CN113101989A - 一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片 - Google Patents

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张星辰
李志伟
郑昕宇
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Abstract

本发明公开了一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，包括导电基底、与导电基底相配合的芯片本体，芯片本体包括盖板、开设在盖板内的微通道，微通道包括依次相连通的第一入口、细胞阵列化捕获区和第一出口，细胞阵列化捕获区包括依次相连通的第一通道、捕获通道、至少一个分通道和第二通道，第一通道与所述第一入口相连通，捕获通道的至少一个侧壁间隔开设有多个捕获口，第二通道与所述第一出口相连通。本发明可以对多个单细胞进行捕获，并实现单细胞水平上的捕获、拉伸与释放，有利于在单细胞水平上分析其力学特性；使芯片在无拆卸下重复利用，提升芯片利用率，提高自动化程度；可以提供更多有效的拉伸形变量数据。

Description

一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片。
背景技术
微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。
生命体内细胞的生长、分化、分裂、凋亡等生物学过程会受到包括力学因素在内的多种环境因素的影响，其中，生物力学因素与细胞的生物性能密切相关，直接影响细胞的形态、结构、生长及功能。因而通过研究细胞的生物力学特性可以在一定程度上表征细胞的生理功能。对细胞进行拉伸操作就可以通过拉伸形变量的不同，测量出各个细胞的力学特性。现有的测量技术主要包括微管吸吮、光镊、磁微粒扭转、原子力显微镜，但是这些方法大多都对细胞损伤大、操作困难且无法实现高通量。微管吸吮技术无法实现高通量，容易损害细胞样品；光镊也难以实现高通量，操作复杂，价格昂贵；磁微粒扭转技术操作困难；原子力显微镜依赖细胞自身的粘附性，操作难度较大。总之，现有的技术或多或少存在着自动化程度低、操作困难、效率较低、无法实现高通量、价格昂贵等问题。
发明内容
针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片。
为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：
一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，包括导电基底、与所述导电基底相配合的芯片本体，所述芯片本体包括盖板、开设在所述盖板内的微通道，所述微通道包括第一入口、细胞阵列化捕获区和第一出口，所述细胞阵列化捕获区包括依次相连通的第一通道、捕获通道、至少一个分通道和第二通道，所述第一通道与所述第一入口相连通，所述捕获通道的至少一个侧壁间隔开设有多个捕获口，所述第二通道与所述第一出口相连通。
作为本发明的进一步改进，所述捕获口包括喇叭口、与所述喇叭口相连通的通孔。
作为本发明的进一步改进，所述喇叭口的外部宽度为10-20μm、内部宽度为4-12μm，所述捕获通道的宽度为80-120μm。
作为本发明的进一步改进，所述喇叭口的外部宽度为15μm、内部宽度为8μm，所述捕获通道的宽度为100μm。
作为本发明的进一步改进，所述导电基底与所述芯片本体紧密键合。
作为本发明的进一步改进，所述导电基底为ITO玻璃，所述ITO玻璃的ITO电极对准所述喇叭口。
作为本发明的进一步改进，所述ITO电极的边缘对准所述喇叭口。
作为本发明的进一步改进，所述第一入口处安装有第一单向阀，所述第一出口连接有第一微流泵。
作为本发明的进一步改进，所述微通道还包括第二入口和第二出口，所述第二入口与所述第二通道相连通，所述第二出口与所述第一通道相连通。
作为本发明的进一步改进，所述第二入口连接有第二微流泵，所述第二出口处安装有第二单向阀。
本发明的有益效果是：
