CN108303364B - 高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法，该装置包括：微流控芯片，包括：主压缩通道，其横截面积小于细胞横截面积，使细胞沿其产生拉伸并流动；辅压缩通道，与主压缩通道交叉联通，其横截面积小于拉伸的细胞的侧边横截面积；以及电极，分别设置于辅压缩通道两端，在两电极间形成导电通道；阻抗测量模块，连接两个电极，测量细胞流经主压缩通道和辅压缩通道的交叉位置时两电极间阻抗数据；以及数据处理模块，连接至阻抗测量模块，根据获得的阻抗数据计算细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数。进一步提供了使用该装置进行检测的方法。本公开实现了前述参数的高通量检测，峰值检测通量可达到100cells/s。
Description
技术领域
本公开涉及微流控技术领域，尤其涉及一种高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法。
背景技术
细胞异质性(heterogeneity)是一种从细菌细胞到真核细胞普遍存在的生物学现象。研究单细胞的异质性对于理解干细胞分化过程、肿瘤诊疗等有着重要意义。在研究单细胞异质性的众多表征方法中，细胞尺寸是一项很重要的物理参数。此外，单细胞电学特性作为一种重要的单细胞生物物理特性，已经被证明可以用于区分不同的肿瘤细胞、血细胞。单细胞电学特性包括细胞膜电容和细胞质电阻，考虑到细胞在尺寸上的差异，使用独立于细胞尺寸的参数进行细胞间的比较更有意义。而若想得到独立于细胞尺寸的参数，即细胞膜比电容和细胞质电导率，则需依赖于细胞尺寸参数。所以，细胞尺寸、细胞膜比电容、细胞质电导率的检测具有重要意义。
关于细胞尺寸的检测，一般可通过采集细胞图像并通过图像处理软件对细胞直径进行测量。本课题组曾提出，基于压缩通道，显微镜和高速摄像机拍摄到细胞在压缩通道中伸长的图像，进行图像处理得到细胞的伸长长度，但是因为受限于高速光学拍照，无法实现高通量检测。
而针对细胞尺寸和细胞电学特性同时进行高通量检测的方法则更鲜有报道。基于微流控技术研究单细胞电学特性的方法主要有阻抗频谱技术、微阻抗流式细胞仪等。阻抗频谱技术的具体步骤是通过微操作方法(如流体力捕获、负压吸取、介电泳力捕获、表面修饰等)，将细胞固定在电极之间，记录阻抗变化，表征细胞电学特性。该方法不能连续测量且通量低；微阻抗流式细胞仪是在流式细胞仪的基础上，在流道侧壁安装电极，通过检测细胞流过时多个频率点阻抗变化表征细胞电学特性。该方法可高通量得到细胞尺寸数据以及细胞膜电容、细胞质电导等电学参数。但是电极之间存在溶液，会形成较大的漏电流，无法得到尺寸无关的单细胞电参数。
因此发展一种高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的方法是非常有意义的。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本公开提供了一种高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法，以至少部分解决以上所提出的技术问题。
(二)技术方案
根据本公开的一个方面，提供了一种细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测装置，尺寸无关单细胞电参数包括细胞膜比电容和细胞质电导率，该高通量检测装置包括：微流控芯片，包括：主压缩通道，其横截面积小于细胞横截面积，用于使细胞沿主压缩通道产生拉伸并流动；辅压缩通道，与主压缩通道交叉联通，辅压缩通道的横截面积小于拉伸的细胞的侧边横截面积；以及电极，分别设置于辅压缩通道的两端，并且两个电极均和辅压缩通道连通，用于形成导电通道；阻抗测量模块，连接两个电极，用于在若干检测频率下分别测量细胞流经主压缩通道和辅压缩通道的交叉位置时导电通道内的阻抗变化；以及数据处理模块，连接至阻抗测量模块，用于根据导电通道内单一检测频率下的阻抗数据随细胞流动的变化规律，计算沿主压缩通道方向的细胞尺寸，以及根据在至少两个检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据、和无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率。
