CN107828653B - 开放式单细胞研究用芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种开放式单细胞研究用芯片及其制备方法，所述芯片包括由基片、挡墙以及透明盖片围成的封装结构，所述基片在封装结构内侧具有微孔阵列结构，所述微孔阵列结构的若干微孔内分别容纳有单细胞，各个所述微孔的上方通过3D打印方式分别加入单细胞研究用试剂的液滴，所述封装结构内其余空间填充密封油，进一步提供所述芯片的制作方法。本发明将3D打印技术与单细胞微孔阵列完美结合，高效快捷地实现了单细胞水平上的研究，建立了一个结构简单、运用范围广泛、功能完善的单细胞研究系统，并实现了高占有率的单细胞捕获，可多样性、精确性、多步对单个细胞进行加液处理，开放式结构可应用于多种研究体系。

Description

开放式单细胞研究用芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及单细胞研究方法技术领域，特别涉及一种开放式单细胞研究用芯片及其制备方法。

背景技术

单细胞异质性已成为细胞生物学领域的重点研究对象之一，然而由于单细胞的尺度约15μm，单个细胞的捕获、筛选、样品处理以及信号检测方面对传统的实验手段提出了巨大挑战。微流控技术作为一种精确有效处理皮升量级流体的手段，有望成为单细胞研究的有力工具。目前已有多种新型的微流控芯片成功运用于单细胞水平研究，然而这些方法仍然存在局限性。

第一类是单细胞微孔结构阵列捕获单细胞，这类单细胞微孔只能容纳一个细胞，因此单细胞占有率可以突破泊松分布限制，能达到97％，然而微孔的空间小，难以提供足够的试剂进行后续的检测实验，使得单细胞微孔结构阵列芯片难以进行后期的细胞处理过程。

第二类是传统的T型通道油包水微流控装置，此类微流控可以快速高通量地生成包涵少量细胞的微液滴，然而此手段存在一个无法克服的矛盾：如果液滴体积大，则单细胞个数服从泊松分布；如果液滴体积小，则单个液滴试剂量不够。此类油包水微流控装置也延伸出油层中点样、喷墨打印等新技术，然而都存在相同的缺陷。

第三类微流控装置则通过设计复杂的微结构并配合阀的开关控制，可以实现单个细胞的捕获并进行后续进液，然而此种微流控装置结构复杂，应用范围窄，无法成为一种开放式的单细胞研究方法。

因此人们一直在寻求更快速、更简便的单细胞研究手段，以能够实现高的单细胞占有率，可以多次对单个反应池进液，开放式的操作方式可用于多种应用等多种目的。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于，提供一种开放式单细胞研究用芯片及其制备方法，以期解决上述提及的技术问题中的至少之一。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

作为本发明的一方面，提供一种开放式单细胞研究用芯片，包括由基片、挡墙以及透明盖片围成的封装结构，所述基片在封装结构内侧具有微孔阵列结构，所述微孔阵列结构的若干微孔内分别容纳有单细胞，各个所述微孔的上方通过3D打印方式分别加入单细胞研究用试剂的液滴，所述封装结构内其余空间填充密封油。

优选地，各个所述微孔的直径和深度均大于单细胞的直径，且小于单细胞的直径的两倍；各个所述微孔之间间距根据3D打印方式加入单细胞研究用试剂液滴体积进行设计，满足各个微孔之间液滴不相互串扰。

优选地，所述基片由无机非金属材料、医用金属材料或有机薄片材料制成，其中无机非金属材料选自石英玻璃、硅片或二氧化硅片中的一种，医用金属材料选自医用不锈钢、医用钴基合金、医用钛或医用钛合金中的一种，有机薄片材料选自有机玻璃或环烯烃共聚材料。

所述挡墙的制备材料选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、双面胶或硅胶。

所述密封油选自氟化油、矿物油或石蜡油，所述单细胞研究用试剂为细胞裂解液、酶检测试剂、核酸检测试剂或蛋白质检测试剂。

作为本发明的另一方面，提供一种开放式单细胞研究用芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：具有微孔阵列结构的基片的制备；

步骤2：所述微孔阵列结构的微孔对单细胞的捕获；

步骤3：使用密封油对所述微孔进行密封后，在基片周围固定挡墙，以及对准所述微孔通过3D打印方式加入单细胞研究用试剂的液滴；

步骤4：在所述固定挡墙内注满密封油，并加盖透明盖片固定封装。

优选地，所述步骤1中，通过光刻工艺和刻蚀工艺在基片表面制作微孔阵列结构，以及在制作微孔阵列结构前后对基片的清洗。

优选地，所述步骤1中，对基片表面改性，以减少检测过程蛋白质的特异性吸附，包括硅烷化处理和牛血清蛋白溶液清洗处理。

优选地，所述步骤2中，所述基片采用重力沉降法或离心法将单细胞捕获于所述微孔内。

优选地，所述重力沉降法具体包括：

子步骤2-1：将所述基片置于磷酸缓冲液中，通过真空脱气排空所述微孔内的气体；

子步骤2-2：向磷酸缓冲液中加入细胞，静置一段时间后细胞落入微孔中；

子步骤2-3：对基片表面进行冲洗，以除去微孔外的多余细胞。

优选地，所述步骤3中，将所述基片浸入密封油，并使用硅胶片刮液，并在基片表面形成一层油膜，进而进行密封；

优选地，所述步骤3中，利用3D打印平台上的多个喷头，对准所述微孔按照所述单细胞研究用试剂使用顺序打印液滴，通过喷头直径和打印参数如脉冲电压的宽度和幅度控制打印液滴的体积和速度，所述3D打印平台为喷墨式打印平台。

基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：

1、将较为成熟的喷墨平台与单细胞微孔阵列巧妙结合，其中单细胞微孔阵列基片制作步骤快速简便，通过重力沉降法或离心法捕获单细胞，单细胞占有率高，极大的降低了成本；使用3D打印平台向细胞添加研究用试剂，可以高速、高通量、定点、定量、次序地打印不同种类试剂，打印过程灵活，可更换试剂使得应用更加广泛，可适用于多类单细胞研究体系，作为一种通用的单细胞研究工具，具有无可估量的科研价值和市场前景。

2、将3D打印平台和单细胞微孔结构阵列结合，利用3D打印平台将反应试剂打入密封油并与单细胞微孔中细胞融合，突破单细胞微孔结构阵列难以处理细胞的局限性，巧妙地将单细胞微孔阵列高单细胞占有率的优点跟3D打印平台高速、高通量、定量、定点、灵活打印试剂液滴的优点相结合。

附图说明

图1为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制作方法流程图；

图2A为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制备过程中细胞进孔的原理示意图；

图2B为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制备过程中冲洗孔外细胞的原理示意图；

图2C为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制备过程中对孔内细胞开始密封操作的原理示意图；

图2D为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制备过程中对孔内细胞密封后的原理示意图；

图2E为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制备过程中3D打印研究用试剂的原理示意图；

图2F为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的制备过程中芯片封装的原理示意图；

图2G为本发明一实施例的开放式单细胞研究用芯片的局部结构放大示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明将3D打印平台与单细胞微孔结构阵列相结合，通过喷头直径和打印参数如脉冲电压的宽度与幅度控制打印液滴的体积和速度，进而控制液滴打印的雷诺数和韦伯数，打印液滴穿过密封油层后与微孔中细胞相融合，突破单细胞微孔结构阵列难以处理细胞的局限性，实现了定点、定量、次序进液地单细胞处理过程。

3D打印与单细胞微孔阵列两者的结合，利用了单细胞微孔阵列的特点实现了高通量、高占有率的单细胞捕获，其结构简单、操作方面；利用3D打印向单个反应池进行定量加液，其打印样本可变，研究体系丰富。此系统可以实现高通量、多步进液、应用范围广的功能，可作为一种通用的单细胞研究工具，具有无可估量的科研价值和市场前景。

具体地，本发明提供的一种新型的开放式单细胞研究用芯片的制备方法，包括以下步骤：首先准备一洁净的具有单细胞微孔阵列基片，利用重力作用每个微孔捕获一个细胞，并用密封油隔离微孔；然后3D打印平台控制喷头在基片表面上对准微孔反应池次序、定量地喷射液滴，液滴穿透密封油与反应池中细胞结合；最后密封并固定，形成封装好的单细胞研究芯片。

请参阅图1和图2A～2G所示，为本发明提供一种新型的开放式单细胞研究用芯片的制备方法的一实施例，具体步骤如下：

步骤1：取一带有单细胞微孔结构阵列的基片20；

步骤2：将基片20进行表面处理；

步骤3：细胞(22和23)进孔(如图2A所示)；

步骤4：冲洗孔外细胞22(如图2B所示)；

步骤5：密封油25密封(如图2C、2D所示)；

步骤6：在基片20的四周固定挡墙211；

步骤7：利用3D打印平台上的多个喷头27，对准微孔进行液滴(28和29)的顺序打印(如图2E所示)；

步骤8：在基片20上的固定挡墙211内注满密封油25；

步骤9：取一透明盖片210；

步骤10：将透明盖片210固定盖合于基片10上(如图2F所示)，完成芯片的制备。

以下对各个制备步骤作具体说明：

步骤1：取一带有单细胞微孔阵列结构的基片20，该基片20的材料为石英玻璃、硅片、二氧化硅片、医用金属材料或有机薄片的材料等任何无生物毒性的材料。其中单细胞微孔阵列具备的特征是：孔的直径和深度均大于一个细胞的直径和小于两倍细胞的直径(一个细胞直径约15μm)；各个所述微孔之间间距根据3D打印方式加入单细胞研究用试剂液滴体积进行设计，满足各个微孔之间液滴不相互串扰。带有单细胞微孔阵列结构的基片20可由本领域内多种常规手段获得，在本实施例中，利用公知的制备方法进行制备，具体为：取一平板基片，首先要对平板基片进行清洗，以去除表面有机及无机杂质，清洗是依次使用超声波在分析纯丙酮、无水乙醇、去离子水中清洗，去除基片20表面的有机杂质，随后使用硫酸和双氧水的混合液加热煮沸平板基片，并使用去离子水冲洗，去除平板基片表面的无机杂质。然后在平板基片正面旋涂一层均匀的光刻胶；通过光刻工艺和刻蚀工艺将掩模板上的图形转移到平板基片上；所述光刻工艺包括匀胶、前烘、曝光、显影等步骤，刻蚀工艺包括干法刻蚀和湿法刻蚀两种；最后清洗光刻胶，并重复步骤1的清洗步骤以清除基片20上的有机及无机杂质。

步骤2：将基片20进行表面改性，所述的表面改性具体为硅烷化处理和牛血清蛋白溶液清洗表面，减少检测过程中蛋白质的特异性吸附。

步骤3：细胞进孔。将芯片置于磷酸盐缓冲液21中，真空脱气排空小孔中的气体。如图2A所示，然后向磷酸盐缓冲液中加入细胞(22和23)，通过细胞的重力作用，静置一段时间后细胞落入微孔中；也可以将体系密封后采用离心办法，将细胞甩入微孔，减少细胞进孔时间；本领域技术人员应当知晓，重力沉降法或离心法捕获单细胞均为本领域内的常规技术手段。

步骤4：如图2B所示，冲洗大孔中多余细胞22。细胞进孔之后，将芯片取出磷酸盐缓冲液21，并用吸管吸取磷酸盐缓冲液对基片表面进行冲洗，冲洗力度适中。冲洗能将微孔之间的细胞22除去，而微孔中的细胞23保留其中。

步骤5：将冲洗好的基片浸入密封油25中，所述密封油25选自氟化油、矿物油或石蜡油。如图2C、2D所示，用硅胶片26以一定的力度、倾斜度、速度向基片另一端刮液，将磷酸盐缓冲液21刮走。

步骤6：在基片20的四周固定挡墙211。挡墙的材料可为PDMS(聚二甲基硅氧烷)、双面胶、硅胶，可进行粘结固定，当然也可选用合适的材料通过其他固定方式进行固定，例如焊接固定、卡接等，因为是本领域内的常规手段，在此不作赘述。挡墙的高度根据所用油相而定。

步骤7：如图2E、2G所示，利用3D打印平台上的多个喷头27，对准微孔进行液滴(28和29)的顺序打印，所述液滴为单细胞研究用试剂，根据研究需要，选自细胞裂解液、酶检测试剂、核酸检测试剂或蛋白质检测试剂。喷头直径和打印参数根据所用样品的种类、喷打液滴体积、速度而定。可利用现已较为成熟的3D打印平台例如喷墨式打印平台。

步骤8：在基片20上的固定挡墙211内注满密封油。

步骤9：取一透明盖片210；采用步骤1中的清洗方法将透明盖片210清洗干净并烘干。

步骤10：如图2F所示，将透明盖片210水平覆盖在基片20上，压住油层，盖合并固定后形成反应芯片，完成芯片的制备。

以下列举具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

一种用于人慢性髓系白血病细胞(K562)单细胞的蛋白质组学分析的芯片，制备方法如上所述，其中基片的微孔阵列结构的微孔的孔径为20μm、微孔间的间隔为100μm；所述细胞为K562细胞，通过重力法将单个K562细胞捕获于微孔阵列中；使用氟化油作为密封油对K562细胞进行密封；挡墙使用PDMS，挡墙高度为150μm；通过定点、定量、次序打印法，分别对每个微孔次序打印细胞裂解液(含0.2wt％的TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸缓冲盐溶液)和荧光素底物(2-β-D-吡喃半乳糖苷)，选用的3D打印平台为购自美国MicroFab公司的

喷墨打印平台，其喷头直径为50μm，设置打印参数为脉冲宽度为40V，脉冲振幅为20V，由此打印的液滴体积42.8pL，速度为3.83m/s；在挡墙内注满氟化油后，使用透明盖片盖合封装。

对该芯片进行了细胞内β-半乳糖苷酶含量测试，通过实时荧光分析，不同微孔中液滴显示的荧光强度与变化速率不同，显示相同培养环境下的K562细胞，各个单细胞所含有β-半乳糖苷酶量不同，揭示了单细胞异质性。

除了上述列举的实施例外，利用本发明提供的单细胞研究用芯片及相应的制备方法还可完成其他单细胞研究试验，例如单细胞逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，同实施例1中的制备方法，调整打印参数，并依次打印细胞裂解液、逆转录反应液、PCR反应液的液滴。

综上，本发明的单细胞研究用芯片及其制备方法，具有高占有率的单细胞捕获，可多样性、精确性、多步地对单个细胞进行加液处理，其作为一种开放式的研究手段，能够适应多种研究体系，具备通用性。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种开放式单细胞研究用芯片，其特征在于，包括由基片、挡墙以及透明盖片围成的封装结构，所述基片在封装结构内侧具有微孔阵列结构，所述微孔阵列结构的若干微孔内分别容纳有单细胞，各个所述微孔的上方通过3D打印方式分别加入单细胞研究用试剂的液滴，所述封装结构内其余空间填充密封油；

其中，各个所述微孔的直径和深度均大于单细胞的直径，且小于单细胞的直径的两倍。

2.根据权利要求1所述的开放式单细胞研究用芯片，其特征在于，

所述基片由无机非金属材料、医用金属材料或有机薄片材料制成，其中，无机非金属材料选自石英玻璃、硅片或二氧化硅片中的一种，医用金属材料选自医用不锈钢、医用钴基合金、医用钛或医用钛合金中的一种，有机薄片材料选自有机玻璃或环烯烃共聚材料；

所述挡墙的制备材料选自聚二甲基硅氧烷PDMS、双面胶或硅胶；

所述密封油选自氟化油、矿物油或石蜡油；

所述单细胞研究用试剂为细胞裂解液、酶检测试剂、核酸检测试剂或蛋白质检测试剂。

3.一种如权利要求1或2所述的开放式单细胞研究用芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：具有微孔阵列结构的基片的制备；

步骤2：所述微孔阵列结构的微孔对单细胞的捕获；

步骤3：使用密封油对所述微孔进行密封后，在基片周围固定挡墙，以及对准所述微孔通过3D打印方式加入单细胞研究用试剂的液滴；

步骤4：在所述固定挡墙内注满密封油，并加盖透明盖片固定封装。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，通过光刻工艺和刻蚀工艺在基片表面制作微孔阵列结构，并在制作微孔阵列结构前后对基片进行清洗。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，对具有微孔阵列结构的基片表面改性，以减少检测过程蛋白质的特异性吸附，包括硅烷化处理和牛血清蛋白溶液清洗处理。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述基片采用重力沉降法或离心法将单细胞捕获于所述微孔内。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述重力沉降法具体包括：

子步骤2-1：将所述基片置于磷酸缓冲液中，通过真空脱气排空所述微孔内的气体；

子步骤2-2：向磷酸缓冲液中加入细胞，静置一段时间后细胞落入微孔中；

子步骤2-3：对基片表面进行冲洗，以除去微孔外的多余细胞。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，将所述基片浸入密封油，并使用硅胶片刮液，并在基片表面形成一层油膜，进而进行密封。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，利用3D打印平台上的多个喷头，对准所述微孔按照所述单细胞研究用试剂使用顺序打印液滴，通过喷头直径和打印参数控制打印液滴的体积和速度，所述打印参数包括脉冲电压的宽度和幅度，所述3D打印平台为喷墨式打印平台。

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