CN111060364A - 一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片 - Google Patents
一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111060364A CN111060364A CN201911144020.5A CN201911144020A CN111060364A CN 111060364 A CN111060364 A CN 111060364A CN 201911144020 A CN201911144020 A CN 201911144020A CN 111060364 A CN111060364 A CN 111060364A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- screening
- staining
- sample
- cell
- microfluidic chip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 89
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000010186 staining Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 26
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 18
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 18
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims description 11
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 3
- 238000001039 wet etching Methods 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 10
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- NALREUIWICQLPS-UHFFFAOYSA-N 7-imino-n,n-dimethylphenothiazin-3-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2SC3=CC(=[N+](C)C)C=CC3=NC2=C1 NALREUIWICQLPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N1/31—Apparatus therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/2813—Producing thin layers of samples on a substrate, e.g. smearing, spinning-on
- G01N2001/2846—Cytocentrifuge method
Abstract
本发明涉及生物医学工程领域微流控分析检测技术，具体涉及一种用于胸腔积液内肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法及配套微流控芯片，按照样品浓缩‑液基染色‑微流控芯片筛分‑细胞涂片的顺序获得肿瘤细胞涂片；针对现有的胸腔积液中肿瘤细胞的涂片检测方法背景干扰大、操作时间长的问题，将细胞染色和筛分相集成，可短时间内获得只含肿瘤细胞的细胞涂片，提高了胸腔积液中肿瘤细胞的涂片检测效率；设计了配套微流控芯片，该芯片构建双流体并流体系，利用界面作用筛分一定粒径范围的细胞，提高了细胞筛分的适用范围；设计了收缩‑扩张结构，扩大不同细胞的间距，提高筛分纯度；在筛分的同时完成细胞洗涤，提高微流控芯片的集成性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域微流控分析检测技术，具体涉及一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片。
背景技术
病理学检查是诊断肿瘤的“金标准”，在癌症的诊断和治疗中具有至关重要的地位。在肿瘤的各种病理学检查方法中，通过胸腹水涂片进行脱落细胞学检查是诊断原发或转移癌的关键方法。胸腹水涂片的质量直接关系到诊断的准确性和治疗的适用性。然而现有的胸腔积液细胞学涂片操作流程仅包括离心、涂片、染色等步骤，所制备的涂片包含多种细胞，观察肿瘤细胞时背景干扰很大。可以预见，通过对胸水进行细胞筛分处理，获得仅含待观察肿瘤细胞的涂片，将有效的提高涂片质量和诊疗水平。
微流控技术由于其高通量、低样品用量和高灵敏度的优点而在细胞筛分中备受关注。已经有一些微流控芯片被设计出来并展示其应用潜能。Albert J.Mach等人通过设计渐扩流道，实现了血液中细菌的分离；J.Nam等人通过构建粘弹性并流体系，实现了从血液中分离血小板。但以上装置仍存在一些缺点，主要包括：颗粒尺寸小于5μm,不适用于肿瘤细胞；分离距离较小，实际应用中效率较低；分离前需要对样品进行处理，增加了操作难度和时间。而且现有的微流控芯片往往只作为颗粒筛分的装置，装置的功能单一，集成性较差。简单的将现有的微流控芯片筛分技术加入涂片流程将大大提高操作复杂性，不能高效的提高涂片速度和质量，不具备实际应用的可操作性。
