CN107603849B - 单细胞rt-pcr芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的单细胞RT‑PCR芯片包括具有双套孔微阵列结构的基片；所述双套孔微列阵结构包括若干双套孔，该双套孔包括第一孔和位于第一孔内下方的第二孔；所述第二孔实现单细胞捕获，所述第一孔可以盛装反应液，作为RT‑PCR反应池。本发明提供的单细胞RT‑PCR芯片解决了传统单细胞微孔阵列中反应池体积小的问题，高效快捷地实现单细胞捕获与反应试剂进样；同时本发明芯片的结构简单、无需复杂的微流控液路，节省了成本，为单细胞RT‑PCR的产品化提供了最大的可能性。

Description

单细胞RT-PCR芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于单细胞研究领域，特别涉及一种采用单细胞PT-PCR芯片及其制备方法。

背景技术

1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家Kary.B.Mullis在迥然灵感的启迪下发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，实现了在人体外无限扩增DNA片段的梦想。随后，Saiki首次应用PCR法成功地扩增出人的β-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。

PCR是体外酶促反应合成特异性DNA的一种方法，它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应，扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。单细胞逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，通过对单个细胞进行捕获、裂解、mRNA逆转录、目标基因片段PCR扩增以及结果检测分析，实现在基因水平上对细胞异质性的研究。通过对多个单细胞进行平行化的RT-PCR分析，可以对样品细胞群进行种类区分，此过程可运用于循环肿瘤细胞的检测、癌症预后监测等领域；高通量单细胞RT-PCR也可以对同类细胞其目标基因的表达差异进行定性和定量，此过程可运用于药物筛选等领域。

现有的单细胞研究手段可以分为三大类：单细胞微孔阵列芯片、油包水微流控芯片和结构设计精细的微流控芯片。

单细胞微孔阵列芯片采用在基片上刻蚀与单个细胞体积相仿的微孔，细胞在重力作用下进入微孔，由于微孔体积与单个细胞相仿，因此一个微孔只能捕获一个细胞。然而，进行单细胞RT-PCR的时候，需要足够的试剂(>5nL/cell)进行实验。如果增大微孔的体积，将导致一个微孔中可能出现多个细胞的情况，即使可以通过稀释细胞悬浮液降低多细胞情况，但是这种泊松分布使得对微孔的利用率大大减小。

油包水微流控芯片是采用T型结构产生油包水体系，此方法单细胞占有率仍然限制于泊松分布，增大液滴体积使得单细胞占有率大大减小，而小体积的液滴由于微流控的密封结构，使得后期进液困难。

结构设计精细的微流控芯片，通过阀的开关控制可以多步进行液体控制，虽然此类芯片已成功应用于单细胞研究，但是其复杂的结构使得成本高、操作困难。

因此，设计一种高效、经济并且操作方便的芯片对于单细胞研究具有重要意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是为了提供一种单细胞RT-PCR芯片，以解决上述至少一项技术问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种单细胞RT-PCR芯片，该芯片包括：基片、盖片和密封圈。

在进一步实施方案中，所述基片具有双套孔微阵列结构，该双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排等；

在进一步实施方案中，所述双套孔包括第一孔以及由第一孔底部部分区域进一步向下开设的第二孔。

在进一步实施方案中，所述第一孔的直径大于第二孔的直径；所述第一孔的深度大于、小于或等于第二孔的深度；

在进一步实施方案中，所述第二孔的直径和深度均大于细胞的直径(～15μm)且小于细胞直径的两倍，从而只允许单个细胞进入第二孔；

在进一步实施方案中，每一双套孔中所述第二孔为一个或多个。

在进一步实施方案中，所述第二孔为一个时，该第二孔由第一孔底部中心进一步向下开设；所述第二孔为多个时，该第二孔均匀地由第一孔底部向下开设。

在进一步实施方案中，所述盖片与基板之间设置密封圈，该密封圈将所述双套孔微列阵围绕在内部，使得盖片与基板之间形成密封空间。

在进一步实施方案中，所述第二孔捕捉单细胞，所述双套孔中充满反应试剂，所述密封空间充满密封油。

在进一步实施方案中，所述基板的材料为无生物毒性的材料。

在进一步实施方案中，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢。

在进一步实施方案中，所述盖片为透明材料。

在进一步实施方案中，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片。

为实现上述目的，作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种单细胞RT-PCR芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取一基板，对该基板进行清洗以去除表面的有机杂质和无机杂质；

