CN112143489B - 一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法 - Google Patents

一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法，包括金岛增强型多重量子点芯片及其制备方法，运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法，运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法，运用金岛增强型多重量子点荧光策略的临床肿瘤患者血液样品中的KRAS基因单/多碱基突变检测方法。本发明优点在于：信号采集灵敏度高、形象化且可定量化统计分析；样品兼容性好；操作简单快速、无需进行样品扩增；本发明检测过程简单，经过简单的样品提取过程即可进行CTNAs检测，耗时短，省去了扩增步骤，检测快速。

Description

一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检 测方法
技术领域
本发明涉及一种核酸检测技术领域，尤其涉及循环肿瘤核酸检测技术。
背景技术
循环肿瘤核酸(CTNAs)是肿瘤病变释放的无细胞核酸，其已被认为是肿瘤诊断和治疗的潜在标志物。研究表明，肿瘤患者CTNAs的浓度和突变概率通常高于健康人群，依赖于血液样本中CTNAs的诊断策略可以用作一种肿瘤液体活检的方法，且有可能成为肿瘤组织活检的补充或替代方法。然而，血浆或血清样本中CTNAs的浓度和突变概率差异很大；部分CTNAs表达水平低导致临床检测过程中需要大于10ml血清才能获得足够的靶CTNAs底物。基于聚合酶链反应(PCR)保证了检测的敏感性和特异性，但对CTNAs的点突变无法有效检出；DNA测序可有效检出CTNAs突变片段，但价格昂贵、耗时长，极大的限制了其临床应用。以上因素对检测CTNAs和后续分析造成了巨大的阻碍。因此，开发一种通用的、低成本、高灵敏、高特异性的多重CTNAs检测平台，对检测CTNAs和其单/多点突变分析具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种基于金岛增强型多重量子点荧光策略的新型CTNAs多重检测和突变识别方法。
本发明合成了金岛增强型多重量子点芯片，并以该芯片为基础构建荧光识别体系，提供放大的荧光信号，最终实现CTNAs多重检测和点突变识别的目的。本发明开发的金岛增强型多重量子点荧光系统由金岛增强型多重量子点芯片、激光发射模块、显微成像及图像采集系统组成：金岛增强型多重量子点芯片由金岛、捕捉探针、3种量子点信号探针组成；激光发射模块由紫外光激光发射器构成；显微成像系统采用高分辨率显微镜和荧光分光光度计，并配合高精度步进位移台及芯片固定支架，最终得到稳定的、完整的显微图像信息；高灵敏度电荷耦合器件(CCD)作为图像采集的核心部件，可实现高效的图像采集过程。在电金岛增强型多重量子点荧光检测系统的基础上，本发明针对循环肿瘤microRNAs和KRAS基因单/多碱基突变分别设计特异的序列识别、捕捉及量子点信号探针等体系，最终达到高灵敏度检测目的CTNAs的目的。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种金岛增强型多重量子点荧光检测系统及其在CTNAs多重检测和点突变识别中的运用，其主要包括以下步骤：
(1)总体技术路线及流程
本发明旨在于构建金岛增强型多重量子点荧光检测系统，并最终实现基于特异性序列的高灵敏度CTNAs多重检测和突变识别方法。本发明的技术路线如图1所示：
①本发明合成了金岛增强型多重量子点芯片，并以此构建荧光信号识别体系，为金岛增强型多重量子点荧光系统提供可视化荧光信号，最终实现识别多重CTNAs和点突变的目的。
②本发明开发的金岛增强型多重量子点荧光系统由金岛增强型多重量子点芯片、激光发射模块、显微成像及图像采集系统组成。金岛增强型多重量子点芯片利用巯基标记的捕获探针连接到金纳米平台(金岛)形成芯片状的捕获位点，并采用生物素标记的三种量子点在525nm、585nm和650nm处形成信号探针；激光发射模块由市售的紫外光激光发射器构成；显微成像系统采用高分辨率显微镜和荧光分光光度计，并配合高精度步进位移台及芯片固定支架，最终得到稳定的、完整的显微图像信息；高灵敏度电荷耦合器件(CCD)作为图像采集的核心部件，可实现高效的图像采集过程。
③图像采集系统采用高灵敏度电荷耦合器件(CCD)作为核心部件，可实现高效的图像采集过程。
