CN112452367B - 一种双层微孔芯片、双层微孔芯片制备方法及生物装置 - Google Patents

一种双层微孔芯片、双层微孔芯片制备方法及生物装置 Download PDF

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    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation

Abstract

本发明提供的双层微孔芯片，包括第一微孔结构层以及与所述第一微孔结构层连接的第二微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸，本发明提供的双层微孔芯片，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大设计减少了层与层之间的压力差，防止了微孔芯片的堵塞，保证了高通量且通过第一层微孔的截留筛选，提高了筛选捕获的信噪比以及筛选能力。另外，本发明还提供了上述双层微孔芯片制备方法以及包括上述双层微孔芯片的生物装置。

Description

一种双层微孔芯片、双层微孔芯片制备方法及生物装置
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种双层微孔芯片、双层微孔芯片制备方法及生物装置。
背景技术
细胞异质性研究在人类疾病治疗中一直是一项重要的课题，举例来说，多能性干细胞虽可应用于疾病治疗和再生医学等领域，但由于其细胞功能上的异质性，让多能干细胞一直难以稳定的进行细胞分化。另在癌症研究中，肿瘤组群内一小群被称为【肿瘤干细胞】的细胞被认为是造成肿瘤对化疗药物产生抗药性的主要原因。如果能够精确的分析出每种细胞之间的异质性，将有助于简化复杂的生物现象，并提供疾病治疗新的方向。然而单细胞的分析不同于整个细胞群体，在实验工具上更加具有挑战性。传统的单细胞实验的进行往往依赖于有限稀释法(limiting dilution)或者流式细胞仪(FACS)来完成。
近年来，已经有诸多微流控芯片装置利用不同的原理进行单细胞的筛选以及分析，例如微液滴(microdroplets)、介电泳(dielectrophoresis)、流体动力学(hydrodynamics)以及微孔阵列(microwell array)等方式。对于需要进行单细胞培养的应用而言，微液滴细胞培养法能够快速地提供单细胞培养空间，此方法是通过油性介质的分离，将单细胞包裹在细胞培养液滴内进行培养。然而液滴内的细胞培养液在液滴形成之后就无法被置换了，此方法不适用于过程中需要更换培养液的细胞实验，且液滴中也缺乏能够让细胞附着的基质，故无法应用于贴附型细胞的培养。反而微孔设计的芯片能够应用于贴壁或者悬浮的细胞的筛选以及培养。此设计只需要在有孔洞状的结构中，而操作上只需要使用流体力学或者重力的方式就将细胞置入微孔内。然而为了让细胞拥有足够的生长空间，微孔的设计尺寸通常必须远大于一个单细胞的大小，导致了单细胞筛选效率普遍下降了10-30％。目前技术使用的单一微孔所造成的的单细胞捕获效率的降低与有限稀释法都是由于泊松分布的限制。
微孔的设计尺寸需要远大于一个单细胞的大小，导致单细胞的筛选效率大大降低，另外使用的单一微孔进行单细胞捕获的技术其芯片或者系统的流量无法得到精确控制，会导致单细胞筛选的过程中出现目标细胞的丢失导致筛选效率的降低。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种单细胞的筛选效率高的双层微孔芯片。
为解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种双层微孔芯片，包括：第一微孔结构层以及与所述第一微孔结构层连接的第二微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸。
在其中一些实施例中，所述第一微孔结构层与所述第二微孔结构层一体成型，所述第一微孔结构层的厚度为0.5-20um，所述第二微孔结构层的厚度为20-60um。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔均匀间隔分布在所述第一微孔结构层上，所述第二层微孔均匀间隔分布在所述第二微孔结构层上。
在其中一些实施例中，所述第一微孔结构层以及所述第二微孔结构层中微孔的孔隙率为3-10％。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径所在的竖直轴线处于同一水平线且横轴平行。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔及所述第二层微孔为圆形或三角形或菱形。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔及所述第二层微孔为圆形，所述第一层微孔的直径为0.2-20um，所述第二层微孔的直径为20-60um。
在其中一些实施例中，第一微孔结构层以及所述第二微孔结构层采用感光性透明高分子或者热固性透明高分子制成。
在其中一些实施例中，所述样本为生物体细胞或荧光微球。