步骤2：在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基片，所述双套孔微阵列的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排等；

步骤3：对基片进行表面处理；

步骤4：用密封圈将双套孔微列阵结构围绕在内部，用盖片压住密封圈完成芯片封装。

在进一步实施方案中，所述双套孔微阵列的制备过程如下：

步骤21：基板正面均匀地旋涂一层光刻胶；

步骤22：通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔的图形转移到基板上；

步骤23：清洗光刻胶；

步骤24：进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔的图形转移到基板上。

在进一步实施方案中，所述第二孔由第一孔底部部分区域进一步向下开设；所述第一孔的直径大于第二孔的直径；所述第一孔的深度大于、小于或等于第二孔的深度；所述第二孔的直径和深度均大于细胞直径(～15μm)且小于两倍的细胞直径。

在进一步实施方案中，每一双套孔中所述第二孔为一个或多个；所述第二孔为一个时，该第二孔由第一孔底部中心进一步向下开设；所述第二孔为多个时，该第二孔均匀地由第一孔底部向下开设。

在进一步实施方案中，所述清洗方法包括有机清洗和无机清洗；所述表面处理为亲水处理，以减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。所述亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白(BSA)溶液冲洗法。

在进一步实施方案中，所述有机清洗过程为：依次使用丙酮、乙醇、去离子水对基片进行超声清洗；所述无机清洗过程为：1体积30％过氧化氢与3体积98％浓硫酸混合成清洗液，基片浸入清洗液，热板120℃下保持30分钟。

在进一步实施方案中，所述基板为无生物毒性的材料，该无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢。

在进一步实施方案中，所述盖片为透明材料，该透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片。

(三)有益效果

(1)本发明提供的单细胞RT-PCR芯片结构设计简单，降低了成本。

(2)本发明提供的单细胞RT-PCR芯片结，具有一种双套孔微阵列结构，每一个双套孔的结构特征为一个大孔里面包含一个或多个小孔，可作为一个独立反应池；此结构在捕获单细胞时具有通量高、单细胞占有率高的优点，同时提供足够大空间的反应池作为单细胞后续的检测实验，巧妙地解决了传统单细胞芯片的单细胞占有率和单细胞检测所需溶液体积之间的矛盾。

(3)本发明提供的单细胞RT-PCR芯片，能够灵活地改变双套孔微阵列的排布方式、双套孔的数量、以及结构尺寸等参数，适用于不同类型的单细胞检测体系。

附图说明

图1为本发明单细胞RT-PCR芯片在工作状态下的制备过程流程图。

图2为本发明单细胞RT-PCR芯片的内部结构示意图。

图3为本发明单细胞RT-PCR芯片在工作状态下的结构示意图。

图4为本发明实施例1中双套孔微阵列排布及双套孔结构的示意图。

图5为本发明实施例2中双套孔微阵列排布及双套孔结构的示意图。

图6为本发明实施例3中双套孔微阵列排布及双套孔结构的示意图。

图7为本发明实施例4中双套孔微阵列排布及双套孔结构的示意图。

附图标号说明：

20 基片

23 捕获的单细胞

26 反应液

27 密封油

28 盖片

29 密封圈

30 第一孔

31 第二孔

具体实施方式

为了进一步说明本发明的具体技术内容，使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

根据本发明总体上的发明构思，作为本发明的一个方面，提供一种单细胞RT-PCR芯片，如图2所示，该芯片包括：基片20、盖片28以及位于两者之间的密封圈29。

优选地，所述基片20具有双套孔微阵列结构，该双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排等。

优选地，所述双套孔包括第一孔30以及由第一孔30底部部分区域进一步向下开设的第二孔31。

优选地，所述第一孔30的直径大于第二孔31的直径；所述第一孔30的深度大于、小于或等于第二孔31的深度。

优选地，所述第二孔31的直径和深度均大于细胞的直径(～15μm)且小于细胞直径的两倍，只允许单个细胞进入第二孔。

优选地，所述第二孔31为一个或多个。

更优选地，所述第二孔31为一个时，该第二孔31由第一孔30中心底部进一步向下开设；所述第二孔31为多个时，该第二孔31均匀地由第一孔30底部的部分区域进一步向下开设。