④在金岛增强型多重量子点荧光检测系统的基础上，本发明针对循环肿瘤microRNAs和KRAS基因单/多碱基突变分别设计特异的序列识别、捕捉及量子点信号探针等体系，最终达到高灵敏度检测多重CTNAs和点突变的目的。
⑤为了进一步提升便捷性、扩宽其应用范围，本发明开发与金岛增强型多重量子点荧光检测系统配套的样品采集、提取及信号放大等一系列技术，并最终通过检测肿瘤细胞及临床血液样品中的microRNAs和临床血液样品中的KRAS基因单/多碱基突变，验证该方案的可行性、提高稳定性及可操作性，以期实现标准化多重CTNAs和点突变的检测目的。本发明的技术流程图如图2所示。
(2)金岛增强型多重量子点芯片的构建
本发明的金岛增强型多重量子点芯片利用巯基标记的捕捉探针(带有8ntDNA识别域)连接到金岛形成芯片状的捕获位点，捕获靶标后，生物素标记的三种量子点分别在525nm、585nm和650nm处形成信号探针，利用碱基堆积原理实现多重CTNAs和点突变检测，其主要包含以下步骤：
金岛合成并标记捕捉探针：
①将玻璃片浸没在HAuCl4(3mM)中，加入氢氧化铵(1ml HAuCl4中加入20μl)，快速震荡1分钟，使金离子被玻璃片上的正电荷吸收；
②用去离子水冲洗处理过的玻璃片3次，以除去未结合的游离金离子；
③取1mM NaBH4，将玻璃片浸入其中，使金离子还原为金纳米种子；
④将玻璃片用去离子水冲洗2次，放入HAuCl4和羟胺摩尔比例为1:1的溶液中振荡5分钟，然后孵育10分钟，完成金岛生长步骤；
⑤巯基标记的捕捉探针与金岛室温搅拌5小时，将捕捉探针通过Au-S键连接到金岛上，进而形成可捕获目标CTNAs的芯片位点。
多重量子点信号探针构建：
①将生物素标记的ssDNA探针和链霉亲和素标记的量子点(QDs1到QDs3，各种量子点均是1μM，能够在525nm、585nm和650nm处形成信号探针)以30:1的摩尔比混合，后在37℃下反应30分钟。
②使用Nanosep 100KΩ管状超滤膜过滤游离ssDNA探针。经过2次离心和1×PBS缓冲液洗涤，终产物用1×PBS缓冲液重新溶解，并在4℃下储存。
碱基堆积杂交模型建立
①将50nm的捕捉探针与10μL(1mg/mL)的磁珠混合30min，然后用捕捉探针捕获目标核酸，加入信号探针，在37℃下构建碱基堆积杂交模型。
(3)激光发射模块
激光发射模块由市售紫外光激光发射器构成。
(4)显微镜系统
显微镜系统采用高分辨率光学显微镜和荧光分光光度计作为该系统的主体部分，为了达到较好的成像效果，该显微镜拟配备高透、高倍物镜。该显微成像系统还需具备与图像采集系统相配套的采集窗，以便于和图像采集耦合。在高分辨率光学显微镜基础上，配合高精度步进位移台(微米级)，从而实现XY平面的成像信息，步进位移台移动速率需与图像采集系统采集频率相配合，移动一个视野的距离采集一次图像。再加上图像采集系统的可根据光强度在Z轴形成图像信息，最终得到稳定的、完整的显微图像信息。
(5)高灵敏度电荷耦合器件(CCD)
CCD作为图像采集过程中的核心部件，能够识别单光子，进而保证检测CTNAs多重检测和点突变检测的灵敏度。
(6)体外培养肿瘤细胞和肿瘤患者血液中检测microRNA
本发明采用多重量子点激发后所发射的荧光为信号给出方式，将金岛增强型多重量子点芯片作为本发明有效的检测模式，为其高灵敏度性能提供坚实的基础；其主要由以下步骤构成(图2)：
①体外培养的肿瘤细胞(HepG2,A549,MCF-7)或肿瘤患者血液经商品化总RNA提取试剂盒处理得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入标记捕捉探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟(50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟。
⑤向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟，
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号，结果如图5所示。
(7)临床肿瘤患者血液样品中的KRAS基因单/多碱基突变
①临床肿瘤患者血液经商品化总RNA提取试剂盒处理得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入标记捕捉探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟(50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟。
