JP2014233208A - 細胞用ウェルプレートおよび細胞分泌物の分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞から分泌された化学物質を１細胞レベルで定量的に分析するためのウェルプレートおよび方法等を提供すること。【解決手段】細胞を１個のみ収容可能なサイズであり、かつ、底部に配された親水性表面と、当該底部を取り囲むように配された疎水性表面とを有しているウェルが複数形成されているウェルプレートを用いる。【選択図】図２

Description

本発明は、細胞から分泌された化学物質を１細胞レベルで回収する方法および分析する方法、ならびにこれらの方法に利用されるウェルプレート、システム、およびキット等に関するものである。

一般的に、血液、尿、穿刺液、または分泌液などに含まれる化学物質を定量的に分析することによって、病態の診断、治療、および経過観察を行うことがある。例えば、酵素（ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、ＬＤＨ、ＣＫ、アミラーゼなど）、脂質（コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロールなど）、蛋白質（アルブミンなど）、および、老廃物（クレアチニン、尿素窒素、尿酸など）などを定量分析することによって、肝臓・胆道、腎臓、膵臓、または心臓などの機能の状態から疾患が判断される。これらの化学物質は、細胞内で産生されて細胞外へと放出され、血液、尿、穿刺液、または分泌液などに混じる。この過程において化学物質は溶液中に拡散する結果となるため、検出濃度は低い。例えば、がん細胞が分泌した腫瘍マーカーは、血液中に入ると大量の血液によって希釈されてしまう。そのため、末梢血を採取し分析しても、がん早期では、腫瘍マーカーを検出することが困難である。

また、上述の従来の方法では、化学物質は、膨大な、かつ、さまざまな種類の細胞から放出された総集合として検出される。例えば、切除された腫瘍組織検体から分泌される化学物質を調べる場合において、便宜上、細胞は均一的な集合として扱われている。そのため、上記組織検体に、わずかに悪性腫瘍細胞が含まれていたとしても、他の多くが良性腫瘍であれば、全体として良性腫瘍であると診断される。組織検体の細胞診断において、検出精度は高ければ高いほど好ましい。したがって、１細胞レベルで検出することが最も好ましいといえる。

細胞内における化学物質を１細胞レベルで定量的に分析する方法が、特許文献１および非特許文献１に記載されている。特許文献１および非特許文献１に記載されている分析方法では、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析装置が用いられる。これらの方法では、１個の単離された細胞から、細胞内液を金属被覆されたガラスマイクロニードルによって収集し、０．５％ギ酸を含むアセトニトリル溶媒を添加し、エレクトロスプレーイオン化を行った後、電場型フーリエ変換質量分析計に導入する。これらの方法は、細胞内の物質が溶媒中に拡散することがないため、高感度で、高精度の分析を行い得る。

特開２０１１−１２０５８２号公報（２０１１年６月２３日公開）

Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Mizuno H, Tsuyama N, Harada T, Masujima T. J Mass Spectrom. 2008;43(12):1692-700.

特許文献１および非特許文献１に記載のように、細胞内における化学物質を１細胞レベルで定量的に分析する方法は存在するが、細胞から分泌された化学物質を１細胞レベルで定量的に分析する方法は存在しない。

本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞から分泌された化学物質を１細胞レベルで回収する方法および分析する方法、ならびにこれらの方法に利用されるウェルプレート、システム、およびキット等を提供することにある。

本願発明者らは、細胞ひとつひとつを微小な領域に封入することができれば、１細胞レベルで、かつ、分泌された化学物質の拡散を最小限にした、高感度で高精度の定量分析を行うことができると考えた。そして、それを可能にする方法を鋭意検討し、本発明を完成するに至った。

本発明に係るウェルプレートは、ウェル形成面に複数のウェルが形成されている細胞用のウェルプレートであって、
上記ウェルは、容積が１５０ｆＬ以上で４０ｐＬ以下の範囲内であり、かつ、細胞を１個のみ収容可能なサイズに形成されており、
上記ウェルは、底部に配された親水性表面と、当該底部を取り囲むように配された疎水性表面とを有してなり、
上記ウェル形成面は、少なくとも上記ウェルを取り囲むように疎水性表面が配されている。

本発明に係るウェルプレートの一実施形態において、上記ウェルは、直径が１０μｍ以上で４０μｍ以下であり、かつ、高さが２μｍ以上で３０μｍ以下の円柱形である。

本発明に係るウェルプレートの他の実施形態において、上記親水性表面はガラスからなり、かつ、上記疎水性表面はフッ素樹脂からなる。

本発明に係る回収方法は、上記ウェルプレートを用いた、細胞からの分泌物の回収方法であって、疎水性液体と上記ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴から、当該親水性液体の少なくとも一部を回収する工程を含む。

本発明に係る回収方法の一実施形態は、親水性液体に細胞が懸濁されてなる細胞懸濁液を、上記ウェルプレート上に注入し、各ウェルを当該細胞懸濁液で満たす工程１と、上記工程１の後に、疎水性液体を上記ウェルプレート上に注入し、各ウェル内に、疎水性液体と当該ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴を形成させる工程２と、上記工程２から所望の時間が経過した後に、上記液滴から、上記親水性液体の少なくとも一部を回収する工程３とを含む。

本発明に係る分析方法は、上記回収方法を用いて回収した親水性液体中の成分を分析する工程を含む。

本発明に係る分析方法の一実施形態において、分析する上記工程は、細胞分泌物の成分を分析するために行われる。

本発明に係るシステムは、上記回収方法、または上記分析方法に用いるためのシステムであって、上記ウェルプレート、および、疎水性液体と上記ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴から、当該親水性液体の少なくとも一部を回収するサンプル回収装置を備えている。

本発明に係るシステムの一実施形態は、上記サンプル回収装置が回収する上記親水性液体中の成分を分析する分析装置をさらに備えている。

本発明に係るキットは、上記ウェルプレートを含んでいる。

本発明に係るキットの一実施形態は、金属被覆されたガラスマイクロニードルをさらに含んでいる。

本発明によって、細胞から分泌された化学物質を１細胞レベルで定量的に分析することが可能となった。

本発明の一実施形態に係るウェルプレートの概略構成を示す図である。 本発明の一実施形態に係る回収方法の一部の工程を説明する図である。 本発明の一実施形態に係るシステムの概略構成を示す図である。 実施例１における、ウェルからのサンプル回収中の顕微画像を示す図である。 実施例１における、細胞外および細胞内からのサンプルにおけるマススペクトルの一例を示す図である。 実施例１における、細胞外からのサンプルにおける細胞培養時間によるピークの変化を示す図である。 実施例１における、主成分分析法の結果を示す図である。 実施例１における、２つの別個のＴ細胞からのサンプルにおけるマススペクトルの比較を示す図である。 実施例２における、ウェルからのサンプル回収中の顕微画像を示す図である。 実施例２における、ＥＳ細胞から得られたピークとＰａｒｔｉａｌ−ｉＰＳ細胞から得られたピークとの判別分析の結果を示す図である。 実施例３における、ウェルの直径と細胞外液に含まれる分泌物濃度との関係を示す図である。

〔１．ウェルプレート〕
本発明に係るウェルプレートは、ウェル形成面に複数のウェルが形成されている細胞用のウェルプレートであって、上記ウェルは、容積が１５０ｆＬ以上で４０ｐＬ以下の範囲内であり、かつ、細胞を１個のみ収容可能なサイズに形成されており、上記ウェルは、底部に配された親水性表面と、当該底部を取り囲むように配された疎水性表面とを有してなり、上記ウェル形成面は、少なくとも上記ウェルを取り囲むように疎水性表面が配されている。

本発明に係るウェルプレートの一実施形態について、図１を参照して説明する。図１は、本実施形態に係るウェルプレート１の概略構成を示す図であり、（Ａ）はウェルプレート１の概略平面図であり、（Ｂ）はウェルプレート１の概略断面図である。

ウェルプレート１は、１細胞レベルで細胞分泌物を分析するために用いられる、細胞用のプレートである。ウェルプレート１の大きさは、特に限定されず、その目的に応じて適宜設計され得る。ウェルプレート１の大きさは、例えば円形であれば直径０．５ｃｍ〜２．５ｃｍ程度、四角形であれば一辺が０．５ｃｍ〜２．５ｃｍ程度とすることができる。

図１の（Ａ）に示すように、ウェルプレート１では、ウェル形成面５に、複数のウェル２が等間隔で形成されている。各ウェル２は、同じ大きさであり、直径が１０μｍ以上で４０μｍ以下であり、かつ、高さが２μｍ以上で３０μｍ以下の円柱形である。ウェル２の直径および高さは、分析したい細胞の大きさに合わせて、この範囲内で適宜選択すればよい。各ウェル２はこのような大きさを有しているため、各ウェル２には細胞が１個のみ収容される。なお、図１は概略図であり、実際のウェルプレート１上には、例えば、１０μｍ〜４０μｍの間隔で、１００００〜１００００００個のウェル２が形成されている。

ウェル２は、底面（底部）３が親水性材料からなり、側面４が疎水性材料からなる。親水性材料としては、ガラス（疎水性ガラスの場合は親水化したもの）、ならびにアクリルおよび石英などの透明な素材を親水化したものが挙げられる。親水化は、例えば、エチレングリコールまたは親水シリコーンなどによればよい。疎水性材料としては、フッ素樹脂、ポリエステル、およびアクリルなどが挙げられる。

ウェル形成面５は、全体が疎水性材料からなる。疎水性材料としては、側面４の材料として列挙したものが挙げられる。

ウェルプレート１の作製方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。例えば、ウェルプレート１は、文献：Kim, S.H. et al. Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules. Lab Chip 12, 4986-4991 (2012) の記載に基づいて作製することができる（後述の実施例も参照）。

本発明に係るウェルプレートの他の実施形態において、上から見た場合のウェルの形状は、円形でなくてもよく、例えば、楕円形、または方形等であってもよいが、単離細胞は一般的に球状であるため、円形であることが好ましい。また、ウェルの底部は平面でなくてもよく、例えば、半球形に窪んでいてもよい。ウェルプレートの作製の容易性の観点からは、ウェルの底部は平面であることが好ましい。さらに、ウェル全体の形状は、円柱形でなくてもよく、凹型の分割球（半球など；球を平面で分割した形状）、楕円柱、または角柱形等であってもよい。

本発明に係るウェルプレートにおいて、ウェルは、容積が１５０ｆＬ以上で４０ｐＬ以下、好ましくは１５０ｆＬ以上で１ｐＬ以下、より好ましくは１５０ｆＬ以上で５００ｆＬ以下の範囲内であり、かつ、細胞を１個のみ収容可能なサイズに形成されている。例えば、ウェル形成面におけるウェルの開口が円形である場合、当該ウェルの開口の直径は、細胞の直径の１倍以上で２倍未満とすることが望ましく、ウェルの高さは、細胞の直径の０．２倍以上で２倍未満とすることが望ましい。ウェルの開口が楕円形である場合、当該ウェルの開口の直径は、最小部分および最大部分の何れにおいても細胞の直径の１倍以上で２倍未満とすることが望ましく、ウェルの高さは、細胞の直径の０．２倍以上で２倍未満とすることが望ましい。

ウェル形成面は、全体に疎水性表面が配されているものに限定されず、少なくとも各ウェルを取り囲むように疎水性表面が配されていればよい。ウェル形成面は、好ましくは、全体に疎水性表面が配されている。なお、「取り囲む」とは、各ウェルにおいて、ウェル内の疎水性表面とウェル形成面の疎水性表面との間に隙間がない状態であることをいう。

また、ウェルにおける親水性表面および疎水性表面の配置は上記に限定されず、ウェルは、底部に配された親水性表面と、当該底部を取り囲むように配された疎水性表面とを有していればよい。なお、「取り囲む」とは、親水性表面と疎水性表面との間に隙間がない状態であることをいう。

〔２．回収方法〕
本発明に係る回収方法は、上述のウェルプレートを用いるものであって、疎水性液体と上記ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴から、当該親水性液体の少なくとも一部を回収する工程を含んでいる。本発明に係る回収方法は、細胞からの分泌物を１細胞レベルで回収する方法である。

本発明に係る回収方法の一実施形態では、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる上記液滴は、親水性液体に細胞が懸濁されてなる細胞懸濁液を、上記ウェルプレート上に注入し、各ウェルを当該細胞懸濁液で満たす工程１と、当該工程１の後に、疎水性液体を当該ウェルプレート上に注入する工程２とを行うことによって形成される。すなわち、本発明に係る回収方法の一実施形態では、（ｉ）親水性液体に細胞が懸濁されてなる細胞懸濁液を、上述のウェルプレート上に注入し、各ウェルを当該細胞懸濁液で満たす工程１と、（ｉｉ）工程１の後に、疎水性液体を上記ウェルプレート上に注入し、各ウェル内に、疎水性液体と当該ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴を形成させる工程２と、（ｉｉｉ）上記工程２から所望の時間が経過した後に、上記液滴から、上記親水性液体の少なくとも一部を回収する工程３とを含んでいる。本発明に係る回収方法の一実施形態を例に、本発明に係る回収方法について、図２を参照して説明する。なお、以下では、ウェルプレート１を用いて説明するが、本実施形態はこれに限定されず、上述のウェルプレートの何れを用いてもよい。

（工程１）
工程１は、親水性液体２１に細胞２２が懸濁されてなる細胞懸濁液２３を、ウェルプレート１上に注入し、各ウェル２を細胞懸濁液２３で満たす工程である。

親水性液体２１としては、例えば、生理食塩水、培養培地、およびリンゲル液などが挙げられ、目的に応じて適宜選択すればよい。また、親水性液体２１は、浸透圧およびｐＨなどを細胞の生存条件に調整されていることが好ましい場合がある。

細胞２２の種類は、特に限定されない。細胞２２は、例えば、ヒト、マウス、およびラットなどの動物、植物または菌類などに由来する。また、細胞２２は、培養細胞であってもよいし、生体から採取された細胞であってもよい。細胞２２の種類としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球などの血液細胞；乳癌細胞、および胃癌細胞などのがん細胞；ＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞などの幹細胞；未受精卵などが挙げられる。

細胞懸濁液２３において、細胞２２はできるだけ単細胞になるよう懸濁されていることが好ましい。

細胞懸濁液２３をウェルプレート１上に注入する方法は特に限定されず、例えば、公知のマイクロピペットを用いればよい。各ウェル２が細胞懸濁液２３で十分に満たされる量を注入することが好ましい。

図２の（Ａ）は、ウェルプレート１上に細胞懸濁液２３が注入され、各ウェル２が細胞懸濁液２３で満たされた直後の状態を示す模式図である。図２の（Ａ）に示すように、細胞２２の一部はウェル２に入っているが、細胞２２の多くはウェル２に入っていない状態である。その後、例えば、１分〜５分間静置することによって、重力により細胞２２を沈ませる。

（工程２）
工程２は、上述の工程１の後に、疎水性液体２４をウェルプレート１上に注入し、各ウェル２内に、１個の細胞２２と親水性液体２１とを含んでなる液滴２５を形成させる工程である。液滴２５は、疎水性液体２４とウェル２の底面３とに取り囲まれている。

疎水性液体２４としては、例えば、油脂、シリコーンオイル、フッ素化脂肪族化合物などが挙げられる。好ましい疎水性液体２４の特徴としては、親水性液体２１に分散しにくいこと、細胞毒性がないこと、純度が高いこと、および透明であることなどが挙げられる。疎水性液体２４をウェルプレート１上に注入する方法は特に限定されず、例えば、公知のマイクロピペットを用いればよい。疎水性液体２４は、１箇所から注入することが好ましい。１箇所から注入することによって、表面張力により一様に広がるという利点がある。

図２の（Ｂ）は、ウェルプレート１上に疎水性液体２４が注入されている最中の状態を示す模式図である。図２の（Ｂ）に示すように、ウェルプレート１上に注入された疎水性液体２４は、ウェル形成面５および疎水性材料からなる側面４に沿って流動する。しかし、親水性材料からなる底面３は疎水性液体２４よりも親水性液体２１に対する親和性が高い。そのため、底面３には親水性液体２１が残り、親水性液体２１と混ざりにくい疎水性液体２４は親水性液体２１の上を流動する。親水性液体２１と疎水性液体２４との界面は、エネルギー的に安定なドーム型となる。また、細胞２２は疎水性液体２４よりも親水性液体２１に対する親和性が高いため、ウェル２の外にある細胞２２は、流動してきた疎水性液体２４に押されて、ウェル２の中に入る。ウェル２の直径および高さは、細胞２２が１個のみが入るように設計されているため、各ウェル２内には、１個の細胞２２と親水性液体２１とからなるドーム型の液滴２５が形成される。液滴２５は、疎水性液体２４と底面３とに取り囲まれている。疎水性液体２４に押し出された親水性液体２１は、吸引すればよい。吸引する方法としては、例えば、ピペットで吸い取る方法、濾紙で吸い取る方法などが挙げられる。

形成される液滴２５の体積は、ウェル２の直径および高さに依存する。すなわち、液滴２５の体積は、ウェル２の体積に依存する。例えば、ウェル２が直径１０μｍ、高さ５μｍであり、細胞２２が直径６μｍである場合、液滴２５に含まれる親水性液体２１の体積は、２８０ｆＬ程度である。

このように、工程１および工程２を行うことによって、細胞２２を１個ずつ、微量の親水性液体２１に封入することができる。

（工程３）
工程３は、上述の工程２から所望の時間が経過した後に、液滴２５から、親水性液体２１の少なくとも一部を回収する工程である。

工程２の後、工程３を行う前に、所望の時間おく。この間に、液滴２５に含まれる細胞２２は細胞内から親水性液体２１へ種々の化学物質を分泌する。分泌させる時間はその目的に応じて適宜設定される。分泌された化学物質（分泌物）は、液滴２５に閉じ込められる。工程３では、細胞２２から分泌された種々の化学物質を含む液滴２５から、親水性液体２１の少なくとも一部を回収する。ウェルプレート１には蓋がなく、また、親水性液体２１は疎水性液体２４に覆われているだけであるため、親水性液体２１を容易に回収することができる。

回収する方法は特に限定されないが、例えば、回収した親水性液体２１を、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）を用いた電場型フーリエ変換質量分析計に供する場合、親水性液体２１はガラスマイクロニードルを用いて回収される（図４参照）ことが好ましい。回収した親水性液体２１に含まれる化学物質はイオン化され、かつ、回収した親水性液体２１は霧状でなければならないからである。化学物質のイオン化のために、ガラスマイクロニードルは、金属によって被覆されている。金属としては、銀、鉄、および金などが挙げられる。ガラスマイクロニードルの内部への親水性液体２１の吸入には、例えば、シリンジポンプを用いればよい。

このように、工程１、工程２、および工程３を行うことによって、細胞２２からの分泌物を１細胞レベルで回収することができる。

〔３．分析方法〕
本発明に係る分析方法は、上述の回収方法を用いて回収した親水性液体中の成分を分析する工程を含んでいる。当該工程は、例えば、細胞分泌物の成分を分析するために行われるものである。

分析方法は特に限定されないが、例えば、質量分析、ラマン散乱解析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、プロテインアレイ、およびＥＬＩＳＡなどが挙げられる。質量分析のイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、電子衝撃イオン化法（ＥＩ）、化学イオン化法（ＣＩ）、およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）などが挙げられる。また、質量分析計のアナライザーの種類としては、四重極型（Ｑ）、二重収束型（磁場型，ＥＢ）、飛行時間型（ＴＯＦ）、イオントラップ型（ＩＴ）、およびイオンサイクロトロン型（フーリエ変換型，ＦＴ）などが挙げられる。なかでも、電場型フーリエ変換質量分析計は、感度が高いため好ましい。

ＥＳＩ法を用いた電場型フーリエ変換質量分析計を用いる場合、例えば、上述の工程３において親水性液体２１を吸入したガラスマイクロニードルに、０．５％ギ酸を含むアセトニトリル溶媒を添加し、エレクトロスプレーイオン化を介して、化学物質をイオン化すると同時に、親水性液体２１を霧状化し、電場型フーリエ変換質量分析計に導入して、質量分析を行えばよい。これにより、親水性液体２１中の成分を分析することができる。さらに、例えば、細胞２２を含まない親水性液体２１（コントロール）のスペクトルを比較することによって、細胞２２を含む液滴２５から回収された親水性液体２１に含まれている細胞分泌物の成分を同定することができる。

このように、本発明に係る分析方法を用いれば、１個の細胞に由来する分泌物を分析する、すなわち、１細胞レベルで細胞分泌物を分析することができる。また、本発明に係る分析方法は、多数の細胞を容易に１個ずつ封入することができるため、短時間で効率的に網羅的な定量分析を行うことができる。さらに、細胞を１個ずつ、微量の親水性液体に封入することができるため、分泌物の濃度の低下を抑えることができ、高感度で、高精度の定量分析を行うことができる。

〔４．システム〕
本発明に係るシステムは、上述の回収方法、または上述の分析方法に用いるためのシステムであって、上述のウェルプレートおよびサンプル回収装置を備えている。当該サンプル回収装置は、疎水性液体とウェルプレートのウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴から、当該親水性液体の少なくとも一部を回収するものである。

本発明に係るシステムの一実施形態について、図３を参照して説明する。図３は、本実施形態に係るシステム５０の概略構成を示す図である。

システム５０は、ウェルプレート４１、ステージ４２、サンプル回収装置４３、サンプル処理装置４４、および分析装置４５を備えて構成されている。以下に、サンプルの回収、およびサンプルの分析を行う際のシステムの動作について簡単に説明する。

ウェルプレート４１は、上述のウェルプレート１と同じものである。ウェルプレート４１は、例えば、上記〔２．回収方法〕欄の記載に従って、疎水性液体とウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴が、各ウェルに１つずつ形成された状態である。

ウェルプレート４１は、ステージ４２のプレート支持面に保持されている。ステージ４２は、ＸＹＺの三方向に動かすことができる。サンプルを回収する際には、ステージ４２を動かすことによって、ウェルプレート４１とサンプル回収装置４３との位置関係を調節することができる。

サンプル回収装置４３は、ウェルプレート４１の各ウェルに形成された液滴から親水性液体を回収する。サンプル回収装置４３は、親水性液体の回収に用いることができる限り特に限定されないが、例えば、上記〔２．回収方法〕欄に記載のように、マイクロニードルとシリンジポンプとを備えた構成が挙げられる。サンプル回収装置４３によって回収された親水性液体は、例えば、細胞から分泌された成分を含んでおり、必要に応じてサンプル処理装置４４および分析装置４５に供される。

サンプル処理装置４４は、サンプル回収装置４３によって回収された親水性液体を前処理して、分析装置４５に供給する装置である。分析装置４５が例えば電場型フーリエ変換質量分析計の場合、サンプル処理装置４４は、エレクトロスプレーイオン化装置であり得る。なお、分析装置４５での分析に際して、かかる前処理が不要な場合は、サンプル処理装置４４を設置しなくてもよい。

分析装置４５は、サンプル回収装置４３によって回収された親水性液体（必要に応じて、サンプル処理装置４４で前処理が行われたもの）の分析を行う。分析装置４５は、例えば、親水性液体中に含まれる成分の成分分析を行う。分析装置４５としては、例えば、上記〔３．分析方法〕欄に記載のものが挙げられる。

なお、図示していないが、システム５０の動作は、制御部によって自動制御されていてもよい。すなわち、ステージ４２上にウェルプレート４１を配置すれば、サンプル回収装置４３による親水性液体の回収、必要に応じて行われる回収した親水性液体の前処理、および親水性液体の分析を自動で行うこともできる。

〔５．キット〕
本発明に係るキットは、上述のウェルプレートを含む。本発明に係るキットは、細胞分泌物の分析用である。

本発明に係るキットは、さらに、上述の疎水性液体、上述の親水性液体、金属被覆されたガラスマイクロニードル、イオン化溶媒、および超純水のうちの少なくとも１つを含んでいてもよく、なかでも、疎水性液体および金属被覆されたガラスマイクロニードルのうちの少なくとも１つを含んでいることが好ましく、金属被覆されたガラスマイクロニードルを含んでいることがより好ましい。

このように、本発明は、単細胞から分泌される化学物質を網羅的にかつ定量的に分析することができる。すなわち、血液、尿、穿刺液、または分泌液などに放出される細胞由来の化学物質を、本発明では１細胞レベルで分析することができる。そのため、本発明は、生化学分析診断などにおいて、特に有用である。

また、本発明では、わずかな分泌物の変化を検出することができるとともに、細胞ごとにおける相違を比較することができる。すなわち、細胞の状態または種類を判別することができる。例えば、腫瘍組織の良性／悪性診断を１細胞レベルで行うことができるため、悪性腫瘍の早期発見に大きく貢献することが期待される。

また、本発明では、ウェルプレートに膨大な微小ウェルを形成することができる。そのため、分析のスリープットは高く、ドラッグスクリーニングなどの膨大数の試行条件を必要とする場合にも有用である。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

〔実施例１〕
直径２５ｍｍの円形カバーガラス（松浪硝子工業株式会社製）上にフッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ，旭硝子社製）を２０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートし、１８０℃で１時間加温することによって、ガラスをフッ素樹脂でコートした。これを４回繰り返し、厚み５μｍのフッ素樹脂膜を作製した。次いで、フォトレジスト（AZP4903, AZ Electronic Materials社製）を塗布し、ＵＶリソグラフィー法によって直径１０μｍの円をパターニングし、ドライエッチング法によって直径１０μｍ、深さ５μｍのマイクロウェルを形成した（RIE-10NR，Samco社製）。このようにして作製したウェルプレートを直径２０ｍｍの貫通穴を開けた直径３５ｍｍの細胞培養ディッシュ底面にマニキュアで貼り付けた。２４時間乾燥後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）に浸漬し、次いで減圧することによって、マイクロウェル内の気泡を取り除いた。

マウス（BALB/c，５〜８週齢）を開腹後、滅菌ピンセットを用いてリンパ節を採取し、さらにＤ−ＰＢＳ中で滅菌ピンセットを用いてほぐすことによって、単細胞浮遊液を得た。単細胞浮遊液を遠沈管に入れ５分間静置した後、上澄みを回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心した沈殿した細胞を、５％牛血清を含むRPMI1640培地に懸濁した。さらに、Milteny Biotec社のMACS磁気トラップシステムを用い、Ｔ細胞およびＢ細胞をそれぞれ得た。

１×１０^５個／ｍＬのＴ細胞またはＢ細胞を含むＨＥＰＥＳ溶液（25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.49 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 12 mM NaHCO₃, 0.37 mM KH₂PO₄ および5.6 mM Glucose）５００μＬを、作製したウェルプレート上に載せ、３分間静置した。次いで、油（ＦＣ−４０，シグマ社製）を上部からゆっくりと注ぐことによって、細胞とＨＥＰＥＳ溶液をウェル内に封入した。室温で１時間培養した後、細胞が１個だけ入っているウェルから、細胞周辺の溶液２００ｆＬを金属皮膜したガラスマイクロニードル（Humanix社製）を用いて回収した（図４；Ｔ細胞が入っているウェルからのサンプル回収中の顕微画像（Ａ）、その模式図（Ｂ））。ガラスマイクロニードル中の溶液にイオン化溶媒として０．５％のギ酸を含むアセトニトリル１μＬを加え、エレクトロスプレーイオン化を介して、化学物質をイオン化すると同時に溶液を霧状化し、電場型フーリエ変換質量分析計（LTQ Orbitrap XL，Thermo Fisher Scientific社製）に導入した。

得られたピークをＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）データベースと照合したところ、細胞由来のピークであることが確認された。例えば、１個のＴ細胞を封入したウェルでは、２７００個以上のピークが検出され（図５の（Ａ））、細胞の代謝物として１５７個の候補が得られた。比較検証のために細胞内液を同様に分析すると、より多くのピークが検出された（図５の（Ｂ））。これは、細胞内部にある化学物質の一部が、細胞外へと放出されていることを示している。

また、マイクロウェル内の溶液から得られたピークが、細胞の分泌液由来であることを確認するために、細胞の封入から３０分後および１時間後に、マイクロウェル内の溶液を回収し、上記分析を行った。その結果、時間経過と共に、取得されるピークの強度は大きくなり、これらの化学物質が、確かに細胞から分泌されていることが確かめられた。図６に、一例として、m/z = 139.074に相当する検出ピーク（ヘキサン酸であると考えられる）を示す。

また、回収した溶液に含まれる化学物質の分析により、血中に含まれるＴ細胞とＢ細胞の両者を区別することを試みた。両者の相違を容易に可視化するために、主成分分析法を用いて、質量分析で得られた多変量のデータを、互いに相関のない、少ない個数の特性値にまとめた（図７）。主成分分析には、MarkerView software（AB Sciex社製）を用いた。図７に示されるように、Ｔ細胞とＢ細胞とで有意な差がみられた。すなわち、Ｔ細胞とＢ細胞とでは分泌する物質に違いがあり、本発明の手法ではその違いを検出できることを示している。つまり、本発明の手法によって細胞種を判別できることが明らかとなった。

また、２つの別個のＴ細胞において、ピークを比較した。両者は、互いに類似したピークを有していたが、分泌された化学物質にわずかな違いがあることがわかった（図８）。このことは、同種の細胞であっても、細胞ごとに、分泌される化学物質がわずかに異なること、および、本発明の手法によってそのわずかな違いを検出できることを示している。

〔実施例２〕
実施例１と同様の方法を用いて、直径４０μｍ、深さ５μｍのマイクロウェルを有するウェルプレートを作製した。作製したウェルプレートを直径２０ｍｍの貫通穴を開けた直径３５ｍｍの細胞培養ディッシュ底面にマニキュアで貼り付けた。２４時間乾燥後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）に浸漬し、次いで減圧することによって、マイクロウェル内の気泡を取り除いた。

ＥＳ培地（１０％ＦＢＳ、１％グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン、および１％ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーゲル培地）で培養したＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、または部分的に初期化されたｉＰＳ細胞（Ｐａｒｔｉａｌ−ｉＰＳ細胞）を１％トリプシン含有ＥＧＴＡ溶液で剥離した。次いで、細胞をＥＳ培地に懸濁し、１０００ｒｐｍで３分間遠心したのち、沈殿した細胞をＨＥＰＥＳ溶液に懸濁した。

１×１０^５個／ｍＬのＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞またはＰａｒｔｉａｌ−ｉＰＳ細胞を含むＨＥＰＥＳ溶液（25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.49 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 12 mM NaHCO₃, 0.37 mM KH₂PO₄および5.6 mM Glucose）５００μＬを、作製したウェルプレート上に載せ、３分間静置した。次いで、油（ＦＣ−４０，シグマ社製）を上部からゆっくりと注ぐことによって、細胞とＨＥＰＥＳ溶液をウェル内に封入した。室温で１時間培養した後、細胞が１個だけ入っているウェルから、細胞周辺の溶液２００ｆＬを金属皮膜したガラスマイクロニードルを用いて回収した（図９；ＥＳ細胞が入っているウェルからのサンプル回収中の顕微画像）。ガラスマイクロニードル中の溶液にイオン化溶媒として０．５％のギ酸を含むアセトニトリル１μＬを加え、エレクトロスプレーイオン化を介して、化学物質をイオン化すると同時に溶液を霧状化し、電場型フーリエ変換質量分析計に導入した。

得られたピークをＫＥＧＧデータベースと照合したところ、細胞由来のピークであることが確認された。ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞から得られたピークとＰａｒｔｉａｌ−ｉＰＳ細胞から得られたピークとを判別分析によって比較したところ、有意な差があり、この手法によって細胞種を判別できることが明らかとなった（図１０）。

〔実施例３〕
実施例１と同様の方法を用いて、直径１０μｍ、深さ５μｍのマイクロウェルを有するウェルプレート、直径１５μｍ、深さ５μｍのマイクロウェルを有するウェルプレート、および、直径４０μｍ、深さ５μｍのマイクロウェルを有するウェルプレートを作製した。作製したウェルプレートを直径２０ｍｍの貫通穴を開けた直径３５ｍｍの細胞培養ディッシュ底面にマニキュアで貼り付けた。２４時間乾燥後、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）に浸漬し、次いで減圧することによって、マイクロウェル内の気泡を取り除いた。

１×１０^５個／ｍＬのＴ細胞を含むＨＥＰＥＳ溶液（25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.49 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, 12 mM NaHCO₃, 0.37 mM KH₂PO₄ および5.6 mM Glucose）５００μＬを、作製したウェルプレート上に載せ、３分間静置した。次いで、油（ＦＣ−４０，シグマ社製）を上部からゆっくりと注ぐことによって、細胞とＨＥＰＥＳ溶液をウェル内に封入した。室温で１時間培養した後、細胞が１個だけ入っているウェルから、細胞周辺の溶液２００ｆＬを金属皮膜したガラスマイクロニードルを用いて回収した。ガラスマイクロニードル中の溶液にイオン化溶媒として０．５％のギ酸を含むアセトニトリル１μＬを加え、エレクトロスプレーイオン化を介して、化学物質をイオン化すると同時に溶液を霧状化し、電場型フーリエ変換質量分析計に導入した。

m/z = 229.216に相当する物質（テトラデカン酸であると考えられる）の濃度を、直径が異なるマイクロウェル同士で比較した。その結果を図１１に示す。マイクロウェルの直径が大きくなるにつれて、上記物質の濃度は低くなった。このように、微小な体積の溶液に細胞を封入することにより、分泌物の濃度が向上する、すなわち分析の感度の向上に寄与することがわかった。

本発明に係るウェルプレート、回収方法、分析方法、システム、およびキットは、例えば、医療分析分野において、１細胞レベルでの細胞分泌物の分析に利用し得る。

１ ウェルプレート
２ ウェル
３ 底面（底部）
４ 側面
５ ウェル形成面
２１ 親水性液体
２２ 細胞
２３ 細胞懸濁液
２４ 疎水性液体
２５ 液滴
４１ ウェルプレート
４２ ステージ
４３ サンプル回収装置
４４ サンプル処理装置
４５ 分析装置
５０ システム

Claims (11)

1. ウェル形成面に複数のウェルが形成されている細胞用のウェルプレートであって、
   上記ウェルは、容積が１５０ｆＬ以上で４０ｐＬ以下の範囲内であり、かつ、細胞を１個のみ収容可能なサイズに形成されており、
   上記ウェルは、底部に配された親水性表面と、当該底部を取り囲むように配された疎水性表面とを有してなり、
   上記ウェル形成面は、少なくとも上記ウェルを取り囲むように疎水性表面が配されている、ウェルプレート。
2. 上記ウェルは、直径が１０μｍ以上で４０μｍ以下であり、かつ、高さが２μｍ以上で３０μｍ以下の円柱形である、請求項１に記載のウェルプレート。
3. 上記親水性表面はガラスからなり、かつ、上記疎水性表面はフッ素樹脂からなる、請求項１または２に記載のウェルプレート。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載のウェルプレートを用いた、細胞からの分泌物の回収方法であって、
   疎水性液体と上記ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴から、当該親水性液体の少なくとも一部を回収する工程を含む、回収方法。
5. １個の細胞と親水性液体とを含んでなる上記液滴は、
   親水性液体に細胞が懸濁されてなる細胞懸濁液を、上記ウェルプレート上に注入し、各ウェルを当該細胞懸濁液で満たす工程１と、
   上記工程１の後に、疎水性液体を上記ウェルプレート上に注入する工程２とを行うことによって形成される、請求項４に記載の回収方法。
6. 請求項４または５に記載の回収方法を用いて回収した親水性液体中の成分を分析する工程を含む、分析方法。
7. 分析する上記工程は、細胞分泌物の成分を分析するために行われる、請求項６に記載の分析方法。
8. 請求項４もしくは５に記載の回収方法、または請求項６もしくは７に記載の分析方法に用いるためのシステムであって、
   請求項１〜３の何れか１項に記載のウェルプレート、および、疎水性液体と上記ウェルの底部に配された親水性表面とに取り囲まれた、１個の細胞と親水性液体とを含んでなる液滴から、当該親水性液体の少なくとも一部を回収するサンプル回収装置を備えたシステム。
9. 上記サンプル回収装置が回収する上記親水性液体中の成分を分析する分析装置をさらに備えた、請求項８に記載のシステム。
10. 請求項１〜３の何れか１項に記載のウェルプレートを含む、キット。
11. 金属被覆されたガラスマイクロニードルをさらに含む、請求項１０に記載のキット。