综上所述，提出一种肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法，并基于该方法开发一种配套微流控芯片，对进一步提高肿瘤细胞涂片质量，提高肿瘤诊断准确性和缩短诊断时间具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法，以及为实现该方法所开发的应用于胸腔积液诊断的微流控芯片，提高胸腔积液细胞涂片的质量，减少操作时间，实现对胸腔积液中肿瘤细胞的高效检测，该操作简单且分离纯度高。
为了解决现有技术存在的问题，本发明采用如下技术方案予以实施：
所述筛分-细胞涂片的顺序获得肿瘤细胞涂片，其具体步骤为：
(1)通过离心的方法由适量胸腔积液样品获得胸腔积液细胞浓缩液样品；
(2)将染色液滴加入胸腔积液细胞浓缩液，对细胞进行染色，所得溶液为样品溶液；在该过程中，在液体环境而非干燥的载玻片上完成对细胞的染色；
(3)按照下述该方法的配套微流控芯片的使用方法，对样品溶液进行处理；
(4)在样品收集出口获得的肿瘤细胞收集液后，均匀涂布在载玻片上观察镜检。
本发明还可以采用如下技术方案予以实施：
该方法所用配套微流控芯片的制造方法，包括如下步骤：
(1)通过湿法刻蚀在玻璃基底上制作处通道阳模；
(2)在模具上浇筑聚合物材料获得微流体通道机构；
(3)对聚合物材料和载玻片进行表面等离子处理；
(4)将聚合物材料和载玻片键合，获得用于肿瘤细胞筛分的微流控芯片。
本发明还可以采用如下技术方案予以实施：
该方法所用配套微流控芯片，由芯片本体构成，所述芯片本体上设有微流体通道结构，所述微流体通道机构一侧为伸缩式微流体通道，其另一侧为直流边通道构成；所述微流体通道进口端分别连接样品入口和鞘流入口的，其出口端分别连接废液出口和样品收集出口，所述收缩-扩张式微流体通道由至少40个以上具有收缩-扩张的单元交错构成。
(1)所述单元中收缩段尺寸为宽80～150μm、长150～300μm；
(2)单元中扩张段尺寸为宽200～400μm、长150～300μm；
(3)样品入口、鞘流入口的宽度为100～400μm；
(4)废液出口、样品收集出口连接于单元的扩张段之后，且宽度为50～300μm。
1.该方法所用配套微流控芯片的使用方法，包括如下步骤：
(1)样品溶液从样品入口注入，且其粘度低于1.15mpa·s(以同等测试条件下，去离子水粘度 1.02mpa·s为基准)；
(2)鞘流从鞘流入口注入，且其粘度高于1.15mpa·s(以同等测试条件下，去离子水粘度1.02 mpa·s为基准)；
(3)样品溶液与鞘流的体积流率比小于1：4；
(4)样品溶液与鞘流之间形成稳定的并流界面。
有益效果
传统的涂片检测方法由以下操作构成：1)离心获得胸腔积液细胞浓缩液；2)将细胞浓缩液涂布于载玻片，获得待染色涂片；3)挥发干燥，使细胞固定于待染色涂片；4)在涂片上染色；5)冲洗，洗掉涂片上的多余染液；5)镜检、观察。其存在以下缺点：1)为对肿瘤细胞进行筛分，所以获得的涂片中包含大量红细胞和染色沉淀，干扰了肿瘤细胞的观察；2)冲洗过程会损失珍贵的肿瘤细胞，使涂片中的肿瘤细胞数量降低；3)挥发干燥、冲洗等过程耗时长，获得细胞染色涂片需耗时40-45分钟，检测效率低下。
本发明的一种肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法具有以下优点：1)在液基中而非在载玻片上进行细胞染色，染色更均匀；2)利用微流控筛分技术获得的样品收集液仅包含染色完成的肿瘤细胞，去除了红细胞、白细胞等影响肿瘤细胞观察的干扰项；3)细胞筛分的过程同时完成了肿瘤细胞从染液到透明溶液的洗涤过程，所获得的样品收集溶液可以无需冲洗而直接涂片，大大减少了肿瘤细胞损失；4)在样品收集出口获得的肿瘤细胞收集液，取0.25mL 样品收集液均匀涂布在载玻片上，无需等待液体挥发干燥即可镜检、观察，将涂片制作时间缩短约30分钟。
附图说明
图1是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的操作流程图；
图2是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片的结构示意图；1-微流道系统中样品入口，2-微流道系统中的鞘流入口，3-微流道系统中的直边侧，4-微流道系统中的收缩-扩张侧，5-微流道系统中的废液出口，6-微流道系统中样品收集出口，7-微流道系统中的通路；
图3是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片的形貌俯视图；
图4是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片的收缩-扩张结构局部放大图；
图5是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片的出口结构局部放大图；
图6是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片中红细胞受到界面作用而被限制于样品流中的原理示意图；8-样品流体；9-鞘流；10-样品流体和鞘流的并流界面；11-红细胞；
图7是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片中白细胞受到界面作用而被限制于样品流中的原理示意图；12-白细胞；