在本公开的一些实施例中，数据处理模块根据以下公式计算细胞尺寸lcell：vcell×(t2-t1)＝lchannel2或vcell×(t4-t3)＝lchannel2；以及vcell×(t3-t2)＝lcell-lchannel2；
其中，vcell为细胞在主压缩通道中的通过速率，lchannel2为辅压缩通道在主压缩通道方向上的横截面宽度，t1、t2、t3和t4分别为阻抗变化过程中阻抗幅值增加、维持、减小再到维持或阻抗相位减小、维持、增加再到维持的开始时刻。
在本公开的一些实施例中，主压缩通道的横截面为矩形、圆形或半圆形，横截面尺寸介于5～20μm之间；辅压缩通道的横截面为矩形、圆形或半圆形，横截面尺寸介于2.5～8μm之间。
在本公开的一些实施例中，微流控芯片还包括：细胞流入通道，连接至主压缩通道，用于使细胞顺利进入主压缩通道；以及细胞回收通道，连接至主压缩通道，用于使细胞从主压缩通道流出后排出微流控芯片。
在本公开的一些实施例中，该高通量检测装置还包括：压力控制模块，连接至细胞流入通道或细胞回收通道，用于提供细胞在主压缩通道内流动的动力。
在本公开的一些实施例中，阻抗测量模块的检测频率为0～1MHz。
在本公开的一些实施例中，数据处理模块根据以下公式计算细胞膜比电容和细胞质电导率：
Zm＝Zparasitic||Rchannel；
Zm＝＝Zparasitic||{Rchannel′+[Rleak||(Rcytoplasm+2×Zmembranel)]}；
其中，Zm为总等效阻抗，Zparasitic为寄生电容阻抗，Rchannel为两电极间导电溶液总电阻，j为复数中虚数符号，f为检测频率，Cparasitic为寄生电容，r为对微流控通道进行有限元仿真得到的比例系数，Rchannel4为辅压缩通道部分的总电阻，lec为辅压缩通道总长度；Sec为辅压缩通道横截面积；σliquid为导电溶液电导率，Rchannel’为两电极间不含交叉位置的导电溶液的电阻，lchannell为主压缩通道宽度，Zmembranel为细胞膜阻抗，Rcytoplasm为细胞质电阻，Rleak为细胞周围没有完全填充部分的漏电阻，Cmembranel为细胞膜电容，Cspecificmembrane为细胞膜比电容，σcytoplasm为细胞质电导率，Sea为利用数值模拟得到的修正因子MF对Sec进行修正得到的细胞质电阻等效面积。。
根据本公开的另一个方面，提供一种使用如上所述的高通量检测装置进行细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数检测的方法，包括：使主压缩通道和导电通道内充满导电溶液；在若干检测频率下分别测量细胞流经主压缩通道和辅压缩通道的交叉位置时导电通道内的阻抗变化；根据导电通道内的单一检测频率下阻抗数据随细胞流动的变化规律，计算沿主压缩通道方向的细胞尺寸；以及根据在至少两个检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，以及无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率。
在本公开的一些实施例中，根据以下公式计算细胞尺寸lcell：vcell×(t2-t1)＝lchannel2或vcell×(t4-t3)＝lchannel2；以及vcell×(t3-t2)＝lcell-lchannel2；
其中，vcell为细胞在主压缩通道中的通过速率，lchannel2为辅压缩通道在主压缩通道方向上的横截面宽度，t1、t2、t3和t4分别为阻抗变化过程中阻抗幅值增加、维持、减小再到维持或阻抗相位减小、维持、增加再到维持的开始时刻。
在本公开的一些实施例中，检测频率的范围为0～1MHz。
在本公开的一些实施例中，细胞膜比电容和细胞质电导率通过以下公式计算得到：
Zm＝Zparasitic||Rchannel；
Zm＝Zparasitic||{Rchannel′+[Rleak||(Rcytoplasm+2×Zmembranel)]}；