⑤向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟，
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号，结果如图6所示。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)信号采集灵敏度高、形象化且可定量化统计分析
本发明采用高灵敏度CCD做为量子点荧光信号的接收体系，具有灵敏度高、实验结果形象化的优点，且可对图形化的实验结果进行定量化的统计分析。
(2)样品兼容性好
本发明在构建电化学发光扫描成像识别平台的基础上，可同时针对体外培养肿瘤细胞和肿瘤患者血液等多种样品进行CTNAs多重检测和点突变检测流程，具有样品兼容性好的特点，应用范围广。
(3)操作简单快速、无需进行样品扩增
本发明检测过程简单，经过简单的样品提取过程即可进行CTNAs检测，耗时短，省去了扩增步骤，检测快速。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1.金岛增强型多重量子点荧光系统技术路线图。
图2.金岛增强型多重量子点荧光系统流程图。A.金岛增强型多重量子点荧光形成的形成过程；B.电化学发光扫描成像系统的结构。
图3.金岛增强型多重量子点荧光系统的原理验证。A.合成金岛的TEM形态；B.装载多重量子点的金岛芯片的TEM形态；C.多重量子点信号探针的粒径；D.优化数据采集时间；E-G.金岛增强型多重量子点荧光系统的多重检测性能。
图4.带有荧光分光光度计的金岛增强型多重量子点荧光系统的灵敏度和特异性。A.多重循环肿瘤microRNA的检测；B.具有3个循环肿瘤microRNA的金岛增强型多重量子点芯片的TEM形态；C.用荧光分光光度计检测多重循环肿瘤microRNA的原理；D.用荧光分光光度计检测荧光分光光度计多重循环肿瘤microRNA的敏感性；E.图3D中QDs1的线性分析；F.图3D中的QDs2的线性分析；G.图3D中QDs3的线性分析；H.具有CTNAM1和M2的金岛增强型多重量子点荧光系统的特异性；I.具有随机序列(RS1至RS3)的金岛增强型多重量子点荧光系统的特异性。
图5.检测肿瘤细胞系(HepG2，A549，MCF-7)的microRNA和肿瘤患者血液中的CTNAs。A.检测HepG2细胞系中的microRNA；B.检测A549细胞系中的microRNA；C.检测MCF-7细胞系中的microRNA；D.检测肝癌患者血液中CTNAs；E.检测肺癌患者血液中CTNAs；F.检测乳腺癌患者血液中CTNAs。
图6.单碱基突变的多重检测。A.用金岛增强型多重量子点荧光策略检测135A突变；B.用金岛增强的多重量子点荧光策略检测135C突变；C.用金岛增强型多重量子点荧光策略检测135T突变；D.用金岛增强型多重量子点荧光策略对135A、C和T进行多重检测；E.检测样品ID 1-10中的多重单碱基突变；F.检测样品ID 11-20中的多重单碱基突变；G.检测样品ID 21-30中的多重单碱基突变；H.样品ID 31-40中多重单碱基突变的检测；I.图6E-H中单个、两个和三个突变检测结果的阳性率。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1金岛增强型多重量子点荧光策略
(1)总体技术路线及流程
本发明旨在于构建金岛增强型多重量子点荧光检测系统，并最终实现基于特异性序列的高灵敏度CTNAs多重检测和突变识别方法。本发明的技术路线如图1所示：
①本发明合成了金岛增强型多重量子点芯片，并以此构建荧光信号识别体系，为金岛增强型多重量子点荧光系统提供可视化荧光信号，最终实现识别多重CTNAs和点突变的目的。
②本发明开发的金岛增强型多重量子点荧光系统由金岛增强型多重量子点芯片、激光发射模块、显微成像及图像采集系统组成：金岛增强型多重量子点芯片利用巯基标记的捕获探针连接到金纳米平台形成芯片状的捕获位点，并采用生物素标记的三种量子点在525nm、585nm和650nm处形成信号探针；激光发射模块由市售的紫外光激光发射器构成；显微成像系统采用高分辨率显微镜和荧光分光光度计，并配合高精度步进位移台及芯片固定支架，最终得到稳定的、完整的显微图像信息；高灵敏度电荷耦合器件(CCD)作为图像采集的核心部件，可实现高效的图像采集过程。
③图像采集系统采用高灵敏度电荷耦合器件(CCD)作为核心部件，可实现高效的图像采集过程。
