CN111040928A - 一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，芯片上设有不对称收缩‑扩张式微流体通道，通道的一侧连接2个液体进口，另一侧连接一个出口，突扩腔体一侧连接一个液体出口，该发明用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，在微流道内实现对样品细胞悬浮液的捕捉，同时保持细胞在微涡流中按照固定轨道旋转，利用剪切应力处理寇氏隐甲藻细胞，通过腔体一侧的鞘流出口收集，操作简单并且剪切精度高；同时该发明可以与寇氏隐甲藻细胞部分结构被剪切后运动状态的观察和DHA产量研究相集成，研究受涡旋内剪切力作用一定时间后寇氏隐甲藻细胞的形态结构和运动状态，提高其DHA产量。

Description

一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片

技术领域

本发明涉及生物化学工程领域微流控分析检测技术，具体涉及一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片。

背景技术

在疾病诊断、化学和生物分析、微藻生物技术等领域，以一种简单有效、高通量、无标记的方法实现颗粒和细胞捕捉具有重要的意义。微流控技术主要通过搭建微米量级的流道装置，实现对流道内流体、颗粒、气泡、液滴等的精准操作。由于装置内的细胞微环境可以通过调节流量和剪切应力等不同因素来控制，能够提供高通量的细胞操作并且能够在对腔室内细胞进行精确控制，微流控技术在高通量筛选、细胞捕捉和生化合成方面具有广阔的应用前景。在微流控技术中，一些主动分离方法包括流式细胞术、介电泳、光镊、声镊等技术，提供了对目标生物颗粒的精确控制，但它们的通量较低，需要昂贵的设备来提供外力。惯性微流控技术作为一种被动式分选技术，利用颗粒的惯性和其他作用(如Dean流)来操纵粒子，该技术利用颗粒周围流场的惯性效应，使其穿越流场流线，在微腔室中达到平衡位置^[10]，该技术具有操作简单、样品消耗量少、分辨精度高、分离效率高、非特异性应用条件等优点。

惯性微流控技术可以满足高通量细胞处理和分析的需要，具有良好的试剂体积控制、细胞处理、设备自动化、多组分集成等功能。一些学者利用涡旋从主流中捕获特定大小的生物颗粒，并研究了离心力和剪应力对在水平涡旋中循环的生物颗粒形态的影响。Hur等人确定了颗粒迁移进入微涡流中的临界粒径和临界流速，在mL/min尺度上处理细胞溶液并成功的从血液中分离出了癌细胞。Wang等人设计了一种装置在两个对称的腔室中产生用于细胞分离的层流微涡，通过鞘流连续收集颗粒。但以上装置仍存在一些缺点，主要包括：样品溶液流体种类单一，流速局限性大，细胞捕捉效率低；形成稳定的微涡流需要高流速，容易引起流道材料变形，影响实验结果；捕捉后直接释放，实际应用中收集到的溶液浓度和纯度较低，影响后续的观察和进一步实验；现有的微流控芯片大多只作为细胞分选和富集的装置，装置的功能单一，集成性较差。简单的应用现有的微流控芯片技术实现寇氏隐甲藻细胞的处理和收集将大大提高后续操作的复杂性，不能对细胞处理实现精准控制，不具备实际应用的可操作性。

综上所述，开发一种寇氏隐甲藻细胞处理装置，实现对细胞受剪切力的精准控制，研究受剪切力作用一定时间后细胞的形态结构和运动状态，与游动细胞和孢囊对比生产DHA的能力，具有重要的生物学意义。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于流体动力学用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，在微流道内实现对样品细胞悬浮液的捕捉，同时保持细胞在微涡流中按照固定轨道旋转，利用剪切应力处理寇氏隐甲藻细胞，通过腔体一侧的鞘流出口收集，操作简单并且剪切精度高。该装置的另一个功能是与寇氏隐甲藻细胞部分结构被剪切后运动状态的观察和DHA产量研究相集成，研究受涡旋内剪切力作用一定时间后寇氏隐甲藻细胞的形态结构和运动状态，提高其DHA产量。

本发明可以采用如下技术方案予以实施：

该方法所用配套微流控芯片的制造方法，包括如下步骤：

(1)通过湿法刻蚀在玻璃基底上制作处通道阳模；

(2)在模具上浇筑聚合物材料获得微流体通道机构；

(3)对聚合物材料和载玻片进行表面等离子处理；

(4)将聚合物材料和载玻片键合，获得用于寇氏隐甲藻处理及收集的微流控芯片。

本发明还可以采用如下技术方案予以实施：

本发明提供的基于流体动力学用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片如图1、2和3所示。芯片上设有收缩-扩张微流体通道，在通道一端设有两个入口，直边侧为样品悬浮液入口，另一侧为缓冲液入口，在收缩-扩张区域每个腔体侧边设有一个鞘流出口，在通道直边另一端设有一个出口，鞘流出口为样品收集出口，直边出口为废液出口。

