CN113092345A - 一种细胞力学特性自动化测量系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞力学特性自动化测量系统，包括微流控芯片、工控机、图像采集模块、第一微流泵、第二微流泵和信号发生器，微流控芯片分别与第一微流泵、第二微流泵、信号发生器相连接，图像采集模块、第一微流泵、第二微流泵以及信号发生器均与工控机相连接。本发明还公开了一种细胞力学特性自动化测量方法。本发明通过视觉反馈进行硬件控制，并结合图像形态算法识别细胞长度，自动测量出大批量的细胞形变量数据，建立细胞力学数据库，可以使得细胞力学特性分析具有统计学意义，其操作简单，自动化程度高，效率较高，可面向多种集成单细胞捕获、拉伸与释放功能于一体的微流控芯片或其他类似装置进行外部系统集成，用途较广，适用性较强。

Description

一种细胞力学特性自动化测量系统及方法

技术领域

本发明涉及一种测量设备，尤其涉及一种细胞力学特性自动化测量系统及方法。

背景技术

细胞力学(cell mechanics)是生物力学的一个前沿领域，也是组织工程学的一个重要组成部分。它涉及细胞在力学载荷作用下细胞膜、细胞骨架的变形、弹性常数、粘弹性、粘附力等力学性能的研究，以及力学因素对细胞生长、发育、成熟、增殖、衰老和死亡等的影响及其机制研究。细胞力学关注人体各类细胞，尤其是与血液循环系统、人体支撑运动系统、消化系统等有关的细胞。

细胞是生物体结构和功能的基本单位，生命活动都离不开细胞，因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键，而细胞力学特性的研究更是细胞研究中的关键。微流控芯片中多是基于介电泳进行细胞拉伸，然后通过细胞形变量不同来检测细胞的力学特性，而针对细胞的形变量测量，目前基本都是通过人工测量来完成的，利用显微摄像头拍摄后手动测量细胞形变前后的拉伸长度。这样的细胞测量方式，总是存在人为的机械式操作，操作繁琐，自动化程度低，耗时较长，效率低下，无法获得大量的数据，测量数据也不准确。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的在于提供一种细胞力学特性自动化测量系统及方法。

为了实现上述目的，本发明一实施例提供的技术方案如下：

一种细胞力学特性自动化测量系统，包括微流控芯片、工控机、图像采集模块、第一微流泵、第二微流泵和信号发生器，所述微流控芯片分别与所述第一微流泵、第二微流泵、信号发生器相连接，所述图像采集模块、第一微流泵、第二微流泵以及信号发生器均与所述工控机相连接。

在其中一实施例中，所述微流控芯片包括导电基底、与所述导电基底相配合的芯片本体，所述芯片本体包括盖板、开设在所述盖板内的微通道，所述微通道包括第一入口、第二入口、细胞捕获区、第一出口和第二出口，所述第一微流泵与所述第一入口相连接，所述第二微流泵与所述第二出口相连接。

在其中一实施例中，所述细胞捕获区包括捕获通道、开设在所述捕获通道的至少一个侧壁上的至少一个捕获口，所述第一入口、第二入口、第一出口、第二出口均与所述捕获通道相连通。

