CN103674813A - 基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法。该方法将待测细胞等效为各向同性的粘弹性体,利用待测细胞进入和通过压缩通道中的等效力学模型,基于待测细胞前端瞬时进入压缩通道的位移与细胞的尺寸、杨氏模量、压强和压缩通道的几何参数的关系,实现了待测细胞杨氏模量的测量。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息检测技术领域,尤其涉及一种基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法。
背景技术
细胞作为生命活动的基本单位,内含有各种生物分子,它们之间相互作用,共同构成一个繁忙而有序的系统。细胞骨架作为细胞的重要功能单元,参与细胞增殖、分裂和变形等重要的生理功能,与细胞的状态关系密切。初步研究表明不同恶性程度的肿瘤细胞和不同分化程度的干细胞存在细胞骨架功能的区别,表现为细胞力学特性参数即杨氏模量的差别。所以实现单个细胞的杨氏模量的高通量采集,可以为细胞生物物理特性的表征提供可靠的方法和途径。
细胞力学特性检测的传统仪器主要有原子力显微镜、微吸管法、光镊子等设备。虽然现有的仪器能够表征细胞的杨氏模量,但是检测通量低,检测速度约为一个小时检测数个细胞,不能采集几百个甚至几千个细胞的力学信息,缺乏统计学意义。
微流控技术是指在微观尺寸下控制和检测流体的技术,由于其特征尺寸与细胞大小相匹配,具备实现细胞力学特性高通量表征的潜在能力,但是其研究仍然处于起步阶段。
2005年英国剑桥大学Dr.Guck团队应用基于光致拉伸效应的微流控芯片,高通量捕获并表征悬浮于微沟道中的单个细胞的变形度,发现肿瘤细胞与正常细胞在变形度方面存在差异。2011年加拿大多伦多大学的Prof.Sun团队使用负压将单个细胞吸过横截面积小于细胞横截面积的微沟道,高通量记录不同细胞通过微细沟道的时间差异,区分几种红细胞的力学特性。2012年美国加州大学洛杉矾分校的Prof.Di Carlo团队基于流体应力引起细胞变形的原理,使用微流控芯片高通量检测细胞的变形度,报道不同种类细胞的力学特性差异。
然而,现有的细胞力学特性高通量表征的微流控芯片只能表征一些依赖于细胞尺寸的力学特性参数如变形度等,不能实现细胞固有力学特性参数即细胞的杨氏模量的定量测量。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题,本发明提供了一种基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法。
(二)技术方案
根据本发明的一个方面,提供了一种基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法。该方法包括:
步骤A,准备微流控芯片,其中,该微流控芯片具有供单个待测细胞压缩通过的压缩通道,该压缩通道两侧分别具有样品池;
步骤B,向微流控芯片压缩通道一侧的样品池中注入细胞培养液以及待测细胞,采用负压吸或使用正压压的方式使待测细胞通过压缩通道,得到待测细胞在蠕变过程之前进入压缩通道时的瞬时位移ΔX;
步骤C,利用如下公式求取待测细胞的杨氏模量Eyoung′s-modulus:
ΔX/Wconstrictionchannel=k(dcelldiameter)×Ppressure/Eyoung′s modulus
其中,k(dcell-diameter)为预设系数,Ppressure为正压或负压的压强,Wconstriction为压缩通道的几何参数,dcell-diameter为待测细胞的直径。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出,本发明基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法具有以下有益效果:
(1)将待测细胞等效为各向同性的粘弹性体,利用待测细胞进入和通过压缩通道中的等效力学模型,基于待测细胞前端瞬时进入压缩通道的位移与细胞的尺寸、杨氏模量、压强和压缩通道的几何参数的关系,实现了待测细胞杨氏模量的测量;
(2)需要的附属设备为常规的倒置显微镜和摄像头,不需要昂贵的外围设备如原子力显微镜、微纳操作设备(微管吸吮)、精密光源(光摄子)等,可以在传统的生物实验室使用,具有可移植性高的优势;
(3)所使用的微流控芯片选取载玻片和聚二甲基硅氧烷等低成本材料进行加工,基于微细加工方法,具有成本低、可批量化制造、一次性等特点。