其中，Zm为总等效阻抗，Zparasitic为寄生电容阻抗，Rchannel为两电极间导电溶液总电阻，j为复数中虚数符号，f为检测频率，Cparasitic为寄生电容，r为对微流控通道进行有限元仿真得到的比例系数，Rchannel4为辅压缩通道部分的总电阻，lec为辅压缩通道总长度；Sec为辅压缩通道横截面积；σliquid为导电溶液电导率，Rchannel’为两电极间不含交叉位置的导电溶液的电阻，lchannell为主压缩通道宽度，Zmembranel为细胞膜阻抗，Rcytoplasm为细胞质电阻，Rleak为细胞周围没有完全填充部分的漏电阻，Cmembranel为细胞膜电容，Cspecificmembrane为细胞膜比电容，σcytoplasm为细胞质电导率，Sea为利用数值模拟得到的修正因子MF对Sec进行修正得到的细胞质电阻等效面积。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本公开高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法至少具有以下有益效果其中之一：
(1)利用细胞流经交叉联通的压缩通道时，在交叉位置处产生的阻抗变化规律，计算沿主压缩通道方向的细胞尺寸，整个检测过程不受限于高速光学拍照，无需进行复杂的图像处理，实现了高通量的细胞尺寸检测，峰值检测通量可达到100cells/s。
(2)利用检测过程中的阻抗数据，可以获取细胞尺寸、细胞膜比电容和细胞质电导率，避免了复杂的后期数据处理过程，保证了该三个参数的高通量检测。
(3)由于电场方向与细胞流动方向垂直，且细胞在主压缩通道中被压缩，在交叉位置处能将辅压缩通道很好地填充，沿电场方向存在的漏电流很小或几乎没有，有利于得到尺寸无关的单细胞电参数。
(4)微流控芯片的结构可以进行并行化结构扩展，可方便地进行细胞穿行方向上的并联和串联排布，同时高效地测量多个细胞的细胞尺寸、细胞膜比电容和细胞质电导率。
附图说明
图1为本公开实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测装置的示意图。
图2为图1中微流控芯片的示意图。
图3为本公开实施例微流控芯片的加工流程图。
图4(a)～图4(e)为细胞流经交叉位置处的示意图。
图4(f)～图4(g)为细胞流经交叉位置处的阻抗变化示意图。
图5(a)为无细胞通过交叉位置时压缩通道电学模型。
图5(b)为单细胞电学模型。
图5(c)为有细胞通过交叉位置时细胞与压缩通道等效电学模型。
图6为本公开实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测方法流程图。
【附图中本公开实施例主要元件符号说明】
1-微流控芯片；
11-细胞流入通道； 12-主压缩通道； 13-细胞回收通道；
14-辅压缩通道； 15-导电通道； 16-电极；
2-压力控制模块；
3-阻抗测量模块。
具体实施方式
本公开提供了一种高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法，其中尺寸无关单细胞电参数包括细胞膜比电容和细胞质电导率，利用细胞流经交叉联通的压缩通道时，在交叉位置处的阻抗数据，计算细胞尺寸、细胞膜比电容和细胞质电导率，整个检测过程不受限于高速光学拍照，无需进行复杂的图像处理，实现了这三个参数的同时、高通量检测。
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
图1为本公开实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测装置的示意图。如图1所示，本公开细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测装置包括：微流控芯片1，包括：主压缩通道12，其横截面积小于细胞横截面积，用于使细胞沿主压缩通道12产生拉伸并流动；辅压缩通道14，与主压缩通道12交叉联通，辅压缩通道14的横截面积小于拉伸的细胞的侧边横截面积；以及电极16，分别设置于辅压缩通道14的两端，并且两个电极16均和辅压缩通道14连通，用于在两个电极间形成导电通道15；阻抗测量模块3，连接两个电极16，用于测量细胞流经主压缩通道12和辅压缩通道14的交叉位置时导电通道15内的阻抗变化；数据处理模块(图中未画出)，连接至阻抗测量模块3，用于根据导电通道15内单一检测频率下的阻抗幅值或相位随细胞流动的变化规律，计算沿主压缩通道方向的细胞尺寸、以及根据在至少两个检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，以及无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率。
以下分别对本实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测装置的各组成部件作详细说明。
微流控芯片一般包括绝缘衬底及与其紧密结合的绝缘承载体，上述的主压缩通道12、辅压缩通道14均形成于绝缘承载体内。绝缘衬底可采用玻璃材料，还可以采用硅片、聚酸甲酯(Polymethylmethacrylate，简称PMMA，英文Acrylic，又称做压克力、亚克力或有机玻璃)或聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，简称PDMS)片等片状材料。绝缘承载体可采用PDMS材料，还可以采用玻璃、负性光刻胶SU-8、硅片等材料。
在不同的实施例中，主压缩通道12的横截面可为矩形、圆形或半圆形，横截面尺寸介于5～20μm之间，例如横截面为矩形时，横截面尺寸为该矩形的对角线长度，其具体数值需要根据细胞尺寸选取，尺寸过大细胞不易变形，不能良好地填充辅压缩通道，根据细胞平均尺寸及经验值确定其典型值为15μm左右；辅压缩通道的横截面可为矩形、圆形或半圆形，横截面尺寸介于2.5～8μm之间，例如横截面为圆形时，圆形的直径可为3μm。
主压缩通道12和辅压缩通道14呈直角相交，实际上并不局限于直角，非直角相交的情况下也可实现细胞尺寸、细胞膜比电容和细胞质电导率的检测。
由于辅压缩通道14尺寸较小，故将两个电极16设置于辅压缩通道14的两端，并且电极和与该电极靠近的辅压缩通道口之间形成通道，以使两电极能够与辅压缩通道内的导电溶液相接触，该通道和辅压缩通道14共同构成了导电通道15，导电通道15内充满导电溶液，实现阻抗测量功能。
在不同的实施例中，可使用不同种类的电极，例如可以是Ag/AgCl电极，也可以是甘汞电极，石墨电极或纯银电极。电极可以形成于绝缘衬底上或者嵌入绝缘衬底，只要电极能够与通道内的导电溶液接触即可。
图2为图1中微流控芯片的示意图。如图2所示，微流控芯片1还包括：细胞流入通道11，连接至主压缩通道12的第一端，用于注入细胞，并使细胞顺利进入主压缩通道12；以及细胞回收通道13，连接至主压缩通道12的第二端，用于使细胞从主压缩通道12流出后排出微流控芯片1。
本实施例的微流控芯片的制作过程如图3所示，包括：
步骤a：准备载玻片；
步骤b：在载玻片上旋涂一层负性光刻胶SU-85，前烘、曝光、不显影、后烘，形成主压缩通道及辅压缩通道阳模；
步骤c：在负性光刻胶SU-85上再旋涂一层负性光刻胶SU-825，前烘、对准曝光；
步骤d：进行后烘、显影、坚膜，形成细胞流入通道、导电通道、细胞回收通道阳模；
步骤e：在制作好的模具上浇注配置好的PDMS与固化剂混合液；
步骤f：固化后脱膜得到微流控通道；
步骤g：在载玻片上旋涂一层AZ 1500、前烘、曝光；
步骤h：显影，去除有电极位置的光刻胶；
步骤i：在步骤h得到的载玻片上进行溅射金属；
步骤j：进行剥离操作，获得金属电极；
步骤k：在PDMS材料上打孔，并将得到的PDMS与步骤j的载玻片对准键合。
除了图3中所示使用盖板加基板封接的形式形成通道，也可在玻璃等材料的内部刻蚀，同样可得到上述结构的微流控芯片。
该高通量检测装置还包括：压力控制模块2，本实施例中压力控制模块2采用常规结构，例如可采用依次连接的密闭软管、压力控制器和负压源(泵)等部件，其中密闭软管的一端连接至细胞回收通道，另一端连接至压力控制器，通过负压驱动细胞通过主压缩通道。当然也可采用能够提供正压的压力控制模块，通过在细胞流入通道处施加正压的方式，驱动细胞通过主压缩通道。
阻抗测量模块3为公知技术，包括锁相放大器和函数发生器，其检测频率为0～1MHz，频率过高会将细胞击穿，本实施例中使用的阻抗测量模块根据需要可以精确检测1mHz～250kHz下，阻抗幅值为1MΩ至20MΩ的直流和交流阻抗，输出频率至少为1000点/秒。
数据处理模块计算细胞尺寸、细胞膜比电容和细胞质电导率的原理如下：
关于细胞尺寸的计算：由于微流控芯片中将主压缩通道12的横截面积设置为小于细胞横截面积，并将辅压缩通道的横截面积设置为小于拉伸的细胞的侧边横截面积，使得电极间阻抗数据(包括相位和幅值)随着细胞流经交叉位置处时，能够产生以下规律，根据该规律计算细胞尺寸：如图4(a)至图4(e)所示，细胞前端开始进入主压缩通道与辅压缩通道交叉位置处时，电极间阻抗幅值逐渐增大；当细胞将辅压缩通道横截面全部填充满后，细胞沿着主压缩通道继续流动，电极间阻抗幅值数据基本不发生变化；细胞末端开始流出交叉位置处时，电极间阻抗幅值逐渐减小。阻抗相位变化与阻抗幅值相反。具体计算时，单个使用阻抗幅值数据或者阻抗相位数据均可实现。可将图4(f)采集的阻抗数据归纳为图4(g)中的模型。