在其中一实施例中，所述捕获口包括喇叭口、与所述喇叭口相连通的通孔，所述喇叭口、通孔均与所述捕获通道相连通。

在其中一实施例中，所述导电基底包括为ITO玻璃，所述ITO玻璃的ITO电极的两端连接到所述信号发生器上，所述ITO电极的边缘对准所述喇叭口。

在其中一实施例中，所述图像采集模块包括显微镜、与所述显微镜相连接的工业相机，所述工业相机与所述工控机相连接。

一种细胞力学特性自动化测量方法，使用上述任意实施例的测量系统，包括以下步骤：

(1)开启第一微流泵；

(2)实时检测细胞捕获情况，判断是否达到捕获数量阈值，若是，则关闭第一微流泵；若否，则重复步骤(2)；

(3)开启信号发生器，发出低压信号，对细胞进行电捕获，接着发出高压信号，对细胞进行拉伸；

(4)实时检测记录细胞拉伸情况；

(5)关闭信号发生器，开启第二微流泵，释放微流控芯片中被拉伸的细胞；

(6)实时检测细胞释放情况，判断是否达到释放数量阈值，若是，则关闭第二微流泵，循环步骤(1)至步骤(6)，直至任务结束；若否，则重复步骤(6)。

在其中一实施例中，所述步骤(3)中，低压信号为第一正弦波信号，第一正弦波信号的电压为5Vpp、频率为12MHz，高压信号为第二正弦波信号，第二正弦波信号的电压为8Vpp、频率为12MHz。

在其中一实施例中，所述步骤(4)包括实时检测细胞在电压改变下的拉伸情况，记录细胞拉伸形变量数据，并生成细胞的拉伸量随时间变化的关系图。

在其中一实施例中，实时检测细胞在电压改变下的拉伸情况包括以下步骤：

通过图像处理依次进行灰度化、背景差分、二值化及高斯滤波处理；

通过边缘轮廓算法对细胞进行外接矩形的框选；

根据外接矩形的长宽值计算细胞的长度变化值。

本发明的有益效果是：

本发明应用自动化测量系统，通过视觉反馈进行硬件控制，并结合图像形态算法识别细胞长度，可以在无人操作的环境下，自动测量出大批量的细胞形变量数据，建立细胞力学数据库，可以使得细胞力学特性分析具有统计学意义，其操作简单，自动化程度高，效率较高，可面向多种集成单细胞捕获、拉伸与释放功能于一体的微流控芯片或其他类似装置进行外部系统集成，用途较广，适用性较强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的测量系统的微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明的测量系统的细胞捕获区的结构示意图；

图3为本发明的测量系统的结构示意图；

图4为本发明的测量系统的原理框图；

图5为本发明的测量方法的流程图；

图6为本发明在细胞捕获区识别的单个细胞的捕获图和释放图；

图7为本发明细胞的电捕获和拉伸状态图；

图8为本发明的细胞的拉伸量随时间变化的关系图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

如图1-图4所示，本发明一实施例提供了一种细胞力学特性自动化测量系统，包括微流控芯片1、工控机2、图像采集模块3、第一微流泵4、第二微流泵5和信号发生器6，微流控芯片1分别与第一微流泵4、第二微流泵5、信号发生器6相连接，图像采集模块3、第一微流泵4、第二微流泵5以及信号发生器6均与工控机1相连接。

在本实施例中，微流控芯片1包括导电基底101、与导电基底101相配合的芯片本体，芯片本体包括盖板103、开设在盖板103内的微通道，微通道包括第一入口104、第二入口105、细胞捕获区、第一出口106和第二出口107，细胞捕获区分别与第一入口104、第二入口105、第一出口106、第二出口107相连通，第一微流泵4与第一入口104相连接，第二微流泵5与第二出口107相连接。

具体地，细胞捕获区包括捕获通道108、开设在捕获通道108的至少一个侧壁上的至少一个捕获口109，第一入口104、第二入口105、第一出口106、第二出口107均与捕获通道108相连通，通过第一入口104通入加入细胞的缓冲液，利用流体动力学原理，细胞卡在捕获口109，当细胞捕获并拉伸完成之后，在第二入口105将缓冲液通入，缓冲液反向流经细胞捕获区，在流体力的作用下带动细胞向第二出口107流出，完成细胞的释放，从而便于接收新的细胞。

可以理解的是，在其他实施例中，可以在捕获通道108的一个侧壁上设置多个捕获口109，或者在捕获通道108相对的两个侧壁上均设置多个捕获口109，来实现对细胞的阵列化捕获与拉伸，大大提高细胞测量效率，充分补充实验数据。