图8是本发明所述一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片中肿瘤细胞穿越界面后进一步向收缩-扩张侧迁移的原理示意图；13-肿瘤细胞；
图9是实施例在出口处捕捉的细胞分离图；
图10a、图10b均是实施例与传统方法的染色涂片对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。本发明提供的一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法如图1所示，其操作步骤为：
(1)对胸腔积液进行预处理，包括：将胸腔积液以800～1500r/min的速度离心3分钟，得到细胞富集液；将适量瑞士吉姆萨染液A液加入细胞富集液染色1分钟；再将等量瑞士吉姆萨染液B液加入细胞富集液；以滴管或移液枪轻轻吹打溶液确保细胞与染色溶液充分接触，得到样品溶液；
(2)将样品溶液与鞘流(PEO溶液)分别吸取至各自注射器中，注射器与配套肿瘤细胞筛分微流控芯片间通过塑料软管相连；
(3)使用精密注射泵将两种溶液沿各自入口注射到微通道中，调节注射泵设置，使样品溶液与鞘流之间的流率比为1：7；
(4)样品中的肿瘤细胞与其他细胞在肿瘤细胞筛分微流控芯片中实现分离，在废液出口获得包含红细胞和白细胞的废液，在样品收集出口获得纯净的肿瘤细胞提取液；
(5)将获得的肿瘤细胞均匀涂抹在载玻片上，盖好盖玻片，得到细胞涂片；
(6)镜检观察。
(7)样品溶液中不应产生粒径大于10μm的不溶性沉淀。
(8)肿瘤细胞涂片无需冲洗。
(9)肿瘤细胞涂片无需干燥。
所用配套微流控芯片如图2所示。芯片上设有收缩-扩张微流体通道，在通道一端设有两个入口，直边侧为样品入口，收缩-扩张侧为鞘流入口，在通道另一端设有两个出口，直边侧为废液出口，收缩-扩张侧为样品收集出口。
利用微型泵或注射泵将含有红细胞、白细胞和肿瘤细胞的胸腔积液样品从用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片的样品入口注入，将配制的聚环氧乙烷(PEO)溶液从鞘流入口注入。两股流体进入流道后形成双层并流结构，样品流体全部从废液出口流出，鞘流一部分从废液出口流出，一部分从样品收集出口流出。本发明利用惯性升力和界面粘弹性力对大小细胞筛分，并在筛分后利用迪恩力扩大肿瘤细胞侧向迁移距离。
其筛分原理具体是：样品中的细胞在流道中受到以惯性升力为驱动力的影响，从直边侧向收缩-扩张侧运动，在样品流和鞘流的并流界面处受到作为阻力的界面粘弹性力的阻碍。惯性升力和界面粘弹性力的大小分别正比于粒径的6次方和3次方，因此只有特定粒径的细胞可以在界面处受力平衡，这个尺寸就称为临界粒径。红细胞和白细胞粒径小于临界粒径，所受的驱动力小于阻力所以留在样品流体中。肿瘤细胞的粒径大于临界粒径，所受的驱动力大于阻力而穿越并流界面进入鞘流。在鞘流中，肿瘤细胞受到迪恩力、粘弹性升力和惯性升力的共同作用而进一步向收缩-扩张侧迁移，最终在废液出口收集红细胞和白细胞，在样品收集出口收集肿瘤细胞。进入废液通道和样品收集通道之前的最后一个腔体为扩张腔，以保证颗粒筛分距离足够大。
上述用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片中，微通道整体厚度为30～ 60μm。
上述用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片中，样品入口、鞘流入口的宽度为100～400μm。
上述用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片中，废液出口、样品收集出口的宽度为50～300μm。
上述用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片中，收缩段尺寸为宽80～150μm、长150～300μm。
上述用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片中，扩张段尺寸为宽200～ 400μm、长150～300μm。
上述用于胸腔积液内肿瘤细胞筛分和涂片的微流控芯片，它可以由玻璃片、硅片加工获得阳模,然后利用在模具上浇筑聚合物材料的方式获得微通道结构，最后将聚合物材料与玻璃进行键合。
实施例1
如图2所示，是一种将肿瘤细胞染色与筛分相集成的处理方法的配套微流控芯片装置。如图3、图4和图5所示，该芯片上设计了液体出入口和收缩-扩张结构，主要构造包括：1- 微流道系统中样品入口，2-微流道系统中的鞘流入口，3微流道系统中的直边侧，4-微流道系统中的收缩-扩张侧，5-微流道系统中的废液出口，6-微流道系统中样品收集出口，7-微流道系统中的通路，芯片上的进样口与出样口均与外界相通，便于接通微管，装载或排出液体。结构尺寸设计为：微通道整体厚度为30μm，样品入口、鞘流入口的尺寸为100μm，废液出口、样品收集出口的尺寸为50μm，收缩段尺寸为宽80μm、长150μn，扩张段尺寸为宽200μm、长150μm，该尺寸能满足胸腔积液样品溶液与鞘流的流动要求和肿瘤细胞筛分要求。其制作过程为：
(1)通过湿法刻蚀在玻璃基底上制作处通道阳模；
(2)在模具上浇筑聚合物材料获得微通道结构；
(3)对聚合物材料和载玻片进行表面等离子处理；
(4)将聚合物材料和载玻片键合，获得肿瘤细胞筛分微流控芯片。
