CN106568982B - 一种用于二维液滴阵列形成和筛选的装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于大规模单层二维液滴阵列形成和筛选的装置及其使用方法，该装置包括微柱阵列芯片、辅助液滴铺展的刮板、用于操纵液滴的探针、三维平移台等部分组成。利用微柱之间的间隙形成捕陷单个液滴的微槽单元，通过重力作用和毛细作用或使用辅助手段使得液滴单层单个铺展在微槽单元中，从而形成单层液滴阵列。利用本发明能够进行液滴的准确定位、检测，以及对目标液滴的吸取等后续处理。其装置具有结构简单，容易操作的特点，方法具有液滴铺展速度快、通量高、液滴捕陷效率高、液滴位置固定等优点，适用于单细胞分析与筛选、单分子分析与筛选、高通量基因筛选、蛋白质定向进化、抗体筛选、微生物研究、药物筛选等领域。

Description

一种用于二维液滴阵列形成和筛选的装置及其使用方法

技术领域

本发明涉及的领域为微流控液滴领域，特别涉及一种用于大规模二维液滴阵列形成和筛选的装置及其使用方法。

背景技术

基于液滴的多相微流控技术是近年来高通量筛选研究领域中的热点之一。它通过微米级通道（或微结构）中多相流体的控制，实现大批量油包水或水包油型液滴微反应器的生成、混合、反应以及分析筛选。基于液滴的多相微流控技术解决了单相微流控系统中混合速度慢、分析通量低、易引起交叉污染等问题，并进一步减少了试剂和样品的消耗。另外，微液滴技术具有操作自动化、生成频率高、分析速度快等优点，使其广泛应用于高通量筛选、单细胞分析、单分子分析等方面。

当前液滴筛选的一般方法主要是在封闭通道内，利用流体压力、表面波诱导、电泳、介电泳等手段对不同尺寸或者具有不同内容物的连续流动液滴进行筛选(PNAS,2010,107,4004-4009)。这类技术虽然具有操纵速度快、自动化程度高等优点，但是由于筛选过程在封闭通道中进行，多个目标液滴一般被分隔至单个通道中，因此筛选操作通常只能起到对目标液滴富集的作用，难以直接针对特定的目标液滴进行后续的分析测定或培养等操作。

开放式的液滴阵列芯片系统能够很好地解决上述问题，目前形成开放式液滴阵列的芯片主要有以下两种，一是具有亲水-疏水表面的芯片（Lab Chip,2010,10,3355-3362），这种方法形成的液滴阵列，由于液滴相直接与芯片表面接触，无法完成液滴的完全收集等操作。二是具有微坑的芯片。这种方法形成的液滴阵列实验操作复杂，由于微坑结构是下端封闭的，铺展液滴困难，液滴生成速度较慢，一般为0.1至1Hz，限制了该方法在高通量筛选中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量液滴阵列和筛选的装置及其使用方法。其装置具有结构简单，容易操作的特点，方法具有液滴铺展速度快、通量高、液滴捕陷效率高、液滴位置固定等优点，适用于单细胞分析与筛选、单分子分析与筛选、高通量基因筛选、蛋白质定向进化、抗体筛选、微生物研究、药物筛选等领域。

一种用于二维液滴阵列形成和筛选的装置，包括：用于铺展液滴的阵列芯片（也称为微柱阵列芯片）；所述的阵列芯片上设有由两个以上的微柱构成的微柱阵列，相邻微柱之间留有间隙以形成捕陷单个液滴的微槽单元；

所述阵列芯片带有微柱的一面配合有用于辅助液滴铺展的刮板。

根据本发明，主要是利用两个或两个以上的微柱之间的间隙形成一个捕陷单个液滴的微槽单元。如何保证微槽单元捕陷单个液滴的便利性、成功率和可靠性，是本发明设计的主要目标。为保证液滴阵列的单个液滴规则排列，所述的微槽单元需要满足可以容纳且只能容纳一个液滴的条件。为此，微槽单元的内直径或者最大内对角线应大于单个液滴直径，以使微槽单元的空间可以容纳一个液滴。所述的微槽单元的内直径或者最大内对角线还应小于两个液滴直径之和，以使其空间不能容纳两个液滴，即一个微槽单元只能容纳单个液滴。为提高微槽单元容纳单个液滴的概率和可靠性，微槽单元的内直径或者最大内对角线为单个液滴直径的1.0倍至1.5倍。在此范围内，微槽单元内的空间恰好可以容纳一个液滴，而不致因为液滴具有变形性或液滴尺寸波动而造成一个微槽单元内容纳两个液滴的情况。

