CN104087506B - 一种高通量单细胞反转录pcr分析装置 - Google Patents

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Abstract

一种高通量单细胞逆转录PCR装置，试剂进口、样品进口通过微阀和微流道连接，微流道和两个以上串联的单细胞捕获腔的一端连接，串联的单细胞捕获另一端和废液出口连接，每一个单细胞捕获腔包括一个倒三角辅助捕获结构和一个捕获陷阱，捕获陷阱位于单细胞捕获腔的中央下部，倒三角辅助捕获结构位于捕获陷阱上方，捕获陷阱和逆转录腔连接，逆转录腔和核酸扩增腔连接，从样品进口注入的细胞悬浮液进入串联的细胞捕获腔，在水动力作用下，细胞被捕获至细胞捕获陷阱，然后通过试剂进口加入细胞裂解液，细胞裂解液依次进入细胞捕获陷阱，完成逆转录、核酸扩增和检测，本发明结构简单且易于实现。

Description

一种高通量单细胞反转录PCR分析装置
技术领域
本发明涉及分子生物学、细胞生物学和微流控技术领域，具体涉及一种高通量单细胞逆转录PCR装置。
背景技术
细胞是生物体基本的结构和功能单位，有机体的生理功能和一切生命现象都是以细胞为基础表达的。核酸是生命体遗传物质，和细胞的分裂、生长、分化和凋亡等活动息息相关。PCR(聚合酶链式反应)技术是一种重要的核酸检测技术，用于放大扩增特定的DNA片段；反转录PCR是以RNA起点用以分析细胞基因表达情况的手段。由于PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优点而广泛应用于生物、医学、农业和食品安全等领域。
传统基因扩增及测定技术只能获得大量细胞的平均统计数据，这种平均结果会直接掩盖掉细胞群体中单细胞的差异性，可能导致对细胞生理过程的误解，导致误判或不能及早判断。针对单细胞的基因分析则使得同一细胞内或不同细胞间多种基因的同时测定成为可能，可得到单个细胞的基因分析结果。但常规的PCR仪不能满足单细胞基因分析单原始样本高通量的要求，微流控技术的快速发展为解决这一问题提供了可能。
单细胞PCR的流程包括细胞捕获、细胞裂解、核酸纯化和核酸扩增以及检测等步骤，主要技术瓶颈在于如何高效率低成本的捕获单细胞和高通量分析的便捷实现。常规的细胞捕获方法包括光镊、磁力、介电泳以及机械力捕获等，这些方法大多存在所需设备复杂、操作难度大或者难以长期稳定捕获的缺点。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高通量单细胞逆转录PCR装置，能够实现单细胞被动捕获，使高通量单细胞基因的稳定分析成为现实。
为实现上述技术目的，本发明提出如下技术方案：
一种高通量单细胞逆转录PCR装置，包括试剂进口1、样品进口2，试剂进口1、样品进口2通过微阀6和微流道7的入口连接，微流道7的出口通过微阀6和两个以上串联的单细胞捕获腔3的一端连接，串联的单细胞捕获腔3另一端通过微阀6和废液出口11连接，单细胞捕获腔3之间通过微阀6连接，每一个单细胞捕获腔3包括一个倒三角辅助捕获结构8和一个捕获陷阱9，捕获陷阱9位于单细胞捕获腔3的中央下部，倒三角辅助捕获结构8位于捕获陷阱9上方，捕获陷阱9通过微阀6和逆转录腔4的上方连接，逆转录腔4的下方通过微阀6和核酸扩增腔5连接，逆转录腔4预封装有预转录试剂，核酸扩增腔5预封装有核酸扩增试剂。
所述的捕获陷阱9左侧采用一个斜坡结构10，右侧为直角结构，微加热器12紧贴在直角结构外侧面，微加热器12采用金属铂薄膜微加热器。
所述的倒三角辅助捕获结构8能够由倒梯形结构、倒圆锥结构代替。
所述逆转录腔4外侧设有用于为逆转录提供条件的热学装置13。
所述核酸扩增腔5外侧设有用于核酸扩增的热循环装置14和光学检测装置15。
所述单细胞捕获腔3的捕获陷阱9下方还能够直接连接核酸扩增装置用于PCR反应。
本发明的有益效果是：(1)细胞捕获设计结构简单且易于实现较高的捕获效率。(2)整体结构设计高度集成，易于加工实现，操作方便且节约空间。(3)可以实现单细胞基因表达的高通量分析。
附图说明
图1是本发明装置整体示意图。
图2是单细胞捕获原理图。
图3是核酸反转录示意图。
图4是核酸扩增示意图。
图5是单细胞捕获结构流线仿真图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行清楚描述。
参照图1和图2，一种高通量单细胞逆转录PCR装置，包括试剂进口1、样品进口2，试剂进口1、样品进口2通过微阀6和微流道7的入口连接，微流道7的出口通过微阀6和两个以上串联的单细胞捕获腔3的一端连接，串联的单细胞捕获腔3另一端通过微阀6和废液出口11连接，单细胞捕获腔3之间通过微阀6连接，每一个单细胞捕获腔3包括一个倒三角辅助捕获结构8和一个捕获陷阱9，捕获陷阱9位于单细胞捕获腔3的中央下部，倒三角辅助捕获结构8位于捕获陷阱9上方，捕获陷阱9通过微阀6和逆转录腔4的上方连接，逆转录腔4的下方通过微阀6和核酸扩增腔5连接，逆转录腔4预封装有预转录试剂，核酸扩增腔5预封装有核酸扩增试剂。