附图说明
图1为根据本发明实施例基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量方法的流程图;
图2为根据本发明实施例基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量方法中微流控芯片和图像采集装置的示意图;
图3A为在负压吸力作用下,由显微镜和摄像头实时记录的细胞前端逐渐伸长进入压缩通道物理过程时的四张照片;
图3B为摄像头实时记录的细胞逐渐进入压缩通道前端位移与时间关系的曲线图;
图4为基于计算机仿真得到的细胞逐渐进入压缩通道的物理过程;
图5为通过计算机仿真得到的细胞位移与压缩通道高度、细胞杨氏模量以及压强等参数关系的曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。需要说明的是,在附图或说明书描述中,相似或相同的部分都使用相同的图号。附图中未绘示或描述的实现方式,为所属技术领域中普通技术人员所知的形式。另外,虽然本文可提供包含特定值的参数的示范,但应了解,参数无需确切等于相应的值,而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应的值。
本发明将细胞等效为各向同性的粘弹性体,基于待测细胞前端瞬时进入压缩通道的位移与细胞的尺寸、杨氏模量、压强和压缩通道的几何参数的关系,实现单个细胞的杨氏模量的求取。
在本发明的一个示例性实施例中,提供了一种基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法。图1为根据本发明实施例基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量方法的流程图。图2为根据本发明实施例基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量方法中微流控芯片和图像采集装置的示意图。
请参照图1和图2,本实施例基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量方法包括:
步骤A,准备微流控芯片,将微流控芯片放入显微镜的载物台上,摄像头对准显微镜的目镜,调整显微镜的放大倍数,以通过摄像头能清楚观察到压缩通道为准,其中,该微流控芯片具有供单个待测细胞压缩通过的压缩通道,该压缩通道两侧分别具有样品池;
请参照图2,微流控芯片基于二甲基硅氧烷材料采用注塑工艺制作。便于观察细胞的物理特性,压缩通道横截面积约为待测细胞横截面积(约为110-250平方微米)的40%-90%。
本实施例中,压缩通道的横截面为正方形,其边长Wconstriction-channel为10μm,压缩通道两端的样品池的高度为45μm。
本实施例中,调节显微镜至能清楚观察到细胞形态,显微镜的放大倍数为400倍,摄像头的扫描速度为每秒200帧,可以清楚观察到每一帧细胞进入压缩通道的位置,以方便记录细胞进入压缩通道的瞬时位移。
步骤B,向微流控芯片压缩通道一侧的样品池中注入细胞培养液以及待测细胞,在微流控芯片压缩通道另一侧使用负压Ppressure将单个细胞连续吸过压缩通道,由摄像头通过显微镜记录单个待测细胞进入压缩通道的过程,进而得到待测细胞在蠕变过程之前进入压缩通道时的瞬时位移ΔX;
本实施例中,显微镜测量得到待测细胞的直径dcell-diameter为15.6μm,
本实施例中,负压Ppressure=500Pa,图3A为在负压吸力作用下,由显微镜和摄像头实时记录细胞前端逐渐伸长进入压缩通道物理过程时的四张照片。请参照图3A:
(1)如图3A中(a)所示,在500Pa负压作用下,待测细胞瞬间被吸入压缩通道中,随即产生一定的位移,此位移即待测细胞的瞬时位移。由于细胞属于粘弹性体材料,在受到外力作用的瞬间,弹性起主要作用,产生明显形变,即瞬时位移,也就是细胞在零正时刻的位移;
(2)如图3A中(b)所示,为500Pa作用下,待测细胞开始缓慢进入压缩通道中,即细胞的蠕变过程;
(3)如图3A中(c)所示,在500Pa作用下,待测细胞瞬间加速进入压缩通道中,即细胞的失稳过程;
(4)如图3A中(d)所示,待测细胞完全进入压缩通道中,开始进入在压缩通道中穿行过程。
图3B为依据摄像头实时记录细胞前端逐渐伸长进入压缩通道物理过程反映的细胞位移随时间变化的曲线。由图3B可知,待测细胞进入压缩通道时的瞬时位移ΔX为4.1μm。
