JP2008005778A - 細胞からの代謝物質の抽出方法 - Google Patents
細胞からの代謝物質の抽出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008005778A JP2008005778A JP2006180223A JP2006180223A JP2008005778A JP 2008005778 A JP2008005778 A JP 2008005778A JP 2006180223 A JP2006180223 A JP 2006180223A JP 2006180223 A JP2006180223 A JP 2006180223A JP 2008005778 A JP2008005778 A JP 2008005778A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- methanol
- filter
- metabolome
- metabolite
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 14
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000000738 capillary electrophoresis-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- QAMFBRUWYYMMGJ-UHFFFAOYSA-N hexafluoroacetylacetone Chemical compound FC(F)(F)C(=O)CC(=O)C(F)(F)F QAMFBRUWYYMMGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 2
- XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N D-fructose 1,6-bisphosphate Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(=O)COP(O)(O)=O XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013626 chemical specie Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl ether Chemical compound CC(C)(C)OC(C)(C)C AQEFLFZSWDEAIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002359 drug metabolite Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N fructose-1,6-phosphate Natural products OC1C(O)C(O)(COP(O)(O)=O)OC1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010995 multi-dimensional NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】メタボローム等の代謝物質を細胞から効率的に抽出する。
【解決手段】細胞を超音波により溶媒(メタノール22)中に懸濁した後で、該メタノール22、クロロホルム36、水32の共存下で細胞を処理することで、メタボロームを抽出する。前記細胞は、例えば、ポリカーボネート製トラックエッチドスクリーンフィルタ14で補集することができる。
【選択図】図1
【解決手段】細胞を超音波により溶媒(メタノール22)中に懸濁した後で、該メタノール22、クロロホルム36、水32の共存下で細胞を処理することで、メタボロームを抽出する。前記細胞は、例えば、ポリカーボネート製トラックエッチドスクリーンフィルタ14で補集することができる。
【選択図】図1
Description
本発明は、細胞の代謝物を定性・定量解析する際に用いるのに好適な、細胞からの代謝物質の抽出方法に関する。
キャピラリ電気泳動(CE)−質量分析(MS)による細胞の全代謝物のメタボローム測定では、細胞機能の迅速なクエンチング、及び、脂質・蛋白質の除去を行う必要がある。そこで、非特許文献1に記載されているように、メタノールに細胞を浸潤して抽出したメタボローム試料に、クロロホルム処理による脂質除去、除蛋白質処理を施して最終試料を調製している。
又、他のメタボローム試料の調製方法としては、非特許文献2で、ホットエタノール(HE)、コールドメタノール(CM)、ホットメタノール(HM)、過塩素酸(PCA)、アルカリ(AL)、メタノールクロロホルム(MC)について検討されている。この結果によると、簡便性と再現性を考慮すると、CM法が良いと結論されている。
更に、非特許文献3には、ヘキサフルオロアセチルアセトン(1,1,1,5,5,5-ヘキサフルオロ-2,4-ペンタンジオン:HFA)を抽出溶媒として用いると、水溶性・脂溶性物質がバランス良く抽出されると発表されているが、詳細なデータは不明である。
又、特許文献1には、酢酸エチルやt−ブチルエーテル/イソプロパノールを用いて薬物代謝体を取得する方法が記載されている。
しかしながら、特許文献1に記載された方法は、メタボローム試料には適していない。
又、迅速に細胞だけを集めるため、一般的には濾過フィルタが用いられているが、フィルタ上に付着した細胞をメタノールに浸潤するだけでメタボローム試料が調製できるかは不明であった。
非特許文献1では、細胞を集める際に減圧濾過で用いるフィルタとして、紙製濾紙やポリビニリデンフロライド製網目状フィルタなどを用いていたが、吸湿性のためメタボローム試料抽出の際に、培地成分のキャリーオーバーが大きいなどの問題点を有していた。
又、メタボロームの抽出は、化学種によって抽出効率がまちまちであり、全てを均一に抽出することは困難であった。更に、これまでのメタノールによるメタボローム抽出方法では、ヌクレオチド類などのリン酸を含む化合物の抽出が不完全であった。
従って、他の化合物の抽出には影響を与えず、これらの化合物を、より効率的に抽出する方法が求められていた。
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、細胞からメタボローム等の代謝物質を効率的に抽出することを課題とする。
本発明は、細胞からの代謝物質の抽出に際して、細胞を超音波により溶媒中に懸濁した後で、溶媒から抽出するようにして、前記課題を解決したものである。
前記溶媒をメタノールとし、該メタノール・クロロホルム・水の共存下で細胞を処理することで、代謝物質を抽出することができる。
前記細胞は、フィルタで補集することができる。
前記フィルタは、ポリカーボネート製トラックエッチドスクリーンフィルタとすることができる。
本発明によれば、メタボロームを効率的に抽出することができ、メタボローム抽出の再現性を向上することができる。特に、リン酸を含む化合物の抽出において改善効果が大きく、含まれるリン酸の数が大きい程、効果が大きい。
以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
図1を参照して、本実施形態における微生物メタボローム試料の調製手順を詳細に説明する。
(1)まず図1(A)に示す如く、例えばフラスコ10中の109個の細胞を含む試料体積のバクテリア培地12を、図1(B)に示す如く、例えば減圧濾過によりフィルタ14にサンプリングして集める。前記フィルタ14としては、ポリカーボネート製トラックエッチドスクリーンフィルタ(例えばMilipore社製Isopore Membrane Filter HTTP 孔径0.4μm 直径47mm、047 00)を用いることができる。このフィルタは、孔径が一定であり、フィルタ基材は非吸湿性で、ガラスのように滑らかな表面を持つ。このような特徴から、培地成分の吸着やキャリーオーバーは最小限に留められ、又、メタノール中の超音波処理の際に細胞が剥がれやすいという利点を有する。
(2)次に、図1(C)に示す如く、例えばフィルタホルダ16を用いて、10mlのMlliQ水で二回洗浄する。
(3)次いで、図1(D)に示す如く、例えば蓋つきシャーレ20に内部標準入りの2mlメタノール(MeOH)22を入れる。
(4)次いで、フィルタ14をメタノール22に浸ける。
(5)次いで、図1(E)に示す如く、密閉したシャーレ20を超音波洗浄器24に浮かべ、例えば30秒間処理して、細胞を完全にメタノール22中に懸濁する。
(6)次いで、図1(F)に示す如く、菌が完全に懸濁されたメタノール例えば1.6mlをファルコンチューブ30に移す。
(7)次いで、例えば640μlのMilliQ水と1.6mlのクロロホルムを加え、例えば30秒間ボルテクスにかけて、図1(G)に示す如く、イオン性代謝物質を含む水32と、疎水ペプチドを含むメタノール34と、脂質を含むクロロホルム36に分離させる。
(8)後は従来と同様に、図1(H)に示す如く、水32の層のみをウルトラフィルタチップに移して、蛋白質を取り除き、図1(I)に示す如く、例えば2時間遠心分離し、図1(J)に示す如く、遠心蒸発機で乾燥し、図1(K)に示す如く、内部標準入りの例えば50μlのMilliQ水を加えて再溶解し、例えばCE−MS分析などに用いる。
本発明で用いた超音波処理により、遠心分離後の細胞ペレットを完全に懸濁することができる。又、フィルタ14で集めた細胞をフィルタ14から剥がし、完全に懸濁することができる。
従来法(■印)、CM法(○印)、本発明による超音波処理法(△印)の抽出結果を図2に比較して示す。リン酸基の数に依存して抽出効率が改善され、ATP、CTPで約50倍、GTPでは100倍の抽出率となった。又、これまで検出できなかったdTTPが検出できるようになった。一方、カチオンの定量値は変化しない。又、アニオンではフルクトース1,6-ビスリン酸以外では定量値は変化しない。更に、ここでの超音波処理では、細胞は破壊されないことが確認できた。
又、再現性に関しては、図2中に●印で示す如く、2回の抽出データの比較では最大10%の誤差を生じたが、ヌクレオチド16成分の平均誤差は1%であった。
この手法により調製したメタボローム試料は、CE、液体クロマトグラフィ(LC)、ガスクロマトグラフィ(GC)、MS、薄層クロマトグラフィ(TLC)、核磁気共鳴(NMR)、分光学的手法などを用いた分析などに適用できる。
又、この手法により調製したメタボローム試料は、酵素反応の基質としても利用することができる。
本発明の手法は、更に、バクテリア、培養動物細胞、培養植物細胞、血球、精子、卵子、その他の単細胞試料に適用することができる。
10…フラスコ
12…バクテリア培地
14…フィルタ
20…シャーレ
22、34…メタノール
24…超音波洗浄器
30…ファルコンチューブ
32…水
36…クロロホルム
12…バクテリア培地
14…フィルタ
20…シャーレ
22、34…メタノール
24…超音波洗浄器
30…ファルコンチューブ
32…水
36…クロロホルム
Claims (4)
- 細胞を超音波により溶媒中に懸濁した後で、溶媒から抽出することを特徴とする細胞からの代謝物質の抽出方法。
- 前記溶媒をメタノールとし、該メタノール・クロロホルム・水の共存下で細胞を処理することで、代謝物質を抽出することを特徴とする請求項1に記載の細胞からの代謝物質の抽出方法。
- 前記細胞が、フィルタで補集されたものであることを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞からの代謝物質の抽出方法。
- 前記フィルタが、ポリカーボネート製トラックエッチドスクリーンフィルタであることを特徴とする請求項3に記載の細胞からの代謝物質の抽出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006180223A JP2008005778A (ja) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | 細胞からの代謝物質の抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006180223A JP2008005778A (ja) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | 細胞からの代謝物質の抽出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008005778A true JP2008005778A (ja) | 2008-01-17 |
Family
ID=39064552
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006180223A Pending JP2008005778A (ja) | 2006-06-29 | 2006-06-29 | 細胞からの代謝物質の抽出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008005778A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009130923A1 (ja) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出方法 |
WO2011043107A1 (ja) * | 2009-10-06 | 2011-04-14 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出法 |
US10927401B2 (en) | 2015-09-11 | 2021-02-23 | Keio University | Method for extracting substance from feces sample |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002153297A (ja) * | 2000-11-24 | 2002-05-28 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 微生物数測定方法及び前処理装置付き微生物数測定装置 |
JP2005224218A (ja) * | 2004-02-16 | 2005-08-25 | Human Metabolome Technologies Inc | 遺伝子産物の機能同定方法及び結合物質同定方法 |
-
2006
- 2006-06-29 JP JP2006180223A patent/JP2008005778A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002153297A (ja) * | 2000-11-24 | 2002-05-28 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 微生物数測定方法及び前処理装置付き微生物数測定装置 |
JP2005224218A (ja) * | 2004-02-16 | 2005-08-25 | Human Metabolome Technologies Inc | 遺伝子産物の機能同定方法及び結合物質同定方法 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009130923A1 (ja) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出方法 |
JPWO2009130923A1 (ja) * | 2008-04-25 | 2011-08-11 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出方法 |
WO2011043107A1 (ja) * | 2009-10-06 | 2011-04-14 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出法 |
JP2011079760A (ja) * | 2009-10-06 | 2011-04-21 | National Agriculture & Food Research Organization | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出法 |
US10927401B2 (en) | 2015-09-11 | 2021-02-23 | Keio University | Method for extracting substance from feces sample |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US12005452B2 (en) | Nanoscale biochemical sample preparation and analysis | |
Piehowski et al. | Automated mass spectrometry imaging of over 2000 proteins from tissue sections at 100-μm spatial resolution | |
Frey et al. | Emerging trends in paper spray mass spectrometry: Microsampling, storage, direct analysis, and applications | |
US20230332138A1 (en) | Methods, compositions, and systems for spatial analysis of analytes in a biological sample | |
US20240253036A1 (en) | Fluid delivery methods | |
KR101066159B1 (ko) | 당 사슬-포착 분자로 당 사슬을 정제/농축하는 방법 및 당 사슬 구조의 분석법 | |
Klepárník | Recent advances in the combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: From element to single‐cell analysis | |
Czekalska et al. | A droplet microfluidic system for sequential generation of lipid bilayers and transmembrane electrical recordings | |
US11719702B2 (en) | Methods and systems of proteome analysis and imaging | |
US8663581B2 (en) | Pre-concentrator and method of using the same | |
Balchen et al. | Fundamental studies on the electrokinetic transfer of net cationic peptides across supported liquid membranes | |
US11715633B2 (en) | Multiplexed inductive ionization systems and methods | |
JP5735500B2 (ja) | エネルギー代謝の極性代謝物を分析するための方法 | |
EP3486937A1 (en) | Mass spectrometry analysis of microorganisms in samples | |
CN109564147B (zh) | 用于分析使用吸附材料从样品中提取的分析物的系统和方法 | |
Hamidi et al. | Liquid-phase microextraction of biomarkers: A review on current methods | |
EP3800462A1 (en) | Multilayer device for separating blood components and uses thereof | |
Liang et al. | HyperSCP: Combining isotopic and isobaric labeling for higher throughput single-cell proteomics | |
US11959836B2 (en) | Analysis system and methods of use thereof | |
JP2008005778A (ja) | 細胞からの代謝物質の抽出方法 | |
Ma et al. | Sulfonamide-selective ambient mass spectrometry ion source obtained by modification of an iron sheet with a hydrophilic molecularly imprinted polymer | |
WO2017168493A1 (ja) | 一細胞由来生体分子捕捉用システム | |
Pantůčková et al. | A simple sample pretreatment device with supported liquid membrane for direct injection of untreated body fluids and in‐line coupling to a commercial CE instrument | |
EP3803413A1 (en) | Methods and systems of proteome analysis and imaging | |
US10393750B2 (en) | Formalin-fixed isotope-labeled reference standards and methods for fabrication and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090513 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20111004 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120313 |