根据本发明，所述微柱的高度应大于单个液滴直径的1/3。微柱的高度过小，微柱难以起到对液滴的限位作用，已经捕陷于微槽单元的液滴容易被液滴悬液或间隔相冲出微槽单元。此外，所述的微柱的高度还应小于单个液滴直径的2倍。过高的微柱高度会使液滴深陷于微槽单元，不利于进行后续的液滴取出操作，此外，过高的微柱高度也会使得液滴出现重叠，不能形成单层液滴结构。更为有利的是，微柱的高度为单个液滴直径的1/3至1.5倍。在此范围内，液滴能够被可靠地以单层形式捕陷于微槽单元内，同时又比较方便进行液滴的取出操作。此外，组成一个微槽单元的相邻微柱之间的间距应小于单个液滴的直径，以使已经捕陷于微槽单元的液滴不能通过微柱间的缝隙漏出微槽单元。

根据本发明，所述的微柱阵列芯片上的微槽单元的数量通常为数十至数百万。如采用大尺度（面积）芯片或者连续可重复使用的芯片，微槽单元的数量可增加至千万或上亿水平以上，以进行超高通量筛选。微柱阵列芯片上不同的微槽单元可共用微柱。

根据本发明，所述的微柱阵列芯片上的微柱的横截面的形状为圆形、或方形、或菱形、或六边形、或十字形、或其他多边形。所述的微柱阵列芯片的材质是无机材料，如玻璃、石英、硅或金属，或有机材料，如高分子聚合物等，或无机-有机复合材料。作为优选，微柱阵列芯片的材料应该是透明的，以方便进行液滴检测和液滴操纵。

根据本发明，当液滴为水相液滴，间隔相为疏水性液体时，所述的微柱阵列芯片表面，包括微柱表面，为疏水性表面；当液滴为疏水性液滴，间隔相为亲水性液体时，所述的微柱阵列芯片表面，包括微柱表面，则为亲水性表面。即保证微柱阵列芯片表面（包括微柱表面）的表面性质与间隔相相容，这是本发明与亲水-疏水表面液滴芯片的重要区别。

根据本发明，所述的辅助液滴铺展的刮板的功能是为了帮助液滴在芯片表面的快速铺展，进入微槽单元。刮板的至少一个边或一个面与微柱阵列芯片表面平行。更为有利的是，该边或该面的宽度大于微柱阵列芯片上微柱阵列的整体宽度。当液滴为水相液滴时，所述的辅助液滴铺展的刮板的表面为疏水性表面；当液滴为疏水性液滴时，所述的辅助液滴铺展的刮板的表面为亲水性表面。即刮板的表面性质与间隔相相容，对刮板的表面处理应预先进行，以防止刮板与液滴接触时造成液滴融合。

作为优选，所述的装置还包括用于操作液滴的探针；

所述的阵列芯片、刮板和探针中的一个或者多个独立地或组合地固定在三维平移台上。具体可以是所述的微柱阵列芯片固定于三维平移台上，或者辅助液滴铺展的刮板固定于三维平移台上，或者探针固定于三维平移台上。或者微柱阵列芯片、辅助液滴铺展的刮板、探针三者中的两者或三者分别固定在两个或两个以上三维平移台上。三维平移台可以是手动的，也可以是自动的。

根据本发明，所述的用于操纵液滴的探针，其功能是将捕陷于微槽单元的液滴整体取出，或从微槽单元的液滴内吸出部分液体，或将新的液体或液滴加入到微槽单元内的液滴中，或对微槽单元的液滴进行液滴的迁移、融合、分裂、新液滴生成等其他操作。所述的用于操纵液滴的探针可以有多种结构，作为优选，采用的两类结构为具有通道的毛细管形结构，或不具有通道的实心探针结构。探针与液滴的接触端为平整截面结构、或是锥形尖端结构、或是其他结构。探针与液滴的接触端的表面经过疏水化处理，或是亲水化处理，或是抛光处理，或是选择性亲水/疏水化处理，以辅助液体的取出或加入操作。

本发明还提供了一种用于大规模二维液滴阵列形成和筛选的装置的使用方法，具体步骤为：

（a）将预先形成的含有具有良好尺寸均一性的液滴和间隔相的液滴悬液倾倒在微柱阵列芯片上；使用具有良好尺寸均一性的液滴的目的是保证一个液滴捕陷于一个微槽单元，不会出现液滴过大不能进入微槽单元的情况，也不会出现液滴过小，一个微槽单元内容纳2个或2个以上液滴的情况；

