）に通
して脱塩した。
半球（２００〜２６０ｍｇ）をクロロホルム：メタノー
ル（２：１（容量比））およびクロロホルム：メタノー
ル：蒸留水（１：２：０．８（容量比））で抽出し、総
脂質（単純脂質、リン脂質および糖脂質）を含む抽出液
を得た。この抽出液をDEAE-Sephadexカラムに通した
後、クロロホルム：メタノール：0.8N 酢酸ナトリウム
（１：２：０．８）で酸性糖脂質を溶出した。０．１Ｎ
の水酸化ナトリウム・メタノール溶液で加水分解した
後、１Ｎ酢酸で中和し、逆相カラム（SeppackC18）に通
して脱塩した。
【００４４】上記方法１、方法２および方法３によって
得られた糖脂質をクロロホルム：メタノール（２：１
（容量比））に溶解した後、シリカゲルプレートにクロ
ロホルム：メタノール：0.25% CaCl2（６０：３５：
８）で展開し、アンスロン硫酸を吹き付けてホットプレ
ートで発色させた。プレート上のバンドは、クロマトス
キャナー（Shimadzu CS-930）で定量し、それぞれの方
法における糖脂質の回収率、および回収された糖脂質の
組成を比較検討した。なお、シアル酸の定量はチオバル
ビツール法（Aminiitt,D.(1961) Biochem J,81,384-39
2）により行ない、糖脂質の定量はフェノール酸硫酸法
（Dubols,M(1956) Anal.chem. 28,350）により行なっ
た。
得られた糖脂質をクロロホルム：メタノール（２：１
（容量比））に溶解した後、シリカゲルプレートにクロ
ロホルム：メタノール：0.25% CaCl2（６０：３５：
８）で展開し、アンスロン硫酸を吹き付けてホットプレ
ートで発色させた。プレート上のバンドは、クロマトス
キャナー（Shimadzu CS-930）で定量し、それぞれの方
法における糖脂質の回収率、および回収された糖脂質の
組成を比較検討した。なお、シアル酸の定量はチオバル
ビツール法（Aminiitt,D.(1961) Biochem J,81,384-39
2）により行ない、糖脂質の定量はフェノール酸硫酸法
（Dubols,M(1956) Anal.chem. 28,350）により行なっ
た。
【００４５】薄層クロマトグラフィーの展開結果を図１
および図２に示す。図１は、方法１で得られた糖脂質の
展開結果であり、図１中、レーン１は上層に含有される
糖脂質、レーン２は中間層に含有される糖脂質、レーン
３は下層に含有される糖脂質、レーン４は分子量マーカ
ーである。また、図２は、方法１〜３で得られた糖脂質
の展開結果であり、図２中、レーンＭは分子量マーカ
ー、レーンＩは方法１で得られた中間層に含有される糖
脂質、レーンＩＩは方法２で得られた糖脂質、レーンＩ
ＩＩは方法３で得られた糖脂質である。
および図２に示す。図１は、方法１で得られた糖脂質の
展開結果であり、図１中、レーン１は上層に含有される
糖脂質、レーン２は中間層に含有される糖脂質、レーン
３は下層に含有される糖脂質、レーン４は分子量マーカ
ーである。また、図２は、方法１〜３で得られた糖脂質
の展開結果であり、図２中、レーンＭは分子量マーカ
ー、レーンＩは方法１で得られた中間層に含有される糖
脂質、レーンＩＩは方法２で得られた糖脂質、レーンＩ
ＩＩは方法３で得られた糖脂質である。
【００４６】図１に示すように、上層（レーン１）に
は、痕跡量程度の糖脂質以外に脂質は認められなかっ
た。また、中間層（レーン２）には、コレステロール、
セレブロシド（Cereb）、スルファチド（Sulf）、ガン
グリオシド（GA2，GM2，GM1，GD1a，GD1b，GT1b）が認
められた。また、下層（レーン３）には、コレステロー
ル、セレブロシド（Cereb）、スルファチド（Sulf）、
ガングリオシド（GA2，GM2）が認められた。
は、痕跡量程度の糖脂質以外に脂質は認められなかっ
た。また、中間層（レーン２）には、コレステロール、
セレブロシド（Cereb）、スルファチド（Sulf）、ガン
グリオシド（GA2，GM2，GM1，GD1a，GD1b，GT1b）が認
められた。また、下層（レーン３）には、コレステロー
ル、セレブロシド（Cereb）、スルファチド（Sulf）、
ガングリオシド（GA2，GM2）が認められた。
【００４７】したがって、中間層および下層に総糖脂質
が含有されており、中間層および下層を分離することに
よって総糖脂質を得ることができることが判明した。ま
た、中間層には、ほとんどのガングリオシドが含有され
ているので、中間層を分離することによってガングリオ
シドを得ることができることが判明した。
が含有されており、中間層および下層を分離することに
よって総糖脂質を得ることができることが判明した。ま
た、中間層には、ほとんどのガングリオシドが含有され
ているので、中間層を分離することによってガングリオ
シドを得ることができることが判明した。
【００４８】また、中間層に含有されるガングリオシド
には、シアル酸残基を有するガングリオシド（GM2，GM
1，GD1a，GD1b，GT1b）の他、ガングリオシドからシア
ル酸残基が外れたアシアロガングリオシド（GA2（アシ
アロGM1））、グロボシドなどの糖脂質も含まれてお
り、中間層および下層を分離することによって、分離条
件を変えることなく、多種類の糖脂質を回収できること
が判明した。
には、シアル酸残基を有するガングリオシド（GM2，GM
1，GD1a，GD1b，GT1b）の他、ガングリオシドからシア
ル酸残基が外れたアシアロガングリオシド（GA2（アシ
アロGM1））、グロボシドなどの糖脂質も含まれてお
り、中間層および下層を分離することによって、分離条
件を変えることなく、多種類の糖脂質を回収できること
が判明した。
【００４９】図２に示すように、方法１で得られた中間
層に含有される糖脂質の展開結果と、方法２で得られた
糖脂質の展開結果とはほぼ一致しており、方法１によっ
てクロマトグラフィーと同程度の種類の糖脂質を分離・
精製できることが判明した。また、方法１および方法２
で回収された糖脂質の量は、方法１の方が方法２よりも
糖で４．７％、シアル酸で９．８％多かったことから、
方法１がクロマトグラフィーと同程度の回収率で糖脂質
を分離・精製できることが判明した。
層に含有される糖脂質の展開結果と、方法２で得られた
糖脂質の展開結果とはほぼ一致しており、方法１によっ
てクロマトグラフィーと同程度の種類の糖脂質を分離・
精製できることが判明した。また、方法１および方法２
で回収された糖脂質の量は、方法１の方が方法２よりも
糖で４．７％、シアル酸で９．８％多かったことから、
方法１がクロマトグラフィーと同程度の回収率で糖脂質
を分離・精製できることが判明した。
【００５０】また、図２に示すように、方法１で得られ
た中間層に含有される糖脂質は、方法３で得られた糖脂
質よりも多種類で、しかも回収率が高く、方法１は従来
法よりも多種類の糖脂質を高回収率で分離・精製できる
ことが判明した。なお、方法３で回収された糖脂質の量
が方法１および方法２の半分以下であったのは、DEAE-S
ephadexカラムで中性糖脂質であるGA2が除かれていたた
めである。
た中間層に含有される糖脂質は、方法３で得られた糖脂
質よりも多種類で、しかも回収率が高く、方法１は従来
法よりも多種類の糖脂質を高回収率で分離・精製できる
ことが判明した。なお、方法３で回収された糖脂質の量
が方法１および方法２の半分以下であったのは、DEAE-S
ephadexカラムで中性糖脂質であるGA2が除かれていたた
めである。
【００５１】〔実施例２〕Sandhoff病モデルマウスの脳
以外の生体サンプルからも、方法１によって糖脂質を分
離した。用いた生体サンプルは、脳、腎臓、脾臓、肝
臓、心臓、肺、子宮、精巣および膵臓である。方法１に
よって得られた糖脂質をクロロホルム：メタノール
（２：１（容量比））に溶解した後、シリカゲルプレー
トにクロロホルム：メタノール：0.25% CaCl2（６０：
３５：８）で展開し、アンスロン硫酸を吹き付けてホッ
トプレートで発色させた。プレート上のバンドは、クロ
マトスキャナー（Shimadzu CS-930）で定量し、糖脂質
の回収率、および回収された糖脂質の組成を比較検討し
た。
以外の生体サンプルからも、方法１によって糖脂質を分
離した。用いた生体サンプルは、脳、腎臓、脾臓、肝
臓、心臓、肺、子宮、精巣および膵臓である。方法１に
よって得られた糖脂質をクロロホルム：メタノール
（２：１（容量比））に溶解した後、シリカゲルプレー
トにクロロホルム：メタノール：0.25% CaCl2（６０：
３５：８）で展開し、アンスロン硫酸を吹き付けてホッ
トプレートで発色させた。プレート上のバンドは、クロ
マトスキャナー（Shimadzu CS-930）で定量し、糖脂質
の回収率、および回収された糖脂質の組成を比較検討し
た。
【００５２】その結果を図３に示す。図３に示すよう
に、肝臓、脾臓、子宮および脳から各臓器に蓄積してい
るGM2,GA2, GD2を、腎臓からはグロボシドを精製するこ
とができた。また、蓄積せず自然状態で存在する微量の
ガングリオシドも精製することができた。特筆すべき
は、ガングリオ（ganglio）系列以外のグロボ（globo）
系列、ラクト（lacto）系列も同時に精製できているこ
とである。糖脂質の基本糖鎖系列には、ガングリオ（ga
nglio）系列、グロボ（globo）系列、ラクト（lacto）
系列、イソグロボ（isoglobo）系列、ネオラクト（neol
acto）系列、イソガングリオ（isoganglio）系列、ラク
トガングリオ（lactoganglio）系列などがあるが、これ
らの結果から、ガングリオ（ganglio）系列を含む基本
糖鎖系列全てを同じ条件で一括して精製できることが示
唆された。
に、肝臓、脾臓、子宮および脳から各臓器に蓄積してい
るGM2,GA2, GD2を、腎臓からはグロボシドを精製するこ
とができた。また、蓄積せず自然状態で存在する微量の
ガングリオシドも精製することができた。特筆すべき
は、ガングリオ（ganglio）系列以外のグロボ（globo）
系列、ラクト（lacto）系列も同時に精製できているこ
とである。糖脂質の基本糖鎖系列には、ガングリオ（ga
nglio）系列、グロボ（globo）系列、ラクト（lacto）
系列、イソグロボ（isoglobo）系列、ネオラクト（neol
acto）系列、イソガングリオ（isoganglio）系列、ラク
トガングリオ（lactoganglio）系列などがあるが、これ
らの結果から、ガングリオ（ganglio）系列を含む基本
糖鎖系列全てを同じ条件で一括して精製できることが示
唆された。
【００５３】
【発明の効果】本発明により、糖脂質の分離方法が提供
される。本発明の糖脂質の分離方法は、簡便かつ低コス
トに多数のサンプルを処理でき、しかも多種類の糖脂質
を回収できるとともにその回収率が高い。このような効