优选地，所述密封圈29将所述双套孔微列阵围绕在内部，使得盖片28与基片20之间形成密封空间。

优选地，所述芯片在工作状态时，所述第二孔31捕捉单细胞，所述双套孔中充满反应试剂作为RT-PCR反应池，所述密封空间充满密封油。

优选地，所述基片20的材料为无生物毒性的材料。

更优选地，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢。

优选地，所述盖片28为透明材料。

更优选地，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片。

根据本发明总体上的发明构思，作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种单细胞RT-PCR芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：取一基板，对该基板进行清洗，以去除表面的有机杂质和无机杂质；

步骤2：在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基:20，所述双套孔微阵列的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排等；

步骤3：对基片20进行表面处理；

步骤4：用密封圈29将双套孔微列阵结构围绕在内部，用盖片28压住密封圈完成芯片封装。

进一步地，所述双套孔微阵列的制备过程如下：

步骤21：基板正面均匀地旋涂一层光刻胶；

步骤22：通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔30的图形转移到基板上；

步骤23：清洗光刻胶；

步骤24：进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔31的图形转移到基板上。

进一步地，所述第二孔31由第一孔30底部部分区域进一步向下开设；所述第一孔30的直径大于第二孔31的直径；所述第一孔30的深度大于、小于或等于第二孔31的深度；所述第二孔31的直径和深度均大于细胞直径(～15μm)且小于两倍的细胞直径。

进一步地，每一双套孔中所述第二孔31为一个或多个；所述第二孔31为一个时，该第二孔31由第一孔30底部中心进一步向下开设；所述第二孔31为多个时，该第二孔31均匀地由第一孔30底部向下开设。

进一步地，所述清洗方法包括有机清洗和无机清洗；所述表面处理为亲水处理，以减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。所述亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白(BSA)溶液冲洗法。

更进一步地，所述有机清洗过程为：依次使用丙酮、乙醇、去离子水对基片进行超声清洗；所述无机清洗过程为：1体积30％过氧化氢与3体积98％浓硫酸混合成清洗液，基片浸入清洗液，热板120℃下保持30分钟。

进一步地，所述基板为无生物毒性的材料，该无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢。

进一步地，所述盖片28为透明材料，该透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片。

进一步地，所述芯片在工作状态下的封装过程如下：

步骤41：细胞入孔：

优选地，将上述步骤3的基片20水平放置在细胞悬浮液中，静置一段时间后在重力作用下使细胞进入第一孔30或第二孔31；

优选地，对细胞悬浮液和基片20的密封体系进行离心，将细胞甩入第一孔30和第二孔31，加快细胞入孔进程；

步骤42：保持第一孔30和第二孔31朝上，取出基片20，用缓冲液冲洗基片表面，清除基片20表面以及第一孔30中的细胞；

步骤43：用惰性气体或氮气吹干基片表面以及第一孔30和第二孔31中残留的缓冲液；或者使残留的缓冲液自然蒸发；

步骤44：向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂；

优选地，采用刮液方式向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂，具体步骤如下：

步骤45：在所述基片20的一端滴加一步法RT-PCR反应试剂；

用硅胶片以一定的力度、倾斜度、速度向基片的另一端刮液，使反应试剂充满第一孔30和第二孔31；

刮液完成之后，沿刮液方向迅速添加密封油。

步骤46：继续向基片20表面添加密封油，形成一定厚度的密封油层；

在双套孔微列阵周围设置密封圈29，在基片20表面形成一个凹槽；

向所述凹槽中加入过量的密封油；

步骤47：取一盖片28，清洗并烘干，去除盖片28上的有机杂质和无机杂质；将上述盖片28水平压在密封圈和密封油上，完成工作状态下单细胞RT-PCR芯片的封装。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述说明。

实施例1：

本实施例提供一种具有双套孔微阵列结构的单细胞RT-PCR芯片，如图4所示，该芯片的双套孔微阵列的阵列排布为矩形，所述双套孔包括一个第一孔30和一个第二孔31，该芯片在工作状态下的制备过程如图1所述，具体如下：

(1)取一基板，该基板为无生物毒性的材料；

优选地，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢等；

优选地，对所述基板进行清洗，以去除表面的有机杂质和无机杂质；

更优选地，所述基板的清洗方法包括有机清洗和无机清洗；其中，所述有机清洗过程为：依次使用丙酮、乙醇、去离子水对基片进行超声清洗；所述无机清洗过程为：1体积30％过氧化氢与3体积98％浓硫酸混合成清洗液，基片浸入清洗液，热板120℃下保持30分钟。

(2)在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基片20，所述双套孔微阵列的制备方法如下：

在步骤1基础上，于基板正面旋涂一层均匀的光刻胶；

通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔30的图形转移到基板上；

清洗光刻胶，并重复步骤1所述清洗过程；

进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔31的图形转移到基板上，得到具有双套孔微阵列结构的基片20。

优选地，所述双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式为矩形；

优选地，所述双套孔包括第一孔30及位于第一孔内下方的第二孔31；

优选地，所述第一孔30的直径大于第二孔31的直径；所述第一孔30的深度可大于、小于或等于第二孔31的深度；

更优选地，所述第二孔31的直径和深度均大于细胞直径(～15μm)且小于两倍的细胞直径；

更优选地，所述第一孔30的直径为100μm，深度为40μm；

优选地，所述第二孔31为一个，该第二孔31位于第一孔30中心的下方；

(3)对步骤2得到的基片20进行表面处理；

优选地，所述表面处理采用亲水处理，以减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。

更优选地，所述亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白(BSA)溶液冲洗法。

(4)细胞入孔；

优选地，所述细胞入孔可通过将上述基片水平放置在细胞悬浮液中，静置一段时间后在重力作用下使细胞进入第一孔30或第二孔31；

优选地，所述细胞入孔可通过对细胞悬浮液和基片20的密封体系进行离心，将细胞甩入第一孔30和第二孔31，加快细胞入孔进程；

(5)保持第一孔30和第二孔31朝上，取出基片20，用缓冲液冲洗基片表面，清除基片20表面以及第一孔30中的细胞；

(6)用惰性气体或氮气吹干基片表面以及第一孔30和第二孔31中残留的缓冲液；或者使残留的缓冲液自然蒸发；

(7)向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂；

优选地，采用刮液方式向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂，具体步骤如下：

在所述基片20的一端滴加一步法RT-PCR反应试剂；

用硅胶片以一定的力度、倾斜度、速度向基片的另一端刮液，使反应试剂充满第一孔30和第二孔31；

刮液完成之后，沿刮液方向迅速添加密封油。

(8)芯片封装，具体过程如下：

在上述步骤7基础上，继续向基片20表面添加密封油，形成一定厚度的密封油层；

在所述基片表面的双套孔微列阵周围设置密封圈29，在基片20表面形成一个凹槽；

向所述凹槽中加入过量的密封油；

取一盖片28，采用步骤1所述清洗方法，去除盖片28上的有机杂质和无机杂质，清洗后的盖片28进行烘干；

将上述盖片28水平压在密封圈和密封油上，完成单细胞RT-PCR芯片的封装。

优选地，所述盖片28为透明材料；

更优选地，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片等。

实施例2：

本实施例提供一种具有双套孔微阵列结构的单细胞RT-PCR芯片，如图5所示，该芯片的双套孔微阵列的阵列排布为矩形，所述双套孔包括一个第一孔30和5个第二孔31，该芯片在工作状态下的制备过程如图1所述，具体如下：

步骤1：取一基板，该基板为无生物毒性的材料；

优选地，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢等；

优选地，对所述基板进行清洗，以去除表面的有机杂质和无机杂质；

更优选地，所述基板的清洗方法包括有机清洗和无机清洗；其中，所述有机清洗过程为：依次使用丙酮、乙醇、去离子水对基片进行超声清洗；所述无机清洗过程为：1体积30％过氧化氢与3体积98％浓硫酸混合成清洗液，基片浸入清洗液，热板120℃下保持30分钟。

步骤2：在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基片20，所述双套孔微阵列的制备方法如下：

在步骤1基础上，于基板正面旋涂一层均匀的光刻胶；

通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔30的图形转移到基板上；

清洗光刻胶，并重复步骤1所述清洗过程；

进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔31的图形转移到基板上，得到具有双套孔微阵列结构的基片20。