所述的间隔相（8）和液滴（7）的亲水性能相反；

（b）利用刮板在微柱阵列芯片表面的刮动，液滴悬液的重力作用，以及间隔相在微柱阵列的毛细作用，或使用其他辅助手段，使得液滴呈单层铺展于微槽单元阵列中，且一个液滴捕陷于一个微槽单元；

（c）在形成液滴阵列的微柱阵列芯片上补充间隔相，使间隔相完全覆盖捕陷于微槽单元内的液滴，防止液滴蒸发；

（d）对微柱阵列芯片进行加热处理，或致冷处理，或孵育（温育）处理，在微柱阵列芯片上的液滴内进行化学反应、或生物反应、或细胞培养等其他操作；

（e）对微柱阵列芯片上的液滴进行检测，确定并获得目标液滴的位置信息；

（f）利用三维平移台调整用于操纵液滴的探针与微柱阵列芯片的相对位置，使得探针位于微槽单元内的目标液滴的上方，利用探针将目标液滴从微槽单元中取出，进行后续操作。

根据本发明，在步骤（b）中，利用刮板在微柱阵列芯片表面的刮动，或使用其他辅助手段，使得液滴悬液于微柱阵列芯片上表面之间产生平行相对运动，促进液滴在微柱阵列芯片上表面及微槽单元内的快速铺展，增加液滴进入并被捕陷于微槽单元的概率。

根据本发明，固定刮板的位置不动，保证刮板的下沿与微柱阵列芯片表面的间距小于一个液滴的距离，在刮板一侧加入液滴悬液，使微柱阵列芯片朝向与液滴悬液相反的方向、沿水平方向连续移动，可实现自动化的大规模的液滴的铺展与捕陷。

根据本发明，步骤（e）中检测手段包括肉眼识别、荧光检测、吸收光度检测、其他光谱检测、电化学检测、色谱检测、电泳检测、质谱检测、或其他检测方法。

根据本发明，步骤（f）将目标液滴从微槽单元中取出，是逐个将液滴取出，进行单独处理。即探针每次操作只取出一个液滴，再使该取出的单个液滴脱离探针进行后续操作。然后，再利用该探针取出下一个液滴。还可以采用另一种取液滴方式，即多个液滴连续取出。利用探针连续顺序取出多个液滴后，再进行后续的操作。

根据本发明，为进一步提高操纵液滴的通量，可以采用多个探针组成探针阵列，同时对微柱阵列芯片的多个目标液滴进行高通量取出操作，或其他后续处理操作。

根据本发明，还可以采用无探针的非接触方法，将目标液滴从微槽单元中取出。所述的非接触方法包括介电液滴操控、电磁液滴操控、超声液滴操控、光镊液滴操控、或其他非接触液滴操控方法。

根据本发明，可采用自动化的三维平移台并与计算机联用以实现液滴的自动铺展、自动检测和自动吸取。

与现有技术相比，本发明的优点主要在于：

与微孔阵列芯片相比，采用微柱结构形成微槽单元的方法进行液滴悬液的铺展和液滴的捕陷时，微柱之间缝隙所产生的毛细作用使得液滴悬液中的间隔相从缝隙中快速流出，会显著提高液滴的铺展速度和液滴捕陷的成功率和可靠性，实验操作更简便，有利于提高分析和筛选通量。通常，铺展相同面积的微柱阵列芯片所需时间比微坑阵列芯片减少30%以上；同时微柱阵列芯片的液滴捕陷效率也比微坑阵列芯片的高约30%，能达到95%以上。采用微槽单元捕陷液滴的方法，与随机铺展的液滴相比，能够保证液滴位置不变，实现液滴的准确定位，同时，带有缝隙的微槽单元也有利于进行液滴的吸取操作。采用浸油的半开放式的液滴阵列，有利于灵活地对液滴进行后续的操纵和处理。

附图说明

图1是用于形成二维液滴阵列的微柱阵列芯片结构示意图；

图2是用于大规模二维液滴阵列形成和筛选的装置的结构示意图；

图3是由两个微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图4是由三个横截面为圆形微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图5是由四个横截面为圆形微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图6是由五个横截面为圆形微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图7是由六个横截面为圆形微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图8是由四个横截面为菱形微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图9是由四个横截面为六边形微柱形成捕陷液滴的微槽单元的示意图；

图10是实施例1中使用的横截面为菱形的微柱阵列芯片进行液滴铺展与捕陷操作的示意图；

图11是实施例1中以毛细管连接注射泵作为探针进行液滴阵列中液滴吸取操作的示意图；

图12是实施例1中使用的横截面为菱形的实际微柱阵列芯片的俯视图，以及在其上形成的实际液滴阵列的俯视图；

图13是实施例2中使用的横截面为正方形的实际微柱阵列芯片的俯视图，以及在其上形成的实际液滴阵列的俯视图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，以下将详细描述根据本发明的优选实施例。

实施例1

利用标准的软光刻技术在PDMS芯片1上加工出阵列排布的横截面为菱形的微柱5结构，微柱5横截面的边长为42μm，微柱5之间的缝隙为16μm，微槽单元6的直径为47μm。(图12A)

以绿色色素溶液为液滴相，含3%ABIL EM90表面活性剂的矿物油为间隔相，利用具有T形通道的芯片制备直径约为38μm的绿色液滴7；再以荧光素钠溶液为液滴相，以含3%ABIL EM90表面活性剂的矿物油为间隔相，利用具有T形通道的芯片制备直径为38μm的荧光素钠液滴7。

混合两种液滴悬液9并将其倾倒在微柱阵列芯片1上；利用抛光片作为刮板2使得液滴悬液9与芯片1上表面产生水平相对运动，促进液滴在芯片1表面的快速铺展，形成单层液滴7阵列（图12B）；在形成液滴阵列的微柱阵列芯片1表面补充间隔相8油相，防止液滴7蒸发；采用显微镜对微柱阵列芯片1上的液滴7进行检测，确定荧光素钠液滴的位置；将操纵液滴的探针毛细管3一端与液体驱动系统相连，并将液体驱动系统固定在三维平移台4上，利用三维平移台4调整毛细管3进口端位置，使得毛细管3进口端位于微槽单元6内目标液滴7上方，操纵液体驱动系统将选定的荧光素钠液滴从微槽单元6中吸取出来；再利用三维平移台调整毛细管3进口端位置，使得毛细管进口端移出间隔相8油面，操纵液体驱动系统将目标液滴7转入液滴收集管内或者其他装置进行后续操作。

铺展3cm×3cm面积的微柱阵列芯片约需要50s，捕陷绿色色素液滴的效率为98.3%。

实施例2

通过微加工方法在PDMS芯片1上加工出阵列排布的横截面为正方形的微柱5结构，微柱5横截面的边长为36μm，微柱5之间的缝隙为16μm，微槽单元的直径为47μm（图13A）。

以绿色色素溶液为液滴相，含3%ABIL EM90表面活性剂的矿物油为间隔相，利用具有T形通道的芯片制备直径为38μm的绿色液滴；再以荧光素钠溶液为液滴相，含3%ABILEM90表面活性剂的矿物油为间隔相，利用具有T形通道的芯片制备直径为38μm的荧光素钠液滴。

混合两种液滴悬液9并将其倾倒在微柱阵列芯片1上；利用作为刮板2的抛光片使得液滴悬液9与芯片1上表面产生水平相对运动，促进液滴7在芯片表面的快速铺展，形成单层液滴阵列（图13B）；在形成液滴阵列的微柱阵列芯片1表面补充间隔相8油相，防止液滴7蒸发。采用带有高灵敏CCD照相机的荧光显微镜对微柱阵列芯片1上的各液滴7的荧光强度进行面阵成像检测，确定荧光素钠液滴的位置并获得其位置信息；将操纵液滴的探针3毛细管一端与液体驱动系统-柱塞泵相连。将微柱阵列芯片1固定在计算机程序控制的自动三维平移台4上。根据目标液滴7的位置信息，计算机控制三维平移台4移动调整芯片1的位置，使得毛细管3进口端位置位于微槽单元6内目标液滴1的上方，对准目标液滴。操纵液体驱动系统将选定的荧光素钠液滴7从微槽单元6中吸取出来。利用计算机控制三维平移台4，使得芯片1脱离毛细管探针3，再利用三维平移台4移动调整位于其上的液滴收集管对准毛细管3进口端位置，操纵液体驱动系统将目标液滴7转入液滴收集管内，进行后续的操作。铺展3cm×3cm面积的微柱阵列芯片约需要50s，捕陷两种液滴的效率为96.1%。

实施例3

采用实施例1中的液滴阵列芯片，以PCR反应液作为液滴相，Bio-Rad的generationoil为间隔相，利用T字形通道制备直径为38μm的数字PCR液滴。将PCR液滴置于PCR仪中进行扩增。反应完全后，倾倒液滴悬液在微柱阵列芯片1上；利用抛光片作为刮板2使得液滴悬液9与芯片1表面产生水平相对运动，促进液滴在芯片表面的快速铺展，形成单层液滴7阵列；在形成液滴阵列的微柱阵列芯片1表面补充间隔相8油相，防止液滴7蒸发；对微柱阵列芯片1上的液滴7进行检测。铺展3cm×3cm面积的微柱阵列芯片约需要50s，捕陷PCR反应液液滴的效率为97.4%。

Claims (9)

1.一种用于二维液滴阵列形成和筛选的装置，包括：用于铺展和固定单层液滴的阵列芯片(1)；其特征在于，所述的阵列芯片(1)上设有由三个以上的微柱(5)构成的微柱阵列，相邻微柱(5)之间留有间隙以形成捕陷单个液滴的微槽单元(6)；

所述阵列芯片(1)带有微柱(5)的一面配合有用于辅助液滴铺展的刮板(2)；

所述的微槽单元(6)的内直径或者最大内对角线大于单个液滴(7)直径，小于两个液滴(7)直径之和；

组成微槽单元(6)的相邻微柱(5)之间的间距小于单个液滴(7)的直径；

所述的微柱(5)的高度大于单个液滴(7)直径的1/3，小于单个液滴(7)直径的2倍；

所述的刮板(2)的一个边或一个面与阵列芯片(1)表面平行。

2.根据权利要求1所述的用于二维液滴阵列形成和筛选的装置，其特征在于，还包括用于操作液滴的探针(3)；

所述的阵列芯片(1)、刮板(2)和探针(3)中的一个或者多个，独立地或组合地固定在一个或多个三维平移台(4)上。

3.根据权利要求1或2所述的用于二维液滴阵列形成和筛选的装置，其特征在于，所述的微柱(5)的横截面的形状为圆形、方形、菱形、六边形或十字形；

当液滴(7)为水相液滴，间隔相(8)为疏水性液体时，所述的阵列芯片(1)表面为疏水性表面；当液滴(7)为疏水性液滴，间隔相(8)为亲水性液体时，所述的阵列芯片(1)表面为亲水性表面。

4.根据权利要求1或2所述的用于二维液滴阵列形成和筛选的装置，其特征在于

所述刮板的边的长度或所述刮板的面的宽度大于阵列芯片(1)上微柱阵列的整体宽度；

当液滴(7)为水相液滴时，所述的辅助液滴铺展的刮板(2)的表面为疏水性表面；当液滴(7)为疏水性液滴时，所述的辅助液滴铺展的刮板(2)的表面为亲水性表面。

5.根据权利要求2所述的用于二维液滴阵列形成和筛选的装置，其特征在于，所述的探针(3)为具有通道的毛细管形结构或不具有通道的实心结构；

探针(3)与液滴(7)的接触端为平整截面结构或锥形尖端结构，所述的接触端的表面经过疏水化处理、亲水化处理、抛光处理或者选择性亲水/疏水化处理。

6.一种如权利要求1～5任一项所述的用于二维液滴阵列形成和筛选的装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将预先形成的含有具有良好尺寸均一性的液滴(7)和间隔相(8)的液滴悬液(9)倾倒在所述的阵列芯片(1)上；

(b)利用所述的刮板(2)在所述的阵列芯片(1)表面的刮动，使液滴悬液(9)与阵列芯片(1)上表面产生平行相对运动，使得液滴(7)呈单层铺展于微槽单元(6)阵列中，且一个液滴(7)捕陷于一个微槽单元(6)；

(c)在形成液滴(7)阵列的阵列芯片(1)上补充间隔相(8)；

(d)在阵列芯片(1)上的各液滴(7)内进行化学反应、生物反应或细胞培养；

(e)对阵列芯片(1)上的液滴(7)进行检测，确定并获得目标液滴的位置信息；

(f)利用探针(3)进行接触式操作或者非接触式操作的方式，将目标液滴从微槽单元(6)中取出，实现目标液滴的筛选，并进行后续操作。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(e)中，检测手段包括肉眼识别、荧光检测、吸收光度检测、电化学检测、色谱检测、电泳检测或质谱检测。

8.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(f)中，将目标液滴从微槽单元(6)中取出时，可以采用逐个取出的方法，或是多个液滴连续取出的方法，或是多个液滴同时取出的方法；

当对多个液滴同时取出的时候，采用多个用于操纵液滴的探针(3)组成的探针阵列，同时对阵列芯片(1)的多个目标液滴(7)进行高通量取出操作。

9.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(f)中，采用接触式操作时，利用三维平移台(4)调整所述的探针(3)与阵列芯片(1)的相对位置，使得探针(3)位于微槽单元(6)内的目标液滴(7)的上方，利用探针(3)将目标液滴从微槽单元(6)中取出，进行后续操作；

采用非接触式操作时，所述的非接触方法包括介电液滴操控、电磁液滴操控、超声液滴操控或光镊液滴操控。