实施例2
本实施例中，配套微流控芯片的制作方法与实施例1基本相同，不同之处为：微通道整体厚度为60μm，样品入口、鞘流入口的尺寸为400μm，废液出口、样品收集出口的尺寸为300μm，收缩段尺寸为宽150μm、长300μ，扩张段尺寸为宽400μm、长300μm。
实施例3
以上述配套微流控芯片为基础，实现一种肿瘤细胞染色和筛分的集成操作。首先，将3mL 胸腔积液以1000r/min的速度离心3min，得到细胞富集液；将1.5mL瑞士吉姆萨染液A液加入细胞富集液染色1分钟；再将1.5mL瑞士吉姆萨染液B液加入细胞富集液；以滴管或移液枪轻轻吹打溶液确保细胞与染色溶液充分接触，得到样品溶液。
将样品溶液和聚环氧乙烷PEO溶液吸入注射器，通过注射泵将其分别从样品入口和鞘流入口注入微通道。首先通入鞘流液体，初始体积流率设置为30μL/min，待微通道内充满鞘流液体后，以10μL/min的体积流率通入样品溶液，待两相溶液形成稳定并流界面后增加鞘流体积流率为70μL/min。
如图6和图7所示，在该流率比(1:7)下，样品溶液受到挤压以一薄层沿直边侧流动，其余位置均为鞘流溶液。样品溶液中的红细胞和白细胞在壁面附近受到的惯性升力FL的驱动作用，向通道中心迁移；颗粒运动至并流界面时，试图从样品溶液穿越界面进入粘弹性的鞘流溶液，此时受到指向直边侧的界面粘弹性力Fei。惯性升力和界面粘弹性力的大小分别正比于粒径的6次方和3次方，因此只有特定粒径的细胞可以在界面处受力平衡，这个粒径就称为临界粒径。红细胞和白细胞粒径均小于临界粒径，所以不能穿越界面而留在样品溶液中。如图8所示，肿瘤细胞的粒径大于临界粒径因而可以穿越界面进入鞘流中。在鞘流中，肿瘤细胞受到指向收缩-扩张侧的迪恩力、指向收缩-扩张侧的粘弹性力以及指向直边侧的惯性升力作用，继续向指向收缩-扩张侧迁移，最终稳定在三力平衡位置。
在上述原理下，如图9所示，红细胞和白细胞被限制于样品流中，紧贴直边侧从废液出口流出；肿瘤细胞进入鞘流溶液并充分迁移，从样品收集出口流出。肿瘤细胞从样品溶液中被筛分出来并发生充分侧向迁移，肿瘤细胞运动轨迹与样品溶液轨迹间距充分远，样品收集出口获得的肿瘤细胞纯度达到98％。
相比于在入口注入的胸腔积液样品溶液中含有红细胞、白细胞、肿瘤细胞和大量染液，此时的样品收集液仅包含染色完成的肿瘤细胞和无色透明的PEO溶液。即完成了肿瘤细胞从染液到透明溶液的洗涤过程。所获得的样品收集溶液可以无需冲洗而直接涂片。在样品收集出口获得的肿瘤细胞收集液，取0.25mL样品收集液均匀涂布在载玻片上，无需等待液体挥发干燥即可镜检、观察。
本发明所提出的一种肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法仅耗时10-15分钟即可获得清晰无背景干扰的肿瘤细胞染色涂片，如图10a所示。
传统的涂片检测方法由以下操作构成：1)离心获得胸腔积液细胞浓缩液；2)将细胞浓缩液涂布于载玻片，获得待染色涂片；3)挥发干燥，使细胞固定于待染色涂片；4)在涂片上染色；5)冲洗，洗掉涂片上的多余染液；5)镜检、观察。按照此流程获得的染色涂片如图10b所示，其存在以下缺点：1)为对肿瘤细胞进行筛分，所以获得的涂片中包含大量红细胞和染色沉淀，干扰了肿瘤细胞的观察；2)冲洗过程会损失珍贵的肿瘤细胞，使涂片中的肿瘤细胞数量降低；3)挥发干燥、冲洗等过程耗时长，获得细胞染色涂片需耗时40-45分钟，检测效率低下。
综上所述，本实验本发明所述的一种肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法具有短耗时、高质量的优点。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优先实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,任何熟悉本专业的技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照样品浓缩-液基染色-微流控芯片筛分-细胞涂片的顺序获得肿瘤细胞涂片；
(2)样品浓缩是指通过离心的方法由适量胸腔积液样品获得胸腔积液细胞浓缩液样品；
(3)液基染色是指将染色液滴加入胸腔积液细胞浓缩液，对细胞进行染色，所得溶液为样品溶液；细胞在液体环境而非干燥的载玻片上完成染色；
(4)微流控芯片筛分是指使用配套微流控芯片按照下述使用方法对样品中的细胞进行筛分；
(5)细胞涂片是指在样品收集出口获得的肿瘤细胞收集液后，均匀涂布在载玻片上观察镜检。
2.如权利要求1所述的一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法的配套微流控芯片的制造方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)通过湿法刻蚀在玻璃基底上制作处通道阳模；
(2)在模具上浇筑聚合物材料获得微流体通道机构；
(3)对聚合物材料和载玻片进行表面等离子处理；
(4)将聚合物材料和载玻片键合，获得肿瘤细胞筛分微流控芯片。
3.如权利要求2所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片，由芯片本体构成，其特征在于，所述芯片本体上设有微流体通道机构，所述微流体通道机构一侧为伸缩式微流体通道，其另一侧为直流边通道构成；所述微流体通道进口端分别连接样品入口和鞘流入口的，其出口端分别连接废液出口和样品收集出口，所述收缩-扩张式微流体通道由至少40个以上具有收缩-扩张的单元交错构成。