优选地，所述双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式为矩形；

优选地，所述双套孔包括第一孔30及位于第一孔内下方的第二孔31；

优选地，所述第一孔30的直径大于第二孔31的直径；所述第一孔30的深度可大于、小于或等于第二孔31的深度；

更优选地，所述第二孔31的直径和深度均大于细胞直径(～15μm)且小于两倍的细胞直径；

更优选地，所述第一孔30的直径为100μm，深度为40μm；

优选地，所述第二孔31为5个，该第二孔31均匀分布于第一孔30的下方；

步骤3：对步骤2得到的基片20进行表面处理；

优选地，所述表面处理采用亲水处理，以减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。

更优选地，所述亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白(BSA)溶液冲洗法。

步骤4：细胞入孔；

优选地，所述细胞入孔可通过将上述基片水平放置在细胞悬浮液中，静置一段时间后在重力作用下使细胞进入第一孔30或第二孔31；

优选地，所述细胞入孔可通过对细胞悬浮液和基片20的密封体系进行离心，将细胞甩入第一孔30和第二孔31，加快细胞入孔进程；

步骤5：保持第一孔30和第二孔31朝上，取出基片20，用缓冲液冲洗基片表面，清除基片20表面以及第一孔30中的细胞；

步骤6：用惰性气体或氮气吹干基片表面以及第一孔30和第二孔31中残留的缓冲液；或者使残留的缓冲液自然蒸发；

步骤7：向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂；

优选地，采用刮液方式向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂，具体步骤如下：

在所述基片20的一端滴加一步法RT-PCR反应试剂；

用硅胶片以一定的力度、倾斜度、速度向基片的另一端刮液，使反应试剂充满第一孔30和第二孔31；

刮液完成之后，沿刮液方向迅速添加密封油。

步骤8：芯片封装，具体过程如下：

在上述步骤7基础上，继续向基片20表面添加密封油，形成一定厚度的密封油层；

在所述基片表面的双套孔微列阵周围设置密封圈29，在基片20表面形成一个凹槽；

向所述凹槽中加入过量的密封油；

取一盖片28，采用步骤1所述清洗方法，去除盖片28上的有机杂质和无机杂质，清洗后的盖片28进行烘干；

将上述盖片28水平压在密封圈和密封油上，完成单细胞RT-PCR芯片的封装。

优选地，所述盖片28为透明材料；

更优选地，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片等。

实施例3：

如图6所示，本实施例提供一种具有双套孔微阵列结构的单细胞RT-PCR芯片，所述双套孔微阵列的阵列排布为环形，所述双套孔包括一个第一孔30和一个第二孔31，该芯片在工作状态下的制备过程如图1所述，具体如下：

步骤1：取一基板，该基板为无生物毒性的材料；

优选地，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢等；

优选地，对所述基板进行清洗，以去除表面的有机杂质和无机杂质；

更优选地，所述基板的清洗方法包括有机清洗和无机清洗；其中，所述有机清洗过程为：依次使用丙酮、乙醇、去离子水对基片进行超声清洗；所述无机清洗过程为：1体积30％过氧化氢与3体积98％浓硫酸混合成清洗液，基片浸入清洗液，热板120℃下保持30分钟。

步骤2：在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基片20，所述双套孔微阵列的制备方法如下：

在步骤1基础上，于基板正面旋涂一层均匀的光刻胶；

通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔30的图形转移到基板上；

清洗光刻胶，并重复步骤1所述清洗过程；

进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔31的图形转移到基板上，得到具有双套孔微阵列结构的基片20。