在本实施例中，捕获口109包括喇叭口110、与喇叭口110相连通的通孔111，喇叭口110、通孔111均与捕获通道108，便于形成流线，卡住细胞。

具体地，第一微流泵4上安装有一个20ml的第一注射器7，未装有溶液，通过施加负压将细胞溶液吸入微流控芯片1中，第二微流泵5上安装有一个20ml的第二注射器8，通过施加正压将DEP缓冲液通入微流控芯片1中，从第二出口107流出，使捕获的细胞在流体力作用下充分释放。

其中，DEP缓冲液中的DEP为介电泳，也称双向电泳，是介电常数较低的物体在非匀强电场中受力的现象。介电力大小与物体是否带电无关，与物体的大小、电学性质、周围介质的电学性质以及外加电场的场强、场强变化率、频率有关。本实施例的DEP缓冲液，主要成分如下：100ml去离子水，8.5g蔗糖，0.3g葡萄糖，0.2mg氯化钙。这个溶液有如下作用，细胞存活时间长(等渗，4个小时以上)，氯化钙的作用是调节电导率，0.2mg恰好使溶液电导率为50μs/cm，此成分的量可以调节。

优选芯片本体的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，是有机硅的一种，成本低廉，使用简单，与硅片之间具有良好的粘附性，而且具有良好的化学惰性，但并不局限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可以为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。优选微通道采用软光刻工艺制作。

本实施例中，导电基底101为ITO玻璃，ITO玻璃是在材质为硅硼基基片玻璃的基底116上利用溅射、蒸发等多种方法在基底116上镀上的一层氧化铟锡(俗称ITO)膜，即硅硼基基片玻璃的上面镀有一层氧化铟锡膜，也就是在基底106上形成ITO电极117，ITO电极117的两端连接到信号发生器6上，ITO电极117的边缘1171对准喇叭口110。可以理解的是，基底116并不局限于硅硼基基片玻璃，也可以为钠钙基基片玻璃。

本实施例的ITO电极117为平行电极，采用光刻工艺以及湿法刻蚀技术。

装配时，将导电基底101放在下面，芯片本体放在上面，通过对准平台进行对准，使导电基底101与芯片本体紧密键合，避免液体的渗漏。

可以理解的是，微流控芯片1并不局限于上述实施例的结构，其他能够集成细胞捕获、拉伸及释放功能于一体的芯片也是可以的。

请参阅图3、图4，第一微流泵4、第二微流泵5、信号发生器6均通过通讯接口9与工控机2相连接。

在本实施例中，通讯接口9为RS485转USB接口，但并不局限于RS485转USB接口，也可以为RS232转USB接口。

请参阅图3、图4，图像采集模块3包括显微镜301、与显微镜301相连接的工业相机302，工业相机302与工控机2相连接。具体地，工业相机302为CCD相机，但并不局限于CCD相机，也可以为其他能够采集图像的设备。

工控机2包括图像处理模块201，能够调用图像采集模块3采集的细胞图像，对细胞图像进行处理分析，形成视觉反馈，便于工控机2通过相关串口协议实现对第一微流泵4、第二微流泵5以及信号发生器6的控制，使第一微流泵4、第二微流泵5发出启停的控制命令、信号发生器6发出启停和高低电压的控制命令。

