CN110093245B - 一种声表面波液滴激发装置及定点释放肿瘤单细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种声表面波液滴激发装置及定点释放肿瘤单细胞的方法。该装置包括声表面波液滴激发芯片、XYZ三维移动平台、微粒捕获基底板、信号发生器和功率放大器；所述声表面波液滴激发芯片通过信号发生器和功率放大器驱动，固定于XYZ三维移动平台上；微粒捕获基底板置于声表面波液滴激发芯片下方。该装置可用于肿瘤单细胞及其他罕有细胞或生物微粒的定点释放。本发明具有以下优点：操作方便、单细胞释放效率高、声学芯片微型化；此外，适用性广，可用于其它捕获‑释放罕有细胞的材料体系，实现罕有细胞的定点释放，在与罕有细胞相关的研究领域中具有可观的应用潜力。

Description

一种声表面波液滴激发装置及定点释放肿瘤单细胞的方法
技术领域
本发明属于微全分析系统领域，特别涉及一种声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞，是指从原发肿瘤病灶上脱落进入外周血循环系统中的细胞，在癌症转移及复发中具有重要的作用，可作为临床检测标志物来衡量癌症的发展状态以及癌症病人治疗后的效果。近年来，循环肿瘤细胞检测技术正成为一种快速可靠的、非侵入的、可重复进行的低成本新型癌症诊断技术，被称为实时肿瘤液态活检技术。随着这一研究领域的不断发展，对捕获的循环肿瘤细胞进行进一步的下游分析，包括定量 PCR， FISH 及全基因组和转录组测序等来获得分子信息，已成为研究癌症发病机制和癌症转移机制等基础生物医学问题必不可少的手段。然而，循环肿瘤细胞往往具有高度异质性，被捕获的细胞中还可能存在少量的白细胞，造成纯度不高，对其进行整体分子水平的生物分析，得到的是平均后的结果往往难以用于进一步深入研究少数更具恶性的循环肿瘤细胞。 发展对单细胞和少量细胞簇进行分子生物学发现的新方法已成为这一领域的迫切需求。
传统获取肿瘤单细胞的主要有基于毛细管的显微操作器、激光显微切割法、流式细胞术和介电泳。显微操作器和激光显微切割法可以准确的获得单个肿瘤细胞，精度高，但是前期样品准备多采用细胞涂片的方法，容易造成靶细胞的大量损失。流式细胞术能够快速的获得单细胞，但是对细胞样本有较高的要求，一般通入的细胞量在105，其中须包括0.1%的靶细胞，而血样中的循环肿瘤细胞的数量极为稀少，很难满足这一要求。介电泳方法通过特殊设计的电极实现对单细胞运动的控制，也可以实现单细胞分选，但是器件制备复杂，往往需要复杂的电极通路。
近年来，基于聚焦声场的声液滴激发技术引起了人们的关注，通过特殊设计的结构，可产生聚焦的声学力，并作用于溶液液面，可实现多种溶液的微液滴激发。此外，通过调节电学信号参数，可实现不同粒径的微液滴。目前，未见将声表面波液滴激发与三维纳米基底相结合用于捕获、定点释放肿瘤细胞用于解决临床研究肿瘤异质性的难题的相关报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明将声表面波液滴激发与三维纳米基底相结合，实现了将捕获后的肿瘤细胞定点释放，用于解决临床研究肿瘤异质性的难题。本发明提供一种声表面波液滴激发装置及应用于捕获-释放罕有细胞的方法。
本发明提供的方法利用圆弧形叉指电极在聚焦声场作用下激发出基质金属蛋白酶的微液滴，然后通过XYZ三维移动平台精确定点，实现激发出的微液滴精确落点，进而实现目标细胞的单个定点释放。该方法简单高效、准确度高，并且回收的单细胞能够完整保存并用于后续基因层面的分子分析。
本发明提供的技术方案如下：
一种声表面波液滴激发装置，包括声表面波液滴激发芯片、XYZ三维移动平台、微粒捕获基底板、信号发生器和功率放大器；
所述声表面波液滴激发芯片通过信号发生器和功率放大器驱动，固定于XYZ三维移动平台上；微粒捕获基底板置于声表面波液滴激发芯片下方。
具体的，所述声表面波液滴激发芯片由压电材料衬底、圆弧形叉指电极和环形水槽构成；
所述环形水槽设置在压电材料衬底上；圆弧形叉指电极设置在环形水槽中，两者的几何中心重合。
具体的，所述压电材料衬底为128°Y-X铌酸锂单晶。
具体的，所述圆弧形叉指电极圆弧角为40°，波长100μm。
具体的，所述环形水槽为环形凹槽，通过在压电材料衬底上软光刻制得；水槽高度为200μm，直径为2mm。