(1)微通道整体厚度为30μm～70μm；

(2)收缩结构和扩张结构交错设置为一组单元，单元数量为1～30，单元中收缩段尺寸为宽50μm～200μm、长100μm～400μm，单元中扩张段尺寸为宽200μm～4mm、长200μm～4mm；

(3)样品溶液入口、缓冲液入口的宽度为50μm～300μm；

(4)鞘流样品收集出口连接于突扩腔体一侧，废液出口连接于直流道之后，宽度为50～300μm。

本发明用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片可与寇氏隐甲藻观察DHA产量研究相集成，具体包括以下步骤：

(1)用100ppm～500ppm的PEO溶液稀释培养基中的寇氏隐甲藻细胞，得到样品细胞悬浮液；

(2)将样品溶液与PBS缓冲液分别吸取至各自注射器中，注射器与寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片间通过塑料软管相连；

(3)打开废液出口止水夹，关闭鞘流出口止水夹。使用精密注射泵将PBS缓冲液注射到微流道中，调节流速使腔室内形成稳定微涡流。降低缓冲液流速，提高样品溶液流速，使细胞在腔室内稳定旋转一定时间；

(4)在保持腔室内微涡流稳定的前提下，提高缓冲液流速，降低样品溶液流速，将流道内未被捕捉的细胞冲洗干净。打开鞘流出口止水夹，关闭废液出口止水夹，在鞘流样品收集出口获得被处理的细胞；

(5)将获得的寇氏隐甲藻细胞溶液均匀涂抹在载玻片上，盖好盖玻片，得到细胞涂片，镜检观察。

有益效果

与现有技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明所涉及的用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片利用流体动力学将一定尺寸范围的细胞限制在微腔室区域内，实现对寇氏隐甲藻细胞的捕捉，避免了对样品细胞的污染，提高了捕捉效率；

(2)利用收缩-扩张结构中的二次流效应和惯性作用相结合，构建稳定的水平面内的循环涡，为细胞捕捉提供了良好环境；

(3)当流体由牛顿流体替换为非牛顿流体时，细胞受到粘弹性力作用。在粘弹性力、惯性升力及Dean曳力的共同影响下，细胞更快的迁移到微涡流中，捕捉效率更高；

(4)在已知孢囊形式的寇氏隐甲藻比游动形式的具有更高的油脂含量和DHA含量的基础上，利用涡旋中的剪切应力作用处理寇氏隐甲藻细胞的水平或侧生鞭毛，实现对细胞受剪切力的精准控制，研究受剪切力作用一定时间后细胞的形态结构和运动状态，与游动细胞和孢囊对比生产DHA的能力，研究结果对于流体力学和细胞生物学具有重要的意义；

(5)将捕捉、处理、收集一体化，减少了后续生物科学实验的操作流程，提高了实验装置的集成性和检测效率。

附图说明

图1是本发明所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的400μm结构示意图；1-微流道系统中样品细胞悬浮液入口，2-微流道系统中PBS缓冲液入口，3-微流道系统中的直流道，4-微流道系统中的突扩腔，5-微流道系统中的鞘流样品收集出口，6-微流道系统中的废液出口；

图2是本发明所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的三入口结构图；

图3是本发明所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的4mm腔室结构图；

图4是本发明所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中细胞在直流道中受到惯性升力作用处于平衡位置的原理示意图；

图5是本发明所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中细胞在突扩腔区域受到二次流、惯性力和粘弹性作用下进入腔体，在腔体内跟随微涡流稳定旋转的原理示意图；

图6是本发明所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中鞘流出口止水夹打开后腔体内流线改变，细胞跟随鞘流流出的原理示意图；

图7是实施例腔体内通过示踪颗粒表示的微涡流流线图；

图8是实施例在突扩腔区域捕捉的荧光颗粒运动轨迹图；

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。

如图5所示，使用止水夹关闭鞘流出口，利用微型泵或注射泵将含有培养基的寇氏隐甲藻细胞悬浮液样品从样品入口注入，调节流速使腔室内形成稳定的微涡流，在大量细胞被捕捉并旋转充分长时间后通入缓冲液，在保持微涡流稳定的同时增大缓冲液流速并减小样品溶液流速。如图6所示，当直流道内无残留细胞时打开鞘流出口止水夹，关闭废液出口止水夹，通过鞘流作用收集被处理的寇氏隐甲藻细胞。本发明利用二次流和惯性作用捕捉细胞，并在捕捉后利用鞘流作用收集被处理细胞。