4.如权利要求3所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片，其特征在于，所述单元中收缩段尺寸为宽80～150μm、长150～300μm。
5.如权利要求3所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片，其特征在于，单元中扩张段尺寸为宽200～400μm、长150～300μm。
6.如权利要求3所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片，其特征在于，样品入口、鞘流入口的宽度为100～400μm。
7.如权利要求3所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片，其特征在于，废液出口、样品收集出口连接于单元的扩张段之后，且宽度为50～300μm。
8.一种权利要求1-7任一项所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片的使用方法，其特征在于：
(1)样品溶液从样品入口注入，且其粘度低于1.15mpa·s；
(2)鞘流从鞘流入口注入，且其粘度高于1.15mpa·s(以同等测试条件下，去离子水粘度1.02mpa·s为基准)；
(3)样品溶液与鞘流的体积流率比小于1：4；
(4)样品溶液与鞘流之间形成稳定的并流界面。
9.如权利要求8所述肿瘤细胞染色和筛分的集成操作方法的配套微流控芯片的使用方法，其特征在于，加入染色液后，上述样品溶液粘度低于1.15mpa·s(以同等测试条件下，去离子水粘度1.02mpa·s为基准)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911144020.5A CN111060364A (zh) | 2019-11-20 | 2019-11-20 | 一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911144020.5A CN111060364A (zh) | 2019-11-20 | 2019-11-20 | 一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111060364A true CN111060364A (zh) | 2020-04-24 |
Family
ID=70298599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911144020.5A Pending CN111060364A (zh) | 2019-11-20 | 2019-11-20 | 一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111060364A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103261436A (zh) * | 2010-09-14 | 2013-08-21 | 加利福尼亚大学董事会 | 利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的方法和装置 |
| CN106076441A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种基于尺寸检测循环肿瘤细胞的微流控装置及方法 |
| CN107674820A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-02-09 | 东南大学 | 一种分选细胞的微流控器件及其使用方法 |
| CN107699478A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-02-16 | 朱嗣博 | 一种循环肿瘤细胞（ctc）检测用微流控芯片装置 |
| US20180185846A1 (en) * | 2015-07-02 | 2018-07-05 | Nanyang Technological University | Leukocyte and microparticles fractionation using microfluidics |
| CN109837204A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-04 | 南京林业大学 | 一种集成细胞分选聚焦的微流控芯片检测系统及方法 |
-
2019
- 2019-11-20 CN CN201911144020.5A patent/CN111060364A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103261436A (zh) * | 2010-09-14 | 2013-08-21 | 加利福尼亚大学董事会 | 利用微流体截留涡流从异质溶液中分离细胞的方法和装置 |
| US20180185846A1 (en) * | 2015-07-02 | 2018-07-05 | Nanyang Technological University | Leukocyte and microparticles fractionation using microfluidics |