优选地，所述双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式为环形；

优选地，所述双套孔包括第一孔30及位于第一孔内下方的第二孔31；

优选地，所述第一孔30的直径大于第二孔31的直径；所述第一孔30的深度可大于、小于或等于第二孔31的深度；

更优选地，所述第二孔31的直径和深度均大于细胞直径(～15μm)且小于两倍的细胞直径；

更优选地，所述第一孔30的直径为100μm，深度为40μm；

优选地，所述第二孔31为一个，该第二孔31位于第一孔30中心的下方；

步骤3：对步骤2得到的基片20进行表面处理；

优选地，所述表面处理采用亲水处理，以减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。

更优选地，所述亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白(BSA)溶液冲洗法。

步骤4：细胞入孔；

优选地，所述细胞入孔可通过将上述基片水平放置在细胞悬浮液中，静置一段时间后在重力作用下使细胞进入第一孔30或第二孔31；

优选地，所述细胞入孔可通过对细胞悬浮液和基片20的密封体系进行离心，将细胞甩入第一孔30和第二孔31，加快细胞入孔进程；

步骤5：保持第一孔30和第二孔31朝上，取出基片20，用缓冲液冲洗基片表面，清除基片20表面以及第一孔30中的细胞；

步骤6：用惰性气体或氮气吹干基片表面以及第一孔30和第二孔31中残留的缓冲液；或者使残留的缓冲液自然蒸发；

步骤7：向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂；

优选地，采用刮液方式向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂，具体步骤如下：

在所述基片20的一端滴加一步法RT-PCR反应试剂；

用硅胶片以一定的力度、倾斜度、速度向基片的另一端刮液，使反应试剂充满第一孔30和第二孔31；

刮液完成之后，沿刮液方向迅速添加密封油。

步骤8：芯片封装，具体过程如下：

在上述步骤7基础上，继续向基片20表面添加密封油，形成一定厚度的密封油层；

在所述基片表面的双套孔微列阵周围设置密封圈29，在基片20表面形成一个凹槽；

向所述凹槽中加入过量的密封油；

取一盖片28，采用步骤1所述清洗方法，去除盖片28上的有机杂质和无机杂质，清洗后的盖片28进行烘干；

将上述盖片28水平压在密封圈和密封油上，完成单细胞RT-PCR芯片的封装。

优选地，所述盖片28为透明材料；

更优选地，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片等。

实施例4：

如图7所示，本实施例提供一种具有双套孔微阵列结构的单细胞RT-PCR芯片，所述双套孔微阵列的阵列排布为环形，所述双套孔包括一个第一孔30和5个第二孔31，该芯片在工作状态下的制备过程如图1所述，具体如下：

步骤1：取一基板，该基板为无生物毒性的材料；

优选地，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢等；

优选地，对所述基板进行清洗，以去除表面的有机杂质和无机杂质；

更优选地，所述基板的清洗方法包括有机清洗和无机清洗；其中，所述有机清洗过程为：依次使用丙酮、乙醇、去离子水对基片进行超声清洗；所述无机清洗过程为：1体积30％过氧化氢与3体积98％浓硫酸混合成清洗液，基片浸入清洗液，热板120℃下保持30分钟。

步骤2：在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基片20，所述双套孔微阵列的制备方法如下：

在步骤1基础上，于基板正面旋涂一层均匀的光刻胶；

通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔30的图形转移到基板上；

清洗光刻胶，并重复步骤1所述清洗过程；

进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔31的图形转移到基板上，得到具有双套孔微阵列结构的基片20。

优选地，所述双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式为环形；

优选地，所述双套孔包括第一孔30及位于第一孔内下方的第二孔31；

优选地，所述第一孔30的直径大于第二孔31的直径；所述第一孔30的深度可大于、小于或等于第二孔31的深度；

更优选地，所述第二孔31的直径和深度均大于细胞直径(～15μm)且小于两倍的细胞直径；

更优选地，所述第一孔30的直径为100μm，深度为40μm；

优选地，所述第二孔31为5个，该第二孔31均匀分布于第一孔30的下方；

步骤3：对步骤2得到的基片20进行表面处理；

优选地，所述表面处理采用亲水处理，以减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。

更优选地，所述亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白(BSA)溶液冲洗法。

步骤4：细胞入孔；

优选地，所述细胞入孔可通过将上述基片水平放置在细胞悬浮液中，静置一段时间后在重力作用下使细胞进入第一孔30或第二孔31；

优选地，所述细胞入孔可通过对细胞悬浮液和基片20的密封体系进行离心，将细胞甩入第一孔30和第二孔31，加快细胞入孔进程；

步骤5：保持第一孔30和第二孔31朝上，取出基片20，用缓冲液冲洗基片表面，清除基片20表面以及第一孔30中的细胞；

步骤6：用惰性气体或氮气吹干基片表面以及第一孔30和第二孔31中残留的缓冲液；或者使残留的缓冲液自然蒸发；

步骤7：向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂；

优选地，采用刮液方式向第一孔30和第二孔31中加入反应试剂，具体步骤如下：

在所述基片20的一端滴加一步法RT-PCR反应试剂；

用硅胶片以一定的力度、倾斜度、速度向基片的另一端刮液，使反应试剂充满第一孔30和第二孔31；

刮液完成之后，沿刮液方向迅速添加密封油。

步骤8：芯片封装，具体过程如下：

在上述步骤7基础上，继续向基片20表面添加密封油，形成一定厚度的密封油层；

在所述基片表面的双套孔微列阵周围设置密封圈29，在基片20表面形成一个凹槽；

向所述凹槽中加入过量的密封油；

取一盖片28，采用步骤1所述清洗方法，去除盖片28上的有机杂质和无机杂质，清洗后的盖片28进行烘干；

将上述盖片28水平压在密封圈和密封油上，完成单细胞RT-PCR芯片的封装。

优选地，所述盖片28为透明材料；

更优选地，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片等。

根据实施例1～4可以看出，本发明提供的单细胞RT-PCR芯片结构设计简单，降低了成本；能够灵活地改变双套孔微阵列的排布方式、双套孔的数量、以及结构尺寸等参数，适用于不同类型的单细胞检测体系；双套孔的结构为一个大孔里面包含一个或多个小孔，可作为一个独立反应池；此结构在捕获单细胞时具有通量高、单细胞占有率高的优点，同时提供足够大空间的反应池作为单细胞后续的检测实验，巧妙地解决了传统单细胞芯片的单细胞占有率和单细胞检测所需溶液体积之间的矛盾。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种单细胞RT-PCR芯片，包括基片、盖片，以及位于基片和盖片之间的密封圈，其特征在于，所述基片上具有双套孔微阵列结构，该双套孔微阵列结构包括若干双套孔；所述双套孔包括第一孔以及由第一孔底部部分区域进一步向下开设的第二孔；

所述第一孔的直径大于第二孔的直径；

所述第二孔的直径和深度均大于细胞的直径且小于细胞直径的两倍，保证只允许单个细胞进入第二孔，所述密封圈将所述双套孔微列阵围绕在内部，使盖片与基片之间形成密封空间，所述密封空间充满密封油。

2.根据权利要求1所述的单细胞RT-PCR芯片，其特征在于：

每一双套孔中所述第二孔为一个或多个；

所述第二孔为一个时，该第二孔由第一孔底部中心进一步向下开设；

所述第二孔为多个时，该第二孔均匀地由第一孔底部向下开设。

3.根据权利要求1所述的单细胞RT-PCR芯片，其特征在于：

所述双套孔微阵列结构的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排。

4.根据权利要求1所述的单细胞RT-PCR芯片，其特征在于：

所述基片为无生物毒性的材料，所述无生物毒性的材料包括石英玻璃、硅片、二氧化硅片、光纤面板、有机薄片和医用不锈钢；

所述盖片为透明材料，所述透明材料包括石英玻璃、二氧化硅片和透明的有机薄片。

5.一种制备单细胞RT-PCR芯片的方法，包括以下步骤：

步骤1：取一基板，对该基板进行清洗以去除表面的有机杂质和无机杂质；

步骤2：在基板上制备双套孔微阵列结构，得到具有双套孔微阵列结构的基片，所述双套孔微阵列的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排，所述双套孔微阵列结构包括若干双套孔；所述双套孔包括第一孔以及由第一孔底部部分区域进一步向下开设的第二孔；所述第一孔的直径大于第二孔的直径；所述第二孔的直径和深度均大于细胞的直径且小于细胞直径的两倍，保证只允许单个细胞进入第二孔，密封圈将所述双套孔微列阵围绕在内部，使盖片与基片之间形成密封空间，所述密封空间充满密封油；

步骤3：对基片进行表面处理；

步骤4：用密封圈将双套孔微列阵结构围绕在内部，用盖片压住密封圈完成芯片封装。

6.根据权利要求5所述的制备单细胞RT-PCR芯片的方法，其特征在于，步骤2包括以下子步骤：

步骤21：基板正面均匀地旋涂一层光刻胶；

步骤22：通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上第一孔的图形转移到基板上；

步骤23：清洗光刻胶；

步骤24：进行第二次光刻工艺和刻蚀工艺，将掩模板上第二孔的图形转移到基板上。

7.根据权利要求6所述的制备单细胞RT-PCR芯片的方法，其特征在于：

每一双套孔中所述第二孔为一个或多个；

所述第二孔为一个时，该第二孔由第一孔底部中心进一步向下开设；所述第二孔为多个时，该第二孔均匀地由第一孔底部向下开设。

8.根据权利要求5所述的制备单细胞RT-PCR芯片的方法，所述清洗方法包括有机清洗和无机清洗；所述表面处理为亲水处理，该亲水处理包括硅烷化处理和牛血清蛋白溶液冲洗法。

9.一种单细胞RT-PCR芯片的使用方法，其特征在于，该芯片在工作状态时，所述第二孔捕捉单细胞；所述双套孔中充满反应试剂，作为RT-PCR反应池；所述密封空间中充满密封油，该芯片为权利要求1～4中任一项所述的单细胞RT-PCR芯片。

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