④在金岛增强型多重量子点荧光检测系统的基础上，本发明针对循环肿瘤microRNAs和KRAS基因单/多碱基突变分别设计特异的序列识别、捕捉及量子点信号探针等体系，最终达到高灵敏度检测多重CTNAs和点突变的目的。
⑤为了进一步提升便捷性、扩宽其应用范围，本发明开发与金岛增强型多重量子点荧光检测系统配套的样品采集、提取及信号放大等一系列技术，并最终通过检测肿瘤细胞及临床血液样品中的microRNAs和临床血液样品中的KRAS基因单/多碱基突变，验证该方案的可行性、提高稳定性及可操作性，以期实现标准化多重CTNAs和点突变的检测目的。本发明的技术流程图如图2所示。
(2)金岛增强型多重量子点芯片的构建
本发明的金岛增强型多重量子点芯片利用巯基标记的捕捉探针(带有8ntDNA识别域)连接到金岛形成芯片状的捕获位点，捕获靶标后，生物素标记的三种量子点分别在525nm、585nm和650nm处形成信号探针，利用碱基堆积原理实现多重CTNAs和点突变检测，其主要包含以下步骤：
金岛合成并标记捕捉探针：
①将玻璃片浸没在HAuCl4(3mM)中，加入氢氧化铵(1ml HAuCl4中加入20μl)，快速震荡1分钟，使金离子被玻璃片上的正电荷吸收；
②用去离子水冲洗处理过的玻璃片3次，以除去未结合的游离金离子；
③取1mM NaBH4，将玻璃片浸入其中，使金离子还原为金纳米种子；
④将玻璃片用去离子水冲洗2次，放入HAuCl4和羟胺摩尔比例为1:1的溶液中振荡5分钟，然后孵育10分钟，完成金岛生长步骤；金岛的TEM形态如图3A所示，装载多重量子点的金岛芯片的TEM形态如图3B所示。
⑤巯基标记的捕捉探针与金岛室温搅拌5小时，将捕捉探针通过Au-S键连接到金岛上，进而形成可捕获目标CTNAs的芯片位点。
多重量子点信号探针构建：
①将生物素标记的ssDNA探针和链霉亲和素标记的量子点QDs1、QDs 2、QDs3，三种量子点均是1μM，以探针：量子点＝30:1的摩尔比混合，然后在37℃下反应30分钟。
②使用Nanosep 100KΩ管状超滤膜过滤游离ssDNA探针。经过2次离心和1×PBS缓冲液洗涤，终产物用1×PBS缓冲液重新溶解，并在4℃下储存。多重量子点信号探针的粒径如图3C所示。数据采集时间优化试验如图3C所示，金岛增强型多重量子点荧光系统的多重检测性能试验结果如图3E所示。
碱基堆积杂交模型建立
①将50nm的捕捉探针与10μL(1mg/mL)的磁珠混合30min，然后用捕捉探针捕获目标核酸，加入信号探针，在37℃下构建碱基堆积杂交模型。
(3)激光发射模块
激光发射模块由市售紫外光激光发射器构成。
(4)显微镜系统
显微镜系统采用高分辨率光学显微镜和荧光分光光度计作为该系统的主体部分，为了达到较好的成像效果，该显微镜拟配备高透、高倍物镜。该显微成像系统还需具备与图像采集系统相配套的采集窗，以便于和图像采集耦合。在高分辨率光学显微镜基础上，配合高精度步进位移台(微米级)，从而实现XY平面的成像信息，步进位移台移动速率需与图像采集系统采集频率相配合，移动一个视野的距离采集一次图像。再加上图像采集系统的可根据光强度在Z轴形成图像信息，最终得到稳定的、完整的显微图像信息。
(5)高灵敏度电荷耦合器件(CCD)
CCD作为图像采集过程中的核心部件，能够识别单光子，进而保证检测CTNAs多重检测和点突变检测的灵敏度。
实施例2金岛增强型多重量子点荧光系统在体外培养肿瘤细胞microRNA检测中的应用
本发明以金岛增强型多重量子点芯片为依托，其技术流程主要由以下步骤组成(图2)：
①体外培养的肿瘤细胞(HepG2,A549,MCF-7)经商品化总RNA提取试剂盒处理得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入标记捕捉探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟(50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟；
⑤向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号。其原理图如图2所示。实验结果如图5所示，当目标microRNA存在时，金岛增强型多重量子点荧光系统可得到稳定的响应信号。
本实施例体外培养肿瘤细胞microRNA及探针的序列见表1-3所示。
实施例3金岛增强型多重量子点荧光系统在肿瘤患者血液中microRNA检测中的运用
本发明以金岛增强型多重量子点芯片为依托，其技术流程主要由以下步骤组成，如图2所示：