| CN106076441A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-11-09 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 一种基于尺寸检测循环肿瘤细胞的微流控装置及方法 |
| CN107699478A (zh) * | 2017-09-19 | 2018-02-16 | 朱嗣博 | 一种循环肿瘤细胞（ctc）检测用微流控芯片装置 |
| CN107674820A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-02-09 | 东南大学 | 一种分选细胞的微流控器件及其使用方法 |
| CN109837204A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-06-04 | 南京林业大学 | 一种集成细胞分选聚焦的微流控芯片检测系统及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109852530B (zh) | 一种集循环肿瘤细胞捕获、裂解与核酸检测于一体的微流控芯片及其装置以及方法 | |
| Warkiani et al. | An ultra-high-throughput spiral microfluidic biochip for the enrichment of circulating tumor cells | |
| CN106754240B (zh) | 用于捕获和鉴定循环肿瘤细胞的微流控芯片 | |
| CN107012067B (zh) | 一种高通量配对捕获单细胞/单颗粒的微流控芯片及其应用 | |
| CN106076441B (zh) | 一种基于尺寸检测循环肿瘤细胞的微流控装置及方法 | |
| CN111088146A (zh) | 一种从胸腔积液中筛分肿瘤细胞的微流控芯片 | |
| JP6265508B2 (ja) | マイクロ流体装置およびその使用 | |
| Chiu et al. | Enhancement of microfluidic particle separation using cross-flow filters with hydrodynamic focusing | |
| CN101358912B (zh) | 含原位聚合甲基丙烯酸丁酯预处理整体柱的三维微流控芯片 | |
| CN104073428A (zh) | 一种细胞分离微结构系统 | |
| Tan et al. | Continuous-flow cytomorphological staining and analysis | |
| CN109913352B (zh) | 一种基于非接触式介电电泳力操控捕获微颗粒和细胞的微流控装置及方法 | |
| WO2018214623A1 (zh) | 一种用于循环肿瘤细胞分离的微流控芯片，一种循环肿瘤细胞分离方法以及计数方法 | |
| Huang et al. | Rapid separation of human breast cancer cells from blood using a simple spiral channel device | |
| Jung et al. | Sorting of human mesenchymal stem cells by applying optimally designed microfluidic chip filtration | |
| CN106179545B (zh) | 用于生物分析的微流控芯片设备及其制备方法 | |
| EP2908140A1 (en) | Microchannel chip for microparticle separation, microparticle separation method and system for microparticle separation using chip | |
| Shirai et al. | Hybrid double-spiral microfluidic chip for RBC-lysis-free enrichment of rare cells from whole blood | |
| CN111040928B (zh) | 一种用于寇氏隐甲藻处理及收集的高通量微流控芯片 | |
| CN106345541A (zh) | 一种双相液液萃取与电泳分离集成微流控装置及方法 | |
| CN111060364A (zh) | 一种肿瘤细胞染色和筛分的集成方法及配套微流控芯片 | |
| WO2021115047A1 (zh) | 一种微流控芯片及基于微流控芯片的全血分离方法 | |
| Zhu et al. | Cell loss in integrated microfluidic device | |
| KR101048858B1 (ko) | 개방형 그루브 채널 칩 | |
| CN205981839U (zh) | 一种自动胸腹水快速制片染色系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200424 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |