WO2011043107A1 - 植物からのシアル酸含有化合物の抽出法 - Google Patents

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WO2011043107A1
WO2011043107A1 PCT/JP2010/060010 JP2010060010W WO2011043107A1 WO 2011043107 A1 WO2011043107 A1 WO 2011043107A1 JP 2010060010 W JP2010060010 W JP 2010060010W WO 2011043107 A1 WO2011043107 A1 WO 2011043107A1
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sialic acid
water
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眞市朗 川瀬
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独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting a sialic acid-containing compound from plants, and more particularly to a method for extracting a sialic acid-containing compound from cereal and / or legume seeds.
  • Sialic acid is a generic name for acyl derivatives of neuraminic acid, which is an amino sugar, and there are more than 20 types of derivatives. Naturally, N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid are the most abundant. It exists as “ganglioside”, a sialic acid-containing glycosphingolipid and “polysialic acid sugar chain”, which is a sialic acid-containing sugar chain, in animal brains, milk, chicken egg yolk, and the like. Ganglioside is a general term for glycolipids having sialic acid on the non-reducing terminal side, and there are a plurality of types depending on the number of sialic acids and binding sites.
  • Polysialic acid is a sugar chain in which several tens of sialic acids are bonded. Polysialic acid constitutes the sugar chain part of nerve adhesion factor (NCAM), which is a huge nerve-specific glycoprotein that functions in the field of nerve cell migration, neurite elongation, and synapse formation.
  • NCAM nerve adhesion factor
  • a compound containing sialic acid in the molecular structure 1) develops reddish purple or blue-violet color by reacting resorcinol-hydrochloric acid reagent (for example, see Non-patent Document 1), 2) has affinity for serotonin affinity column (For example, see Non-Patent Document 2).
  • substances exhibiting these properties are compounds having sialic acid in the molecular structure.
  • Sialylated compounds differentiation of neural constituting the brain, growth, an essential substance for maintaining, learning ability enhancing action by oral ingestion has also been observed, is a substance having a high functionality (e.g., non-patent Reference 3). Furthermore, sialic acid-containing compounds are also known to have an immune activation effect and an anticancer effect. Therefore, in the future, sialic acid-containing compounds are expected to be widely used for the treatment of brain-related diseases and malignant neoplastic diseases that will increase with the arrival of an aging society.
  • sialic acid-containing compounds have been prepared mainly from bovine brain and milk, but due to the occurrence of bovine spongiform encephalopathy (BSE) problem, preparation from bovine brain and milk has become difficult.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • Chicken eggs are also a source of sialic acid-containing compounds, but the safety of the production of sialic acid-containing compounds from chicken eggs has been questioned due to the occurrence of the bird flu problem. In other words, it is said that the bird flu virus does not infect chicken eggs, but it is difficult to say that the consumer is relieved.
  • sialic acid-containing compounds have been artificially chemically synthesized, but at present, this method has not reached a practical level in terms of yield and cost, and has not yet been mass-produced. .
  • Patent Document 1 describes in parallel that a glycolipid containing gangliosides from a plant-derived raw material can be extracted, but only an extraction method from mouse brain is disclosed in detail. No specific method for extracting glycolipids containing gangliosides from plants is described. Moreover, since chloroform is used, it is not preferable.
  • the present invention solves the above-mentioned conventional problems, and makes it essential to use reagents that are harmful to the human body and the environment from raw materials that are easy to obtain and that are not likely to be contaminated with animal pathogenic pathogens (highly safe raw materials).
  • the objective is to extract a sialic acid-containing compound inexpensively and easily.
  • sialic acid-containing compounds are present in large amounts in plants, particularly grains and beans. Then, the present inventors roughly extract soluble components using water, water containing alcohol or water-containing alcohol, and purify the obtained crude extract to prevent contamination with animal pathogens. It has been found that sialic acid-containing compounds that are not feared can be easily extracted. The present invention has been completed based on such knowledge.
  • the present invention according to claim 1 is a method in which a soluble component is roughly extracted from a plant body or a processed product of the plant body using water, alcohol or hydrous alcohol, and dialysis, salting out or
  • the present invention provides a method for extracting a sialic acid-containing compound, characterized by being separated and recovered by a chromatography column.
  • the present invention according to claim 2 provides the method for extracting a sialic acid-containing compound according to claim 1, wherein the plant body is a seed of cereals and / or beans.
  • the present invention according to claim 3 is the extraction of the sialic acid-containing compound according to claim 1 or 2, wherein the plant body or a processed product of the plant body is pulverized, ground, crushed or powdered.
  • the present invention according to claim 4 provides the method for extracting a sialic acid-containing compound according to any one of claims 1 to 3, wherein sonication is performed in the step of roughly extracting the soluble component.
  • the present invention according to claim 5 is characterized in that the water is tap water, deionized water, distilled water, or water containing a salt, acid, alkali, saccharide or pH buffer.
  • the extraction method of the sialic acid containing compound as described in 1 above is provided.
  • the present invention according to claim 6 provides the method for extracting a sialic acid-containing compound according to any one of claims 1 to 5, wherein the alcohol is methanol, ethanol, isopropanol, ethylene glycol, or glycerol. It is.
  • the present invention according to claim 7 is the method according to any one of claims 1 to 6, wherein the separation and recovery are performed by a serotonin affinity column, a lectin affinity column, a gel filtration column, an ion exchange column, or a silica gel column.
  • the present invention provides a method for extracting a sialic acid-containing compound.
  • the present invention according to claim 8 provides a sialic acid-containing compound obtained from the extraction method according to any one of claims 1 to 7.
  • the raw material is derived from plants (especially grains and legume seeds) and no harmful chemicals (especially chloroform) are used in the production process, there is no risk of contamination with animal pathogens and safety.
  • High sialic acid-containing compounds can be provided.
  • the present invention makes it possible to provide a sialic acid-containing compound at a low cost because the raw materials are easily obtained and the process is easy.
  • the present invention makes it possible to effectively use non-standard or discarded cereals and beans, waste (such as rice bran and bran) generated during processing of cereals, and non-standard beans.
  • Test Examples 1 to 3 In Test Examples 1 to 3 and extracted with water as the extraction solvent, soybean seeds whole grain flour, wheat flour, brown rice whole grain flour, or brown rice aleurone layer part of the powder, the crude extract from a thin layer It is the figure which isolate
  • Test Example 4 a crude extract from brown rice paste powder portion or rice germ extracted using ethylene glycol as an extraction solvent was separated by thin layer chromatography, and resorcinol-hydrochloric acid treatment was performed on the sialic acid-containing compound. It is the figure which detected presence.
  • FIG. 3 is a diagram in which the presence of all organic compounds is detected in an atmosphere
  • FIG. 3B is a diagram in which the presence of a sialic acid-containing compound is detected by resorcinol hydrochloric acid treatment.
  • a crude extract from brown rice paste layer portion powder or white rice surface layer portion powder extracted using water as an extraction solvent was separated by thin layer chromatography, and resorcinol-hydrochloric acid treatment contained sialic acid. It is the figure which detected presence of the compound.
  • Test Example 7 a crude extract from red bean seed powder extracted with water, water containing hydrochloric acid or ethylene glycol as an extraction solvent was separated by thin layer chromatography, and contained sialic acid by resorcinol hydrochloric acid treatment. It is the figure which detected presence of the compound.
  • Test Examples 8-10 the brown rice outermost layer portion, brown rice paste powder layer portion, white rice surface layer portion, black soybean seed cotyledons or crude extract from corn flour were separated by thin layer chromatography and resorcinol-hydrochloric acid treatment. It is the figure which detected presence of the sialic acid containing compound.
  • Example 11 the crude extract from the rice germ or brown rice paste layer powder extracted using water as the extraction solvent was separated by thin layer chromatography, and resorcinol-hydrochloric acid treatment was present for the presence of sialic acid-containing compounds.
  • FIG. In Example 1, it is the figure which fractionated the water extract from the powder
  • Example 2 it is the figure which fractionated the water extract from the rice germ with the serotonin affinity column.
  • Example 3 it is the figure which fractionated the water extract from the powder
  • Example 3 the fraction fractionated by the serotonin affinity column was separated by thin layer chromatography, and the figure showing the presence of all organic compounds in an iodine vapor atmosphere (a), and sialic acid treated with resorcinol hydrochloride It is the figure (b) which detected presence of the containing compound.
  • Experiment 12 it is the figure which isolate
  • Test Example 16 water as the extraction solvent, or 11.83% acetic acid, or extracted with 7.06% hydrochloric acid, the crude extract of wheat small Busuma, separated by thin layer chromatography, with resorcinol hydrochloric acid treatment It is the figure which detected presence of the sialic acid containing compound.
  • Experiment 17 it is the figure which isolate
  • Example 18 the crude extract from rice bran, wheat bran, and barley bran extracted using water as an extraction solvent was separated by thin layer chromatography, and the presence of a sialic acid-containing compound was detected by lectin binding reaction.
  • the fraction fractionated by the gel filtration column was separated by thin layer chromatography, and the presence of sialic acid-containing compounds was detected by resorcinol hydrochloric acid treatment.
  • a method for extracting a sialic acid-containing compound characterized in that a soluble component is roughly extracted from raw materials derived from plants (especially cereals and legume seeds) using water or alcohol and purified from the obtained crude extract. It is about.
  • sialic acid-containing compound refers to a compound having sialic acid in the molecular structure.
  • Sialic acid is a generic name for acyl derivatives of neuraminic acid, which is an amino sugar, and there are more than 20 types of derivatives.
  • N-acetylneuraminic acid and N-glycolylneuraminic acid are the most abundant. Exists.
  • sialic acid is a nine carbon sugar having a skeleton composed of nine carbons, and has a carboxyl group or N-acyl group as a functional group. There is a feature.
  • KDN 2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid
  • a sugar having an ⁇ -keto acid with a carbon sugar skeleton (2-keto-3-deoxynononic acid) is employed.
  • sialic acid-containing compounds include polysialic acid sugar chains that are 'sialic acid-containing sugar chains', fetuins that are 'sialic acid-containing glycoproteins containing the aforementioned sugar chains', ⁇ 1-acid glycoproteins, and mucins And ganglioside (sphingoglycolipid) which is a “sialic acid-containing glycolipid”.
  • polysialic acid is a sugar chain in which several tens of sialic acids are bonded.
  • polysialic acid constitutes the sugar chain part of nerve adhesion factor (NCAM), which is a huge nerve-specific glycoprotein that functions in the field of nerve cell migration, neurite elongation, and synapse formation.
  • NCAM nerve adhesion factor
  • Ganglioside is a general term for glycolipids having sialic acid on the non-reducing terminal side, and there are a plurality of types depending on the number of sialic acids and binding sites.
  • most of the plant-derived sialic acid-containing compounds in the present invention are glycolipids and glycoproteins, and most of them are glycolipids.
  • sialic acid has a negative charge and is involved in cell adhesion, cell differentiation and the like, and is an essential substance for differentiation, growth and maintenance of nerve cells.
  • the sialic acid-containing compound is a concept including sialic acid alone.
  • cereals refers to plants that attach seeds containing edible starches among grasses, and include types classified into not only wheat and rice but also minor grains.
  • rice belonging to the family Gramineae (rice), wheat (wheat), barley (barley), rye (rye), buckwheat (cultivar of oats, oats, oats), wild grass, millet, millet, Japanese millet, millet, pearl barley, corn, sorghum (Takaki, Kouriyan, Sorghum), pearl millet, Tef, Phenio, Kodra (Cordungbier), Makomo, and the like.
  • “barley”, “wheat”, “rice”, and “corn”, which are the main cereals can be preferably used.
  • rye and buckwheat which are closely related to wheat and barley, can also be suitably used.
  • any varieties and strains can be used as long as they belong to Hordeum vulgare. Examples thereof include Nijo barley, Rokujo barley, bare barley, and barley barley.
  • the “wheat” wheat, wheat
  • any species, variety, or strain can be used as long as it belongs to the genus Triticum.
  • T. aestivum ordinary wheat, bread wheat
  • T. compactum club wheat, dense wheat
  • any varieties and strains including japonica varieties and indica varieties can be used as long as they belong to Oryza sativa.
  • any varieties and strains can be used as long as they belong to Zea mays. Examples thereof include sweet corn (sweet seed), popcorn (popcorn raw material), dent corn (corn starch raw material), flint corn, waxy corn, and the like.
  • “beans” include edible types belonging to legumes, such as soybeans, red beans, mung bean, kidney beans, peas, broad beans, and the like. Can be suitably used.
  • the “soybean” (soybean, Glycine max), any varieties and strains can be used as long as they belong to Glycine max.
  • black beans, red beans, dada beans, green soybeans, white soybeans, beggar beans, Miyagi shirome, large white, natto grains, and the like can be mentioned.
  • the “red beans” adzuki bean
  • any varieties and strains can be used as long as they belong to Vigna angularis. For example, it is possible to cite large payings, medium payings, white red beans, black red beans, and the like.
  • any plant body that is, any organ or tissue of a plant can be used, but it is preferable to use 'seed'.
  • any tissue or part can be used as long as it is a tissue derived from seeds.
  • an embryo, embryo, endosperm, seed coat, cocoon, paste layer, starch storage unit, paste layer, cotyledon, etc. are used. be able to.
  • the whole seed (whole grain) can also be used.
  • a processed product can be used as a raw material of this invention.
  • wheat flour, barley flour, rice flour (brown rice flour, white rice flour, etc.), cooked rice, corn flour, soybean flour, red bean flour, coconut powder, and the like can be used.
  • rice that is to be disposed of such as rice milled rice and whitening process (rice bran, wheat bran, barley bran, germ, etc.), remaining starch extracted from starch, shochu lees, soybean product straw (such as okara), non-standard or Surplus crops and the like can also be suitably used.
  • the rough extraction of the sialic acid-containing compound in the present invention can be performed by the following method.
  • the raw material can be used in the extraction process as it is depending on the type, structure and processing state to be used.
  • treatment such as shredding and crushing, preferably crushing, grinding
  • a grinder (Ultracentrifugal Mill, made by MRK-RETSCH, or Cyclone Sample Mill, UDY CORPORATION), a brush rice mill (HRG-122, made by Minoru Sangyo) or a grinding rice mill It can be pulverized using a machine (Grain Testing Mill, manufactured by SATAKE). Further, when the beans are pulverized, a pulverizer (Ultracentrifugal Mill, manufactured by MRK-RETSCH) can be used. In addition, the powdery processed products such as rice germ, wheat flour, and rice flour that fall off during the milling process can be directly used for coarse extraction without being pulverized.
  • the raw material is immersed in a solvent to perform a rough extraction process.
  • Any solvent can be used as the solvent used in the rough extraction treatment as long as it is water, alcohol, or water-containing alcohol.
  • the sialic acid-containing compound that can be extracted in this step can be extracted from any molecular species as long as it is soluble (particularly water-soluble) in these solvents.
  • extraction with improved solubility can be achieved by adding salt, acid, alkali, saccharide, pH buffering agent in water. Some can be done.
  • water any water such as tap water, distilled water, deionized water, and water having high hardness can be used.
  • Examples of the “salt” include sodium chloride and sodium citrate. By containing a salt, the solubility of an active ingredient can be improved and extraction efficiency can be improved.
  • Examples of the “acid” include hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, acetic acid, citric acid, malic acid and the like. Preferably, hydrochloric acid and acetic acid can be preferably used.
  • the sialic acid-containing compound can be reduced in molecular weight and elution efficiency can be improved. In addition, there is an effect that it is possible to suppress the propagation of miscellaneous bacteria during long-time immersion in a temperature range of 25 to 40 ° C.
  • alkali examples include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, ammonia and the like, and preferably, magnesium hydroxide and ammonia can be suitably used. There is an effect that it is possible to suppress the propagation of miscellaneous bacteria during long-time immersion in the temperature range of 25 to 40 ° C.
  • saccharide examples include sorbitol, glucose, sucrose, trehalose, xylitol and the like.
  • the concentration of salt, acid, alkali, saccharide, pH buffering agent, etc. contained in water varies depending on the substance used. For example, when sodium chloride is used, 0.1 to 5% (w / V) is desirable. Further, when hydrochloric acid is used, 0.5 to 12% (v / v), preferably about 1% (v / v) to 7% (v / v) (about 0.28N to 2N) is contained. It is desirable. Further, when acetic acid is used, it is 0.5 to 12% (v / v), preferably about 1.7% (v / v) to 12% (v / v) (about 0.28N to 2N). It is desirable to contain.
  • hydrous alcohol or “(100%) alcohol” can be used as a solvent used in this step.
  • the water to be mixed with the hydrous alcohol is normal water (tap water, distilled water, deionized water, etc.), and contains the salt, acid, alkali, saccharide, pH buffer, and the like. Water can be used.
  • alcohol monoalcohols (monohydric alcohol), such as methanol, ethanol, butanol, and isopropanol; glycols (divalent alcohol), such as ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, glycerin, Examples thereof include glycerols (trivalent alcohol) such as polyglycerol.
  • glycols divalent alcohol
  • ethylene glycol, ethanol and isopropanol which are monoalcohols (more particularly, methanol and ethanol which are lower alcohols having a high polarity and a small number of carbon atoms).
  • ethylene glycol which is a glycol
  • glycerin which is a glycerin
  • the concentration of alcohol relative to water varies depending on the alcohol used. For example, in the case of using ethanol, 5% (v / v) to 100% (v / v: water content 0 %), Preferably 5% (v / v) to 50% (v / v). When ethylene glycol is used, 20% (v / v) to 100% (v / v: moisture content 0%), preferably 50% (v / v) to 100% (v / v: moisture content 0). %) Is desirable. By using the solvent having the predetermined alcohol concentration, it is expected that the extraction efficiency is improved and impurities are reduced.
  • the sonication can be carried out in any way which is conventional done, for example, it can be used B-42J Ultrasonic Cleaner (manufactured by BRANSON).
  • a rough extraction treatment is performed at a temperature of 1 to 80 ° C., preferably 5 to 40 ° C., for 1 minute to 24 hours, preferably 5 minutes to 12 hours.
  • a rough extraction treatment it is desirable to carry out at least 1 hour or more.
  • the endogenous enzyme contained in the plant body as the raw material can be worked.
  • a processed plant product in which the endogenous enzyme is inactivated is used as a raw material
  • water containing a high concentration acid for example, about 2N hydrochloric acid or acetic acid
  • about 40 to 80 ° C. preferably Can be reduced in molecular weight and fragmented by carrying out rough extraction at about 80 ° C.
  • elution efficiency can be improved by performing mixing, stirring, shaking, pressurization and the like.
  • the extraction solvent is alcohol, sufficient extraction may be possible even with simple stirring and mixing.
  • water or water containing salt, acid, alkali, sugar, pH buffer
  • an appropriate amount for example, 0.5 to 5 times amount
  • ethanol is poured into the crude extract. By adding, it is possible to precipitate and remove polymer contaminants such as nucleic acids and polysaccharides.
  • the crude extract obtained in the above step can be purified to increase the content of the sialic acid-containing compound.
  • the fraction containing a large amount of sialic acid-containing compound can be separated and collected by dialysis, salting out, or chromatography column.
  • the “dialysis” can be performed by electrodialysis or simple dialysis.
  • the “salting out” can be performed using sodium chloride, sodium sulfate, or the like.
  • an affinity column (serotonin affinity column, lectin affinity column, heparin column, antibody column, etc.), ion exchange column (quaternary ammonium group binding carrier column, diethylaminoethyl group binding carrier column, etc.)
  • Gel filtration columns cross-linked agarose gel columns, cross-linked dextran gel columns, etc.
  • adsorption resin columns (porous adsorption resin columns, activated carbon columns, etc.), silica gel columns, silica gel columns with modifying groups, solid phases, etc. it can.
  • the column form is not limited to the form used for high-speed chromatography, but can be used without any problem even with a disposable column such as a solid phase cartridge.
  • affinity columns and gel filtration columns are preferred in terms of improving the content rate.
  • an adsorption resin column, a silica gel column, a dialysis method, and the like can be given.
  • the affinity column a column packed with a sialic acid-containing compound and a column carrier exhibiting a strong specific affinity is preferable, and in particular, a serotonin affinity column or a lectin affinity column (most preferably a serotonin affinity column) is preferable.
  • a serotonin affinity carrier (LAS-Serotonin carrier, manufactured by J-Oil Mills) can be used.
  • a serotonin affinity carrier in which a ligand is chemically coupled to a suitable commercially available carrier (such as Sephadex manufactured by Pharmacia) using serotonin as a ligand can be prepared and used.
  • Concanavalin A (ConA) carrier can be mentioned as a carrier having binding properties with sialic acid.
  • ConA carrier collects sialic acid sugar chains containing mannose by utilizing affinity for mannose. Therefore, it is not very suitable for use as a column carrier in this step.
  • gel filtration column agarose gel, cross-linked agarose gel, acrylamide polymer gel, and other commercially available general gels can be used.
  • the purity of the sialic acid-containing compound can be further increased. Further, by separating a peak containing a sialic acid-containing compound from the obtained purified product by HPLC, the purity of the purified product can be further increased, or a pure product can be isolated.
  • the elution fraction (purified product) containing a high amount of the sialic acid-containing compound recovered through the purification is preferably used after elution of the elution solvent, dialysis removal, concentration to dryness, and the like.
  • the recovered amount of the sialic acid-containing compound recovered through the above purification step is, for example, about 2.5 to 4.5 mg when extracted with 3 g of cereal or legume seeds as a raw material and purified with a serotonin affinity column. Can be extracted. Moreover, by performing the said refinement
  • Sialic acid-containing compounds are essential substances for neuronal differentiation, growth and maintenance, and include central neurological disorders such as Alzheimer's disease, dementia, spinal cord injury; diabetic neuropathy, motor disorders associated with peripheral neuropathy and It can be expected to be an active ingredient having an effective therapeutic and preventive effect on sensory impairment. In addition to the above diseases, memory improvement can be expected. Furthermore, the compound is also known to have an immune activation effect and an anticancer effect.
  • the plant-derived sialic acid-containing compound (purified product) obtained through the above steps can be made into a drug, a functional food or drink, a functional cosmetic, etc. by mixing with various raw materials.
  • the said extract which is an active ingredient in this invention originates in a plant (especially grain, legume seed), it is excellent in safety
  • oral administration for example, in the case of oral administration, it can be in the form of powder, fine granules, granules, etc. In addition to the form filled in capsules, it is mixed with the form of a solution dispersed in water, excipients, etc. It can also be made into the form of the tablet obtained by doing. In the case of transdermal administration, it may be in the form of a cream, gel, seal, or a shape for fixing a support containing an active ingredient.
  • functional foods and beverages food for specified health use, nutritional functional foods, health foods
  • various foods such as ham, sausage, kamaboko, chikuwa, bread, butter, powdered milk, confectionery, etc.
  • drinks such as water, alcoholic beverages, fruit juice, milk, soft drinks and the like.
  • a functional cosmetic for example, it can be added to a form suitable for cosmetics, for example, cream, gel, lotion, hairdressing, etc. to make the compound suitable for percutaneous ingestion. .
  • Example 1 Detection of sialic acid-containing compound from crude soybean seed extract
  • 15 mL of water was added to 3 g of soybean powder obtained by pulverizing whole soybean seeds (Sachiyutaka) with a pulverizer (Ultracentrifugal Mill, manufactured by MRK-RETSCH, mesh diameter 0.5 mm or 1 mm) and mixed well (Sample 1) -1).
  • the mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON).
  • the treated product was allowed to stand at 10 ° C. for 12 hours and then subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes.
  • ⁇ Test Example 2> (Detection of sialic acid-containing compound from crude extract of whole brown rice grain and brown rice paste layer) 15 mL of water was added to 3 g of powder obtained by pulverizing whole brown rice (Koshihikari) with a pulverizer (Cyclone Sample Mill, manufactured by UDY Corporation), and mixed well (Sample 2-2).
  • brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a grinding-type rice mill (made by Satake Grain Testing Mill, Satake), and the brown rice is 100% by mass.
  • 15 mL of water was added to 3 g of the powder derived from (the brown rice paste powder layer portion that had been scraped and recovered), and mixed well (Sample 2-5).
  • the sialic acid-containing compound was detected by spraying and heating and coloring at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • lane 1 is whole soybean seed (Sachiyutaka) flour (sample 1-1)
  • lane 2 is brown rice (Koshihikari) whole grain flour (sample 2-2)
  • lane 3 is wheat flour (agricultural forest 61).
  • No.) (sample 3-3)
  • lane 4 flour (Western White) (sample 3-4)
  • lanes 5 brown rice (Koshihikari) aleurone layer part of the powder (sample 2-5), as an extraction solvent of water
  • the crude extract obtained by using the above-mentioned process is developed on a silica gel plate.
  • a crude extract containing a sialic acid-containing compound can be obtained from powder derived from soybean, rice and wheat seeds by using water as an extraction solvent without using a harmful organic solvent. Became clear. Moreover, since most of the detected sialic acid-containing compounds moved greatly from the origin, it was suggested that they were glycolipids, which are substances having a high affinity for the developing solvent. The sialic acid-containing compound that does not move from the vicinity of the origin in Samples 1-3 and 1-4 (lanes 3 and 4) is considered to be a glycoprotein adsorbed on a silica gel plate.
  • Brown rice (Koshihikari) is ground sequentially from the outside with a grinding-type rice mill (Grain Testing Mill, manufactured by SATAKE).
  • a portion in the range of 96 to 91% by mass corresponding to the paste layer portion (scraped) 15 mL of 100% (v / v) ethylene glycol was added to 3 g of the powder derived from the recovered brown rice paste powder portion) and mixed well (Sample 4-7).
  • 15 g of 100% (v / v) ethylene glycol was added to 3 g of rice germ (Koshihikari) and mixed well (Sample 4-8).
  • lane 1 is an N-acetylneuraminic acid standard (containing sialic acid) (N-Acetylneuraminic acid Type IV-S, manufactured by Sigma), and lane 2 is a ganglioside G D1a standard (containing sialic acid) ( Disialoganglioside-G D1a (manufactured by Sigma), lane 3 is ganglioside G T1b preparation (containing sialic acid) (Trisialoganglioside-G T1b , Sigma), lane 4 is phosphatidylserine preparation (Phosphatidylserine from beef brain, SERDANY Research Laboratories) Lane 5 is a phosphatidylethanolamine preparation (L- ⁇ -Phosphatidylethanolamine from plant, AVANTI Polar-Lipids), and lane 6 is a lysophosphatidylcholine preparation (L- ⁇ -Lysophosphatidylcholine from soybean
  • Lane 7 is brown rice (Koshihikari) paste powder (sample 4-7)
  • lane 8 is rice germ (Koshihikari) (sample 4-8)
  • 100% (v / v) ethylene glycol is used as an extraction solvent.
  • the crude extract obtained from the above steps is developed on a silica gel plate.
  • Brown rice (Koshihikari) is ground sequentially from the outside with a grinding-type rice mill (made by Satake Grain Testing Mill, Satake). If brown rice is 100% by mass, the portion in the range of 96 to 91% by mass corresponding to the paste layer (scraping) Then, 15 mL of water was added to 3 g of the powder derived from the brown rice paste powder portion recovered in this manner and mixed well (Sample 5-1). In addition, 15 mL of 100% (v / v) ethylene glycol was added to 3 g of the powder of the brown rice paste layer and mixed well (Sample 5-2).
  • the developed silica gel plate was allowed to stand for 72 hours at room temperature in an iodine vapor atmosphere to detect all organic compounds. Subsequently, the silica gel plate taken out from the iodine vapor atmosphere is allowed to stand for 24 hours. After sufficiently desorbing iodine, the resorcinol hydrochloric acid is sprayed, and the color development treatment is performed at 95 ° C., thereby detecting the sialic acid-containing compound. Went. The results are shown in FIG. In FIG. 3, the detected all organic compounds are shown in (a), and the detected sialic acid-containing compounds are shown in (b).
  • Brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a grind-type rice mill (made by Grain Testing Mill, Satake). If the brown rice is 100% by mass, the portion in the range of 96-91% by mass corresponding to the paste layer (cut off) 15 mL of water was added to 3 g of the powder derived from the recovered brown rice paste powder layer) and mixed well (samples 6-1 to 6-3). Also, brown rice (Koshihikari) was ground from the outside with a grinding-type rice mill (produced by Grain Testing Mill, Satake).
  • lane 1 is a centrifugal supernatant (sample 6-1) after adding ethanol obtained from the powder of the brown rice paste layer portion
  • lane 2 is ethanol obtained from the powder of the brown rice paste layer portion.
  • the water re-dissolved solution of the centrifugal precipitate after the addition (Sample 6-2)
  • Lane 3 is the water re-dissolved solution of the centrifugal precipitate after the first water rough extraction obtained from the flour of the brown rice paste powder layer (Sample 6-2).
  • Lane 4 is the centrifugation supernatant after adding ethanol obtained from the powder of the white rice surface layer (Sample 6-4)
  • Lane 5 is the centrifugal precipitate after adding ethanol obtained from the powder of the white rice surface layer.
  • lane 6 is a silica recipitated water resolubilized solution (sample 6-6) after the first rough extraction obtained from the white rice surface layer powder. It is a thing. Further, Lane 7 ganglioside G D1a preparation (containing sialic acid) (Disialoganglioside-G D1a, manufactured by Sigma), Lane 8 ganglioside G T1b preparation (containing sialic acid) (Trisialoganglioside-G T1b, manufactured by Sigma), lane 9 N-acetylneuraminic acid preparation (including sialic acid) (N-Acetylneuraminic acid Type IV-S, manufactured by Sigma) is developed on a silica gel plate.
  • ganglioside G D1a preparation containing sialic acid
  • Lane 8 ganglioside G T1b preparation containing sialic acid
  • Trisialoganglioside-G T1b manufactured by Sigma
  • the centrifugal supernatant (crude extract) after adding ethanol obtained by the above extraction method from the powder of the brown rice paste powder layer or the white rice surface layer (sample 6-1, 6-4) (lanes 1 and 4) were shown to contain particularly large amounts of sialic acid-containing compounds.
  • the sialic acid-containing compound is also contained in a large amount in the water re-dissolved solution (sample 6-2) (lane 2) of the centrifugal precipitate after ethanol addition. It was shown that.
  • the water re-dissolved solution (samples 6-3, 6-6) (lanes 3 and 6) of the centrifugal precipitate (residue) after the first water rough extraction is used. From the fact that almost no sialic acid-containing compound was present, it was shown that most of the sialic acid-containing compound was extracted into the crude extract in the first water crude extraction. Moreover, since most of the detected sialic acid-containing compounds moved greatly from the origin, it was suggested that they were glycolipids, which are substances having a high affinity for the developing solvent. The sialic acid-containing compound that does not move from the vicinity of the origin in Samples 6-1 and 6-4 (lanes 1 and 4) is considered to be a glycoprotein adsorbed on a silica gel plate.
  • Example 7> (Detection of sialic acid-containing compounds from crude extracts using various solvents) 15 mL of water was added to 3 g of powder obtained by pulverizing red bean seeds with a pulverizer (Ultracentrifugal Mill, manufactured by MRK-RETSCH), and mixed well (samples 7-1, 7-4, 7-7). Further, 15 mL of 1% (v / v) hydrochloric acid was added to 3 g of the red bean seed powder and mixed well (samples 7-2, 7-5, 7-8). Further, 15 mL of 100% (v / v) ethylene glycol was added to 3 g of the red bean seed powder and mixed well (samples 7-3, 7-6, 7-9).
  • the sialic acid-containing compound was detected by spraying and heating and coloring at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • lane 5 uses 1% (v / v) hydrochloric acid at 25 ° C. as extraction solvent from red bean seed flour, and the crude extract obtained from the above step (sample 7-5), lane 6 Is 100% (v / v) at 25 ° C as an extraction solvent from red bean seed flour.
  • Brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a grind-type rice mill (Grain Testing Mill, manufactured by SATAKE). If brown rice is 100% by mass, the part in the range of 100 to 96% by mass corresponding to the outermost layer (scraped and collected) 15 ml of water was added to 3 g of the powder derived from the outermost layer portion of brown rice, which was mixed well (Sample 8-1). Also, brown rice (Koshihikari) is ground sequentially from the outside with a grinding-type rice mill (Grain Testing Mill, manufactured by SATAKE).