在其中一些实施例中，所述第二层微孔的平面形状内切的最大圆的直径为容纳到所述样本的1-3倍的范围或优选1-2.4的范围或更优选1-1.4倍的范围。
在其中一些实施例中，所述第二层微孔的深度为要容纳为所述样本直径的1-3倍或优选1-2.4的范围或更优选1-1.6倍的范围。
在其中一些实施例中，当该捕获的样本为荧光微球时，并且所述荧光微球的直径为30um时，所述第二层微孔直径为30-35um，深度为30-55um。
第二方面，本发明提供了一种所述的双层微孔芯片的制备方法，包括下述步骤：
在衬底上形成一层金属种子层；
在所述金属种子层表面涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔；
在所述第一层光刻胶微孔层涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第二层光刻胶微孔层，得到所述第二微孔结构层，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔；
将所述金属种子层进行剥离，得到所述双层微孔芯片；
所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸。
在其中一些实施例中，所述的衬底为硅或氮化硅或氧化硅。
在其中一些实施例中，在衬底上形成一层金属种子层的步骤中，具体为：
利用磁控溅射在衬底表面溅射一层金属，所述金属为铬或镍或铝。
在其中一些实施例中，在所述金属种子层表面涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层的步骤中，具体为：
利用软光刻的工艺在所述金属种子层旋涂光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层。
在其中一些实施例中，利用软光刻的工艺在所述金属种子层旋涂光刻胶的步骤中具体包括：
在其中一些实施例中，所述的光刻胶包括SU8-3005或SU8-3025。
在其中一些实施例中，将所述金属种子层进行剥离，得到所述双层微孔芯片的步骤中，具体为：
最后利用金属清洗液对所述金属种子层进行剥离。
第三方面，本发明还提供了一种生物装置，包括上壳体、所述的双层微孔芯片以及下壳体，所述上壳体及所述下壳体固定安装，所述双层微孔芯片固定于所述上壳体及所述下壳体形成的空间内。
采用上述技术方案，本发明实现的技术效果如下：
第一方面，本发明提供的双层微孔芯片，包括第一微孔结构层以及与所述第一微孔结构层连接的第二微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸，本发明提供的双层微孔芯片，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大设计减少了层与层之间的压力差，防止了微孔芯片的堵塞，保证了高通量且通过第一层微孔的截留筛选，提高了筛选捕获的信噪比以及筛选能力。
第二方面，本发明提供的双层微孔芯片的制备方法，结合了软光刻复制技术以及膜转移技术，此方法简便、快速，适用于不同材质的微孔的制备。
第三方面，本发明提供了一种包括上述双层微孔芯片的生物装置，能够用于体外诊断的单细胞捕获、分析以及胞间物质传输等方面，提高了单细胞分析的准确性，从而为单细胞的实时监测提供了新型的手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的双层微孔芯片的结构示意图；
图2为本发明实施例1提供的双层微孔芯片内样本捕获的概略说明图。
图3为本发明实施例2提供的双层微孔芯片的制备方法的步骤流程图；
图4为本发明实施例2提供的双层微孔芯片的制备方法的原理示意图；
图5为本发明实施例3提供的生物装置的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
请参阅图1，为本发明一实施方式提供的双层微孔芯片100的结构示意图，包括第一微孔结构层110以及与所述第一微孔结构层110连接的第二微孔结构层120。以下详细说明各个部件之间的连接关系。
所述第一微孔结构层110包括若干个第一层微孔111，所述第二微孔结构层120包括若干个第二层微孔121，所述第一层微孔111的孔径以及所述第二层微孔121的孔径均保持一致，所述第一层微孔111的孔径及所述第二层微孔121的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔121具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸。
可以理解，由于所述第一层微孔111的孔径及所述第二层微孔的121孔径由小到大设计减少了层与层之间的压力差，防止了微孔芯片的堵塞，保证了高通量且通过第一层微孔111的截留筛选，提高了筛选捕获的信噪比以及筛选能力。
在其中一些实施例中，所述第一微孔结构层110与所述第二微孔结构层120一体成型，所述第一微孔结构层110的厚度为0.5-20um，所述第二微孔结构层120的厚度为20-60um。
可以理解，在第一微孔结构110的厚度为10um，第二微孔结构层的厚度为30um，当第一微孔结构层与第二微孔结构层的厚度为1:3的时候，单细胞或者磁珠的捕获效率较优。
具体地，所述第一微孔结构层110设置在所述第二微孔结构层120上的穿孔，所述第二微孔结构层120为设置在第一微孔结构层110上的穿孔。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔111均匀间隔分布在所述第一微孔结构层110上，所述第二层微孔121均匀间隔分布在所述第二微孔结构层120上。
进一步地，所述第一微孔结构层110以及所述第二微孔结构层120中微孔的孔隙率为3-10％。
可以理解，当第一微孔结构层以及所述第二微孔结构层的孔隙率为5％的时候，单细胞或者磁珠的捕获效率较优。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔111的孔径以及所述第二层微孔121的孔径所在的竖直轴线处于同一水平线且横轴平行。
在其中一些实施例中，所述第一层微孔111及所述第二层微孔121为圆形或三角形或菱形。
进一步地，当所述第一层微孔111及所述第二层微孔121为圆形时，所述第一层微孔111的直径为0.2-20um，所述第二层微孔121的直径为20-60um。
可以理解，在第一微孔结构110的直径为10um，第二微孔结构层的直径为30um，当第一微孔结构层与第二微孔结构层的厚度为1:3的时候，单细胞或者磁珠的捕获效率较优。
在其中一些实施例中，第一微孔结构层110以及所述第二微孔结构层120采用感光性透明高分子或者热固性透明高分子制成。
在其中一些实施例中，所述样本为生物体细胞或荧光微球。
在其中一些实施例中，所述第二层微孔121的平面形状内切的最大圆的直径为容纳到所述样本的1-3倍的范围或优选1-2.4的范围或更优选1-1.4倍的范围。
在其中一些实施例中，所述第二层微孔121的深度为要容纳为所述样本直径的1-3倍或优选1-2.4的范围或更优选1-1.6倍的范围。
在其中一些实施例中，当该捕获的样本为荧光微球时，并且所述荧光微球的直径为30um时，所述第二层微孔121直径为30-35um，深度为30-55um。
可以理解，在第一微孔结构110的直径为10um，第二微孔结构层的直径为30um，当第一微孔结构层与第二微孔结构层的厚度为1:3的时候，单细胞或者磁珠的捕获效率较优。
请参阅图2，为本发明实施例1提供的双层微孔芯片内样本捕获的概略说明图，其中圆球表示样本。
可以理解，在实际中微孔的尺寸应考虑要容纳在微孔中的生物样本的直径与微孔尺寸的恰当比来适当决定。
本发明上述实施例1提供的双层微孔芯片，包括第一微孔结构层以及与所述第一微孔结构层连接的第二微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸，本发明提供的双层微孔芯片，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大设计减少了层与层之间的压力差，防止了微孔芯片的堵塞，保证了高通量且通过第一层微孔的截留筛选，提高了筛选捕获的信噪比以及筛选能力。
实施例2
请参阅图3，为本发明提供了一种所述的双层微孔芯片的制备方法的步骤流程图，包括下述步骤：
步骤S110：在衬底上形成一层金属种子层。
在其中一些实施例中，所述的衬底为硅或氮化硅或氧化硅。
在其中一些实施例中，在衬底上形成一层金属种子层的步骤中，具体为：利用磁控溅射在衬底表面溅射一层金属，所述金属为铬或镍或铝。
步骤S120：在所述金属种子层表面涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔。
在其中一些实施例中，在所述金属种子层表面涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层的步骤中，具体为：利用软光刻的工艺在所述金属种子层旋涂光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层。
具体地，在其中一些实施例中，利用软光刻的工艺在所述金属种子层旋涂光刻胶的步骤中具体包括：先以低速旋转的方式，使光刻胶慢慢旋开至硅片的边缘；再通过高旋转的方式，将光刻胶旋涂至所述金属种子层边缘，所述的低速旋转的方式为转速500rpm旋胶10s，所述的高旋转的方式为以转速2500旋胶30s。
在其中一些实施例中，所述的光刻胶包括SU8-3005或SU8-3025。
可以理解，利用光刻技术在所述金属种子层旋涂光刻胶过程中，需要对所述金属种子层经过前烘、曝光、后烘、显影等几步工艺。
步骤S130：在所述第一层光刻胶微孔层涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第二层光刻胶微孔层，得到所述第二微孔结构层，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔。
在本实施例中采用的具体技术方案可参考步骤S120中，这里不再赘述。
步骤S140：将所述金属种子层进行剥离，得到所述双层微孔芯片，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸。
在其中一些实施例中，将所述金属种子层进行剥离，得到所述双层微孔芯片的步骤中，具体为：最后利用金属清洗液对所述金属种子层进行剥离。