①肿瘤患者血液经商品化总RNA提取试剂盒等步骤处理后得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入标记捕获探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟(50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟；
⑤向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号。其原理图如图2所示。实验结果如图5所示，当目标microRNA存在时，金岛增强型多重量子点荧光系统可得到稳定的响应信号。
本实施例肿瘤患者血液中microRNA及探针的序列见表1-3所示。
实施例4金岛增强型多重量子点荧光系统在临床肿瘤患者血液样品中KRAS基因单/多碱基突变检测中的运用
本发明以金岛增强型多重量子点芯片为依托，其技术流程主要由以下步骤组成，如图2所示：
①肿瘤患者血液经商品化总RNA提取试剂盒等步骤处理后得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入标记捕获探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟(50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠)，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟；
⑤向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并用最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号。其原理图如图2所示。
实验结果如图6所示，当目标单/多点突变存在时，金岛增强型多重量子点荧光系统可得到稳定的响应信号。
本发明以循环肿瘤microRNAs和KRAS基因单/多碱基突变等CTNAs为研究对象，以构建金岛增强型多重量子点芯片作为技术支撑，开发了新型的金岛增强型多重量子点荧光检测系统，实现了灵敏度高、操作简单、快速且成本低廉的CTNAs多重检测和点突变识别方法。本发明提出的基于金岛增强型多重量子点芯片的检测方法，能够为CTNAs多重检测和突变识别提供有力的技术支持，通过构建特异的CTNAs序列识别、捕捉及量子点信号探针等体系，可实现将肿瘤患者血样、体外培养肿瘤细胞中的核酸信息转化为荧光信号，为研究者提供精确、客观、系统的监测指标。
本实施例临床肿瘤患者血液样品中KRAS基因单/多碱基突变的序列见表4所示.
另外，还针对带有荧光分光光度计的金岛增强型多重量子点荧光系统的灵敏度和特异性进行了相关试验。如图4A.是多重循环肿瘤microRNA的检测结果；如图4B.是具有3个循环肿瘤microRNA的金岛增强型多重量子点芯片的TEM形态实验图；如图4C.是用荧光分光光度计检测多重循环肿瘤microRNA的原理；如图4D.用荧光分光光度计检测荧光分光光度计多重循环肿瘤microRNA的敏感性的结果；如图4E.是图3D中QDs1的线性分析试验图；如图4F.图3D中的QDs2的线性分析试验图；如图4G.图3D中QDs3的线性分析试验图；如图4H.具有CTNAM1和M2的金岛增强型多重量子点荧光系统的特异性的试验图；如图4I.具有随机序列(RS1至RS3)的金岛增强型多重量子点荧光系统的特异性试验图。随机序列和CTNAs M1、M2的序列见表5。
表1.microRNA21的序列及探针。
Figure GDA0003929053130000131
Figure GDA0003929053130000141
表2.microRNA210的序列及探针。
Figure GDA0003929053130000142
表3.microRNA214的序列及探针。
Figure GDA0003929053130000143
表4. 135突变序列及探针
Figure GDA0003929053130000151
表5.随机序列和CTNAs M1、M2的序列。
Figure GDA0003929053130000152
Figure GDA0003929053130000161
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Figure IDA0003929053150000011
Figure IDA0003929053150000021
Figure IDA0003929053150000031
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Figure IDA0003929053150000051