所述的捕获陷阱9左侧采用一个斜坡结构10，右侧为直角结构，提高细胞捕获效率，微加热器12紧贴在直角结构外侧面，用于辅助细胞裂解，微加热器12采用金属铂薄膜微加热器。
所述的倒三角辅助捕获结构8能够由倒梯形结构、倒圆锥结构代替。
参照图3，所述逆转录腔4外侧设有用于为逆转录提供条件的热学装置13。
参照图4，所述核酸扩增腔5外侧设有用于核酸扩增的热循环装置14和光学检测装置15。
所述单细胞捕获腔3的捕获陷阱9下方还能够直接连接核酸扩增装置用于PCR反应。
本发明的工作原理为：
参照图2，从样品进口2注入细胞悬浮液，通过微阀6进入串联的细胞捕获腔3，细胞悬浮液依次通过每个细胞捕获腔3，在水动力作用下，细胞被捕获至细胞捕获陷阱9，仿真结果如图5所示，然后通过试剂进口1加入细胞裂解液，细胞裂解液通过微阀6依次进入细胞捕获陷阱9，在微加热器13辅助作用下细胞裂解，裂解后所得核酸通过微阀6进入逆转录腔4，完成逆转录，逆转录结束样品通过微阀6进入核酸扩增腔5进行核酸扩增和检测。
具体操作步骤如下：
1、预处理：
反应开始时，将细胞捕获腔3之间所有微阀6及试剂进口1微阀6打开，使用缓冲液清洗细胞捕获单元，然后关闭所有微阀6，使用缓冲液清洗为防止细胞粘附在微流道7内壁上；
2、细胞捕获：
通过样品进口2注入细胞悬浮液，具体操作时先使细胞悬浮液充满入口，再然后打开和样品进口2连接的微阀6，以防止空气进入形成气泡；再打开细胞捕获腔之间的微阀6，水动力下单细胞被动捕获至各细胞捕获陷阱9；捕获结束后在显微镜下观察细胞捕获情况，并从废液出口11导走多余细胞悬浮液；
捕获结束用缓冲液冲洗细胞捕获腔3，用于去除细胞外RNA，并加入细胞裂解液，然后关闭细胞捕获腔3的各阀门，形成隔离单细胞反应室；
3、细胞裂解
借助裂解液和热作用裂解细胞；
4、逆转录
打开逆转录腔上方的微阀6，将所得单细胞裂解后所得注入逆转录腔4，待逆转录结束；
5、PCR扩增
逆转录结束后，打开核酸扩增腔5和逆转录腔4之间的微阀6，逆转录所得DNA进入核酸扩增腔5，然后进行PCR扩增，PCR扩增及检测通过外置的热循环装置15和光学检测装置16辅助完成；
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种高通量单细胞逆转录PCR装置，包括试剂进口(1)、样品进口(2)，其特征在于：试剂进口(1)、样品进口(2)通过微阀(6)和微流道(7)的入口连接，微流道(7)的出口通过微阀(6)和两个以上串联的单细胞捕获腔(3)的一端连接，串联的单细胞捕获腔(3)另一端通过微阀(6)和废液出口(11)连接，单细胞捕获腔(3)之间通过微阀(6)连接，每一个单细胞捕获腔(3)包括一个倒三角辅助捕获结构(8)和一个捕获陷阱(9)，捕获陷阱(9)位于单细胞捕获腔(3)的中央下部，倒三角辅助捕获结构(8)位于捕获陷阱(9)上方，捕获陷阱(9)通过微阀(6)和逆转录腔(4)的上方连接，逆转录腔(4)的下方通过微阀(6)和核酸扩增腔(5)连接，逆转录腔(4)预封装有预转录试剂，核酸扩增腔(5)预封装有核酸扩增试剂。
2.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞逆转录PCR装置，其特征在于：所述的捕获陷阱(9)左侧采用一个斜坡结构(10)，右侧为直角结构，微加热器(12)紧贴在直角结构外侧面，微加热器(12)采用金属铂薄膜微加热器。
3.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞逆转录PCR装置，其特征在于：所述的倒三角辅助捕获结构(8)能够由倒梯形结构、倒圆锥结构代替。
4.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞逆转录PCR装置，其特征在于：所述逆转录腔(4)外侧设有用于为逆转录提供条件的热学装置(13)。
5.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞逆转录PCR装置，其特征在于：所述核酸扩增腔(5)外侧设有用于核酸扩增的热循环装置(14)和光学检测装置(15)。
6.根据权利要求1所述的一种高通量单细胞逆转录PCR装置，其特征在于：所述单细胞捕获腔(3)的捕获陷阱(9)下方还能够直接连接核酸扩增装置用于PCR反应。
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