步骤C,将细胞前端瞬时进入压缩通道的位移ΔX、将单个细胞吸过压缩通道的压强、压缩通道的几何参数代入如下公式,求取细胞的杨氏模量Eyoung′s-modulus:
ΔX/Wconstrictionchannel=k(dcelldiameter)×Ppressure/Eyoung′s modulus (1)
其中,ΔX为显微镜记录待测细胞瞬时位移;Wconstriction-channel为横截面为正方形的压缩通道的宽度;Ppressure为将待测细胞引入压缩通道的压强;EYoung’s modulus为待测细胞的杨氏模量,k(dcell-diameter)为预设系数,是细胞尺寸的函数o
本实施例中,ΔX=4.1μm,Wconstriction-channel=10.0μm,Ppressure=-500Pa,dcell-diameter=15.6μm,k(dcell-diameter)=4.77,计算得到Eyoung′s-modulus=5.8kPa。
经过多次试验可知:以瞬时位移/沟道尺寸为自变量,以压强/杨氏模量为因变量,因变量随自变量呈线性变化,且该线性变化的斜率相对于待测细胞直径的变化而变化。
通过线性拟合以位移/沟道尺寸为自变量,以压强/杨氏模量为因变量的曲线,得到预设系数k(dcell-diameter)的步骤如下:
子步骤C′1,设定待测细胞的直径dcell-diameter=15μm、压缩通道的边长Wconstriction-channel=10μm;
子步骤C′2,设定待测细胞为各项同性的粘弹性体,压缩通道为刚体材料,构建单细胞微沟道挤压模型;
子步骤C′3,基于上述单细胞微沟道挤压模型,仿真待测细胞的杨氏模量为Ei,压强为Pj情况下细胞进入压缩通道的过程,记录相应的瞬时位移Xij,其中,i=1、2、……、n;j=1、2、……、m,n为杨氏模量取值的个数,m为压强取值的个数;
子步骤C′4,线性拟合以瞬时位移/沟道尺寸为自变量,以压强/杨氏模量为因变量的曲线,得到所述预设系数k(dcell-diameter)。
为了节省人工计算量,上述步骤可以采用ABAQUS仿真软件来进行。图4中(a)-(d)为使用ABAQUS仿真软件,待测细胞在压缩沟道尺寸不变,杨氏模量不变,不同负压作用下细胞前端进入压缩通道的过程。其中(a)图对应的负压为200Pa;(b)图对应的负压为400Pa;(c)图对应的负压为600Pa;(d)图对应的负压为800Pa。由四副图可以看出,在不同压强下,细胞前端瞬间进入压缩通道的位移会发生相应的变化。
在压缩沟道尺寸不变的情况下,图5为通过计算机仿真得到的细胞位移与压缩通道高度、细胞杨氏模量以及压强等参数关系的曲线图。由图5可以看出,当细胞仅伸进压缩通道一小部分时,其瞬时位移随压强变化基本呈线性趋势,进一步归纳得到公式1中对应不同细胞直径的系数k(dcell-diameter):
(1)当dcell-diameter小于13.5μm时,k(dcell-diameter)为9.60;
(2)当dcell-diameter13.5~16.5μm时,k(dcell-diameter)为4.77;
(3)当dcell-diameter大于16.5μm时,k(dcell-diameter)为3.39。
至此,已经结合附图对本实施例进行了详细描述。依据以上描述,本领域技术人员应当对本发明基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法有了清楚的认识。
此外,上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施方式中提到的各种具体结构、形状或方式,本领域的普通技术人员可对其进行简单地熟知地替换,例如:
(1)压缩通道截面形状不仅局限于上文提到的正方形结构,还可以用其他形状,如圆形等,此时,Wconstriction-channel为圆形的直径;
(2)细胞通过压缩通道的方式,不仅可以用上文提到的负压驱动方式,还可以使用正压或其他的驱动方式,即在步骤B中,使用正压Ppressure将单个细胞连续挤入压缩通过通道即可;
(3)吸入或压入待测细胞的压强Ppressure可根据需要进行取值,一般情况下,该压强介于200Pa~800Pa之间;
(4)除了采用显微镜和摄像头的组合来记录待测细胞进入压缩通道的过程之外,本领域技术人员还可以采用其他的方式来记录该过程,进而得到细胞前端瞬时进入压缩通道的位移ΔX。