如图5所示，本申请另一实施例提供了一种细胞力学特性自动化测量方法，使用上述任意实施例中的测量系统，包括以下步骤：

(1)开启第一微流泵4；

(2)实时检测细胞捕获情况，判断是否达到捕获数量阈值，若是，则关闭第一微流泵4；若否，则重复步骤(2)；

(3)开启信号发生器6，发出低压信号，对细胞进行电捕获，接着发出高压信号，对细胞进行拉伸；

(4)实时检测记录细胞拉伸情况；

(5)关闭信号发生器6，开启第二微流泵5，释放微流控芯片1中被拉伸的细胞；

(6)实时检测细胞释放情况，判断是否达到释放数量阈值，若是，则关闭第二微流泵，循环步骤(1)至步骤(6)，直至任务结束；若否，则重复步骤(6)。

为了进一步说明本发明的细胞力学特性自动化测量方法，作为优选方案，包括以下步骤：

(1)微流控芯片1放置在图像采集模块3下，开启第一微流泵4，此时第一微流泵4的流速为2μl/min，状态为抽吸；

(2)显微镜301和工业相机302配合下实时检测细胞捕获情况，判断是否达到捕获数量阈值，此判断是通过图像处理模块201中的灰度化、背景差分、二值化及高斯滤波处理，再通过边缘轮廓算法对细胞进行外接矩形的框选，最后根据外接矩形的个数便可以知道细胞的数量，从而得知在喇叭口110处是否有细胞，若是，表示在喇叭口110处捕获到细胞，自动关闭第一微流泵4，实现预期的单细胞捕获，其中，捕获数量阈值是根据捕获口109的数量来设定，比如捕获口109只有1个，则矩形的个数达到1则表示达到捕获数量阈值；或者捕获口109有多个，则设定一个捕获率，该捕获率指的是有细胞的捕获口数量与总的捕获口数量的比值，若达到该捕获率，则表示达到捕获数量阈值；若否，则重复步骤(2)；

(3)在视觉检测的信号判断下，当停止第一微流泵4后，自动开启信号发生器6，发出低压信号，低压信号为第一正弦波信号，第一正弦波信号的电压为5Vpp、频率为12MHz，对Jurkat细胞进行电捕获，在延时5s后，发出高压信号，高压信号为第二正弦波信号，第二正弦波信号的电压为8Vpp、频率为12MHz，此时细胞会在电场梯度作用下进行拉伸；

(4)在显微镜301和工业相机302的作用下实时检测细胞在电压改变下的拉伸情况，通过图像处理模块201中的灰度化、背景差分、二值化及高斯滤波处理，再通过边缘轮廓算法对细胞进行外接矩形的框选，最后根据外接矩形的长宽便可以知道细胞的长度变化，记录细胞拉伸形变量数据，并生成细胞的拉伸量随时间变化的关系图；

(5)在信号发生器6增加电压完成拉伸后，延时10s，自动关闭信号发生器6，开启第二微流泵5，此时第二微流泵5的流速为500μl/min，状态为灌注，充分释放微流控芯片1中被拉伸的细胞；

(6)在显微镜301和工业相机302的作用下实时检测细胞释放情况，判断是否达到释放数量阈值，此判断是通过图像处理模块201中的灰度化、背景差分、二值化及高斯滤波处理，再通过边缘轮廓算法对细胞进行外接矩形的框选，最后根据外接矩形的个数便可以知道细胞的数量，从而得知在喇叭口110处是否有细胞，若矩形个数为0，则表示细胞捕获区没有细胞，达到释放数量阈值，自动关闭第二微流泵5；若否，则重复步骤(6)。在任务需求没有结束时，自动重复步骤(1)至步骤(6)，形成循环实现自动检测。

图6(a)为在细胞捕获区识别到的单个细胞的状态图，图6(b)为利用DEP溶液反向流动释放细胞之后检测到无细胞的状态。图7(a)为在完成细胞的物理捕获之后，通过介电泳的方式在低压的情况下完成的电捕获，图7(b)为增大电压时使细胞拉伸的状态图，细胞是否到达及拉伸长度的判定主要依靠图像算法中的轮廓检测，采用动态物体的外接矩形来实现其判定。图8为采用本系统的长度检测算法在未经拟合的情况下生成的一个Jurkat细胞的拉伸量随时间变化的关系图。

具体的测试方法：细胞识别，通过视觉图像检测，单细胞识别率可达几乎100％，且可以精确检测出每个捕获口的异常捕获情况。细胞拉伸记录，通过视觉信号反馈给硬件相应的控制命令，在介电泳的作用下使细胞拉伸，可检测细胞捕获区单细胞的拉伸形变量，记录在excel表格中。本实验采用Jurkat细胞，在电压为5Vpp、频率为12MHz的交流信号下捕获，可以测出其直径大约11μm，在电压为8Vpp、频率为12MHz的交流信号下，拉伸后长度多数在13μm左右。