果は、分離対象をガングリオシドとしたときに特に大き
い。
される。本発明の糖脂質の分離方法は、簡便かつ低コス
トに多数のサンプルを処理でき、しかも多種類の糖脂質
を回収できるとともにその回収率が高い。このような効
果は、分離対象をガングリオシドとしたときに特に大き
い。
【図１】本発明に係る糖脂質の分離方法によって得られ
た上層、中間層および下層を薄層クロマトグラフィー処
理したときの展開結果を示す図である。
た上層、中間層および下層を薄層クロマトグラフィー処
理したときの展開結果を示す図である。
【図２】本発明に係る糖脂質の分離方法および従来法で
得られた糖脂質を薄層クロマトグラフィー処理したとき
の展開結果を示す図である。
得られた糖脂質を薄層クロマトグラフィー処理したとき
の展開結果を示す図である。
【図３】本発明に係る糖脂質の分離方法によって様々な
組織から得られた糖脂質を薄層クロマトグラフィー処理
したときの展開結果を示す図である。
組織から得られた糖脂質を薄層クロマトグラフィー処理
したときの展開結果を示す図である。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１１Ｂ 3/16 Ｃ１１Ｂ 3/16
Ｃ１１Ｃ 3/00 Ｃ１１Ｃ 3/00
(72)発明者 勝山 佳代子
長野県須坂市春木町1002−６
Ｆターム(参考） 4C090 AA07 BA76 BA77 BA91 BC01
BC15 BC27 CA08 CA09 CA11
CA31 CA32 DA22 DA25
4H059 AA04 BA04 BA12 BA26 BA43
BC02 BC42 CA12 CA38 CA99
EA21
Claims (6)
- 【請求項１】 以下の工程： （ａ）生体サンプルを非極性溶媒と極性溶媒との混合液
で抽出した抽出物に加水分解処理を施して得られる試料
溶液を、該試料溶液よりも浸透圧の低い溶液に半透膜を
介して接触させる工程 （ｂ）前記接触を、前記試料溶液が二層または三層に分
かれるまで継続し、中間層および／または下層を分離す
る工程を含むことを特徴とする糖脂質の分離方法。 - 【請求項２】 前記糖脂質がガングリオシドであって、
前記工程（ｂ）において、前記接触を前記試料溶液が三
層に分かれるまで継続し、中間層を分離することを特徴
とする請求項１記載の分離方法。 - 【請求項３】 生体サンプルが、動物若しくは植物の細
胞若しくは組織または微生物の菌体であることを特徴と
する請求項１または２記載の分離方法。 - 【請求項４】 前記非極性溶媒が、クロロホルム、ピリ
ジンまたはこれらの混合物であり、前記極性溶媒が水、
メタノール、酢酸ナトリウムまたはこれらの２種以上の
混合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか
に記載の分離方法。 - 【請求項５】 前記非極性溶媒と極性溶媒との混合液
が、水とメタノールとクロロホルムとピリジンとの混合
物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記
載の分離方法。 - 【請求項６】 前記試料溶液が、前記抽出物に加水分解
処理を施した後、中和処理を施して得られるものである
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の分離
方法。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP2001321157A JP2003129083A (ja) | 2001-10-18 | 2001-10-18 | 糖脂質の分離方法 |
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| US10/825,210 US20050119475A1 (en) | 2001-10-18 | 2004-04-16 | Method of separating glycolipids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001321157A JP2003129083A (ja) | 2001-10-18 | 2001-10-18 | 糖脂質の分離方法 |
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|---|---|
| JP2003129083A true JP2003129083A (ja) | 2003-05-08 |
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ID=19138430
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|---|---|---|---|
| JP2001321157A Pending JP2003129083A (ja) | 2001-10-18 | 2001-10-18 | 糖脂質の分離方法 |
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- 2004-04-16 US US10/825,210 patent/US20050119475A1/en not_active Abandoned
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