具体的，所述XYZ三维移动平台由支架和光学三维精密微调滑台移动手动位移平台组成，前者用于固定声表面波液滴激发芯片，后者用于控制支架的移动，移动精度为10μm。
具体的，所述微粒捕获基底板的制备方法如下：
（1）制备前驱液：采用吗啉乙磺酸溶液充分洗涤明胶纳米颗粒，然后将明胶纳米颗粒置于EDC/NHS溶液中反应得到NHS-基团修饰的明胶纳米颗粒；再用去离子水分散该NHS-修饰的纳米颗粒制备成前驱液；
（2）将玻片置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中浸泡制备氨基化的玻片；
（3）将氨基化的玻片浸泡在前驱液中反应以形成明胶纳米颗粒涂层的纳米基底；
（4）将纳米基底先浸没在链霉亲和素溶液中，在4℃条件下过夜反应，之后再加入生物素修饰的特异性抗体，室温下反应2小时，得到用于捕获肿瘤细胞的微粒捕获基底板。
另一方面，本发明提供上述声表面波液滴激发装置进行声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法，包括以下步骤：
1）制备微粒捕获基底板，捕获住肿瘤细胞；
2）将声表面波液滴激发芯片固定在XYZ三维移动平台上；
3）将基质金属蛋白酶溶液加入至声表面波液滴激发芯片中的环形水槽里；
4）将圆弧形叉指电极的几何中心通过显微镜观察和XYZ三维移动平台移动，准确定点于目标肿瘤细胞；
5）将脉冲信号接入功率放大器，功率放大器又接入声表面波液滴激发芯片，通过产生的声学力激发出基质金属蛋白酶微液滴，并落于目标肿瘤细胞之上；
6）利用基质金属蛋白酶微液滴对明胶的酶促降解作用，溶解微液滴覆盖下的明胶颗粒纳米层，释放肿瘤单细胞。
具体的，所述步骤3）中基质金属蛋白酶溶液体积为1.5-2.5μL。
具体的，所述步骤5）中微液滴直径为30μm。
具体的所述步骤6）中明胶纳米颗粒涂层基底被基质金属蛋白酶微液滴溶解的面积直径为200-400μm。
除此以外，本发明还提供上述的声表面波液滴激发装置在捕获-释放罕有细胞中的应用。
本发明中提供的用于捕获细胞的明胶纳米颗粒涂层可以替换成二氧化锰纳米膜、氧化锌纳米膜等基底材料，再根据基底材料选择相对应的用于溶解基底材料的微滴液如草酸微液滴、磷酸微液滴。本发明提供的方法可以实现肿瘤单细胞的定点释放，但不局限于肿瘤细胞，还可以应用于其它罕有细胞或生物微粒如胎儿有核红细胞、肿瘤干细胞以及外泌体微囊泡等。
本发明的有益效果：
1. 利用明胶纳米颗粒对基质金属蛋白酶的酶降解响应的原理，和声表面波液滴激发技术，可实现肿瘤单细胞的定点释放，该方法简单、高效；
2. 利用明胶纳米颗粒制备肿瘤细胞捕获平台，制备方式不仅简单，且捕获细胞能力高；
3. 利用声表面波液滴激发技术，可激发微液滴，且微液滴大小可控，位置可控，精度高，为实现肿瘤单细胞的定点释放提供有力的工具；
4. 利用微液滴溶解捕获了细胞的衬底的原理和声表面波液滴激发技术，可适用其它捕获-释放细胞的材料体系；
5. 本发明提供的技术可适用其它罕有细胞或其它生物微粒，实用性高、应用广；
6. 本发明提供的声表面波液滴激发芯片体积小，可集成度高；
7. 本发明提供了一种罕见细胞或微粒捕获即单个释放的新思路，具有极大的参考价值。
附图说明
图1是声表面波液滴激发装置的结构示意图；
图2是声表面波液滴激发芯片结构示意图；
图3是明胶纳米基底对乳腺癌细胞系捕获效果的明场图；
图4是基质金属蛋白酶微液滴对液滴覆盖下的明胶纳米基底的降解过程荧光图；其中，黑色圆表示明胶纳米基底已完全降解；
图5是本发明提供的装置对肿瘤细胞定点释放效果明场图；其中，虚线箭头-肿瘤细胞，虚线圆-平铺后的微液滴；
附图中：1-玻片；2-明胶纳米颗粒涂层的纳米基底；3-特异性抗体；4-微粒捕获基底板；5-压电材料衬底；6-圆弧形叉指电极；7-环形水槽；8- XYZ三维移动平台；9-基质金属蛋白酶微液滴；10-覆盖于基质金属蛋白酶微液滴下的目标肿瘤细胞。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明利用一种声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法，原理如图1、图2所示，具体表示为制备明胶纳米颗粒涂覆的纳米基底并化学修饰上特异性抗体用于细胞捕获，制备声表面波液滴激发芯片，并利用聚焦的声学力作用在基质金属蛋白酶试剂酶溶液液面处，激发出微液滴，随后利用基质金属蛋白酶微液滴对明胶的酶促降解作用，溶解肿瘤周围的明胶纳米基底，进而实现肿瘤单细胞释放。