在不同电压峰峰值下拉伸数据有很多，都可以给出一定的数据，得出具有统计学意义的结论，通过不同微流控芯片结构的设计，还可以测出其他不同尺寸直径的细胞的力学特性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种细胞力学特性自动化测量系统，其特征在于，包括微流控芯片、工控机、图像采集模块、第一微流泵、第二微流泵和信号发生器，所述微流控芯片分别与所述第一微流泵、第二微流泵、信号发生器相连接，所述图像采集模块、第一微流泵、第二微流泵以及信号发生器均与所述工控机相连接。

2.根据权利要求1所述的一种细胞力学特性自动化测量系统，其特征在于，所述微流控芯片包括导电基底、与所述导电基底相配合的芯片本体，所述芯片本体包括盖板、开设在所述盖板内的微通道，所述微通道包括第一入口、第二入口、细胞捕获区、第一出口和第二出口，所述第一微流泵与所述第一入口相连接，所述第二微流泵与所述第二出口相连接。

3.根据权利要求2所述的一种细胞力学特性自动化测量系统，其特征在于，所述细胞捕获区包括捕获通道、开设在所述捕获通道的至少一个侧壁上的至少一个捕获口，所述第一入口、第二入口、第一出口、第二出口均与所述捕获通道相连通。

4.根据权利要求3所述的一种细胞力学特性自动化测量系统，其特征在于，所述捕获口包括喇叭口、与所述喇叭口相连通的通孔，所述喇叭口、通孔均与所述捕获通道相连通。

5.根据权利要求4所述的一种细胞力学特性自动化测量系统，其特征在于，所述导电基底包括为ITO玻璃，所述ITO玻璃的ITO电极的两端连接到所述信号发生器上，所述ITO电极的边缘对准所述喇叭口。

6.根据权利要求1所述的一种细胞捕获与拉伸一体式的阵列化微流控芯片，其特征在于，所述图像采集模块包括显微镜、与所述显微镜相连接的工业相机，所述工业相机与所述工控机相连接。

7.一种细胞力学特性自动化测量方法，其特征在于，使用如权利要求1-6中任意一项所述的测量系统，包括以下步骤：

(1)开启第一微流泵；

(2)实时检测细胞捕获情况，判断是否达到捕获数量阈值，若是，则关闭第一微流泵；若否，则重复步骤(2)；

(3)开启信号发生器，发出低压信号，对细胞进行电捕获，接着发出高压信号，对细胞进行拉伸；

(4)实时检测记录细胞拉伸情况；

(5)关闭信号发生器，开启第二微流泵，释放微流控芯片中被拉伸的细胞；

(6)实时检测细胞释放情况，判断是否达到释放数量阈值，若是，则关闭第二微流泵，循环步骤(1)至步骤(6)，直至任务结束；若否，则重复步骤(6)。

8.根据权利要求7所述的一种细胞力学特性自动化测量方法，其特征在于，所述步骤(3)中，低压信号为第一正弦波信号，第一正弦波信号的电压为5Vpp、频率为12MHz，高压信号为第二正弦波信号，第二正弦波信号的电压为8Vpp、频率为12MHz。

9.根据权利要求7所述的一种细胞力学特性自动化测量方法，其特征在于，所述步骤(4)包括实时检测细胞在电压改变下的拉伸情况，记录细胞拉伸形变量数据，并生成细胞的拉伸量随时间变化的关系图。

10.根据权利要求9所述的一种细胞力学特性自动化测量方法，其特征在于，实时检测细胞在电压改变下的拉伸情况包括以下步骤：

通过图像处理依次进行灰度化、背景差分、二值化及高斯滤波处理；

通过边缘轮廓算法对细胞进行外接矩形的框选；

根据外接矩形的长宽值计算细胞的长度变化值。

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