1、本发明微流控芯片通过微通道以及电极结构的设计，可以用来对多个单细胞进行捕获，实现细胞的阵列化捕获和拉伸，并实现单细胞水平上进行的捕获、拉伸与释放，有利于在单细胞水平上分析其力学特性。
2、使用两个入口、两个出口以及两个单向阀的设计，使芯片在无拆卸的情况下可重复利用，更易释放细胞以及释放后的反复操作，提升芯片利用率，同时也更容易与自动化技术相结合，提高自动化程度。
3、可以通过细胞释放功能清空捕获区进而实现反复拉伸操作，可以提供更多有效的拉伸形变量数据，提高数据的可靠性以及结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的优选实施例的基底的结构示意图；
图2为本发明的优选实施例的导电基底的结构示意图；
图3为图2中A的放大示意图；
图4为本发明的优选实施例的芯片本体的结构示意图；
图5为图4中B的放大示意图；
图6为图5中C的放大示意图；
图7为本发明的优选实施例的微流控芯片的结构示意图；
图8为在未加ITO电极下进行的单细胞预捕获和释放实验效果图；
图9是键合ITO电极之后，捕获与释放的实验效果图；
图10为细胞捕获、拉伸与释放的原理图；
图11为实际进行的细胞拉伸实验图；
图中：10、导电基底，101、基底，102、ITO电极，1021、ITO电极的边缘，20、芯片本体，201、盖板，202、第一入口，203、第一出口，204、第一通道，205、捕获通道，206、分通道，207、第二通道，208、捕获口，209、喇叭口，210、通孔，213、第二入口，214、第二出口，215、第一过渡通道，216、第二过渡通道，217、第三过渡通道，218、第四过渡通道。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如图1-图7所示，本发明一实施例提供了一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，包括导电基底10和芯片本体20。
芯片本体20包括盖板201、开设在盖板201内的微通道，微通道包括依次相连通的第一入口202、细胞阵列化捕获区和第一出口203，细胞阵列化捕获区包括依次相连通的第一通道204、捕获通道205、至少一个分通道206和第二通道207，第一通道204与第一入口202相连通，捕获通道205的至少一个侧壁间隔开设有多个捕获口208，第二通道207与第一出口203相连通，利用流体动力学原理，使细胞卡在捕获口208，第一个细胞会堵住一个捕获口208，从而使其他细胞往另外的捕获口208流动，当所有捕获口208都完成捕获之后，多余的细胞会从后面的分通道206经由第二通道207流出。
请参阅图5、图6，在本实施例中，捕获口208包括喇叭口209、与喇叭口209相连通的通孔210，喇叭口209的外部与捕获通道205相连通，喇叭口209的内部与通孔210相连通，通孔210与分通道206相连通，便于形成流线，卡住细胞。
为了提高捕获效率，缩短捕获时间，提升细胞测量数据量，本实施例优选捕获通道205相对的两个侧壁均间隔开设有多个捕获口208，分通道206的数量为两个，每个分通道206均与捕获通道205、第二通道207相连通。
本实施例优选喇叭口209的外部宽度d1为10-20μm、内部宽度d2为4-12μm，捕获通道205的宽度d3为80-120μm，对细胞的捕获效率高。
进一步优选喇叭口209的外部宽度d1为15μm、内部宽度d2为8μm，捕获通道205的宽度d3为100μm，用于捕获10-13μm的单细胞，达到最佳的捕获率。具体地，通孔210的孔径与喇叭口209的内部宽度d2相同。
本实施例优选第一入口202处安装有第一单向阀(图中未示出)，当往第一入口202通入细胞溶液时，第一单向阀设置成只进不出，第一出口203连接有第一微流泵(图中未示出)，第一微流泵上安装有一个20ml的第一注射器(图中未示出)，未装有溶液，通过施加负压将细胞溶液吸入芯片本体20。
微通道还包括第二入口213和第二出口214，第二入口213与第二通道207相连通，第二出口214与第一通道204相连通，当细胞捕获并拉伸完成之后，在第二入口213将缓冲液通入芯片本体20，缓冲液反向流经细胞阵列化捕获区，在流体力的作用下带动细胞向第二出口214流出，完成细胞释放，从而便于接收另一批细胞。