请再参阅图4，为本发明实施例2提供的双层微孔芯片的制备工艺原理图。
本发明提供的双层微孔芯片的制备方法，结合了软光刻复制技术以及膜转移技术，此方法简便、快速，适用于不同材质的微孔的制备。
实施例3
请参阅图5，为本发明实施例3提供的一种生物装置的结构示意图，包括上壳体310、上述实施例1中所述的双层微孔芯片100以及下壳体320，所述上壳体310及所述下壳体320固定安装，所述双层微孔芯片100固定于所述上壳体310及所述下壳体320形成的空间内。
在其中一些实施例中，所述上壳体310、双层微孔芯片100以及下壳体320通过四个顶点的磁片进行牢固键合。
本发明实施例3中提供的生物装置，能够用于体外诊断的单细胞捕获、分析以及胞间物质传输等方面，提高了单细胞分析的准确性，从而为单细胞的实时监测提供了新型的手段。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，仅具体描述了本发明的技术原理，这些描述只是为了解释本发明的原理，不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处解释，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，及本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其他具体实施方式，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种双层微孔芯片，其特征在于，包括：第一微孔结构层以及与所述第一微孔结构层连接的第二微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸；
第一微孔结构的厚度为10um，第二微孔结构层的厚度为30um，第一微孔结构层以及所述第二微孔结构层的孔隙率为5％，所述第一层微孔及所述第二层微孔的横截面为圆形，所述第一层微孔的直径为10um，所述第二层微孔的直径为30um。
2.如权利要求1所述的双层微孔芯片，其特征在于，所述第一层微孔均匀间隔分布在所述第一微孔结构层上，所述第二层微孔均匀间隔分布在所述第二微孔结构层上。
3.如权利要求1所述的双层微孔芯片，其特征在于，所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径所在的竖直轴线处于同一水平线且横轴平行。
4.如权利要求1所述的双层微孔芯片，其特征在于，第一微孔结构层以及所述第二微孔结构层采用感光性透明高分子或者热固性透明高分子制成。
5.如权利要求1所述的双层微孔芯片，其特征在于，所述样本为生物体细胞或荧光微球。
6.如权利要求5所述的双层微孔芯片，其特征在于，所述第二层微孔的平面形状内切的最大圆的直径为容纳到所述样本的1-3倍的范围。
7.如权利要求5所述的双层微孔芯片，其特征在于，所述第二层微孔的深度为要容纳为所述样本直径的1-3倍。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的双层微孔芯片的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
在衬底上形成一层金属种子层；
在所述金属种子层表面涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层，所述第一微孔结构层包括若干个第一层微孔；
在所述第一层光刻胶微孔层涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第二层光刻胶微孔层，得到所述第二微孔结构层，所述第二微孔结构层包括若干个第二层微孔；
将所述金属种子层进行剥离，得到所述双层微孔芯片；
所述第一层微孔的孔径以及所述第二层微孔的孔径均保持一致，所述第一层微孔的孔径及所述第二层微孔的孔径由小到大，且任意一个所述第二层微孔具有仅可容纳一个样本的形状以及尺寸；
在所述金属种子层表面涂覆光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层的步骤中，具体为：
利用软光刻的工艺在所述金属种子层旋涂光刻胶，并在所述光刻胶上制作第一层光刻胶微孔层，得到所述第一微孔结构层。
9.如权利要求8所述的双层微孔芯片的制备方法，其特征在于，所述的衬底为硅或氮化硅或氧化硅。
10.如权利要求8所述的双层微孔芯片的制备方法，其特征在于，在衬底上形成一层金属种子层的步骤中，具体为：
利用磁控溅射在衬底表面溅射一层金属，所述金属为铬或镍或铝。
11.如权利要求8所述的双层微孔芯片的制备方法，其特征在于，所述的光刻胶包括SU8-3005或SU8-3025。
12.如权利要求8所述的双层微孔芯片的制备方法，其特征在于，将所述金属种子层进行剥离，得到所述双层微孔芯片的步骤中，具体为：
最后利用金属清洗液对所述金属种子层进行剥离。
13.一种生物装置，其特征在于，包括上壳体、权利要求1至7任一项所述的双层微孔芯片以及下壳体，所述上壳体及所述下壳体固定安装，所述双层微孔芯片固定于所述上壳体及所述下壳体形成的空间内。
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