如图4(g)，在t1～t2时刻，细胞运动距离为辅压缩通道宽度lchannel2，有：
vcell×(t2-t1)＝lchannel2， (1)
在t2～t3时刻，细胞运动距离为lcell-lchannel2，有：
vcell×(t3-t2)＝lcell-lchannel2， (2)
在t3～t4时刻，细胞运动距离为辅压缩通道宽度lchannel2，有：
vcell×(t4-t3)＝lchannel2， (3)
其中，vcell为细胞在主压缩通道中的通过速率，lchannel2为辅压缩通道在主压缩通道方向上的横截面宽度，t1、t2、t3和t4分别为阻抗变化过程中阻抗幅值增加、维持、减小再到维持或阻抗相位减小、维持、增加再到维持的开始时刻。
联立式(1)、式(2)或者式(2)、式(3)，求解方程组即可得到细胞尺寸lcell。
关于细胞膜比电容和细胞质电导率的计算：根据在至少两个检测频率下有细胞通过主压缩通道12和辅压缩通道14的交叉位置时测得的阻抗数据，以及无细胞通过所述交叉位置时测得的阻抗数据，计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率，其中，频率范围理论值为0～1MHz，但应考虑实际阻抗测量模块的检测范围。
具体地，细胞膜比电容和细胞质电导率的计算过程如下：
步骤a’：当无细胞通过所述交叉位置时，建立压缩通道电学模型，如图5(a)所示，有：
Zm＝Zparasitic||(Rchannel1+Rchannel2+Rchannel3)， (4)
简写为：Zm＝Zparasitic||Rchannel， (5)
其中，Zm为总等效阻抗，Zparasitic为寄生电容阻抗，有
j为复数中虚数符号，f为检测频率，Cparasitic为寄生电容，Rchannel为两电极间导电溶液总电阻，Rchannell为图2中与上电极连接的辅压缩通道内导电溶液电阻，Rchannel2为与下电极连接的辅压缩通道内导电溶液电阻，Rchannel3为主压缩通道与辅压缩通道交叉位置的导电溶液电阻。
步骤b’：根据至少两个检测频率下无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，分别计算得到Rchannel和Zparasitic。
例如，将低频阻抗幅值(此时相位约为0°)数据代入式(5)，检测频率为1kHz，认为寄生电容阻抗无穷大，求解方程，可得到Rchannel。将高频阻抗幅值和相位数据以及Rchannel代入式(5)，检测频率为100kHz，求解复数方程，可得到Zparasitic。
步骤c’：根据
以及
其中，r为对微流控通道进行有限元仿真得到的比例系数，Rchannel4为辅压缩通道部分的总电阻；lec为辅压缩通道总长度；Sec为辅压缩通道横截面积；σliquid为导电溶液电导率。
步骤d’：当有细胞通过所述交叉位置时，基于单细胞电学模型建立细胞与压缩通道等效电学模型，如图5(b)和5(c)所示，有：
Zm＝Zparasitic||{Rchannel1+Rchannel2+[Rleak||(Rcytoplasm+Zmembranel+Zmembrane2)]}， (9)
其中，Rleak为细胞周围没有完全填充部分的漏电阻，Zmembranel和Zmembrane2为细胞膜阻抗，Rcytoplasm为细胞质电阻。
为了简化模型，认为细胞膜是均一的，Zmembranel和Zmembrane2相等，导电通道为对称的，Rchannell与Rchannel2相等，并用Rchannel’代替二者之和，有：
Zm＝Zparasitic||{Rchannel′+[Rleak||(Rcytoplasm+2×Zmembranel)]}， (10)
其中，Rchannel’为导电通道内不含交叉位置的导电溶液的电阻，可根据
计算得到，lchannel1为主压缩通道宽度。
步骤e’：根据在和步骤b’相同的检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，分别计算得到Rcytoplasm和Zmembranel。
例如，将低频阻抗幅值数据代入式(10)，检测频率为1kHz，可认为寄生电容阻抗和细胞膜阻抗均为无穷大，结合公式(11)的Rchannel’，求解方程，可得到Rleak；将高频阻抗幅值和相位数据代入式(10)，检测频率为100kHz，结合步骤b求得的Zparasitic、公式(11)的Rchannel’，求解复数方程，即可得到细胞膜电容阻抗Zmembranel和细胞质电阻Rcytoplasm。
步骤f’：根据
以及
根据
求得细胞质电导率σcytoplasm。
其中，Cmembranel为细胞膜电容，Sea为利用数值模拟得到的修正因子MF，进而获得细胞质电阻等效面积。因为在实验中，电场线通过细胞膜后会发生一定程度的扭曲，故细胞质电阻有效面积会同细胞膜电容有效面积存在差异，即SeaMF*Sec。
以上计算过程是以一个高频信号和一个低频信号激励下得到的阻抗数据为例进行的计算，实际上若使用两个高频信号激励下得到的阻抗数据，如100kHz与200kHz，同样可联立上述方程组(5)、(6)、(7)、(8)、(10)和(11)得到Rcytoplasm和Zmembranel。但求解过程比使用1kHz和100kHz两个频率复杂，需进行迭代求解，，最终可拟合出满足误差要求的Rcytoplasm和Zmembranel。重复步骤f’，即可求得细胞膜比电容Cspecificmembrane和细胞质电导率σcytoplasm。
具体地，相关未知量大致范围如下：已报道的细胞膜电容Cmembranel特征值为1pf～10pF量级，细胞质电阻Rcytoplasm特征值为100kΩ～1MΩ，同时根据细胞培养液电导率(1S/m量级)，可推测压缩通道中漏电阻Rleak特征值为1MΩ～10MΩ量级，无细胞时，压缩通道整体阻抗特性为100kΩ～1MΩ。
至此，本实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测装置介绍完毕。
图6为本公开实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测方法流程图。如图6所示，一种使用前述的检测装置进行细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数高通量检测的方法，包括：
步骤A：使主压缩通道12和导电通道15内充满导电溶液；
具体地，可先利用导电溶液将微流控芯片内各通道的气泡排出，该导电溶液一般情况下可采用与细胞等渗透压的细胞培养液，磷酸盐缓冲液或生理盐水；并使导电通道内充满导电溶液，导电溶液与注入细胞的细胞悬浮液保持一致效果更佳。
步骤B：测量细胞流经主压缩通道12和辅压缩通道14的交叉位置时导电通道内的阻抗变化，检测频率为0～1MHz。
步骤C：根据单一检测频率下导电通道内的阻抗数据随细胞流动的变化规律，计算沿主压缩通道方向的细胞尺寸、以及根据在至少两个检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，以及无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率；
细胞尺寸的计算方法可按照前述联立式(1)、式(2)或者式(2)、式(3)，求解方程组得到；
细胞膜比电容和细胞质导电率的计算方法可按照前述联立上述方程组(5)、(6)、(7)、(8)、(10)、(11)、(12)、(13)和(14)进行求解得到，实现了细胞尺寸、细胞膜比电容和细胞质电导率高通量的测量。
至此，本实施例细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数的高通量检测方法介绍完毕
综上所述，本公开提供一种高通量检测细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数装置和方法，基于交叉联通的压缩通道，利用细胞流经交叉位置处产生的单一频率下的阻抗变化，获取细胞尺寸；根据至少两个检测频率下的阻抗数据计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率，实现了三个参数的高通量测量。
还需要说明的是，并且图中各部件的形状和尺寸不反映真实大小和比例，而仅示意本公开实施例的内容。
除非有所知名为相反之意，本说明书及所附权利要求中的数值参数是近似值，能够根据通过本公开的内容所得的所需特性改变。具体而言，所有使用于说明书及权利要求中表示尺寸、频率等等的数字，应理解为在所有情况中是受到「约」的用语所修饰。一般情况下，其表达的含义是指包含由特定数量在一些实施例中±10％的变化、在一些实施例中±5％的变化、在一些实施例中±1％的变化、在一些实施例中±0.5％的变化。
此外，除非特别描述或必须依序发生的步骤，上述步骤的顺序并无限制于以上所列，且可根据所需设计而变化或重新安排。并且上述实施例可基于设计及可靠度的考虑，彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用，即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种使用高通量检测装置进行细胞尺寸、尺寸无关单细胞电参数检测的方法，其中，所述高通量检测装置包括：
微流控芯片，包括：
主压缩通道，其横截面积小于细胞横截面积，用于使细胞沿所述主压缩通道产生拉伸并流动，所述主压缩通道的横截面为矩形、圆形或半圆形，横截面尺寸介于5～20μm之间；
辅压缩通道，与所述主压缩通道交叉联通，所述辅压缩通道的横截面积小于拉伸的细胞的侧边横截面积，所述辅压缩通道的横截面为矩形、圆形或半圆形，横截面尺寸介于2.5～8μm之间；以及
电极，分别设置于所述辅压缩通道的两端，并且两个电极均和所述辅压缩通道连通，用于形成导电通道；
阻抗测量模块，连接两个所述电极，用于在若干检测频率下分别测量细胞流经主压缩通道和辅压缩通道的交叉位置时所述导电通道内的阻抗变化；以及
数据处理模块，连接至所述阻抗测量模块，用于根据导电通道内单一检测频率下的阻抗数据随细胞流动的变化规律，计算沿所述主压缩通道方向的细胞尺寸，以及根据在至少两个检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据、和无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率；
所述方法包括：
使所述主压缩通道和导电通道内充满导电溶液；
在若干检测频率下分别测量细胞流经所述主压缩通道和辅压缩通道的交叉位置时所述导电通道内的阻抗变化；
根据所述导电通道内单一检测频率下的阻抗数据随细胞流动的变化规律，并根据以下公式计算沿所述主压缩通道方向的细胞尺寸：
vcell×(t2-t1)＝lchannel2或vcell×(t4-t3)＝lchannel2；以及
vcell×(t3-t2)＝lcell-lchannel2；
其中，vcell为细胞在主压缩通道中的通过速率，lchannel2为辅压缩通道在主压缩通道方向上的横截面宽度，t1、t2、t3和t4分别为阻抗变化过程中阻抗幅值增加、维持、减小再到维持或者阻抗相位减小、维持、增加再到维持的开始时刻；以及
根据在至少两个检测频率下有细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，以及无细胞通过所述交叉位置时的阻抗数据，通过以下公式计算得到细胞膜比电容和细胞质电导率；
Zm＝Zparasitic||Rchannel；
Zm＝Zparasitic||{Rchannel′+[Rleak||(Rcytoplasm+2×Zmembrane1)]}；
其中，Zm为总等效阻抗，Zparasitic为寄生电容阻抗，Rchannel为两电极间导电溶液总电阻，j为复数中虚数符号，f为检测频率，Cparasitic为寄生电容，r为对微流控通道进行有限元仿真得到的比例系数，Rchannel4为辅压缩通道部分的总电阻，lec为辅压缩通道总长度；Sec为辅压缩通道横截面积；σliquid为导电溶液电导率，Rchannel’为两电极间不含交叉位置的导电溶液的电阻，lchannel1为主压缩通道宽度，Zmembrane1为细胞膜阻抗，Rcytoplasm为细胞质电阻，Rleak为细胞周围没有完全填充部分的漏电阻，Cmembrane1为细胞膜电容，Cspecificmembrane为细胞膜比电容，σcytoplasm为细胞质电导率，Sea为利用数值模拟得到的修正因子MF对Sec修正得到的细胞质电阻等效面积。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述微流控芯片还包括：
细胞流入通道，连接至所述主压缩通道，用于使细胞顺利进入所述主压缩通道；以及
细胞回收通道，连接至所述主压缩通道，用于使细胞从所述主压缩通道流出后排出所述微流控芯片；
所述高通量检测装置还包括：
压力控制模块，连接至所述细胞流入通道或所述细胞回收通道，用于提供细胞在所述主压缩通道内流动的动力。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述阻抗测量模块的检测频率为0～1MHz。
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