如图4所示，其处理原理具体是：流体速度梯度场使颗粒在剪切诱导惯性升力的作用下，向流体流速低的方向运动，由于不对称尾流作用，颗粒迁移到壁面附近时受到壁面诱导惯性升力，向远离壁面的方向运动。这两种力使颗粒在壁面和流道中心的某个位置处保持动态平衡。在收缩-扩张流道中可以产生两种二次流，一是流道扩张区域内由于流体边界层脱离产生的水平面上的循环涡，二是在横截面平面内由腔体收缩区域下游的径向压力梯度产生的反旋转流动。颗粒在直流道中流动时，在惯性升力的作用下处于动态平衡。当颗粒到达扩张区域时，壁面诱导惯性升力突然减小，在剪切诱导惯性升力和粘性力的共同作用下，颗粒穿过流线迁移至涡旋。由于径向加速度大小与速度成二次比，与半径成反比，微流道内的高流速与微涡的小半径相结合，可以产生高径向加速度。利用这种自旋涡旋与惯性迁移作用，可根据细胞的大小选择性地捕获，并在腔室内通过剪切力处理细胞。鞘流出口止水夹打开后，腔室内流线改变，被捕获的细胞在鞘流作用下流出。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中，微通道整体厚度为30～70μm。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中，样品溶液入口、缓冲液入口的宽度为50～300μm。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中，废液出口、鞘流样品收集出口的宽度为50～300μm。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中，突扩腔个数为1～30。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中，收缩段尺寸为宽50～200μm、长100～400μm。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片中，扩张段尺寸为宽200μm～4mm、长200μm～4mm。

上述用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，它可以对玻璃片、硅片进行加工获得阳模,然后利用在模具上浇筑聚合物材料的方式获得微通道结构，最后将聚合物材料与玻璃进行键合。

实施例1

如图1、2和3所示，是一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片装置。该芯片上设计了液体出入口和收缩-扩张结构，主要构造包括：1-微流道系统中样品细胞悬浮液入口，2-微流道系统中PBS缓冲液入口，3-微流道系统中的直流道，4-微流道系统中的突扩腔，5-微流道系统中的鞘流样品收集出口，6-微流道系统中的废液出口，芯片上的进样口与出样口均与外界相通，便于接通微管，装载或排出液体。结构尺寸设计为：微通道整体厚度为50μm，样品溶液入口、缓冲液入口的尺寸为100μm，鞘流样品收集出口、废液出口的尺寸为100μm，突扩腔个数为3，收缩段尺寸为宽100μm、长400μm，扩张段尺寸为宽200μm～4mm、长200μm～4mm，该尺寸能满足样品溶液与缓冲液的流动要求和寇氏隐甲藻细胞捕捉要求。其制作过程为：

(1)通过湿法刻蚀在玻璃基底上制作处通道阳模；

(2)在模具上浇筑聚合物材料获得微通道结构；

(3)对聚合物材料和载玻片进行表面等离子处理；

(4)将聚合物材料和载玻片键合，获得寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片。

实施例2

本实施例中，用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的结构，制作方法与实施例1基本相同，不同之处为：微通道整体厚度为30μm，样品入口、鞘流入口的尺寸为50μm，废液出口、样品收集出口的尺寸为50μm，突扩腔个数为1，收缩段尺寸为宽50μm、长400μm，扩张段尺寸为宽4mm、长4mm。

实施例3

利用用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，实现寇氏隐甲藻细胞的捕捉和处理。首先，配置浓度为300ppm的分析纯聚氧化乙烯(PEO)溶液，溶液配制完成后使用磁力搅拌(<30r/min)缓慢搅拌1h后，放入摇床(100r/min)震荡24h。将1mL寇氏隐甲藻细胞悬浮液用300ppm的PEO溶液稀释10倍，得到样品细胞悬浮液。

关闭鞘流出口止水夹，打开废液出口止水夹。将样品溶液和缓冲液吸入注射器，通过注射泵将其分别从样品溶液入口和缓冲液入口注入微流道。首先通入缓冲液，初始体积流率设置为600μL/min。待流体充满整个流道并在腔室内形成稳定涡旋后，增大样品溶液流速至600μL/min，降低缓冲液流速至0。