  • brown rice When brown rice is 100% by mass, 96 to 91% by mass (removed by scraping) 15 g of water was added to 3 g of the powder derived from the brown rice paste powder layer portion and mixed well (Sample 8-2).
  • brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a grinding-type rice mill (made by Grain Testing Mill, manufactured by SATAKE). If the brown rice is 100% by mass, the portion in the range of 91-86% by mass corresponding to the surface layer of white rice (scraping) 15 g of water was added to 3 g of the powder derived from the white rice surface layer portion recovered in this manner and mixed well (Sample 8-3).
  • the sialic acid-containing compound was detected by spraying and heating and coloring at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • Example 9> Detection of sialic acid-containing compound from crude extract of black soybean molting seed cotyledon
  • 15 mL of water was added to 3 g of the powder obtained by pulverizing the cotyledon portion of the black soybean molting seed with a pulverizer (Ultracentrifugal Mill, manufactured by MRK-RETSCH), and mixed well (Sample 9-4).
  • 15 mL of 1% (v / v) hydrochloric acid was added to 3 g of the cotyledon portion of the black soybean molting seed and mixed well (Sample 9-5).
  • the sialic acid-containing compound was detected by spraying and heating and coloring at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • Example 10> Detection of sialic acid-containing compound from corn seed crude extract
  • 15 mL of water was added to 3 g of powder obtained by pulverizing corn seeds (popcorn seeds) with a pulverizer (Ultracentrifugal Mill, manufactured by MRK-RETSCH), and mixed well (Sample 10-6).
  • 15 mL of 1% (v / v) hydrochloric acid was added to 3 g of the corn seed (popcorn seed) powder and mixed well (Sample 10-7). These mixtures were sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON). These treated products were allowed to stand at 10 ° C.
  • lane 1 uses water as an extraction solvent from the brown rice outermost layer powder, the crude extract obtained from the above process (sample 8-1), and lane 2 shows the brown rice paste powder portion from the powder.
  • the crude extract (sample 8-2) obtained from the above step using water as the extraction solvent Lane 3 is the crude extract (sample) obtained from the above step using water as the extraction solvent from the powder of the white rice surface layer. 8-3), Lane 4 uses water as an extraction solvent from black soybean seed cotyledon powder, the crude extract obtained from the above process (Sample 9-4), and Lane 5 shows black soybean seed cotyledon powder.
  • the crude extract (sample 9-5) obtained from the above step using 1% (v / v) hydrochloric acid as the extraction solvent Lane 6 is the crude extract obtained from the above step using water as the extraction solvent from corn seeds. Extract (sample 10-6), lane 7 is corn seed With 1% (v / v) hydrochloric acid as the extraction solvent, in which the crude extract solution obtained from the above step (sample 10-7), was developed on the silica gel plate.
  • Lane 8 ganglioside G D1a preparation of (containing sialic acid) (Disialoganglioside-G D1a, manufactured by Sigma)
  • Lane 9 ganglioside G T1b preparation (containing sialic acid)
  • silica gel It is developed on a plate.
  • the crude extract (samples 9-4, 9-5) (lanes 4 and 5) obtained from the above process using water or 1% (v / v) hydrochloric acid as an extraction solvent from black soybean cotyledon powder was used.
  • sialic acid containing compounds were included. Moreover, since the detected sialic acid-containing compound moved greatly from the origin, it was suggested that it was a glycolipid that is a substance having a high affinity for the developing solvent.
  • Example 11 (Influence of extraction time on extraction) To 3 g of rice germ (Koshihikari), 15 mL of water was added and mixed well (samples 11-1, 11-2, 11-5, 11-6). In addition, brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a grinding-type rice mill (produced by Grain Testing Mill, Satake). When brown rice is 100% by mass, a portion in the range of 96 to 91% by mass corresponding to the paste layer portion ( 15 mL of water was added to 3 g of the powder derived from the brown rice paste powder portion that had been scraped and collected (samples 11-3, 11-4, 11-7, 11-8).
  • samples 11-2, 11-4, 11-6, and 11-8 “centrifugal supernatant after ethanol addition” obtained from rice germ or brown rice paste layer portion powder was designated as samples 11-2, 11-4, 11-6, and 11-8.
  • / 1 (V / V / V) each component was separated, sprayed with resorcinol-hydrochloric acid, and heat-colored at 95 ° C. to detect sialic acid-containing compounds. The results are shown in FIG.
  • lane 1 is a supernatant obtained after 2.5 hours of water extraction from rice germ (sample 11-1), and lane 2 is a water extract of 2.5 hours from rice germ.
  • lane 4 is extracted from the powder of the brown rice paste powder layer with water for 2.5 hours, and the centrifuged supernatant (sample 11-4) after ethanol addition obtained by the above process lane 5 from rice germ, 10 hours centrifuged supernatant after the conducted water extract (sample 11-5), lane 6 from rice germ, perform water extraction for 10 hours, ethanol Note obtained by the above process Centrifugal supernatant (sample 11-6) after addition, lane 7 is 10 hours of water extraction from the powder in the brown rice paste layer The centrifugal supernatant after (sample 11-7), lane 8 is from the flour of the brown rice aleurone layer part performs water extraction for 10 hours, centrifuged supernatant after addition of ethanol obtained in the above step ( Sample 11-8) was developed on a silica gel plate.
  • the crude extract obtained by water extraction from the rice germ or brown rice paste layer portion at 10 ° C. for 2.5 to 10 hours contains a large amount of sialic acid-containing compound. It was shown to be included.
  • samples 11-5 to 11-8) examples 5 to 8
  • samples 11-1 to 11-4 examples 1 to 4
  • Example 1 Water extraction from the brown rice paste layer portion and affinity column purification
  • brown rice Korean rice (Koshihikari) was ground sequentially from the outside with a grinding rice mill (produced by Grain Testing Mill, Satake), and the brown rice content was 100% by mass. 15 mL of water was added to 3 g of the powder derived from the portion in the range (brown rice paste powder layer portion scraped and collected) and mixed well. This mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds. The treated product was allowed to stand at 10 ° C. for 12 hours and then subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes.
  • Chromatographic conditions include a flow rate of 0.2 mL / min and pure water for 90 minutes (section 1) after removing non-adsorbed components, followed by linear gradient conditions of 4 mM to 30 mM ammonium acetate solution.
  • fractionation with this serotonin affinity column was performed twice (twice each 1 mL of the crude extract), and the fraction from which the sialic acid-containing compound was eluted twice (section 2) was freeze-dried (Freezdryer FD-1 The product was freeze-dried using EYELA, and the weight was measured.
  • Example 2> Water extraction and purification from rice germ
  • [Serotonin affinity column purification] 15 mL of water was added to 3 g of rice germ (Koshihikari) and mixed well. This mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds. The treated product was allowed to stand at 10 ° C. for 12 hours and then subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. 0.1 mL of the separated crude extract was applied to a 4 mm diameter, 5 cm long column (LAS-Serotonin, J-Oil Mills) packed with serotonin affinity carrier (LAS-Serotonin carrier, J-Oil Mills). Fractionated.
  • LAS-Serotonin affinity column purification 15 mL of water was added to 3 g of rice germ (Koshihikari) and mixed well. This mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds. The treated product was allowed to stand at 10 ° C. for 12 hours and then subjected to solid-liquid separation by centr
  • Chromatographic conditions include a flow rate of 0.2 mL / min, pure water transfer for 285 minutes to remove non-adsorbed components, and then ensure the interaction between the sialic acid-containing compound and the serotonin affinity carrier. Therefore, liquid feeding was stopped for 12 hours. Thereafter, a 30 mM ammonium acetate solution was fed for 285 minutes to recover the sialic acid-containing compound dissociated from the carrier. (In this embodiment, the column regeneration process is omitted.) The detection of the sialic acid-containing compound was performed by measuring the amount of the compound eluted from the serotonin affinity carrier by the absorbance at OD280nm. The results are shown in FIG. In FIG. 9, the change in absorbance at OD 280 nm when pure water is fed is shown in (a), and the change in absorbance at OD 280 nm when 30 mM ammonium acetate solution is fed is shown in (b).
  • Example 3> Water extraction and purification from the surface part of white rice
  • Brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a grind-type rice mill (made by Grain Testing Mill, Satake). If brown rice is 100% by mass, the portion in the range of 91-86% by mass corresponding to the surface layer of white rice (cut and collected) 15 ml of water was added to 3 g of the powder derived from the white rice surface layer portion and mixed well. This mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds. The treated product was allowed to stand at 10 ° C. for 12 hours and then subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes.
  • the 1M ammonium acetate solution is sent for 180 minutes to perform column washing (removal of column adsorbing components) (section 3), and finally, the 1M ammonium acetate solution is sent in a linear reverse gradient from the pure water to pure water.
  • the column was regenerated (section 4) by performing 60 minutes of liquid and 180 minutes of pure water.
  • the detection of the sialic acid-containing compound was performed by measuring the amount of the compound eluted from the serotonin affinity carrier by the absorbance at OD280nm. The results are shown in FIG. FIG. 10 shows the change over time in the absorbance at OD 280 nm of the solution that passed through the serotonin affinity column.
  • fractionation with this serotonin affinity column was performed twice (2 times each of the crude extract 2 mL), and the portion of the above 0M to 1M ammonium acetate solution fed to the column under a linear gradient condition (section 2) ) Were collected, freeze-dried using a freeze dryer (Freezdryer FD-1, EYELA), and the weight was measured.
  • the resorcinol hydrochloric acid is sprayed, and the color development treatment is performed at 95 ° C., thereby detecting the sialic acid-containing compound. Went.
  • FIG. 11 representative fractions of the above-mentioned sections 1 to 4 are separated by thin layer chromatography.
  • the detected all organic compounds are shown in (a), and the detected sialic acid-containing compounds are shown in (b). It is a thing.
  • lane 1 is fraction 12 (sample a) eluted from 110 minutes to 120 minutes
  • lane 2 is fraction 44 (sample a) eluted from 430 minutes to 440 minutes
  • lane 3 is from 470 minutes to 480 minutes.
  • Eluted fraction 48 (sample C)
  • lane 4 eluted from fraction 530 to 540 minutes (sample d)
  • lane 5 eluted from 790 minutes to 800 minutes (sample a)
  • lane 6 was 880
  • Fraction 89 (sample F) eluted from 890 minutes to 890 minutes is developed on a silica gel plate.
  • fraction 44 (Sample A) (lane 2) eluted from 430 minutes to 440 minutes (fraction 3) (lane 3) eluted from 470 minutes to 480 minutes.
  • fraction 54 (sample d) eluting from 530 to 540 minutes (lane 4) was shown to contain sialic acid-containing compounds.
  • fraction 80 (sample A) (lane 5) eluted from 790 to 800 minutes and fraction 89 (sample KA) (lane 6) eluted from 880 to 890 minutes do not contain a sialic acid-containing compound. It was shown that.
  • fraction containing the peak of section 2 which is the part where the 0M to 1M ammonium acetate solution shown in FIG. 10 is fed to the column under a linear gradient condition contains a sialic acid-containing compound. It was shown that the low peak seen in section 4 during the column regeneration process does not contain sialic acid-containing compounds. Further, as shown in the comparison result of (a) and (b) of FIG. 11, fraction 44 eluted from 430 minutes to 440 minutes (sample a) (lane 2), fraction 48 eluted from 470 minutes to 480 minutes.
  • Example C (Lane 3), and Fraction 54 (Sample D) (Lane 4) eluted from 530 to 540 minutes, 'contaminant contamination is extremely low (contaminant content is under iodine vapor atmosphere) It was shown that the sialic acid-containing compound can be recovered. Moreover, since the detected sialic acid-containing compound moved greatly from the origin, it was suggested that it was a glycolipid that is a substance having a high affinity for the developing solvent.
  • the sample solution applied to the column contains an amount of the sialic acid-containing compound that greatly exceeds the adsorption ability of the sialic acid-containing compound possessed by the carrier of the serotonin affinity column used. Therefore, if a larger-scale column having sufficient sialic acid-containing compound adsorption capacity, for example, an industrial column having a serotonin affinity carrier volume of about 10 liters or more is used, the sialic acid-containing compound can be separated and recovered more efficiently. Is expected to do.
  • Example 12 (Confirmation of detection of sialic acid-containing compound by lectin blot) Ethylene glycol (15 mL) was added to 3 g of rice germ (Koshihikari) and mixed well. The mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON). The treated product was allowed to stand at 10 ° C. for 12 hours and then subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes (sample 12).
  • MAA lectin is a lectin that specifically binds to the “N-acetylneuraminic acid ⁇ (2 ⁇ 3) Gal” structure
  • SNA-I lectin is “N-acetylneuraminic acid ⁇ ”. It is a lectin that specifically binds to the (2 ⁇ 6) Gal ”or“ N-acetylneuraminic acid ⁇ (2 ⁇ 6) GalNAc ”structure.
  • the poly (isobutyl methacrylate) -treated silica gel plate is washed to remove the fluorescent lectin that is not bound to the target product, and then specifically to the portion where fluorescence is observed, ie, sialic acid.
  • the sialic acid-containing compound was detected by observing the site of the binding lectin. The results are shown in FIGS. 12A to 12D for each combination of detection conditions.
  • the left photograph is a photographed image of the silica gel plate before the lectin binding reaction is performed
  • the right photograph is a photographed image of the silica gel plate after the lectin binding reaction is performed. .
  • the portion not emitting light before the fluorescent lectin binding reaction is after the fluorescent lectin binding operation (right photo in each figure). It was observed that it was emitting light (arrow part).
  • the light-emitting part in the right-hand photographs in each figure indicates that the fluorescently labeled MAA lectin or SNA-I lectin is specifically bound to the compound having a structure specific to the N-acetylneuraminic acid. It is shown. Specifically, from FIGS.
  • the results of this test example showed that a compound containing sialic acid (N-acetylneuraminic acid) was present in the ethylene glycol extract of rice germ. Moreover, since the detected sialic acid-containing compound moved greatly from the origin, it was suggested that it was a glycolipid that is a substance having a high affinity for the developing solvent.
  • sialic acid N-acetylneuraminic acid
  • Brown rice (Koshihikari) is ground from the outside with a brush-type rice mill (made by HRG-122 Minoru Sangyo).
  • brown rice 100% by mass, the portion of the range of 100 to 96% by mass (the brown rice outermost layer part) is cut off.
  • rice with the paste layer remaining (in other words, the outermost layer portion of brown rice is scraped and the remaining 96 mass% of the rice with the germ and paste layer remaining) is placed at 20 ° C. (Sample 13-1, 13-2) or 25 ° C. (samples 13-3 and 13-4) in water for 6 hours and left to stand.
  • the sialic acid-containing compound was detected by performing a heat coloring process at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • lane 1 is extracted from the cooked rice that has been left by soaking the rice from which the outermost layer of brown rice has been shaved and the paste layer remaining in the rice for 6 hours before cooking.
  • 2 ⁇ L of the crude extract (sample 13-1) obtained from the above step was developed on a silica gel plate.
  • Lane 2 is the same 4 ⁇ L (sample 13-2) as lane 1 developed on a silica gel plate.
  • Lane 3 is from rice cooked with rice left with germs and paste layer remaining after cutting off the outermost layer of brown rice for 6 hours before cooking, using water as the extraction solvent,
  • the crude extract 2 ⁇ L (sample 13-3) obtained from the above step is developed on a silica gel plate.
  • Lane 4 is the same 4 ⁇ L (sample 13-4) as lane 3 developed on a silica gel plate.
  • ⁇ Test Example 14> (Detection of a sialic acid-containing compound from a crude extract using glycerol) 100 grams of flour obtained by grinding whole wheat (Agriculture 61) and barley (Sachiho Golden, Betzes, Daishimochi, Ichibamboshi, No. 1) with a grinder (Ultracentrifugal Mill, manufactured by MRK-RETSCH) 15%% (v / v) glycerol was added and mixed well (samples 14-1 to 14-6). These mixtures were sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON). These treated products were allowed to stand at 10 ° C.
  • lane 1 is 100% as the extraction solvent from the wheat Norin 61 whole grain flour with (v / v) with glycerol, crude extract solution obtained from the above step (sample 14-1), lane 2 Barley Using 100% (v / v) glycerol as an extraction solvent from Sachiho Golden Whole Grain, the crude extract obtained from the above process (Sample 14-2) is lane 3, 100% (v / v) from Barley Betze Whole Grain as Extraction Solvent.
  • Example 15> Detection of sialic acid-containing compounds from various cereal-derived flours and crude extracts of processed products
  • the sialic acid-containing compound was detected by spraying and heat-coloring treatment at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • lane 1 uses water as an extraction solvent from Wheat No. 61 whole grain flour
  • the crude extract (sample 15-1) obtained from the above process is used as lane 2 as an extraction solvent from barley sathiho golden whole grain flour.
  • the crude extract solution obtained from the above step (sample 15-2) lane 3 using water as the extraction solvent from barley Betzes whole grain flour
  • Lane 4 uses water as an extraction solvent from barley daisimochi whole grain powder
  • lane 5 uses water as an extraction solvent from barley ichibanboshi whole grain powder.
  • the obtained crude extract (sample 15-5) was used in lane 6, water was used as an extraction solvent from barley-plated No.
  • a crude extract containing sialic acid-containing compounds can be obtained from wheat and barley whole grains, small breasts, and rice germ by extraction using water as an extraction solvent. Indicated. From rice germ, it was shown that one specific kind of sialic acid-containing compound can be extracted at a higher concentration than whole grains of wheat and barley and small breasts. It was shown that multiple types of sialic acid-containing compounds not contained in rice germ can be extracted from wheat and barley. As for wheat and barley, it was shown that sialic acid-containing compounds can be extracted at a higher concentration than whole grains when small bush is used as an extraction raw material.
  • sialic acid-containing compounds moved greatly from the origin, it was suggested that they were glycolipids, which are substances having a high affinity for the developing solvent.
  • the sialic acid-containing compounds that do not move from the vicinity of the origin in Samples 15-1 to 15-9 (lanes 1 to 9) are considered to be glycoproteins adsorbed on the silica gel plate.
  • Example 16> (Influence on extraction by type of acid) Water, 11.83% (2N) acetic acid, or 7.06% (2N) hydrochloric acid 15 mL was added to 3 g of wheat farm 61 No. 61 and mixed well. These mixtures were sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON). These treated products were shaken at 80 ° C. for 3 hours (Samples 16-1 to 16-3), and then separated into solid and liquid by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes. In addition, 15 mL of water was added to 3 g of the wheat bran of No. 61, and mixed well.
  • B-42J Ultrasonic Cleaner manufactured by BRANSON
  • the mixture was sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON).
  • the treated product was immediately left (sample 16-4) or left at 10 ° C. for 28.5 h (about 3 hours) (sample 16-8), and then subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes.
  • the sialic acid-containing compound was detected by spraying and heat-coloring treatment at 95 ° C. The results are shown in FIG.
  • lane 1 is a crude extract obtained by centrifuging after sonication at 80 ° C. for 3 hours using water as an extraction solvent from wheat farm 61 No. 61.
  • Lane 2 is a crude extract (sample 16-2) obtained by centrifuging at 80 ° C. for 3 hours after sonication using 2N acetic acid as an extraction solvent from Wheat Norin 61 No. 61.
  • Lane 3 is a crude extract obtained by centrifuging and centrifuging at 80 ° C. for 3 hours after sonication using 2N hydrochloric acid as an extraction solvent from Wheat Norin 61 small bush (sample 16-3). Is developed on a silica gel plate.
  • Lane 4 is a crude extract (sample 16-4) obtained by centrifuging immediately after sonication using water as an extraction solvent from wheat farm 61 No. 61.
  • Lane 8 is wheat farm 61 No. 61.
  • a crude extract (sample 16-8) obtained by centrifuging using water as an extraction solvent from small breasts after standing at 10 ° C. for about 3 hours and then centrifuging. It is.
  • Lane 5 is a sialic acid-containing compound sample GD1a (manufactured by SIGMA)
  • lane 6 is a sialic acid-containing compound sample GT1b (manufactured by SIGMA)
  • lane 7 is a sialic acid-containing compound sample N-acetylneuraminic acid (manufactured by SIGMA).
  • SIGMA is developed on a silica gel plate.
  • the sialic acid-containing compound moving to a high position on the silica gel plate different from that extracted with water is obtained by the acetic acid treatment and hydrochloric acid treatment at 80 ° C. for about 3 hours. It was shown that This result is thought to be due to the low polarity of the sialic acid-containing compound due to 'low molecular weight and fragmentation' caused by heat treatment. That is, it was suggested that by performing an acid treatment with heat, the molecular weight can be reduced and fragmented, and the solubility can be improved (elution efficiency can be improved).
  • sialic acid-containing compounds moved greatly from the origin, it was suggested that they were glycolipids, which are substances having a high affinity for the developing solvent.
  • the sialic acid-containing compound that does not move from the vicinity of the origin in Samples 16-1, 16-2, 16-4, and 16-8 (lanes 1, 2, 4, and 8) is a glycoprotein adsorbed on a silica gel plate. Conceivable.
  • Example 17 (Effect of extraction time in room temperature extraction) Water (10 mL) was added to 2 g of wheat (white eagles) small bush and mixed well. These mixtures were sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON). Immediately (sample 17-1) or 25 hours at 25 ° C. (sample 17-2), 4 hours (sample 17-3), 12 hours (sample 17-4), 24 hours (sample 17-5) ) After shaking, solid-liquid separation was performed by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes.
  • B-42J Ultrasonic Cleaner manufactured by BRANSON
  • lane 1 uses water as an extraction solvent from wheat (white eagles) small breasts, and immediately after sonication, the crude extract (sample 17-1) obtained from the above step is used.
  • Lane 2 shows wheat ( Egret Wheat) Using water as an extraction solvent from small bush, sonicated and shaken at 25 ° C. for 1 hour, and then the crude extract (sample 17-2) obtained from the above step, lane 3 is wheat (white eagles) small bush using water as the extraction solvent, after 4 hours with shaking at 25 ° C.
  • the colored band near the origin is developed further upward by immersing the wheat flour in water at 25 ° C. (4 hours or more, particularly 12 hours or more). It was shown that it can be converted to a band.
  • This result is thought to be due to the low polarity of the sialic acid-containing compound due to the action of the endogenous enzyme, resulting in “low molecular weight and fragmentation”.
  • sialic acid-containing compounds in wheat small breasts can be reduced in molecular weight and fragmented (by changing the composition of the sialic acid-containing compounds), improving the solubility (elution) It was suggested that the efficiency can be improved.
  • sialic acid-containing compounds moved greatly from the origin, it was suggested that they were glycolipids, which are substances having a high affinity for the developing solvent.
  • the sialic acid-containing compounds that do not move from the vicinity of the origin in Samples 17-1 to 17-5 (lanes 1 to 5) are considered to be glycoproteins adsorbed on the silica gel plate.
  • Example 18> (Detection confirmation of sialic acid-containing compound by lectin blotting from crude extract of each cereal meal) 15 mL of water was added to 3 g of rice (Hitomebo) rice bran, wheat (Nishinochikara) bran, and barley (Mannenbosi) bran and mixed well. These mixtures were sonicated for 1 minute 30 seconds using an sonicator (B-42J Ultrasonic Cleaner, manufactured by BRANSON). This treated product was immediately subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes (Samples 18-1 to 18-3).
  • MAA lectin is a lectin that specifically binds to the “N-acetylneuraminic acid ⁇ (2 ⁇ 3) Gal” structure.
  • the poly (isobutyl methacrylate) -treated silica gel plate is washed to remove the fluorescent lectin that is not bound to the target product, and then specifically to the portion where fluorescence is observed, ie, sialic acid.
  • the sialic acid-containing compound was detected by observing the site of the binding lectin. The results are shown in FIG.
  • lane 1 uses water as an extraction solvent from rice (Hitomeboru) rice, the crude extract (sample 18-1) obtained from the above step, and lane 2 uses water as an extraction solvent from wheat (Nishino Chikara) bran.
  • the crude extract (sample 18-2) obtained from the above step was used for lane 3, and water was used as an extraction solvent from barley (mannenbosi) bran for lane 3, and the crude extract (sample 18-3) obtained from the above step ) On a silica gel plate.
  • the results of this test example showed that a compound containing sialic acid (N-acetylneuraminic acid) was present in the aqueous extract of rice bran, wheat bran, and barley bran. Moreover, since the detected sialic acid-containing compound moved greatly from the origin, it was suggested that it was a glycolipid that is a substance having a high affinity for the developing solvent.
  • sialic acid N-acetylneuraminic acid
  • Example 4> Methanol extraction from whole rice grains and gel filtration column purification
  • [Gel filtration column purification] 15 mL of methanol was added to 3 g of the powder obtained by pulverizing whole grains of rice (Hitomebore) with a pulverizer (Cyclone Sample Mill, manufactured by UDY CORPORATION), and mixed well by hand using a glass rod.
  • the treated product was immediately separated into solid and liquid by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes.
  • the crude extract obtained by concentrating the supernatant obtained by solid-liquid separation with a nitrogen stream was fractionated with a high-performance liquid chromatography system (Nippon Analytical Industry, main unit differential refraction detector) connected to a gel filtration column (Shodex). . Methanol was used as the eluent. As a result, peaks indicated by 1 to 9 were obtained as shown in FIG.
  • peak 8 contains a large amount of sialic acid-containing compound, Moreover, since the detected sialic acid-containing compound moved greatly from the origin, it was suggested that it was a glycolipid that is a substance having a high affinity for the developing solvent.
  • a highly safe sialic acid-containing compound is obtained at low cost from a plant-derived raw material, in particular, a seed of a cereal or legume, and a processed product thereof, without fear of contamination with an animal-borne pathogen. Can do.
  • plant-derived waste rice bran red rice bran, white rice bran
  • wheat bran wheat bran
  • waste soybeans non-standard red beans
  • remaining rice cake obtained by extracting starch from corn.
  • the plant-derived sialic acid-containing compound that is the product of the present invention can be used as a functional food containing sialic acid, a high-value-added cosmetic, and a pharmaceutical raw material.

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Abstract

　本発明は、入手が容易であり且つ動物罹患性病原体の混入の恐れがない原料（安全性の高い原料）から、人体や環境に有害な試薬の使用を必須とせずに、シアル酸含有化合物を安価で且つ容易に抽出することを目的とする。　また、本発明は、植物体（特に穀類や豆類の種子）もしくはその加工品を、水、アルコール又は含水アルコールを用いて可溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、透析、塩析もしくはクロマトグラフィーカラムによって分離し回収することを特徴とする、シアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。

Description

植物からのシアル酸含有化合物の抽出法
　本発明は、植物からのシアル酸含有化合物の抽出法に関し、詳しくは穀類及び／又は豆類の種子からのシアル酸含有化合物の抽出法に関する。
　シアル酸は、アミノ糖であるノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、２０種類以上の誘導体が存在するが、天然には、Ｎ-アセチルノイラミン酸およびＮ-グリコリルノイラミン酸として最も多量に存在しシアル酸含有スフィンゴ糖脂質である「ガングリオシド」やシアル酸含有糖鎖である「ポリシアル酸糖鎖」として、動物の脳、牛乳、鶏卵卵黄などに存在する。
　ガングリオシドは、シアル酸を非還元末端側に有する糖脂質の総称であり、シアル酸の数と結合部位によって複数の種類がある。ポリシアル酸とは、シアル酸が数十個以上結合した糖鎖である。ポリシアル酸は、神経細胞の移動や神経突起の伸長、シナプス形成の場で機能している巨大な神経特異的糖蛋白質である神経接着因子（ＮＣＡＭ）の糖鎖部分を構成している。
　シアル酸を分子構造中に含む化合物は、１）レゾルシノール－塩酸試薬を反応させる事により赤紫色ないし青紫色に発色する（例えば、非特許文献１参照）、２）セロトニンアフィニティーカラムに親和性を有する（例えば、非特許文献２参照）、といった性質を持つ。逆に、これらの性質を示す物質はシアル酸を分子構造中に有する化合物である。
　シアル酸含有化合物は、脳を構成する神経の分化、成長、維持に必須の物質であり、経口摂取により学習能力向上作用も認められている、高い機能性を有する物質である（例えば、非特許文献３参照）。さらに、シアル酸含有化合物は、免疫活性化作用、抗癌作用を有することも知られている。従って、今後、シアル酸含有化合物は、高齢化社会の到来とともに、さらに増大する脳関連疾患や悪性腫瘍性疾患の治療に幅広く利用されることが予想される。
　これまでシアル酸含有化合物は主として牛脳や牛乳から調製されてきたが、牛海綿脳症（ＢＳＥ）問題の発生により牛脳や牛乳からの調製が困難となっている。また、鶏卵もシアル酸含有化合物の供給源であるが、鳥インフルエンザ問題の発生により鶏卵からのシアル酸含有化合物の製造もその安全性が疑問視されている。即ち、鳥インフルエンザウイルスは鶏卵には感染しないとされているが、消費者の安心を得ているとは言い難い。
　なお、シアル酸含有化合物を人工的に化学合成することも行われているが、現時点ではその手法では収率やコストの面において実用可能なレベルに達しておらず、大量生産するには至っていない。
　このような現状から、ウイルスやプリオンなどの動物罹患性病原体の混入の心配のない、新たな天然素材由来のシアル酸含有化合物の供給源が望まれている。
　また、従来の天然物由来のシアル酸含有化合物の抽出方法においては、クロロホルム－メタノール混合溶媒、もしくは熱メタノールなどを用いて抽出されており（シアル酸含有化合物の化学合成法においても、クロロホルムをはじめとする様々な有機溶媒が使用されており）、環境問題及び人体への影響の観点から、有害な有機溶媒の使用を抑制しようとの動きもあり、これらに配慮したシアル酸含有化合物の抽出方法の開発が望まれている。
　これまで、植物にシアル酸が存在することを示唆する報告は、Sharらの論文（非特許文献４，５参照）に記載されている。
　しかしながら、Sharらの論文には、シロイヌナズナにシアル酸の存在を示唆する間接的な証拠の記載があるのみで、シアル酸含有化合物特有の性質の有無を直接調べた実験は行われておらず、さらに具体的な抽出方法も開示されていない。
　なお、特許文献１には、植物を含む生体由来原料からのガングリオシドを含む糖脂質を抽出できる旨が並列的に記載されているが、詳しくはマウスの脳からの抽出方法しか開示されておらず、植物を材料としたガングリオシドを含む糖脂質の具体的な抽出方法は記載されていない。また、クロロホルムを用いるため好ましくない。
特開２００３－１２９０８３号公報
新生化学実験講座４　脂質III　糖脂質, (1990) p149 Carbohydrate Research, 103 (1982) p213-219 ガングリオシド研究法I, (1995), p7-25 Nature Biotechnology, 21 (2003) p1470-1471 Nature Biotechnology, 22 (2004) p1351-1352
　本発明は、上記従来の課題を解決し、入手が容易であり且つ動物罹患性病原体の混入の恐れがない原料（安全性の高い原料）から、人体や環境に有害な試薬の使用を必須とせずに、シアル酸含有化合物を安価で且つ容易に抽出することを目的とする。
　本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、植物体、特に穀類及び豆類の種子、にシアル酸含有化合物が多量に存在することを見出した。
　そして本発明者は、前記植物体を、水、アルコールもしくは含水アルコールを含む水を用いて可溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から精製を行うことで、動物罹患性病原体の混入の恐れがないシアル酸含有化合物を、容易に抽出できることを見出した。
　本発明は、係る知見に基づいて完成されたものである。
　即ち、請求項１に係る本発明は、植物体もしくは植物体の加工品を、水、アルコール又は含水アルコールを用いて可溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、透析、塩析もしくはクロマトグラフィーカラムによって分離し回収することを特徴とする、シアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項２に係る本発明は、前記植物体が、穀類及び／又は豆類の種子である、請求項１に記載のシアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項３に係る本発明は、前記植物体もしくは植物体の加工品が、粉砕、磨砕、擂潰もしくは粉末化されたものである、請求項１又は２に記載のシアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項４に係る本発明は、前記可溶性成分を粗抽出する工程において超音波処理を行う、請求項１～３のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項５に係る本発明は、前記水が、水道水、脱イオン水、蒸留水、もしくは、塩，酸，アルカリ，糖類又はｐＨ緩衝剤を含む水である、請求項１～４のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項６に係る本発明は、前記アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、もしくは、グリセロールである、請求項１～５のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項７に係る本発明は、前記分離回収が、セロトニンアフィニティーカラム、レクチンアフィニティーカラム、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、もしくは、シリカゲルカラムによって行うものである、請求項１～６のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法を提供するものである。
　請求項８に係る本発明は、請求項１～７のいずれかに記載の抽出法から得られるシアル酸含有化合物を提供するものである。
　本発明は、原料が植物（特に穀類、豆類の種子）由来であり、製造工程において有害な化学薬品等（特にクロロホルム）を用いないため、動物罹患性病原体の混入の恐れがなく、安全性の高いシアル酸含有化合物を、提供することを可能とする。
　また、本発明は、原料の入手及び工程が容易であるため、シアル酸含有化合物を安価に提供することを可能とする。
　さらに、本発明は、規格外や廃棄される穀類や豆類、穀類の加工時に生じる廃棄物（米糠やフスマなど）、規格外の豆を有効に利用することを可能にする。
試験例１～３において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、大豆種子全粒の粉、小麦粉、玄米全粒の粉、又は玄米糊粉層部分の粉、からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例４において、抽出溶媒としてエチレングリコールを用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉又は米胚芽からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 図３の（ａ）は、試験例５において、抽出溶媒としてエチレングリコールもしくは水を用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、ヨウ素蒸気雰囲気下で全有機化合物の存在を検出した図であり、図３の（ｂ）は、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例６において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、玄米糊粉層部分の粉もしくは白米表層部分の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例７において、抽出溶媒として水、塩酸を含有する水もしくはエチレングリコールを用いて抽出した、小豆種子の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例８～１０において、玄米最外層部分、玄米糊粉層部分、白米表層部分、黒大豆種子の子葉又はトウモロコシの粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１１において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、米胚芽又は玄米糊粉層部分の粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 実施例１において、玄米糊粉層部分の粉からの水抽出物をセロトニンアフィニティーカラムにより分画した図である。 実施例２において、米胚芽からの水抽出物をセロトニンアフィニティーカラムにより分画した図である。 実施例３において、白米表層部分の粉からの水抽出物をセロトニンアフィニティーカラムにより分画した図である。 実施例３において、セロトニンアフィニティーカラムにより分画した画分を、薄層クロマトグラフィーで分離し、ヨウ素蒸気雰囲気下で全有機化合物の存在を検出した図（ａ）、および、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図（ｂ）である。 試験例１２において、抽出溶媒としてエチレングリコールを用いて抽出した、胚芽からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レクチン結合反応によりシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１３において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、玄米最外層部分を削り取った胚芽と糊粉層の残った米を炊飯したものからの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１４において、抽出溶媒としてグリセロールを用いて抽出した、小麦全粒粉または大麦全粒粉からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１５において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、小麦全粒粉、大麦全粒粉、小麦フスマ、大麦フスマ、米胚芽からの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１６において、抽出溶媒として水、もしくは１１．８３％酢酸、もしくは７．０６％塩酸を用いて抽出した、小麦小ブスマの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１７において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、小麦小ブスマの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 試験例１８において、抽出溶媒として水を用いて抽出した、米糠、小麦フスマ、大麦フスマからの粗抽出液を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レクチン結合反応によりシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。 実施例４において、米全粒の粉からのメタノール抽出物をゲル濾過カラムにより分画した図である。 実施例４において、ゲル濾過カラムにより分画した画分を、薄層クロマトグラフィーで分離し、レゾルシノール塩酸処理でシアル酸含有化合物の存在を検出した図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　植物（特に穀類、豆類の種子）由来の原料から、水やアルコールを用いて可溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から精製を行うことを特徴とする、シアル酸含有化合物の抽出法に関するものである。
＜シアル酸含有化合物＞
　本発明における「シアル酸含有化合物」とは、シアル酸を分子構造中に有する化合物を指す。シアル酸は、アミノ糖であるノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、２０種類以上の誘導体が存在するが、天然には、Ｎ-アセチルノイラミン酸およびＮ-グリコリルノイラミン酸として最も多量に存在する。下記の化学式（１）のＮ-アセチルノイラミン酸の構造が示すように、シアル酸は９個の炭素からなる骨格を有する九炭糖であり、官能基としてカルボキシル基やＮ-アシル基を有するという特徴がある。
　１９８６年に、５位のアミノアシル基が水酸基で置換された2-keto-3-deoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid（ＫＤＮ）が発見されたため、現在ではシアル酸の定義として、９炭糖骨格のαケト酸を持つ糖（２－ケト－３－デオキシノノン酸）が採用されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　シアル酸含有化合物に該当する分子種としては、‘シアル酸含有糖鎖’であるポリシアル酸糖鎖、‘前記糖鎖を含有するシアル酸含有糖タンパク質’であるフェチュイン、α１－酸性糖蛋白質及びムチン、‘シアル酸含有糖脂質’であるガングリオシド（スフィンゴ糖脂質）などが挙げられる。
　ここで、ポリシアル酸とは、シアル酸が数十個以上結合した糖鎖である。特にポリシアル酸は、神経細胞の移動や神経突起の伸長、シナプス形成の場で機能している巨大な神経特異的糖蛋白質である神経接着因子（ＮＣＡＭ）の糖鎖部分を構成している。
　また、ガングリオシドは、シアル酸を非還元末端側に有する糖脂質の総称であり、シアル酸の数と結合部位によって複数の種類がある。なお、後述する実施例から、本発明における植物由来のシアル酸含有化合物のほとんどは糖脂質と糖タンパク質であり、特に大部分が糖脂質であることが示唆されている。
　また、シアル酸は陰性荷電を有し、細胞接着、細胞分化などに関与し、特に神経細胞の分化、成長、維持に必須の物質である。
　なお、本発明においては、シアル酸含有化合物とは、シアル酸単体も含む概念である。
＜原料＞
　本発明におけるシアル酸含有化合物の抽出原料としては、植物体、すなわち植物の器官や組織であれば如何なるものでも用いることができるが、好ましくは、穀類及び／又は豆類の種子を用いることが望ましい。
　ここで「穀類」としては、イネ科植物のうち、食用となる澱粉質を含む種子をつける植物を指し、麦や稲だけでなく雑穀に分類される種類も含むものである。
　具体的には、イネ科に属する稲（イネ）、小麦（コムギ）、大麦（オオムギ）、ライ麦（ライムギ）、燕麦（エンバク、オーツ麦、カラス麦の栽培種）、ワイルドグラス、シコクビエ、キビ、ヒエ、アワ、ハトムギ、トウモロコシ、モロコシ（タカキビ、コウリャン、ソルガム）、トウジンビエ、テフ、フェニオ、コドラ（コードンビエ）、マコモ、などを挙げることができる。
　本発明では、これらの中でも、特に主要な穀類である「大麦」、「小麦」、「稲」、「トウモロコシ」を好適に用いることができる。また、小麦や大麦に近縁なライ麦、燕麦も好適に用いることができる。
　‘大麦’（オオムギ、barley）としては、Hordeum vulgareに属する植物であれば、如何なる品種、系統のものも用いることができる。例えば、二条大麦、六条大麦、裸大麦、皮大麦、などを挙げることができる。
　また、‘小麦’（コムギ、wheat）としては、コムギ属（Triticum）に属する植物であれば、如何なる種、品種、系統のものも用いることができる。例えば、T. aestivum（普通コムギ、パンコムギ）、T. compactum（クラブコムギ、密穂コムギ）、T. durum（デュラムコムギ、マカロニコムギ）、などを挙げることができる。
　また、‘稲’（イネ）としては、Oryza sativaに属する植物であれば、ジャポニカ品種とインディカ品種を含めて、如何なる品種、系統のものも用いることができる。例えば、一般良食米（コシヒカリ、ヒトメボレなど）、低アミロース米、高アミロース米、低グリテリン米、もち米、黒米、赤米、紫米、などを挙げることができる。
　また、‘トウモロコシ’（corn、maize）としては、Zea maysに属する植物であれば、如何なる品種、系統のものも用いることができる。例えば、スイートコーン（甘味種）、ポップコーン（ポップコーンの原料）、デントコーン（コーンスターチの原料）、フリントコーン、ワキシコーン、などを挙げることができる。
　また、「豆類」としては、豆科に属する食用の種類を挙げることができ、例えば、大豆、小豆、リョクトウ、インゲンマメ、エンドウマメ、ソラマメ、などを挙げることができるが、特には、大豆、小豆を好適に用いることができる。
　‘大豆’（ダイズ、Glycine max）としては、Glycine maxに属する植物であれば如何なる品種、系統のものも用いることができる。例えば、黒豆、赤豆、だだちゃ豆、青大豆、白大豆、雁食豆、ミヤギシロメ、大白、納豆小粒、などを挙げることができる。
　また、‘小豆’（アズキ）としては、Vigna angularisに属する植物であれば如何なる品種、系統のものも用いることができる。例えば、大納言、中納言、白小豆、黒小豆、などを挙げることができる。
　本発明の原料である穀類や豆類としては、植物体、すなわち植物の器官や組織であれば如何なるものでも用いることができるが、好ましくは、‘種子’を用いることが望ましい。
　また、種子に由来する組織であれば、いかなる組織や部分でも用いることができるが、例えば、胚、胚芽、胚乳、種皮、糠、糊粉層、澱粉貯蔵部、糊粉層、子葉などを用いることができる。また、種子全体（全粒）を用いることもできる。
　また、本発明の原料としては、加工品を用いることができる。例えば、小麦粉、大麦粉、米粉（玄米粉、白米粉など）、炊飯米、トウモロコシ粉、大豆粉、小豆粉、ココナッツパウダー、などを用いることができる。
　またさらには、廃棄対象となる、精米や精白過程で生じる糠（米糠、コムギフスマ、オオムギフスマ、胚芽など）、澱粉を抽出した残り粕、焼酎絞りかす、大豆製品粕（オカラなど）、規格外や余剰の収穫物、なども好適に用いることができる。
＜粗抽出工程＞
　本発明におけるシアル酸含有化合物の粗抽出は、次の方法により行うことができる。
　前記原料は、用いる種類、組織、加工状態によっては、そのまま抽出工程に用いることができるが、抽出効率の向上の点を鑑みると、細断や破砕などの処理、好ましくは粉砕、磨砕、擂潰、粉末化などの処理（特に好ましくは粉末化）、を行った後で抽出工程に用いることが望ましい。
　なお、これらの処理は、公知技術のどのような方法で行うことができる。例えば、穀類の種子を粉末化する場合は、粉砕機（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製、又はCyclone Sample Mill, UDY CORPORATION製）、ブラシ式精米機（HRG-122、みのる産業製）あるいは研削式精米機（Grain Testing Mill, SATAKE製）を用いて粉末化することができる。また、豆類を粉末化する場合は、粉砕機（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）を用いることができる。
　なお、精米過程で脱落する米胚芽や小麦粉、米粉などのような粉状の加工品は、粉砕等をせずに、そのまま粗抽出に用いることができる。
　本工程では、前記原料を溶媒に浸漬して粗抽出処理を行う。当該粗抽出処理に用いる溶媒としては、水、アルコール、含水アルコールであれば、如何なるものでも用いることができる。
　本工程で抽出できるシアル酸含有化合物は、これらの溶媒に可溶性（特に水溶性）のものであれば、如何なる分子種のものでも抽出することが可能である。また、水溶性の性質が弱いものやｐＨ変化で溶解性が変化するものであっても、塩、酸、アルカリ、糖類、ｐＨ緩衝剤、を水に含有させることで、溶解性が向上し抽出できるものもある。
　本工程においては、溶媒として単に「水」を用いるだけで、前記原料からシアル酸含有化合物を得ることが可能である。
　ここで、水としては、水道水、蒸留水、脱イオン水、硬度の高い水、など如何なる水を用いることもできる。
　また、‘塩’としては、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどを挙げることができる。塩を含有させることによって、有効成分の溶解性を向上させ、抽出効率を向上させることができる。
　また、‘酸’としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸などを挙げることができ、好ましくは、塩酸、酢酸を好適に用いることができる。なお、酸を含有させることによって、シアル酸含有化合物を低分子化させ、溶出効率を向上させることができる。また、２５～４０℃の温度範囲での長時間の浸漬中の雑菌繁殖を抑制できる効果がある。
　また、‘アルカリ’としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニアなどを挙げることができ、好ましくは、水酸化マグネシウム、アンモニアを好適に用いることができる。２５～４０℃の温度範囲での長時間の浸漬中の雑菌繁殖を抑制できる効果がある。
　また、‘糖類’としては、ソルビトール、グルコース、ショ糖、トレハロース、キシリトールなどを挙げることができる。
　本工程において、水に含有させる塩、酸、アルカリ、糖類、ｐＨ緩衝剤などの濃度は、用いる物質によって様々であるが、例えば、塩化ナトリウムを用いた場合では、０．１～５％（ｗ／ｖ）を含有させることが望ましい。また、塩酸を用いた場合では、０．５～１２％（ｖ／ｖ）、好ましくは１％（ｖ／ｖ）～７％（ｖ／ｖ）程度（０．２８Ｎ～２Ｎ程度）を含有させることが望ましい。また、酢酸を用いた場合では、０．５～１２％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．７％（ｖ／ｖ）～１２％（ｖ／ｖ）程度（０．２８Ｎ～２Ｎ程度）を含有させることが望ましい。
　また、本工程に用いる溶媒としては、「含水アルコール」や「（１００％）アルコール」を用いることができる。なお、含水アルコールに混合する水は、通常の水（水道水、蒸留水、脱イオン水、など）を用いるものであるが、上記塩、酸、アルカリ、糖類、ｐＨ緩衝剤、などを含有する水を用いることができる。
　ここで、アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノールなどのモノアルコール類（一価のアルコール）、；エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、などのグリコール類（二価のアルコール）、；グリセリン、ポリグリセリンなどのグリセリン類（三価のアルコール）、を挙げることができる。
　本発明に用いるアルコールとしては、上記のうち、モノアルコール類であるメタノール、エタノール、イソプロパノール（さらに特には、極性の高い炭素数の少ない低級アルコール類であるメタノール、エタノール）を用いることが望ましいが、摂取上の安全性を鑑みると、特にエタノールを用いることが望ましい。
　また、グリコール類であるエチレングリコール、グリセリン類であるグリセリンも好適に用いることができる。
　本粗抽出工程に用いる溶媒において、水に対するアルコールの濃度は、用いるアルコールによって様々であるが、例えば、エタノールを用いる場合では、５％（ｖ／ｖ）～１００％（ｖ／ｖ：含水率０％）、好ましくは５％（ｖ／ｖ）～５０％（ｖ／ｖ）を含有させることが望ましい。
　また、エチレングリコールを用いる場合では、２０％（ｖ／ｖ）～１００％（ｖ／ｖ：含水率０％）、好ましくは５０％（ｖ／ｖ）～１００％（ｖ／ｖ：含水率０％）を含有させることが望ましい。
　当該所定のアルコール濃度の溶媒を用いることによって、抽出効率が向上や夾雑物の減少効果が期待される。
　本粗抽出工程では、前記原料１質量部に対して、１～１０質量部、好ましくは３～５質量部の前記溶媒を注加して浸漬することで、有効成分の抽出を行うことができる。また、さらには超音波処理、などを行うことで、原料をより微細な状態に破砕することができ、抽出効率を向上させることもできる。例えば、超音波処理としては、従来の行われている如何なる方法でも行うことができるが、例えば、B-42J Ultrasonic Cleaner（BRANSON製）を用いることができる。
　その後、１～８０℃、好ましくは５～４０℃の温度で、１分～２４時間、好ましくは５分～１２時間の粗抽出処理を行う。
　なお、抽出効率を向上させたい場合は、少なくとも１時間以上行うことが望ましい。また、有効成分の酵素代謝による変化を防ぎたい場合は、１０℃以下の温度で（特には５分～４時間）の粗抽出処理を行うことが望ましい。
　また、逆に、シアル酸含有化合物を低分子化、断片化させて（易溶性を向上させて）抽出効率を向上させるためには、室温程度（例えば２０～３５℃程度）で４時間以上、好ましくは１２時間以上、さらに好ましくは２４時間以上の粗抽出処理を行うことで、原料である植物体に含まれる内在性酵素を働かせることができる。
　また、（特に、内在性酵素が失活した植物体加工品を原料に用いる場合には）、濃度の高い酸（例えば、２Ｎ程度塩酸や酢酸）を含む水において、４０～８０℃程度、好ましくは８０℃程度で粗抽出処理を行うことで、低分子化、断片化させることができる。
　当該粗抽出処理においては、混合、攪拌、振盪、加圧などを行うことによって、溶出効率を向上することができる。（なお、特に抽出溶媒がアルコールの場合は、単純な攪拌混合だけでも十分な抽出が可能な場合がある。）
　また、粗抽出処理後は、濾過、遠心分離、自然沈降などを行って、原料の残渣や不純物を除去することが望ましい。
　また、抽出溶媒として、水（もしくは塩、酸、アルカリ、糖類、ｐＨ緩衝剤を含む水）を用いた場合、当該粗抽出液に、適量（例えば０．５～５倍量）のエタノールを注加することで、核酸、多糖類などの高分子夾雑物を沈殿させて除去することができる。
＜精製工程＞
　上記工程で得られた粗抽出液は、精製を行うことによって、シアル酸含有化合物の含有率を高めることができる。具体的には、透析、塩析、もしくはクロマトグラフィーカラムによって、シアル酸含有化合物を多く含む画分を分離し、回収することで行うことができる。
　本工程において、‘透析’としては、電気透析法、単純透析、などによって行うことができる。
　また、‘塩析’としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、などによって行うことができる。
　また、‘クロマトグラフィーカラム’としては、アフィニティーカラム（セロトニンアフィニティーカラム、レクチンアフィニティーカラム、ヘパリンカラム、抗体カラム、など）、イオン交換カラム（４級アンモニウム基結合担体カラム、ジエチルアミノエチル基結合担体カラム、など）、ゲル濾過カラム（架橋アガロースゲルカラム、架橋デキストランゲルカラム、など）、吸着樹脂カラム（多孔性吸着樹脂カラム、活性炭カラムなど）、シリカゲルカラム、修飾基付きシリカゲルカラム、固相などによって行うことができる。
　また、カラム形態も、高速クロマトグラフィーに用いられるような形態だけでなく、固相カートリッジのような使い捨てカラムでも問題なく用いることができる。
　これらのうち、アフィニティーカラムやゲル濾過カラム（特にはアフィニティーカラム）が含有率の向上の点で好適である。また、工業的な実用の観点を踏まえると、吸着樹脂カラム、シリカゲルカラム、透析法、などを挙げることができる。
　特に、‘アフィニティーカラム’としては、シアル酸含有化合物と強い特異的親和性を示すカラム担体を充填したものが好ましく、特にセロトニンアフィニティーカラムやレクチンアフィニティーカラム、（最も好適にはセロトニンアフィニティーカラム）が好適である。
　具体的には、セロトニンアフィニティー担体（LAS-Serotonin担体、Ｊ－オイルミルズ製）を用いることができる。もしくは、セロトニンをリガンドとして適当な市販の担体（Pharmacia製Sephadexなど）に化学的にリガンドカップリングさせたセロトニンアフィニティー担体を作成し用いることができる。
　なお、シアル酸との結合性を有する担体として、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）担体を挙げることができるが、ＣｏｎＡ担体は、マンノースとの親和性を利用して、マンノースを含むシアル酸糖鎖を回収するものであるため、本工程のカラム担体として用いるにはあまり好適ではない。
　また、‘ゲル濾過カラム’としては、アガロースゲル、架橋アガロースゲル、アクリルアミド系ポリマーゲル、その他市販されている一般的なゲルを用いることができる。
　これらの精製方法は、組み合わせて行うことで、さらにシアル酸含有化合物の純度を高めることができる。また、得られた精製物から、さらにＨＰＬＣでシアル酸含有化合物を含むピークを分取することで、さらに精製物の純度を高めたり、純品を単離することができる。
　なお、上記精製を経て回収したシアル酸含有化合物を高含有する溶出画分（精製物）は、溶出溶媒等を揮発、透析除去、濃縮乾固等して、用いることが望ましい。
　上記精製工程を経て回収したシアル酸含有化合物の回収量は、例えば、原料として穀類又は豆類の種子を３ｇ用いて水抽出し、セロトニンアフィニティーカラムで精製した場合、２．５～４．５ｍｇ程度が抽出できる。また、当該精製をすることによって、夾雑物の含有量は、ヨウ素蒸気雰囲気下で検出する全有機化合物量の検出限界以下にすることができる。
＜用途＞
　シアル酸含有化合物は、神経細胞の分化、成長、維持に必須の物質であり、アルツハイマー病、認知症、脊髄損傷などの中枢神経障害、；糖尿病性神経障害、末梢神経疾患に付随する運動障害および知覚障害、；に有効な治療や予防効果を有する有効成分となることが期待できる。また、前記疾患以外にも、記憶改善作用が期待できる。
　さらに当該化合物は、免疫活性化作用、抗癌作用を有することも知られている。
　従って、上記工程を経て得た植物由来のシアル酸含有化合物（精製物）は、各種原料に混合することで、薬剤、機能性飲食品、機能性化粧品等とすることができる。
　なお、本発明における有効成分である当該抽出物は、植物（特に穀類、豆類の種子）由来であるため、投与や摂取の上で安全性に優れたものである。
　薬剤の形態としては、例えば経口投与の場合、粉末状、細粒状、顆粒状、などとすることができ、カプセルに充填する形態の他、水に分散した溶液の形態、賦形剤等と混和して得られる錠剤の形態とすることもできる。
　また、経皮投与の場合、クリーム状、ジェル状、シール状、有効成分を含んだ支持体を固定する形状、などの形態にすることができる。
　また、機能性飲食品（特定保健用食品、栄養機能性食品、健康食品）としては、種々の食品、例えばハム、ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、パン、バター、粉乳、菓子などに添加して使用したり、水、酒類、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲物に添加して使用してもよい。
　また、機能性化粧品としては、例えば、化粧品に適した形態、例えば、クリーム状、ジェル状、化粧水、整髪料、などに添加し、当該化合物を経皮摂取の適した形態にすることができる。
　以下に本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
＜試験例１＞（大豆種子の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　大豆種子（サチユタカ）全粒を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製、メッシュ径は0.5mmもしくは1mm）によって粉砕することで得た大豆粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１－１）。この混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１に示す。
＜試験例２＞（玄米全粒および玄米糊粉層部分の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　玄米（コシヒカリ）全粒を粉砕器（Cyclone Sample Mill, UDY Corporation製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料２－２）。
　また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Satake Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料２－５）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１に示す。
＜試験例３＞（小麦粉の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　小麦粉（農林６１号）３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料３－３）。小麦粉（Western White）３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料３－４）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１に示す。
　なお、図１において、レーン１は大豆種子（サチユタカ）全粒の粉（試料１－１）、レーン２は玄米（コシヒカリ）全粒の粉（試料２－２）、レーン３は小麦粉（農林６１号）（試料３－３）、レーン４は小麦粉（Western White）（試料３－４）、レーン５は玄米（コシヒカリ）糊粉層部分の粉（試料２－５）から、抽出溶媒として水を用いて上記工程より得られた粗抽出液を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
〔試験例１～３の結果〕
　その結果、図１が示すように、大豆種子全粒の粉（試料１－１）（レーン１）、玄米全粒の粉（試料２－２）（レーン２）、小麦粉（試料３－３，３－４）（レーン３，４）、玄米糊粉層部分の粉（試料２－５）（レーン５）を原料とし、上記工程より、抽出溶媒として水を用いて得られた粗抽出液には、シアル酸含有化合物が含まれることが明らかになった。また、これらの中でも、大豆種子全粒の粉（試料１－１）（レーン１）と玄米糊粉層部分の粉（試料２－５）（レーン５）に、上記方法で抽出可能なシアル酸含有化合物が、特に多く含まれることが示された。
　この結果から、大豆、米及び小麦の種子に由来する粉末から、有害な有機溶媒を使用することなく、抽出溶媒として水を用いることで、シアル酸含有化合物を含有する粗抽出液が得られることが明らかになった。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料１－３，１－４（レーン３，４）における原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜試験例４＞（エチレングリコールを用いた粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, SATAKE製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料４－７）。また、米胚芽（コシヒカリ）３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料４－８）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図２に示す。
　なお、図２において、レーン１はＮ－アセチルノイラミン酸標品（シアル酸含有）（N-Acetylneuraminic acid Type IV-S, Sigma製）、レーン２はガングリオシドＧD1a標品（シアル酸含有）（Disialoganglioside-ＧD1a, Sigma製）、レーン３はガングリオシドＧT1b標品（シアル酸含有）（Trisialoganglioside-ＧT1b, Sigma製）、レーン４はホスファチジルセリン標品（Phosphatidylserine from beef brain, SERDANY Research Laboratories製）、レーン５はホスファチジルエタノールアミン標品（L-α-Phosphatidylethanolamine from plant, AVANTI Polar－Lipids製）、レーン６はリゾホスファチジルコリン標品（L-α-Lysophosphatidylcholine from soybean, Sigma製）をシリカゲルプレート上で展開したものである。
　レーン７は玄米（コシヒカリ）糊粉層部分の粉（試料４－７）、レーン８は米胚芽（コシヒカリ）（試料４－８）から、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用いて上記工程より得られた粗抽出液を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図２が示すように、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、玄米糊粉層部分の粉（試料４－７）（レーン７）又は米胚芽（試料４－８）（レーン８）を原料とし、上記工程より得られた粗抽出液にも、シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
　また、米胚芽部分（試料４－８）（レーン８）にも、玄米糊粉層部分（試料４－７）（レーン７）と同程度に多量のシアル酸含有化合物を含むことが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜試験例５＞（エチレングリコールによる抽出への影響）
　玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Satake Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料５－１）。また、前記玄米糊粉層部分の粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料５－２）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離した。
　展開したシリカゲルプレートは、ヨウ素蒸気雰囲気下に室温にて７２時間静置することで、全有機化合物の検出を行った。続いて、ヨウ素蒸気雰囲気から取り出したシリカゲルプレートを２４時間静置し、充分にヨウ素を脱着させたのち、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図３に示す。なお、図３において、検出された全有機化合物を（ａ）に、検出されたシアル酸含有化合物を（ｂ）に示す。
　なお、図３において、レーン１は玄米糊粉層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料５－１）、レーン２は玄米糊粉層部分の粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料５－２）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図３の（ａ）と（ｂ）の比較が示すように、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用いて抽出する（試料５－２）（レーン２）ことで、玄米糊粉層部分の粉から、抽出溶媒として水を用いて抽出する（試料５－１）（レーン１）よりも、夾雑物混入の少ないシアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜試験例６＞（エタノール沈殿処理の抽出への影響）
　玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料６－１～６－３）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると白米表層部分に相当する９１～８６質量％部分（削り取って回収した白米表層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料６－４～６－６）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　上記工程により、玄米糊粉層部分の粉又は白米表層部分の粉から得られた、「エタノール注加後の遠心上清」を試料６－１，６－４、「エタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液」を試料６－２，６－５、「最初の水粗抽出後の遠心沈殿の水再溶解液」を試料６－３，６－６とし、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図４に示す。
　なお、図４において、レーン１は玄米糊粉層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心上清（試料６－１）、レーン２は玄米糊粉層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６－２）、レーン３は玄米糊粉層部分の粉から得られた最初の水粗抽出後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６－３）、レーン４は白米表層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心上清（試料６－４）、レーン５は白米表層部分の粉から得られたエタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６－５）、レーン６は白米表層部分の粉から得られた最初の水粗抽出後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６－６）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　また、レーン７はガングリオシドＧD1a標品（シアル酸含）（Disialoganglioside-ＧD1a, Sigma製）、レーン８はガングリオシドＧT1b標品（シアル酸含）（Trisialoganglioside-ＧT1b, Sigma製）、レーン９はＮ－アセチルノイラミン酸標品（シアル酸含）（N-Acetylneuraminic acid Type IV-S, Sigma製）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図４が示すように、玄米糊粉層部分の粉又は白米表層部分から、上記の抽出方法により得られたエタノール注加後の遠心上清（粗抽出液）（試料６－１，６－４）（レーン１，４）には、シアル酸含有化合物が特に多量に含まれることが示された。
　また、原料に玄米糊粉層部分の粉を用いた場合、エタノール注加後の遠心沈殿の水再溶解液（試料６－２）（レーン２）にも、シアル酸含有化合物が多量に含まれることが示された。
　なお、玄米糊粉層部分の粉又は白米表層部分から、最初の水粗抽出後の遠心沈殿（残渣）の水再溶解液（試料６－３，６－６）（レーン３，６）には、シアル酸含有化合物がほとんど存在しないことから、最初の水粗抽出において、シアル酸含有化合物のほとんどが粗抽出液中に抽出されていたことが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料６－１，６－４（レーン１，４）における原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜試験例７＞（各種溶媒を用いた粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　小豆種子を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料７－１，７－４，７－７）。また、前記小豆種子の粉３ｇに、１％（ｖ／ｖ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した（試料７－２，７－５，７－８）。また、前記小豆種子の粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料７－３，７－６，７－９）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃（試料７－７～７－９）、２５℃（試料７－４～７－６）もしくは３７℃（試料７－１～７－３）で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図５に示す。
　なお、図５において、レーン１は小豆種子の粉から抽出溶媒として３７℃の水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－１）、レーン２は小豆種子の粉から抽出溶媒として３７℃の１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－２）、レーン３は小豆種子の粉から抽出溶媒として３７℃の１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－３）、レーン４は小豆種子の粉から抽出溶媒として２５℃の水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－４）、レーン５は小豆種子の粉から抽出溶媒として２５℃の１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－５）、レーン６は小豆種子の粉から抽出溶媒として２５℃の１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－６）、レーン７は小豆種子の粉から抽出溶媒として１０℃の水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－７）、レーン８は小豆種子の粉から抽出溶媒として１０℃の１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－８）、レーン９は小豆種子の粉から抽出溶媒として１０℃の１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料７－９）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図５が示すように、抽出溶媒として水、１％（ｖ／ｖ）塩酸、１００％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを用いて、１０、２５、３７℃の温度で抽出することで、小豆種子の粉からもシアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜試験例８＞（玄米各層の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, SATAKE製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると最外層部分に相当する１００～９６質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米最外層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料８－１）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, SATAKE製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料８－２）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, SATAKE製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると白米表層部分に相当する９１～８６質量％の範囲の部分（削り取って回収した白米表層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料８－３）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図６に示す。
＜試験例９＞（黒大豆脱皮種子子葉部分の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　黒大豆脱皮種子の子葉部分を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料９－４）。また、前記黒大豆脱皮種子の子葉部分の粉３ｇに、１％（ｖ／ｖ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した（試料９－５）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図６に示す。
＜試験例１０＞（トウモロコシ種子の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　トウモロコシ種子（ポップコーン種子）を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１０－６）。また、前記トウモロコシ種子（ポップコーン種子）の粉３ｇに、１％（ｖ／ｖ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１０－７）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図６に示す。
　なお、図６において、レーン１は玄米最外層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料８－１）、レーン２は玄米糊粉層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料８－２）、レーン３は白米表層部分の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料８－３）、レーン４は黒大豆種子の子葉の粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料９－４）、レーン５は黒大豆種子の子葉の粉から抽出溶媒として１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料９－５）、レーン６はトウモロコシ種子から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１０－６）、レーン７はトウモロコシ種子から抽出溶媒として１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１０－７）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　また、レーン８はガングリオシドＧD1a標品（シアル酸含）（Disialoganglioside-ＧD1a, Sigma製）、レーン９はガングリオシドＧT1b標品（シアル酸含）（Trisialoganglioside-ＧT1b, Sigma製）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
〔試験例８～１０の結果〕
　その結果、図６が示すように、玄米最外層部分の粉から、抽出溶媒として水を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料８－１）（レーン１）にも、玄米糊粉層部分の粉もしくは白米表層部分の粉から、抽出溶媒として水を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料８－２，８－３）（レーン２，３）と同程度に多量のシアル酸含有化合物が含まれることが示された。
　また、黒大豆子葉の粉から、抽出溶媒として水もしくは１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料９－４，９－５）（レーン４，５）にも、玄米糊粉層部分の粉もしくは白米表層部分の粉から、抽出溶媒として水を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料８－２，８－３）（レーン２，３）と同程度に多量のシアル酸含有化合物が含まれることが示された。
　また、トウモロコシの粉から、抽出溶媒として水もしくは１％（ｖ／ｖ）塩酸を用い上記工程より得られた粗抽出液（試料１０－６，１０－７）（レーン６，７）においても、シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜試験例１１＞（抽出時間の抽出への影響）
　米胚芽（コシヒカリ）３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１１－１，１１－２，１１－５，１１－６）。また、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１１－３，１１－４，１１－７，１１－８）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で２．５時間（試料１１－１～１１－４）もしくは１２時間（試料１１－５～１１－８）静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　上記工程により、米胚芽又は玄米糊粉層部分の粉から得られた、「エタノール注加後の遠心上清」を試料１１－２，１１－４，１１－６，１１－８とし、最初の「水粗抽出後の遠心上清」を試料１１－１，１１－３，１１－５，１１－７として、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図７に示す。
　なお、図７において、レーン１は米胚芽から、２．５時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１－１）、レーン２は米胚芽から、２．５時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１－２）、レーン３は玄米糊粉層部分の粉から、２．５時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１－３）、レーン４は玄米糊粉層部分の粉から、２．５時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１－４）、レーン５は米胚芽から、１０時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１－５）、レーン６は米胚芽から、１０時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１－６）、レーン７は玄米糊粉層部分の粉から、１０時間の水抽出を行った後の遠心上清（試料１１－７）、レーン８は玄米糊粉層部分の粉から、１０時間の水抽出を行い、上記工程により得られたエタノール注加後の遠心上清（試料１１－８）、を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図７が示すように、米胚芽又は玄米糊粉層部分の粉から、１０℃で２．５～１０時間の水抽出により得られた粗抽出液には、シアル酸含有化合物が多量に含まれることが示された。また、水抽出を１０時間行った場合（試料１１－５～１１－８）（レーン５～８）、２．５時間行った場合（試料１１－１～１１－４）（レーン１～４）よりも抽出できるシアル酸含有化合物の量が増えることが示された。
　なお、水抽出後の遠心上清（試料１１－１，１１－３，１１－５，１１－７）（レーン１，３，５，７）とエタノール注加後の遠心上清（試料１１－２，１１－４，１１－６，１１－８）（レーン２，４，６，８）とでは、シアル酸含有化合物の抽出量に、大きな差は認められなかった。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料１１－３，１１－４，１１－７（レーン３，４，７）における、原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜実施例１＞（玄米糊粉層部分からの水抽出およびアフィニティーカラム精製）
〔セロトニンアフィニティーカラム精製〕
　試験例２と同様に、玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると糊粉層部分に相当する９６～９１質量％の範囲の部分（削り取って回収した玄米糊粉層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
　この混合物に超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した抽出上清に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液１ｍＬを、セロトニンアフィニティー担体LAS-Serotonin担体、Ｊ－オイルミルズ製）を充填した直径４ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（LAS-Serotonin、Ｊ－オイルミルズ製）にアプライし分画した。クロマトグラフィーの条件としては、流速0.2ｍＬ／分で、純水送液を９０分間行い（区間１）非吸着成分の除去を行った後、次いで４ｍＭから３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液の送液を直線勾配条件で１５０分間行い（区間２）担体から解離したシアル酸含有化合物を回収した。なお、最後に純水の送液を９０分間行いカラムの再生処理を行った（区間３）。
　シアル酸含有化合物の検出は、セロトニンアフィニティー担体から溶出した化合物の量をOD280nmの吸光度で測定することにより行った。結果を図８に示す。
　また、このセロトニンアフィニティーカラムによる分画を２回行い（前記粗抽出液１ｍＬずつを２回）、２回分のシアル酸含有化合物が溶出した画分（区間２）を凍結乾燥機（Freezdryer FD-1, EYELA製）を用いて凍結乾燥し、重量を測定した。
　その結果、図８が示すように、純水のカラムへの送液によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出した後（区間１）、４ｍＭから３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液することで、セロトニンアフィニティー担体から解離したシアル酸含有化合物が溶出した画分（区間２）が回収できることが示された。また、区間２の中でも、溶出開始（区間１の最初）から１３０～１６０分後付近の画分に、特に多量のシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
　また、前記粗抽出液２ｍＬ（１ｍＬずつを２回）をセロトニンアフィニティーカラムで分画した画分（区間２）から０．５ｍｇの乾燥固形物が得られることから、原料の玄米糊粉層部分の粉３ｇ（上記工程を経ることで玄米糊粉層部分の粉３ｇから前記粗抽出液２０ｍＬが得られる）からは、５ｍｇのシアル酸含有化合物の乾燥固形物が得られことが示された。
＜実施例２＞（米胚芽からの水抽出および精製）
〔セロトニンアフィニティーカラム精製〕
　米胚芽（コシヒカリ）３ｇに水１５ｍＬを加え、よく混合した。この混合物に超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液０．１ｍＬを、セロトニンアフィニティー担体（LAS-Serotonin担体、Ｊ－オイルミルズ製）を充填した直径4mm、長さ5cmのカラム（LAS-Serotonin、Ｊ－オイルミルズ製）にアプライし分画した。クロマトグラフィーの条件としては、流速0.2mL／分で、純水送液を２８５分間行い非吸着成分の除去を行った後、シアル酸含有化合物とセロトニンアフィニティー担体との相互作用を確実なものにするため１２時間送液を停止した。その後、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液の送液を２８５分間行い担体から解離したシアル酸含有化合物を回収した。（なお、本実施例ではカラム再生処理は省略した。）
　シアル酸含有化合物の検出は、セロトニンアフィニティー担体から溶出した化合物の量をOD280nmの吸光度で測定することにより行った。結果を図９に示す。
　なお、図９において、純水送液時のOD280nmの吸光度の変化を（ａ）に、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液の送液時のOD280nmの吸光度の変化を（ｂ）に示す。
　その結果、図９が示すように、純水のカラムへの送液（ａ）によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出し１２時間送液を停止した後、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液をカラムへ送液（ｂ）することで、セロトニンアフィニティー担体から解離したシアル酸含有化合物が溶出した画分が回収できることが示された。また、３０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液のカラムへの送液開始から、３０～８０分後付近の画分に、特に多量のシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
＜実施例３＞（白米表層部分からの水抽出および精製）
〔セロトニンアフィニティーカラム精製〕
　玄米（コシヒカリ）を研削式精米機（Grain Testing Mill, Satake製）で外側から順次研削し、玄米を１００質量％とすると白米表層部分に相当する９１～８６質量％の範囲の部分（削り取って回収した白米表層部分）由来の粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
　この混合物に超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液２ｍＬを、セロトニンアフィニティー担体（LAS-Serotonin担体、Ｊ－オイルミルズ製）を充填し、担体の充填サイズが高さ4.6cmになった直径26mm、長さ20cmのカラム（XK26/20、Pharmacia Bioteck製）にアプライし分画した。クロマトグラフィーの条件としては、流速0.2mL／分で、純水送液を３００分間行い、非吸着成分の除去を行った（区間１）後、次いで０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液の送液を直線勾配条件で２４０分間行い、担体から解離したシアル酸含有化合物を回収した（区間２）。なお、その後、１Ｍ酢酸アンモニウム溶液の送液を１８０分間行うことでカラム洗浄（カラム吸着成分の除去）（区間３）を行い、最後に１Ｍ酢酸アンモニウム溶液から純水への直線逆勾配での送液を６０分、純水の送液を１８０分間行いカラムの再生処理（区間４）を行った。
　シアル酸含有化合物の検出は、セロトニンアフィニティー担体から溶出した化合物の量をOD280nmの吸光度で測定することにより行った。結果を図１０に示す。
　図１０はセロトニンアフィニティーカラムを通過した溶液のOD280nmの吸光度の経時変化を示したものである。
　また、このセロトニンアフィニティーカラムによる分画は２回行い（前記粗抽出液２ｍＬずつを２回）、２回分の上記の０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液した部分（区間２）に相当する画分を集め、凍結乾燥機（Freezdryer FD-1, EYELA製）を用いて凍結乾燥し、重量を測定した。
　その結果、図１０が示すように、純水のカラムへの送液によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出した（区間１：０～３００分）後、０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液すること（区間２：３００～５４０分）により、セロトニンアフィニティー担体から解離したシアル酸含有化合物が溶出した画分が回収できることが示された。また、カラム洗浄のために１Ｍ酢酸アンモニウム溶液の送液した画分（区間３：５４０～７２０分）においても、６６０分後付近までの画分には、セロトニンアフィニティー担体から解離したシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
　また、区間２及び区間３の中でも、特に、４３０分後付近の画分（区間２での酢酸アンモニウム溶液のカラムへの送液開始から１３０分後付近の画分）をピークに、多量のシアル酸含有化合物が溶出されることが示された。
　なお、区間２と区間３において、シアル酸含有化合物の溶出ピークがブロードになっているのは、本実施例で用いたカラムの体積（実施例１，２の４０倍の体積のものを使用）に対して、送液の流速が遅いために、溶出ピークが拡散しているものと考えられる。
　また、前記粗抽出液４ｍＬ（２ｍＬずつを２回）をセロトニンアフィニティーカラムで分画した画分（区間２）から０．５～０．９ｍｇの乾燥固形物が得られることから、原料の白米表層部分の粉３ｇ（上記工程を経ることで白米表層部分の粉３ｇから前記粗抽出液２０ｍＬが得られる）からは、２．５～４．５ｍｇのシアル酸含有化合物の乾燥固形物が得られことが示された。
〔レゾルシノール塩酸検出〕
　次いで、上記精製工程を経てセロトニンアフィニティーカラムを通過した溶液は、１０分ごとに一つの画分（フラクション）として９６個に分画回収し、凍結乾燥した。
　これらのうち、前記の区間１～４の代表的な画分を再度純水に溶解し、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離した。
　展開したシリカゲルプレートは、ヨウ素蒸気雰囲気下に室温にて７２時間静置することで、全有機化合物の検出を行った。続いて、ヨウ素蒸気雰囲気から取り出したシリカゲルプレートを２４時間静置し、充分にヨウ素を脱着させたのち、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１１に示す。図１１において、前記の区間１～４の代表的な画分を薄層クロマトグラフィーで分離し、検出された全有機化合物を（ａ）に、検出されたシアル酸含有化合物を（ｂ）に示したものである。
　なお、図１１において、レーン１は１１０分から１２０分に溶出した画分１２（試料ア）、レーン２は４３０分から４４０分に溶出した画分４４（試料イ）、レーン３は４７０分から４８０分に溶出した画分４８（試料ウ）、レーン４は５３０分から５４０分に溶出した画分５４（試料エ）、レーン５は７９０分から８００分に溶出した画分８０（試料オ）、レーン６は８８０分から８９０分に溶出した画分８９（試料カ）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１１の（ｂ）が示すように、４３０分から４４０分に溶出した画分４４（試料イ）（レーン２）、４７０分から４８０分に溶出した画分４８（試料ウ）（レーン３）、及び５３０分から５４０分に溶出した画分５４（試料エ）（レーン４）には、シアル酸含有化合物が含まれることが示された。
　また、７９０分から８００分に溶出した画分８０（試料オ）（レーン５）、８８０分から８９０分に溶出した画分８９（試料カ）（レーン６）には、シアル酸含有化合物が含まれないことが示された。
　この結果から、図１０で示した０Ｍから１Ｍ酢酸アンモニウム溶液を直線勾配条件でカラムへ送液した部分である区間２のピークを含む画分には、シアル酸含有化合物が含まれることが示され、カラムの再生過程である区間４に見られる低いピークには、シアル酸含有化合物が含まれないことが示された。
　また、図１１の（ａ）と（ｂ）の比較の結果が示すように、４３０分から４４０分に溶出した画分４４（試料イ）（レーン２）、４７０分から４８０分に溶出した画分４８（試料ウ）（レーン３）、及び５３０分から５４０分に溶出した画分５４（試料エ）（レーン４）からは、‘夾雑物混入が極めて少ない（夾雑物の含有量が、ヨウ素蒸気雰囲気下で検出する全有機化合物量の検出限界以下である）’シアル酸含有化合物が回収できることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
〔考察〕
　これらの結果から、米に由来する粉末から、有害な有機溶媒を使用することなく、水抽出のみを行い、セロトニンアフィニティーカラムで精製することによって、夾雑成分の極めて少なく且つシアル酸含有化合物を高含有する画分が得られることが明らかになった。
　なお、純水のカラムへの送液によってカラムからセロトニンアフィニティー担体非吸着成分を排出した区間１のピークである、１１０分から１２０分に溶出した画分１２（試料ア）（レーン１）には、シアル酸含有化合物が多量に含まれることが示された。これは、使用したセロトニンアフィニティーカラムの担体が有するシアル酸含有化合物吸着能力を大幅に超える量のシアル酸含有化合物が、カラムにアプライした試料液に含まれているからと思われる。
　従って、充分なシアル酸含有化合物吸着能力を有する、さらに大規模なカラム、例えばセロトニンアフィニティー担体の体積が１０リットル程度以上の工業用カラムを用いれば、さらに効率よくシアル酸含有化合物を、分離、回収することが期待される。
＜試験例１２＞（レクチンブロットによるシアル酸含有化合物の検出確認）
　米胚芽（コシヒカリ）３ｇに、エチレングリコール１５ｍＬを加え、よく混合した。
　この混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した（試料１２）。
　上記工程により得られた「米胚芽－エチレングリコール抽出液の遠心上清」（試料１２）を、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）、もしくは、CH3Cl／CH3OH／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）によって展開することで成分ごとに分離したのち、冷風乾燥した。
　このシリカゲルプレートをポリ（イソブチルメタクリレート）のｎ－ヘキサン／CH3Cl＝９／１（Ｖ／Ｖ）溶液（濃度２ｇ／５００ｍＬ）に３０秒間浸漬し、冷風乾燥した。
　次いで、このポリ（イソブチルメタクリレート）処理をしたシリカゲルプレートを、プラスチック容器中でTRITIC蛍光標識ＭＡＡレクチン（E. Y. Labolatory製）の0.15Ｍ塩化ナトリウム－１％ＢＳＡ入り0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝7.2～7.4）で１００倍希釈した溶液、もしくは、TRITIC蛍光標識ＳＮＡ－Ｉレクチン（E. Y. Labolatory製）を0.15Ｍ塩化ナトリウム－１％ＢＳＡ入り0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝7.2～7.4）で１００倍希釈した溶液に浸漬し、室温にて４８時間振盪して、レクチン結合反応を行った。
　なお、‘ＭＡＡレクチン’は、「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造に特異的に結合するレクチンであり、‘ＳＮＡ－Ｉレクチン’は、「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→６）Ｇａｌ」もしくは「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→６）ＧａｌＮＡｃ」構造に特異的に結合するレクチンである。
　レクチン結合反応終了後、ポリ（イソブチルメタクリレート）処理シリカゲルプレートに対し洗浄操作をおこない、目的物に結合していない蛍光レクチンを洗浄除去したのち、蛍光の観察される部分、すなわちシアル酸に特異的に結合するレクチンの存在部位を観察することで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を、検出条件の組合せの違いごとに、図１２（Ａ）～（Ｄ）に示す。
　なお、図１２において、（Ａ）は、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにTRITIC蛍光標識ＭＡＡレクチンを反応させた結果である。
　（Ｂ）は、CH3Cl／CH3OH／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＭＡＡレクチンを反応させた結果である。
　（Ｃ）は、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＳＮＡ－Ｉレクチンを反応させた結果である。
　（Ｄ）は、CH3Cl／CH3OH／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにＴＲＩＴＩＣ蛍光標識ＳＮＡ－Ｉレクチンを反応させた結果である。
　また、（Ａ）～（Ｄ）の各図において、左側の写真はレクチン結合反応を行う前のシリカゲルプレートの撮影画像であり、右はレクチン結合反応を行った後のシリカゲルプレートの撮影画像である。
　その結果、図１２（Ａ）～（Ｄ）が示すように、蛍光レクチン結合反応前（各図の左側写真）において発光していない部分が、蛍光レクチン結合操作後（各図の右側写真）では発光していることが観察された（矢印の部分）。この各図の右側写真の発光部分とは、蛍光標識されたＭＡＡレクチンやＳＮＡ－Ｉレクチンが、上記Ｎ－アセチルノイラミン酸に特異的な構造を有する化合物と特異的に結合していることを示すものである。
　詳しくは、図１２（Ａ）および（Ｂ）（ＭＡＡレクチンでの検出結果）から、シリカゲルプレート上で展開した矢印で示された部分の化合物のなかに、「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造を有する化合物が存在することが示された。
　また、図１２（Ｃ）および（Ｄ）（ＳＮＡ－Ｉレクチンでの検出結果）から、シリカゲルプレート上で展開した矢印で示された部分の化合物のなかに、「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→６）Ｇａｌ」構造もしくは「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→６）ＧａｌＮＡｃ」構造を有する化合物が存在することが示された。
　従って、本試験例の結果から、米胚芽のエチレングリコール抽出液中に、シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸）を含む化合物が存在することが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜試験例１３＞（炊飯米の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　玄米（コシヒカリ）をブラシ式精米機（HRG-122　みのる産業製）で外側から研削し、玄米を１００質量％とすると「１００～９６質量％の範囲の部分（玄米最外層部分）を削り取った胚芽と糊粉層の残った米」（換言すると、玄米最外層部分を削り取って、残った９６質量％の部分にあたる、胚芽と糊粉層の残った米）を、２０℃（試料１３－１、１３－２）もしくは２５℃（試料１３－３、１３－４）の水に６時間浸漬し静置した。そして、軽く３回研いでから、当該米２質量部に水２質量部を加え、家庭用炊飯器で炊飯し、これら炊飯米３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液に、同量のエタノールを注加し、よく混合後、１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した上清は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／水＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１３に示す。
　なお、図１３において、レーン１は‘玄米最外層を削り取った胚芽と糊粉層の残った米’を炊飯前に２０℃の水に６時間浸漬し静置したものを炊飯したものから、抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液２μＬ（試料１３－１）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。また、レーン２はレーン１と同じもの４μＬ（試料１３－２）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　レーン３は‘玄米最外層を削り取った胚芽と糊粉層の残った米’を炊飯前に２５℃の水に６時間浸漬し静置したものを炊飯したものから、抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液２μＬ（試料１３－３）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。また、レーン４はレーン３と同じもの４μＬ（試料１３－４）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１３の結果が示すように、‘玄米最外層を削り取った胚芽と糊粉層の残った米’を炊飯処理しても、水抽出によってシアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜試験例１４＞（グリセロールを用いた粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　小麦（農林６１号）全粒および大麦（サチホゴールデン、Betzes、ダイシモチ、イチバンボシ、烏金１号）全粒を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、１００％（ｖ／ｖ）グリセロール１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１４－１～１４－６）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を１０℃で１２時間静置したのち、3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１４に示す。
　なお、図１４において、レーン１は小麦農林６１号全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４－１）を、レーン２は大麦サチホゴールデン全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４－２）を、レーン３は大麦Ｂｅｔｚｅｓ全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４－３）を、レーン４は大麦ダイシモチ全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４－４）を、レーン５は大麦イチバンボシ全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４－５）を、レーン６は大麦烏金１号全粒粉から抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１４－６）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１４の結果が示すように、抽出溶媒として１００％（ｖ／ｖ）グリセロールを用いて抽出することで、小麦および大麦の全粒粉からシアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料１４－１～１４－６（レーン１～６）における原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜試験例１５＞（各種穀類由来の粉および加工品の粗抽出液からのシアル酸含有化合物の検出）
　小麦（農林６１号）全粒および大麦（サチホゴールデン、Betzes、ダイシモチ、イチバンボシ、烏金１号）全粒を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１５－１～１５－６）。また、小麦（農林６１号）、大麦（サチホゴールデン）の小ブスマ３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１５－７，１５－８）。また、米（ハツシモ）胚芽を粉砕器（Ultracentrifugal Mill, MRK-RETSCH製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した（試料１５－９）。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を直ちに、1000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１５に示す。
　なお、図１５において、レーン１は小麦農林６１号全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－１）を、レーン２は大麦サチホゴールデン全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－２）を、レーン３は大麦Betzes全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－３）を、レーン４は大麦ダイシモチ全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－４）を、レーン５は大麦イチバンボシ全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－５）を、レーン６は大麦烏金１号全粒粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－６）を、レーン７は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－７）を、レーン８は大麦サチホゴールデン小ブスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－８）を、レーン９は米ハツシモ胚芽粉砕粉から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１５－９）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１５の結果が示すように、抽出溶媒として水を用いて抽出することで、小麦および大麦の全粒粉や小ブスマ、米胚芽からシアル酸含有化合物を含む粗抽出液が得られることが示された。
　米胚芽からは、小麦や大麦の全粒や小ブスマと比べて、特定の一種類のシアル酸含有化合物が高濃度で抽出できることが示された。小麦や大麦からは、米胚芽には含まれないシアル酸含有化合物が複数種抽出できることが示された。小麦や大麦に関して、小ブスマを抽出原料とすれば全粒粉からよりも高濃度でシアル酸含有化合物を抽出できることが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料１５－１～１５－９（レーン１～９）における、原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜試験例１６＞（酸の種類による抽出への影響）
　小麦農林６１号の小ブスマ３ｇに、水、もしくは１１．８３％（２Ｎ）酢酸、もしくは７．０６％（２Ｎ）塩酸１５ｍＬを加え、よく混合した。これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を８０℃で３時間振盪したのち（試料１６－１～１６－３）、1000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　また、小麦農林６１号の小ブスマ３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。この混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を直ちに（試料１６－４）、もしくは、１０℃で２８．５ｈ（約３時間）静置したのち（試料１６－８）、1000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１６に示す。
　なお、図１６において、レーン１は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後に８０℃で３時間振盪したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６－１）を、レーン２は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として２Ｎ酢酸を用い、超音波処理後に８０℃で３時間振盪したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６－２）を、レーン３は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として２Ｎ塩酸を用い、超音波処理後に８０℃で３時間振盪したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６－３）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　また、レーン４は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後直ちに遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６－４）を、レーン８は小麦農林６１号小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後１０℃で約３時間静置したのち遠心分離することにより得られた粗抽出液（試料１６－８）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　そして、レーン５はシアル酸含有化合物標品ＧＤ１ａ（SIGMA製）を、レーン６はシアル酸含有化合物標品ＧＴ１ｂ（SIGMA製）を、レーン７はシアル酸含有化合物標品Ｎ－アセチルノイラミン酸（SIGMA製）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１６の結果が示すように、８０℃、約３時間の酢酸処理、塩酸処理によって、水で抽出されるのとは異なるシリカゲルプレート上で高い位置に移動するシアル酸含有化合物が得られることが示された。この結果は、熱を加えた酸処理によって、シアル酸含有化合物の‘低分子化、断片化’が起こり、低極性化したためと考えられる。
　すなわち、熱を加えた酸処理を行うことによって、低分子化、断片化させることが出来、易溶性を向上（溶出効率を向上）させることができることが示唆された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料１６－１，１６－２，１６－４，１６－８（レーン１，２，４，８）における原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜試験例１７＞（室温抽出における抽出時間の影響）
　小麦（シラサギコムギ）の小ブスマ２ｇに、水１０ｍＬを加え、よく混合した。これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。これら処理物を直ちに（試料１７－１）、もしくは２５℃で１時間（試料１７－２）、４時間（試料１７－３）、１２時間（試料１７－４）、２４時間（試料１７－５）振盪したのち、1000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。
　分離した粗抽出液は、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／アセトン／CH3OH／酢酸／水／ピリジン＝７５／４５／３０／２５／５／２０（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を図１７に示す。
　なお、図１７において、レーン１は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後直ちに上記工程より得られた粗抽出液（試料１７－１）を、レーン２は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で１時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７－２）を、レーン３は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で４時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７－３）を、レーン４は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で１２時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７－４）を、レーン５は小麦（シラサギコムギ）小ブスマから抽出溶媒として水を用い、超音波処理後２５℃で２４時間振盪後、上記工程より得られた粗抽出液（試料１７－５）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１７の結果が示すように、小麦小ブスマを２５℃の水に（４時間以上、特には１２時間以上）浸漬することで、原点付近の発色バンドを、より上側に展開されるバンドに転化させることができることが示された。この結果は、内在性酵素の働きによって、シアル酸含有化合物の‘低分子化、断片化’が起こり、低極性化したためと考えられる。
　すなわち、特別な酵素を添加することなく、小麦小ブスマ中のシアル酸含有化合物を低分子化、断片化させること（シアル酸含有化合物の組成を変化させること）が出来、易溶性を向上（溶出効率を向上）させることができることが示唆された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物の大部分は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。なお、試料１７－１～１７－５（レーン１～５）における原点付近から移動しないシアル酸含有化合物は、シリカゲルプレートに吸着した糖タンパク質であると考えられる。
＜試験例１８＞（各穀類糠の粗抽出液からのレクチンブロットによるシアル酸含有化合物の検出確認）
　米（ひとめぼれ）糠、小麦（ニシノチカラ）フスマ、大麦（マンネンボシ）フスマ３ｇに、水１５ｍＬを加え、よく混合した。
　これら混合物に超音波処理装置（B-42J Ultrasonic Cleaner, BRANSON製）を用い超音波処理を１分３０秒施した。この処理物を直ちに1000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した（試料１８－１～１８－３）。
　上記工程により得られた粗抽出液を、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）によって展開することで成分ごとに分離したのち、冷風乾燥した。
　このシリカゲルプレートをポリ（イソブチルメタクリレート）のｎ－ヘキサン／CH3Cl＝９／１（Ｖ／Ｖ）溶液（濃度２ｇ／５００ｍＬ）に３０秒間浸漬し、冷風乾燥した。
　次いで、このポリ（イソブチルメタクリレート）処理をしたシリカゲルプレートを、プラスチック容器中でTRITIC蛍光標識ＭＡＡレクチン（E. Y. Labolatory製）の0.15Ｍ塩化ナトリウム－１％ＢＳＡ入り0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝7.2～7.4）で１００倍希釈した溶液に浸漬し、室温にて２４時間振盪して、レクチン結合反応を行った。
　なお、‘ＭＡＡレクチン’は、「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造に特異的に結合するレクチンである。
　レクチン結合反応終了後、ポリ（イソブチルメタクリレート）処理シリカゲルプレートに対し洗浄操作をおこない、目的物に結合していない蛍光レクチンを洗浄除去したのち、蛍光の観察される部分、すなわちシアル酸に特異的に結合するレクチンの存在部位を観察することで、シアル酸含有化合物の検出を行った。結果を、図１８に示す。
　なお、図１８は、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）で展開したシリカゲルプレートにTRITIC蛍光標識ＭＡＡレクチンを反応させた結果である。すなわち、左側の写真はレクチン結合反応を行う前のシリカゲルプレートの撮影画像であり、右はレクチン結合反応を行った後のシリカゲルプレートの撮影画像である。
　図１８において、レーン１は米（ひとめぼれ）糠から抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１８－１）を、レーン２は小麦（ニシノチカラ）フスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１８－２）を、レーン３は大麦（マンネンボシ）フスマから抽出溶媒として水を用い、上記工程より得られた粗抽出液（試料１８－３）を、シリカゲルプレート上で展開したものである。
　その結果、図１８が示すように、蛍光レクチン結合反応前（各図の左側写真）において発光していない部分が、蛍光レクチン結合操作後（各図の右側写真）では発光していることが観察された（矢印の部分）。この各図の右側写真の発光部分とは、蛍光標識されたＭＡＡレクチンが、上記Ｎ－アセチルノイラミン酸に特異的な構造を有する化合物と特異的に結合していることを示すものである。
　詳しくは、「Ｎ－アセチルノイラミン酸α（２→３）Ｇａｌ」構造を有する化合物が存在することが示すものである。
　従って、本試験例の結果から、米糠、小麦フスマ、大麦フスマの水抽出液中に、シアル酸（Ｎ－アセチルノイラミン酸）を含む化合物が存在することが示された。
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
＜実施例４＞（米全粒からのメタノール抽出およびゲル濾過カラム精製）
〔ゲル濾過カラム精製〕
　米（ひとめぼれ）の全粒を粉砕器（Cyclone Sample Mill, UDY CORPORATION製）によって粉砕することで得た粉３ｇに、メタノール１５ｍＬを加え、ガラス棒を用いて手でよく混合した。この処理物を直ちに3000rpm、１０分間の遠心分離により固液分離した。固液分離して得られた上清を窒素気流によって濃縮した粗抽出液を、ゲル濾過カラム（Shodex）を接続した高速液体クロマトグラフィーシステム（日本分析工業、本体　示差屈折検出器）で分画した。溶離液はメタノールを用いた。
　その結果、図１９に示すように、１～９で示すピークが得られた。
〔レゾルシノール塩酸検出〕
　次いで、上記ピーク１～９で示す画分を、シリカゲルプレート上で、CH3Cl／CH3OH／0.2%CaCl2＝４／４／１（Ｖ／Ｖ／Ｖ）により展開することで成分ごとに分離し、レゾルシノール塩酸を噴霧し、９５℃で加熱発色処理を行うことで、シアル酸含有化合物の検出を行った。図２０に結果を示す。また、図２０におけるレーン番号は、図１９におけるピーク番号に対応するものである。なお、レーンＳはカラム分画前の粗抽出液をアプライしたものである。
　その結果、図２０に示すように、ピーク８にシアル酸含有化合物が多量に含まれることが示され、
　また、検出されたシアル酸含有化合物は、原点から大きく移動していることから、展開溶媒と親和性の高い物質である糖脂質であることが示唆された。
〔考察〕
　これらの結果から、米をメタノール抽出してゲル濾過カラムで精製することで、シアル酸含有化合物を高含有する画分（精製物）が得られることが示された。
　本発明によれば、植物由来の原料、特に穀類又は豆類の種子およびその加工品、から、動物罹患性病原体の混入の恐れがなく、安全性の高いシアル酸含有化合物を、安価に提供することができる。
　また、本発明によれば、植物由来廃棄物である米糠（赤糠、白糠）、コムギふすま、くず大豆、規格外小豆、トウモロコシから澱粉を抽出した残り粕、の新規用途を創出することができる。
　さらに、本発明品である植物由来のシアル酸含有化合物は、シアル酸を含有する機能性食品、高付加価値化粧品および医薬品原料として利用することができる。

Claims (8)

  1. 　植物体もしくは植物体の加工品を、水、アルコール又は含水アルコールを用いて可溶性成分を粗抽出し、得られた粗抽出液から、透析、塩析もしくはクロマトグラフィーカラムによって分離し回収することを特徴とする、シアル酸含有化合物の抽出法。
  2. 　前記植物体が、穀類及び／又は豆類の種子である、請求項１に記載のシアル酸含有化合物の抽出法。
  3. 　前記植物体もしくは植物体の加工品が、粉砕、磨砕、擂潰もしくは粉末化されたものである、請求項１又は２に記載のシアル酸含有化合物の抽出法。
  4. 　前記可溶性成分を粗抽出する工程において超音波処理を行う、請求項１～３のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法。
  5. 　前記水が、水道水、脱イオン水、蒸留水、もしくは、塩，酸，アルカリ，糖類又はｐＨ緩衝剤を含む水である、請求項１～４のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法。
  6. 　前記アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、もしくは、グリセロールである、請求項１～５のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法。
  7. 　前記分離回収が、セロトニンアフィニティーカラム、レクチンアフィニティーカラム、ゲル濾過カラム、イオン交換カラム、もしくは、シリカゲルカラムによって行うものである、請求項１～６のいずれかに記載のシアル酸含有化合物の抽出法。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の抽出法から得られるシアル酸含有化合物。
PCT/JP2010/060010 2008-04-25 2010-06-14 植物からのシアル酸含有化合物の抽出法 WO2011043107A1 (ja)

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