JP2017093359A - マイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物の解析方法 - Google Patents

マイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物の解析方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 細胞回収効率を飛躍的に上げると同時に、希釈率を大きくすることのできる、反応用マイクロチャンバーを内蔵したマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法を提供する。
【解決手段】 マイクロチャンバーアレイ装置において、基板２と電極３とフォトレジスト４が配置される誘電泳動による細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と、この捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と分かれており、前記マイクロチャンバーアレイ１に対向するように配置されるマイクロチャネル７からなる反応用マイクロチャンバー８からなる反応用マイクロチャンバーアレイ６とを具備する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、マイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物の解析方法に関するものである。
近年、細胞集団において、個々の細胞における遺伝子発現には大きなばらつきがあることが指摘されており、１細胞単位で遺伝子発現量を解析する研究が行われている。これに伴い、細胞集団を単一細胞レベルで同時に遺伝子発現解析することが強く求められている。細胞の遺伝子発現解析を行うため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＲＴ−ＰＣＲ）がよく用いられる。
特開２０１２−３４６４１号公報 特表２００４−５３５１７６号公報
Ｓｏｏ Ｈｙｅｏｎ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒａｒｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｒｒａｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ（ＩＳＭＭ），ｐ．２０６−２０７，Ｊｕｌｙ ２０１４ Ｓｏｏ Ｈｙｅｏｎ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ａｒｒａｙｉｎｇ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ａｃｏｕｓｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｅ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ，Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１５ 金秀▼弦▲他、希少細胞解析のためのＥｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ａｒｒａｙの開発、化学とマイクロ・ナノシステム学会第３０回研究会、２０１４年１０月 金秀▼弦▲他、Ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖｅ ｄｏｕｂｌｅ−Ｗｅｌｌ Ａｒｒａｙを用いた希少細胞の１細胞解析、２０１５年度精密工学会秋季大会学術講演会講演論文集、ｐ．７８３−７８４、２０１５年８月
しかしながら、単一細胞を密閉空間（マイクロチャンバー）に閉じ込め細胞破砕の後、ＲＴ−ＰＣＲによる１細胞の遺伝子発現解析を行うためには、細胞から取り出した細胞内物質を希釈（１０００倍以上）する必要がある。これは、細胞内物質がＲＴ−ＰＣＲを阻害するためである。
図８は直径を大きくしたマイクロチャンバーの模式図、図９はマイクロチャンバーの直径を大きくした場合の問題点を示す図、図１０は高さを高くしたマイクロチャンバーの模式図、図１１はマイクロチャンバーの高さを高くした場合の問題点を示す図、図１２は電場のシミュレーション結果を示す図である。
上記特許文献１のマイクロチャンバーアレイ装置の構造において、図８に示すようにマイクロチャンバーの直径を大きくすると、図９に示すように１つのチャンバーに２つ以上の細胞が入ってしまい、単一細胞の解析が難しくなってしまう。また、図１０に示すように、同構造においてマイクロチャンバーの高さを高くすると、図１１に示すように回収率（細胞回収効率）が大幅に小さくなる。これは、図１２に示すように、電界強度勾配（▽Ｅe 2 ）のベクトル方向が内部を向いており、電極から離れる（つまり、マイクロチャンバーの高さが高くなる）ほどその強度が弱まるため、上記特許文献１のように誘電泳動力を用いた発明では細胞を捕捉することが難しくなるからである。
また、上記特許文献２のようにチャネルを有しない装置では、細胞懸濁液を流して回収効率を高めること自体が困難である。
このように、効率のよい単一細胞解析のためには高い回収効率が必要であるが、希釈率を上げるためにマイクロチャンバーを大きくすると、複数の細胞を捕捉したり、誘電泳動力を用いて細胞を捕捉できないという問題があった。
本発明は、上記状況に鑑みて、細胞回収効率を飛躍的に上げると同時に、希釈率を大きくすることのできるマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法を提供することを目的とする。