在收缩-扩张流道中，流道扩张区域内由于流体边界层脱离产生水平面上的循环涡，随着流体流速的逐渐升高，腔室内的微涡流逐渐形成并发展。如图7所示，在600μL/min的流速下，尽管微涡流和主流之间依然存在流体交换，腔室内的微涡流演化至一个相对稳定的阶段。随着样品溶液注入微流道，细胞运动到流道扩张区域。流体速度梯度场使细胞在剪切诱导惯性升力的作用下，向流体流速低的方向运动；由于不对称尾流作用，细胞迁移到壁面附近时受到壁面诱导惯性升力，向远离壁面的方向运动；在横截面平面内由腔体收缩区域下游的径向压力梯度产生的反旋转流动向细胞提供Dean力；流体由牛顿流体替换为非牛顿流体时，细胞受到粘弹性力作用，由于粘弹性力的角落效应，细胞受到指向突扩腔内的力。在上述力的共同作用下，细胞穿越流线进入微涡流中，最终沿着稳定轨道旋转。如图8所示，荧光颗粒在腔室内被捕捉并沿稳定轨道旋转。当细胞在微腔室中旋转一定时间后，受到剪应力的充分作用，寇氏隐甲藻的细胞结构和运动状态发生改变。

在保持总流量为600μL/min并且腔室内微涡流稳定的同时，增大缓冲液流速至600μL/min，降低样品溶液流速至0。将流道内未被捕捉的细胞和其他杂质冲洗干净后，打开鞘流出口止水夹，关闭废液出口止水夹。腔体内流线发生改变，微涡流和主流区域之间出现鞘流区域，细胞跟随鞘流从出口流出。由此实现了对寇氏隐甲藻细胞的剪切和收集。

通过调整PEO溶液的浓度，能够扩大样品溶液的流速调节区间，实现对寇氏隐甲藻细胞处理程度的控制，研究细胞运动状态和结构受处理时间和剪切力大小的影响规律。

实施例4

本实施例中，以实施例3所述寇氏隐甲藻细胞处理和收集为基础，将本发明所述的用于与寇氏隐甲藻细胞受到剪切应力作用后运动状态的观察和DHA产量的研究相集成。如图所示操作流程，在实施例2中收集到被剪切的寇氏隐甲藻细胞溶液。将所获得的样品收集液均匀涂抹在载玻片上进行镜检，观察细胞的结构和运动状态。取部分样品收集液于培养皿中，在已知孢囊状态的寇氏隐甲藻细胞比游动细胞状态DHA产量更高的前提下，研究受剪切应力作用后细胞的DHA产量。可见，本实验本发明所述的微流控芯片能够实现寇氏隐甲藻的高通量处理及收集。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优先实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，任何熟悉本专业的技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，其特征在于，芯片上设有不对称收缩-扩张式微流体通道，通道的一侧连接2个液体进口，另一侧连接一个出口，突扩腔体一侧连接一个液体出口。

2.如权利要求1所述的一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，其特征在于，微通道整体厚度为30μm～70μm，收缩结构和扩张结构交错设置为一组单元，单元数量为1～30，单元中收缩段尺寸为宽50μm～200μm、长100μm～400μm，单元中扩张段尺寸为宽200μm～4mm、长200μm～4mm，样品溶液入口、缓冲液入口的宽度为50μm～300μm，鞘流样品收集出口连接于突扩腔体一侧，废液出口连接于直流道之后，宽度为50～300μm。

3.如权利要求2所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，其特征在于，所述芯片可以与寇氏隐甲藻细胞受剪切应力作用后运动状态的观察和DHA产量研究相集成，其具体步骤为：

(1)用PEO溶液稀释培养基中的寇氏隐甲藻细胞，得到样品细胞悬浮液；

(2)按照寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的使用方法对样品溶液进行处理；

(3)在鞘流样品收集出口获得细胞收集液后，在显微镜下观察其形态、运动状态并检测DHA产量。

4.如权利要求2所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片，其特征在于，所述芯片可以与寇氏隐甲藻细胞受剪切应力作用后运动状态及结构的观察和DHA产量的研究相集成，通过改变溶液粘度和流体流速，调整微涡流的演化阶段和细胞的运动轨迹。

5.一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的使用方法，其特征在于，

(1)向微流道内注入液体前，关闭鞘流出口止水夹为腔室内微涡流的形成提供条件。

(2)样品溶液从样品入口注入，且其粘度为1.02mpa·s～1.15mpa·s(以同等测试条件下，去离子水粘度1.02mpa·s为基准)。

(3)缓冲液从缓冲液入口注入，且其粘度为1.02mpa·s～1.15mpa·s(以同等测试条件下，去离子水粘度1.02mpa·s为基准)。

(4)样品溶液与缓冲液总流量为100μL/min～2mL/min，以形成稳定的微涡流。

(5)使用缓冲液将流道内未被捕捉的细胞冲洗干净，打开鞘流出口止水夹获得被剪切的细胞。

6.如权利要求5所述一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片的使用方法，其特征在于：在关闭鞘流止水夹的前提下，利用腔室内的微涡流、溶液的粘弹性、惯性作用、二次流效应的共同作用实现细胞的捕捉和处理；在处理充分长时间后，打开鞘流止水夹，利用鞘流实现细胞的收集。

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