本实施例优选第二入口213连接有第二微流泵(图中未示出)，第二出口214处安装有第二单向阀(图中未示出)，第二微流泵上安装有一个20ml的第二注射器(图中未示出)，装有DEP缓冲液，通过施加正压沿着第二入口213将DEP缓冲液通入芯片本体20，第二单向阀设置成只出不进，从而在流体力的作用下快速带动细胞向第二出口214流出，完成细胞的快速释放。
为了便于细胞溶液从第一入口202进入第一通道204，再通过第一出口203排出，本实施例优选第一入口202与第一通道204之间连通有第一过渡通道215，第一出口203与第二通道207之间连通有第二过渡通道216。为了便于DEP缓冲液从第二入口213进入第二通道207，再通过第二出口214排出，本实施例优选第二入口213与第二通道207之间连通有第三过渡通道217，第二出口214与第一通道204之间连通有第四过渡通道218。
其中，DEP缓冲液中的DEP为介电泳，也称双向电泳，是介电常数较低的物体在非匀强电场中受力的现象。介电力大小与物体是否带电无关，与物体的大小、电学性质、周围介质的电学性质以及外加电场的场强、场强变化率、频率有关。本实施例的DEP缓冲液，主要成分如下：100ml去离子水，8.5g蔗糖，0.3g葡萄糖，0.2mg氯化钙。这个溶液有如下作用，细胞存活时间长(等渗，4个小时以上)，氯化钙的作用是调节电导率，0.2mg恰好使溶液电导率为50μs/cm，此成分的量可以调节。
优选芯片本体20的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，是有机硅的一种，成本低廉，使用简单，与硅片之间具有良好的粘附性，而且具有良好的化学惰性，但并不局限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可以为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。优选微通道采用软光刻工艺制作。
本实施例中，导电基底10为ITO玻璃，ITO玻璃是在材质为硅硼基基片玻璃的基底101上利用溅射、蒸发等多种方法在基底101上镀上的一层氧化铟锡(俗称ITO)膜，即硅硼基基片玻璃的上面镀有一层氧化铟锡膜，也就是在基底101上形成ITO电极102，ITO电极102对准喇叭口208。可以理解的是，基底101并不局限于硅硼基基片玻璃，也可以为钠钙基基片玻璃。
本实施例中，将ITO电极的边缘1021对准喇叭口208。本实施例的ITO电极102为叉指电极，利用光刻工艺以及湿法刻蚀技术制作而成。本实施例中，叉指电极的电极间隙距离d4设置为20μm，可以使细胞更好地在电极捕获后实现细胞拉伸。
装配时，将导电基底10放在下面，芯片本体20放在上面，通过对准平台进行对准，使导电基底10与芯片本体20紧密键合，避免液体的渗漏。
微流控芯片的力学特性检测具体步骤如下：
(1)单细胞捕获。将微流控芯片放在显微摄像头下，用于在连接的电脑上观察细胞的捕获情况。首先将第一入口202的软管放在DEP溶液中，DEP溶液中加入Jurkat细胞，开启第一微流泵，此时第一微流泵设置的流速为2μl/min，第一注射器抽取，施加负压将第一入口202中的细胞溶液吸入微流控芯片中，依次经过第一过渡通道215、第一通道204进入捕获通道205，在介电泳作用下，细胞会向ITO电极的边缘1021流动，从而被捕获在喇叭口209，显微镜下实时观察细胞的捕获情况，当所有捕获口208完成捕获后，关闭第一微流泵，此时实现预期的单细胞物理捕获。
(2)细胞电捕获及拉伸。在完成上述单细胞捕获后，开启与ITO电极102的两端连接的信号发生器，设置电压5Vpp、频率12MHz的正弦波信号，实现Jurkat细胞的电捕获，在显微镜下观察电捕获情况，完成电捕获后，再设置电压8Vpp、频率12MHz的正弦波信号，此时细胞会在电场梯度作用下进行拉伸，在显微摄像头连接的电脑上检测其拉伸情况。
(3)细胞释放。在信号发生器增加电压完成拉伸后，关闭信号发生器，开启第二微流泵，此时第二微流泵设置流速为500μl/min，将第二注射器中的DEP缓冲液依次通过第二入口213、第三过渡通道217、第二通道207、分通道206、捕获通道205、第一通道204、第四过渡通道218，使得被捕获的细胞由第二出口214排出，充分释放微流控芯片中一批被拉伸的细胞，在显微摄像头连接的电脑上观察其释放情况，当细胞阵列化捕获区没有细胞时，关闭第二微流泵，此时微流控芯片中没有细胞，可以继续进行下一批的拉伸实验，实现微流控芯片1的重复利用。
其中，图8(a)为在未加ITO电极102下进行的单细胞预捕获实验图，图8(b)为在正向捕获完成后利用DEP缓冲液的反向流动来完全释放细胞的实验效果图，可以看到基本多数捕获区域都可以实现单细胞的捕获，其释放效率也非常可观。图9是键合ITO电极102之后，捕获与释放的实验效果图，其中，图9(a)为键合ITO电极102之后，细胞捕获的实验效果图，图9(b)为细胞释放的实验效果图。图10为细胞捕获、拉伸与释放的原理图，其中图10(a)是细胞在正向流动时，利用流体动力学原理实现的细胞物理捕获，图10(b)为在介电泳作用下使ITO电极的边缘1021附近的细胞捕获在ITO电极102上的过程，图10(c)为在介电泳作用下增大电压完成的细胞拉伸，图10(d)为完成拉伸之后，通过反向的冲洗来释放细胞的过程。图11为实际进行的细胞拉伸实验，在捕获完成之后，通过在捕获区域附近的ITO电极102在介电泳作用下实现电捕获及拉伸，其中，图11(a)为拉伸前的细胞图像，图11(b)为拉伸后的细胞图像，通过拉伸前后的比对可以得到其杨氏模量等力学特性参数。
具体实验数据：进行了多次单细胞捕获实验，在本实施例的20个捕获口208中可以捕获不少于14个单细胞，捕获效率不低于70％，反向释放细胞的效率基本可以达到100％。细胞拉伸实验，针对Jurkat细胞，能够在电压5Vpp、频率12MHz的交流信号下实现捕获，在电压8Vpp、频率12MHz的交流信号下实现拉伸。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，包括导电基底、与所述导电基底相配合的芯片本体，所述芯片本体包括盖板、开设在所述盖板内的微通道，所述微通道包括第一入口、细胞阵列化捕获区和第一出口，所述细胞阵列化捕获区包括依次相连通的第一通道、捕获通道、至少一个分通道和第二通道，所述第一通道与所述第一入口相连通，所述捕获通道的至少一个侧壁间隔开设有多个捕获口，所述第二通道与所述第一出口相连通。
2.根据权利要求1所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述捕获口包括喇叭口、与所述喇叭口相连通的通孔。
3.根据权利要求2所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述喇叭口的外部宽度为10-20μm、内部宽度为4-12μm，所述捕获通道的宽度为80-120μm。
4.根据权利要求3所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述喇叭口的外部宽度为15μm、内部宽度为8μm，所述捕获通道的宽度为100μm。
5.根据权利要求1所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述导电基底与所述芯片本体紧密键合。
6.根据权利要求1或5所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述导电基底为ITO玻璃，所述ITO玻璃的ITO电极对准所述喇叭口。
7.根据权利要求6所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述ITO电极的边缘对准所述喇叭口。
8.根据权利要求1所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述第一入口处安装有第一单向阀，所述第一出口连接有第一微流泵。
9.根据权利要求1或8所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述微通道还包括第二入口和第二出口，所述第二入口与所述第二通道相连通，所述第二出口与所述第一通道相连通。
10.根据权利要求9所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述第二入口连接有第二微流泵，所述第二出口处安装有第二单向阀。
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