综上所述,本发明提出细胞进入和通过压缩通道的形变信息向细胞杨氏模量的转变方法,实现细胞固有的力学特性参数即细胞的杨氏模量的高通量采集,为细胞生物物理特性的表征提供可靠的方法和途径,可为贫血、肿瘤等存在细胞力学特性相应改变的疾病提供新的检测手段和新的无需标记的细胞特性标志物。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于微流控技术测量单个细胞杨氏模量的方法,其特征在于,包括:
步骤A,准备微流控芯片,其中,该微流控芯片具有供单个待测细胞压缩通过的压缩通道,该压缩通道两侧分别具有样品池;
步骤B,向所述微流控芯片压缩通道一侧的样品池中注入细胞培养液以及待测细胞,采用负压吸或正压压的方式使待测细胞通过压缩通道,得到待测细胞在蠕变过程之前进入压缩通道时的瞬时位移ΔX;
步骤C,利用如下公式求取待测细胞的杨氏模量Eyoung′s-modulus:
ΔX/Wconstrictionchannel=k(dcelldiameter)×Ppressure/Eyoung′s modulus
其中,k(dcell-diameter)为预设系数,Ppressure为正压或负压的压强,Wconstriction为压缩通道的几何参数,dcell-diameter为待测细胞的直径。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述压缩通道的横截面为正方形,所述压缩通道的几何参数Wconstriction为该正方形的边长;或
所述压缩通道的横截面为圆形,所述压缩通道的几何参数Wconstriction为该圆形的直径。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤C中,当压缩通道的横截面为正方形,该正方形的边长Wconstriction=10μm时,预设系数k(dcell-diameter)满足:
(1)k(dcell-diameter)=9.60,当dcell-diameter小于13.5μm时;
(2)k(dcell-diameter)=4.77,当dcell-diameter13.5~16.5μm时;或
(3)k(dcell-diameter)=3.39,当dcell-diameter大于16.5μm时。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述压缩通道横截面积为单个待测细胞横截面积的40%-90%。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤B中,在微流控芯片压缩通道的另一侧采用负压吸的方式使单个细胞通过压缩通道,所述负压的压强Ppressure介于200Pa~800Pa之间。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤C之前还包括:
子步骤C′1,设定待测细胞的直径dcell-diamete、压缩通道的边长Wconstriction-channel;
子步骤C′2,设定待测细胞为各项同性的超弹性材料,压缩通道为刚体材料,构建单细胞微沟道挤压模型;
子步骤C′3,基于上述单细胞微沟道挤压模型,仿真待测细胞的杨氏模量为Ei,压强为Pj情况下细胞进入压缩通道的过程,记录相应的瞬时位移Xij,其中,i=1、2、……、n;j=1、2、……、m,n为杨氏模量取值的个数,m为压强取值的个数;
子步骤C′4,线性拟合以瞬时位移/沟道尺寸为自变量,以压强/杨氏模量为因变量的曲线,得到所述预设系数k(dcell-diameter)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其特征在于,所述微流控芯片为基于二甲基硅氧烷采用注塑工艺制作。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其特征在于:
所述步骤A还包括:将微流控芯片放至显微镜的载物台上,摄像头对准显微镜的目镜,调整显微镜的放大倍数,以通过摄像头能清楚观察到微流控芯片的压缩通道为准;
所述步骤B还包括:由所述摄像头通过显微镜记录单个待测细胞进入压缩通道的过程,进而得到待测细胞在蠕变过程之前进入压缩通道时的瞬时位移ΔX。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述显微镜的放大倍数为400倍,所述摄像头的扫描速度为每秒200帧。
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