实施例1
一种声表面波液滴激发装置，包括声表面波液滴激发芯片、XYZ三维移动平台8、微粒捕获基底板4、信号发生器和功率放大器。其整体结构如图1所示。
图2示出了所述声表面波液滴激发芯片的结构，由压电材料衬底5、圆弧形叉指电极6和环形水槽7构成。压电材料衬底5为128°Y-X铌酸锂单晶。圆弧形叉指电极6通过在压电材料上软光刻得到，电极圆弧角为40°，波长100μm。环形水槽7为环形凹槽，通过在压电材料衬底5上通过软光刻制得，光刻胶为SU8 2100；水槽高度为200μm，直径为2mm。所述环形水槽7设置在压电材料衬底5上；圆弧形叉指电极6设置在环形水槽中，两者的几何中心重合。
所述XYZ三维移动平台8由支架和光学三维精密微调滑台移动手动位移平台（优选的，型号为SIGMA KOKI XYZ轴三维）组成，支架连接于移动平台上，移动平台作为底座，可三维移动，且含有千分尺。支架用于固定声表面波液滴激发芯片；移动平台用于控制支架的移动，其移动距离由千分尺控制移动精度为10μm。
所述微粒捕获基底板的制备方法如下：
（1）制备前驱液：采用吗啉乙磺酸溶液充分洗涤明胶纳米颗粒，然后将明胶纳米颗粒置于EDC/NHS溶液中反应得到NHS-基团修饰的明胶纳米颗粒；再用去离子水分散该NHS-修饰的纳米颗粒制备成前驱液；
（2）将玻片1置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中浸泡制备氨基化的玻片1；
（3）将氨基化的玻片浸泡在前驱液中反应以形成明胶纳米颗粒涂层的纳米基底2；
（4）将纳米基底2先浸没在链霉亲和素溶液中，在4℃条件下过夜反应，之后再加入生物素修饰的特异性抗体3，室温下反应2小时，得到用于捕获肿瘤细胞的微粒捕获基底板4。
所述声表面波液滴激发芯片通过信号发生器和功率放大器驱动，固定于XYZ三维移动平台8上；微粒捕获板4置于声表面波液滴激发芯片下方用于接收声表面波液滴激发芯片激发的微液滴。
应用实施例1
利用实施例1的装置捕获-定点释放乳腺癌细胞
具体方法如下：
1. 采用吗啉乙磺酸溶液充分洗涤明胶纳米颗粒之后，将明胶纳米颗粒置于EDC/NHS溶液中反应一定时间，得到NHS-基团修饰的明胶纳米颗粒；然后用去离子水分散该NHS-修饰的纳米颗粒制备成前驱液；将玻片1置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中浸泡1小时，制备氨基化的玻片基底；最后将氨基化的玻片浸泡在前驱液中一段时间，形成明胶纳米颗粒涂层的纳米基底2；
2. 将纳米基底2先浸没在链霉亲和素溶液中，在4℃条件下过夜反应，之后再加入生物素修饰的特异性抗体3，室温下反应2小时，最后得到用于捕获肿瘤细胞的微粒捕获基底板4；
3. 将含有肿瘤细胞的悬液滴在微粒捕获基底板4上，过夜反应，之后磷酸缓冲盐溶液反复清洗3次，最后得到捕获有肿瘤细胞的微粒捕获基底板4；
4. 采用软光刻技术、真空镀膜技术和剥离技术，在铌酸锂单晶压电衬底5上得到镀有金属的圆弧形叉指电极6，随后再进行一次软光刻技术，在压电衬底5上制得SU8环形水槽7，该环形水槽7的几何中心与圆弧形叉指电极6的几何中心重合，制得声表面波液滴激发芯片；
5. 将装有基质金属蛋白酶溶液的声表面波液滴激发芯片固定在自制的XYZ三维移动平台上8，降低Z方向上的高度确保激发的液滴的定位准度，接着借助显微镜系统观察，确定目标肿瘤细胞，之后通过移动XY方向确保圆弧形叉指电极的几何中心定位于目标肿瘤细胞；
6. 将信号产生器发出的脉冲信号通过功率放大器后，连入圆弧形叉指电极6的引线处，激发出微液滴于目标肿瘤细胞上10。
7. 利用基质金属蛋白酶微液滴对明胶纳米基底的降解作用，溶解肿瘤周围的明胶纳米基底，实现肿瘤单细胞释放。
图3为明胶纳米基底对乳腺癌细胞系捕获效果的明场图，从图中够可以看出，乳腺癌细胞被有效地捕获于肿瘤细胞捕获基板。
图4为基质金属蛋白酶微液滴对明胶纳米基底的降解过程荧光图；其中，黑色圆表示明胶纳米基底已完全降解。从图中可以看出，在基质金属蛋白酶微液滴激发在明胶纳米基底上后，会迅速降解底部的明胶纳米颗粒，形成黑洞。
图5为本发明提供的装置对肿瘤细胞定点释放效果明场图，从图中可以看出，当用PBS缓冲液冲洗肿瘤细胞捕获基板后，目标肿瘤细胞被成功释放下来，由于基质金属蛋白酶微液滴已降解明胶纳米颗粒。其中，虚线箭头为目标肿瘤细胞，虚线圆为液滴边界。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种声表面波液滴激发装置，特征在于：
包括声表面波液滴激发芯片、XYZ三维移动平台（8）、微粒捕获基底板（4）、信号发生器和功率放大器；
所述声表面波液滴激发芯片通过信号发生器和功率放大器驱动，固定于XYZ三维移动平台（8）上；微粒捕获基底板（4）置于声表面波液滴激发芯片下方；
所述的声表面波液滴激发装置进行声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法，包括以下步骤：
1）制备微粒捕获基底板（4），捕获住肿瘤细胞；
2）将声表面波液滴激发芯片固定在XYZ三维移动平台（8）上；
3）将基质金属蛋白酶溶液加入至声表面波液滴激发芯片中的环形水槽（7）里；
4）将圆弧形叉指电极（6）的几何中心通过显微镜观察和XYZ三维移动平台（8）移动，准确定点于目标肿瘤细胞；
5）将脉冲信号接入功率放大器，功率放大器又接入声表面波液滴激发芯片，通过产生的声学力激发出基质金属蛋白酶微液滴（9），并落于目标肿瘤细胞之上；
6）利用基质金属蛋白酶微液滴（9）对明胶的酶促降解作用，溶解微液滴覆盖下的明胶颗粒纳米层，释放肿瘤单细胞；
所述微粒捕获基底板的制备方法如下：
制备前驱液：采用吗啉乙磺酸溶液充分洗涤明胶纳米颗粒，然后将明胶纳米颗粒置于EDC/NHS溶液中反应得到NHS-基团修饰的明胶纳米颗粒；再用去离子水分散该NHS-修饰的纳米颗粒制备成前驱液；
将玻片（1）置于3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中浸泡制备氨基化的玻片（1）；
将氨基化的玻片浸泡在前驱液中反应以形成明胶纳米颗粒涂层的纳米基底（2）；
将纳米基底（2）先浸没在链霉亲和素溶液中，在4℃条件下过夜反应，之后再加入生物素修饰的特异性抗体（3），室温下反应2小时，得到用于捕获肿瘤细胞的微粒捕获基底板（4）。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：
所述声表面波液滴激发芯片由压电材料衬底（5）、圆弧形叉指电极（6）和环形水槽（7）构成；
所述环形水槽（7）设置在压电材料衬底（5）上；圆弧形叉指电极（6）设置在环形水槽（7）中，两者的几何中心重合。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于：所述压电材料衬底为128°Y-X铌酸锂单晶。
4.根据权利要求2所述的装置，其特征在于：所述圆弧形叉指电极（6）圆弧角为40°，波长100μm。
5.根据权利要求2所述的装置，其特征在于：所述环形水槽（7）为环形凹槽，通过在压电材料衬底（5）上软光刻制得；水槽高度为200μm，直径为2mm。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述XYZ三维移动平台（8）由支架和光学三维精密微调滑台移动手动位移平台组成，前者用于固定声表面波液滴激发芯片，后者用于控制支架的移动，移动精度为10μm。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法中步骤3）中基质金属蛋白酶溶液体积为1.5-2.5μL。
8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法中步骤5）中微液滴直径为30μm。
9.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述声表面波液滴激发及定点释放肿瘤单细胞的方法中步骤6）中明胶纳米颗粒涂层基底被基质金属蛋白酶微液滴溶解的面积直径为200-400μm。
10.权利要求1-9任一项所述的声表面波液滴激发装置在捕获-释放罕有细胞中的应用。
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