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕マイクロチャンバーアレイ装置において、基板と電極とフォトレジストからなり誘電泳動により細胞を捕捉する細胞捕捉用マイクロチャンバーを備える細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと、この細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイとは分かれており、この細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと対向するように配置される、マイクロチャネルからなる反応用マイクロチャンバーを備える反応用マイクロチャンバーアレイとを具備することを特徴とする。
〔２〕上記〔１〕記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーと前記反応用マイクロチャンバーの位置を対応させ、解析時には前記細胞捕捉用マイクロチャンバーと前記反応用マイクロチャンバーによって密閉化されたマイクロチャンバーを形成可能にすることを特徴とする。
〔３〕上記〔１〕または〔２〕記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと前記反応用マイクロチャンバーアレイ間に細胞懸濁液および解析用の溶液を導入可能であることを特徴とする。
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記反応用マイクロチャンバーの寸法は、直径２０μｍ〜２００μｍ、高さ１０μｍ〜１０００μｍであることを特徴とする。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕の何れか一項記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記細胞は前記細胞捕捉用マイクロチャンバーに１つずつ捕捉され、前記反応用マイクロチャンバーの体積を大きくして解析時の前記細胞の希釈率を高くするとともに、細胞の回収効率を９０％以上に保つことができることを特徴とする。
〔６〕マイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物の解析方法において、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと反応用マイクロチャンバーアレイとの間に細胞懸濁液を導入し、誘電泳動による細胞捕捉を行い、解析用の溶液を導入して試薬の交換を行い、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと前記反応用マイクロチャンバーアレイとで捕捉された細胞のシーリングを行い、この細胞の解析を行うことを特徴とする。
本発明によれば、細胞の捕捉はチャンバーに１つずつ捕捉され、チャンバー高さが高くなっても、高い細胞の回収率を維持することができる。例えば、細胞の回収効率を飛躍的にあげる（９０％以上）と同時に、細胞の希釈率を大きくする（１０００倍以上）ことができる。
本発明の実施例を示すマイクロチャンバーアレイ装置の模式図である。 本発明の実施例を示すマイクロチャンバーアレイ装置の図面代用写真である。 本発明の実施例を示すマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析ステップを示す図である。 本発明の実施例を示す反応用マイクロチャンバーの高さが３０μｍの場合の流速及び流線を示す図である。 本発明の実施例を示す反応用マイクロチャンバーの高さが８０μｍの場合の流速及び流線を示す図である。 本発明の実施例を示す細胞捕捉の状態を示す図である。 本発明の実施例を示す反応用マイクロチャンバーの高さ（μｍ）と単一細胞の回収効率（％）の関係を示す図である。 直径を大きくしたマイクロチャンバーの模式図である。 マイクロチャンバーの直径を大きくした場合の問題点を示す図である。 高さを高くしたマイクロチャンバーの模式図である。 マイクロチャンバーの高さを高くした場合の問題点を示す図である。 電場のシミュレーション結果を示す図である。
本発明のマイクロチャンバーアレイ装置は、基板と電極とフォトレジストからなり誘電泳動により細胞を捕捉する細胞捕捉用マイクロチャンバーを備える細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと、この細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイとは分かれており、この細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと対向するように配置される、マイクロチャネルからなる反応用マイクロチャンバーを備える反応用マイクロチャンバーアレイとを具備する。
また、マイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法は、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと反応用マイクロチャンバーアレイとの間に細胞懸濁液を導入し、誘電泳動による細胞捕捉を行い、解析用の溶液を導入して試薬の交換を行い、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと前記反応用マイクロチャンバーアレイとで捕捉された細胞のシーリングを行い、この細胞の解析を行う。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１は本発明の実施例を示すマイクロチャンバーアレイ装置の模式図、図２は本発明の実施例を示すマイクロチャンバーアレイ装置の図面代用写真であり、図２（ａ）はマイクロチャンバーアレイ装置の斜視図を示す図面代用写真、図２（ｂ）は図２（ａ）のマイクロチャンバーアレイ装置のアレイ部分の上面拡大図を示す図面代用写真である。
まず、図１を参照して、本発明のマイクロチャンバーアレイ装置の概要を説明する。
本発明にかかるマイクロチャンバーアレイ装置は、下部構造として細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と、上部構造として反応用マイクロチャンバーアレイ６を備えており、上部構造と下部構造は別体として構成され、互いに対向するように配置されている。
細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１には、基板２、電極３、フォトレジスト４からなる細胞捕捉用マイクロチャンバー５がアレイ状に形成されている。また、反応用マイクロチャンバーアレイ６はマイクロチャネル７からなり、細胞捕捉用マイクロチャンバー５と対応する位置に凹形状の反応用マイクロチャンバー８がアレイ状に形成されている。細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と反応用マイクロチャンバーアレイ６の間を流路とし、細胞を効率良くデバイスに捕捉できるようにしている。この流路に細胞懸濁液が導入され、細胞は誘電泳動により細胞捕捉用マイクロチャンバー５に捕捉される。細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と反応用マイクロチャンバーアレイ６を接触させることにより、反応用マイクロチャンバー８と細胞捕捉用マイクロチャンバー５で密閉化されたマイクロチャンバーを構成できるように位置決めされている。捕捉された細胞はこの密閉化されたマイクロチャンバーで解析を行うことができる。
このように、細胞捕捉用のマイクロチャンバーと反応用のマイクロチャンバーを別体として構成することにより、誘電泳動による細胞の回収効率を向上するとともに、解析時には密閉化されたマイクロチャンバーを構成して高い（１０００倍以上）希釈率を実現することができる。
なお、本明細書において、細胞の「回収効率」とは、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１上を流れる細胞のうち、どれだけ捕捉できたかを示す割合を指している。例えば、１０００個の細胞が流れるうち、９５個の細胞を捕捉することができるような場合、細胞回収効率は９．５％である。他方、上記特許文献１における細胞の「捕捉効率」は、マイクロチャンバーアレイ上のマイクロチャンバーがどれだけ細胞で埋まっているかを示す割合を指している。例えば、１００個のマイクロチャンバーからなるマイクロチャンバーアレイ上を１０００個の細胞が流れるうち、９５個のマイクロチャンバーが細胞を捕捉した場合、マイクロチャンバーアレイの細胞捕捉率は９５％である。このように、両者は定義が異なることを明記しておく。
次に、図２を参照して、本発明のマイクロチャンバーアレイ装置の各部の構成を説明する。
この図において、２０は基板、２１は電極、２２は細胞捕捉用マイクロチャンバー、２３は反応用マイクロチャンバー、２４はマイクロチャネル、２５はアレイ部分、２６は導入口、２７は導出口である。
基板２０は例えばガラス基板であり、基板２０上に電極２１を形成する。電極２１はたとえばＩＴＯ電極であり、櫛型状ＩＴＯ電極を互いに噛み合うように配置してもよい。この電極２１をまたぐように形成される細胞捕捉用マイクロチャンバー２２の直径は細胞一つと同程度の大きさとする。また、細胞捕捉率を上げるためにチャンバー高さを低く形成する（例えば、４μｍ）。解析対象物としての細胞を含んだ細胞懸濁液や解析用の溶液は導入口２６からマイクロチャンバーアレイ装置に導入され、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と反応用マイクロチャンバーアレイ６間の流路を流れて、導出口２７から排出される。図２（ｂ）に示されるアレイ部分２５が図１に示した構造を有しており、マイクロチャネル２４はＰＤＭＳ製である。
このように、細胞捕捉用マイクロチャンバー２２の直径を細胞と同程度とすることで、１つのマイクロチャンバーに２つ以上の細胞は捕捉されない。また、細胞の捕捉後は流路を閉じて、細胞捕捉用マイクロチャンバー２２と反応用マイクロチャンバー２３で密閉化されたマイクロチャンバーを形成して細胞を区画化することができる。
図３は本発明の実施例を示すマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物の解析ステップを示す図である。なお、ここでは解析がＲＴ−ＰＣＲの場合で説明する。
この図において、９は細胞懸濁液、１０は検査対象物としての細胞、１１は解析用の溶液、１２は密閉化されたマイクロチャンバー、１３は細胞内物質、１４は増幅されたＤＮＡである。なお、図１と同じ部分の符号は一部省略しているが、下記説明中で引用する。
まず、図３（ａ）に示すように、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と反応用マイクロチャンバーアレイ６の間に細胞懸濁液９が導入される。
次に、図３（ｂ）に示すように、電極３を用いた誘電泳動により、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１の細胞捕捉用マイクロチャンバー５で細胞１０の捕捉を行う。
次に、図３（ｃ）に示すように、解析用の溶液１１を導入して試薬交換を行う。
次に、図３（ｄ）に示すように、細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１と反応用マイクロチャンバーアレイ６間の流路を閉じ、細胞捕捉用マイクロチャンバー５と反応用マイクロチャンバー８を接触させることで密閉化されたマイクロチャンバー１２を形成し、捕捉された細胞１０のシーリングを行う。
次に、図３（ｅ）に示すように、密閉化されたマイクロチャンバー１２内で電極に強い電圧を印加することで捕捉された細胞１０を電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により破砕する。これにより、細胞内物質１３が密閉化されたマイクロチャンバー１２内に開放され、解析用の溶液１１で希釈される。
次に、図３（ｆ）に示すように、密閉化されたマイクロチャンバー１２内で解析を行う。例えば、ＲＴ−ＰＣＲの場合、増幅されたＤＮＡ１４の解析を行う。反応用マイクロチャンバーの体積を細胞内物質１３を１０００倍以上に希釈できる体積とすることで、細胞内物質１３によるＲＴ−ＰＣＲの阻害が起こらないようにすることができる。
このように、本発明のマイクロチャンバーアレイ装置によれば、反応用マイクロチャンバーアレイ６とは分離した状態の細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ１で細胞を捕捉することで高い回収効率を実現できるとともに、細胞捕捉後は、解析用の溶液で満たされた反応用マイクロチャンバー５と細胞捕捉用マイクロチャンバー８により密閉化されたマイクロチャンバー１２を形成することで、高い希釈率（１０００倍以上）での解析を行うことができる。
図４は本発明の実施例を示す反応用マイクロチャンバーの高さが３０μｍの場合の流速及び流線を示す図、図５は高さが８０μｍの場合の流速及び流線を示す図である。なお、図４、５において、縦軸はＸ軸方向の距離（μｍ）を示し、横軸はＹ軸方向の距離（μｍ）を示す。また、図６は本発明の実施例を示す細胞捕捉の状態を示す図であり、図７は本発明の実施例を示す反応用マイクロチャンバーの高さ（μｍ）と単一細胞の回収効率の関係を示す図である。図７において、縦軸は単一細胞の回収効率（％）を示し、横軸は反応用マイクロチャンバーの高さ（μｍ）を示している。
これらの図から明らかなように、本発明のマイクロチャンバーアレイ装置によれば、反応用マイクロチャンバーの高さを変化させても、細胞の回収効率には大きな変化が見られず、高い回収効率を維持していることがわかる。これは、流路内の流れが層流であるため、上部に反応用マイクロチャンバーがあっても流れの乱れが小さく、流速分布に大きな影響を与えないためである。また、マイクロチャンバーを大きくしても、単一細胞の捕捉が行われていることが見てとれる。
なお、反応用マイクロチャンバーは、直径２０μｍ〜２００μｍ、高さ１０μｍ〜１０００μｍの寸法で製作可能である。また、本発明のマイクロチャンバーアレイ装置で測定された細胞回収効率は９２±２％である。
ちなみに上記特許文献１においては、マイクロチャンバーの直径は２５〜３５μｍ、高さ（深さ）は１５μｍ、体積は７．３〜１４．４ｐＬであり、上記非特許文献３に示したように回収効率は実験結果で１０％であった。
このように、本発明のマイクロチャンバーアレイ装置によれば、９０％以上の細胞回収効率を保ちつつ、密閉化されたマイクロチャンバー１２の体積を大きくして、細胞内物質を１０００倍以上に希釈することができる。
現在、市販されている１細胞ＲＴ−ＰＣＲ装置であるＣ１（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ社製）の同時解析可能な最大細胞数は９６である。本発明のマイクロチャンバーアレイ装置は構造が単純で集積化が容易なため、超並列一細胞解析が可能となる。例えば、１平方センチメートル内に高い希釈率で希釈可能な反応用マイクロチャンバーを１００００個形成可能であるため、１００００細胞の同時解析が実現できる。これによって、細胞の不均一性の状態を把握する基礎研究のみならず、希少ガン細胞の検出等の医療への応用も期待される。
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
本発明は、細胞回収効率を飛躍的に上げると同時に、希釈率を大きくすることのできる、反応用マイクロチャンバーを内蔵したマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法として利用可能である。
１ 細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイ
２、２０ 基板
３、２１ 電極
４ フォトレジスト
５、２２ 細胞捕捉用マイクロチャンバー
６、２３ 反応用マイクロチャンバーアレイ
７、２４ マイクロチャネル
８、２５ 反応用マイクロチャンバー
９ 細胞懸濁液
１０ 細胞
１１ 解析用の溶液
１２ 密閉化されたマイクロチャンバー
１３ 細胞内物質
１４ 増幅されたＤＮＡ
２５ アレイ部分
２６ 導入口
２７ 導出口

Claims (6)

  1. 基板と電極とフォトレジストからなり誘電泳動により細胞を捕捉する細胞捕捉用マイクロチャンバーを備える細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと、
    該細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイとは分かれており、該細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと対向するように配置される、マイクロチャネルからなる反応用マイクロチャンバーを備える反応用マイクロチャンバーアレイとを具備することを特徴とするマイクロチャンバーアレイ装置。
  2. 請求項１記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーと前記反応用マイクロチャンバーの位置を対応させ、解析時には前記細胞捕捉用マイクロチャンバーと前記反応用マイクロチャンバーによって密閉化されたマイクロチャンバーを形成可能にすることを特徴とするマイクロチャンバーアレイ装置。
  3. 請求項１または２に記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと前記反応用マイクロチャンバーアレイ間に細胞懸濁液および解析用の溶液を導入可能であることを特徴とするマイクロチャンバーアレイ装置。
  4. 請求項１〜３記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記反応用マイクロチャンバーの寸法は、直径２０μｍ〜２００μｍ、高さ１０μｍ〜１０００μｍであることを特徴とするマイクロチャンバーアレイ装置。
  5. 請求項１〜４記載のマイクロチャンバーアレイ装置において、前記細胞は前記細胞捕捉用マイクロチャンバーに１つずつ捕捉され、前記反応用マイクロチャンバーの高さを高くして解析時の前記細胞の希釈率を高くするとともに、細胞の回収効率を９０％以上に保つことができることを特徴とするマイクロチャンバーアレイ装置。
  6. 細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと反応用マイクロチャンバーアレイとの間に細胞懸濁液を導入し、誘電泳動による細胞捕捉を行い、解析用の溶液を導入して試薬の交換を行い、前記細胞捕捉用マイクロチャンバーアレイと前記反応用マイクロチャンバーアレイとで捕捉された細胞のシーリングを行い、該細胞の解析を行うことを特徴とするマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物の解析方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108728328A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 中北大学 集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片
WO2019069900A1 (ja) 2017-10-03 2019-04-11 Nok株式会社 細胞捕捉装置

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6775223B2 (ja) * 2016-10-27 2020-10-28 シャープ株式会社 蛍光検査システム、分子検査方法及び蛍光検査方法
CN115943216A (zh) * 2020-05-20 2023-04-07 耶鲁大学 实现双亚泊松单细胞rna测序的集成介电泳-俘获和纳米阱转移方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009504161A (ja) * 2005-08-11 2009-02-05 バイオトローブ インコーポレイティッド アッセイ、合成及び保管のための装置、並びにその製造法、使用法及び操作法
JP2011000079A (ja) * 2009-06-19 2011-01-06 Univ Of Tokyo 粒子を操作する方法及びマイクロ流体装置
WO2012020711A1 (ja) * 2010-08-09 2012-02-16 国立大学法人東京大学 電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法
JP2012529643A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 単一細胞または他の粒子の分析用ピコウェル捕捉装置
WO2014144822A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Immumetrix, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
JP2014233208A (ja) * 2013-05-30 2014-12-15 独立行政法人理化学研究所 細胞用ウェルプレートおよび細胞分泌物の分析方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100261159A1 (en) 2000-10-10 2010-10-14 Robert Hess Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof
US8236574B2 (en) * 2010-03-01 2012-08-07 Quanterix Corporation Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009504161A (ja) * 2005-08-11 2009-02-05 バイオトローブ インコーポレイティッド アッセイ、合成及び保管のための装置、並びにその製造法、使用法及び操作法
JP2012529643A (ja) * 2009-06-09 2012-11-22 オックスフォード・ジーン・テクノロジー・アイピー・リミテッド 単一細胞または他の粒子の分析用ピコウェル捕捉装置
JP2011000079A (ja) * 2009-06-19 2011-01-06 Univ Of Tokyo 粒子を操作する方法及びマイクロ流体装置
WO2012020711A1 (ja) * 2010-08-09 2012-02-16 国立大学法人東京大学 電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法
WO2014144822A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Immumetrix, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
JP2014233208A (ja) * 2013-05-30 2014-12-15 独立行政法人理化学研究所 細胞用ウェルプレートおよび細胞分泌物の分析方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019069900A1 (ja) 2017-10-03 2019-04-11 Nok株式会社 細胞捕捉装置
US11421198B2 (en) 2017-10-03 2022-08-23 Nok Corporation Cell capture apparatus
CN108728328A (zh) * 2018-05-30 2018-11-02 中北大学 集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片
CN108728328B (zh) * 2018-05-30 2021-11-16 中北大学 集成单细胞捕获的微流控细胞分选芯片

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