Figure IDA0003929053150000061
Figure IDA0003929053150000071

Claims (6)

1.一种金岛增强型多重量子点芯片的制备方法，其特征在于：
过程包括：
（1）金岛合成并标记捕捉探针：
a.将玻璃片浸没在3 mM HAuCl4中，按1 ml HAuCl4中加入20 μl氢氧化铵的比例，加入氢氧化铵，快速震荡，使金离子被玻璃片上的正电荷吸收；
b.冲洗处理过的玻璃片，以除去未结合的游离金离子；
c.取1mM NaBH4，将玻璃片浸入其中，使金离子还原为金纳米种子；
d.将玻璃片冲洗，放入HAuCl4和羟胺摩尔比例为1:1的溶液中振荡、孵育，完成金岛生长步骤；
e.巯基标记的捕捉探针与金岛室温搅拌，将捕捉探针通过Au-S键连接到金岛上，进而形成可捕获目标循环肿瘤核酸的芯片位点；
（2）多重量子点信号探针构建：
f.将生物素标记的ssDNA探针和链霉亲和素标记的量子点：QDs1、QDs 2、QDs3，三种量子点均是1μM，以探针：量子点=30:1的摩尔比混合反应，能够在525nm、585nm 和650nm处形成信号探针；
g.过滤、离心、洗涤，终产物用缓冲液重新溶解，并在4℃下储存。
2.根据权利要求1所述的金岛增强型多重量子点芯片的制备方法，其特征在于：
所述（1）金岛合成并标记捕捉探针的更详细过程是：
a.将玻璃片浸没在3 mM HAuCl4中，按1ml HAuCl4中加入20μl氢氧化铵的比例，加入氢氧化铵，快速震荡1分钟，使金离子被玻璃片上的正电荷吸收；
b.用去离子水冲洗处理过的玻璃片3次，以除去未结合的游离金离子；
c.取1mM NaBH4，将玻璃片浸入其中，使金离子还原为金纳米种子；
d.将玻璃片用去离子水冲洗2次，放入HAuCl4和羟胺摩尔比例为1:1的溶液中振荡5分钟，然后孵育10分钟，完成金岛生长步骤；
e.巯基标记的捕捉探针与金岛室温搅拌5小时，将捕捉探针通过Au-S键连接到金岛上，进而形成可捕获目标循环肿瘤核酸的芯片位点。
3.根据权利要求1所述的金岛增强型多重量子点芯片的制备方法，其特征在于：
所述步骤（2）多重量子点信号探针构建的详细过程是：
f.将生物素标记的ssDNA探针和链霉亲和素标记的量子点：QDs1、QDs 2、QDs3，三种量子点均是1μM，以探针：量子点=30:1的摩尔比混合，然后在37°C下反应30分钟，能够在525nm、585nm 和650nm处形成信号探针；
g.使用Nanosep 100KΩ管状超滤膜过滤游离ssDNA探针；经过2次离心和1×PBS缓冲液洗涤，终产物用1×PBS缓冲液重新溶解，并在4℃下储存。
4.一种如权利要求1-3任一所述制备方法得到的金岛增强型多重量子点芯片，其特征在于：
所述芯片由金岛、捕捉探针、3种量子点信号探针组成，所述3种量子点信号探针在525nm、585nm 和650nm处形成信号探针。
5.一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法，其特征在于：
过程如下：
①体外培养的肿瘤细胞HepG2, A549, MCF-7或肿瘤患者血液经商品化总RNA提取试剂盒处理得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44 .5μL超纯水中，并加入2 .5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③首先制备标记捕捉探针的金岛玻片：将玻璃片浸没在3 mM HAuCl4中，按1 ml HAuCl4中加入20 μl氢氧化铵的比例，加入氢氧化铵，快速震荡，使金离子被玻璃片上的正电荷吸收；冲洗处理过的玻璃片，以除去未结合的游离金离子；取1mM NaBH4，将玻璃片浸入其中，使金离子还原为金纳米种子；将玻璃片冲洗，放入HAuCl4和羟胺摩尔比例为1:1的溶液中振荡、孵育，完成金岛生长步骤；巯基标记的捕捉探针与金岛室温搅拌，将捕捉探针通过Au-S键连接到金岛上；
然后向步骤②所得混合物中加入标记捕捉探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟，50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟；
⑤先制备3种量子点信号探针：将生物素标记的ssDNA探针和链霉亲和素标记的量子点：QDs1、QDs 2、QDs3，三种量子点均是1μM，以探针：量子点=30:1的摩尔比混合反应，能够在525nm、585nm 和650nm处形成信号探针；过滤、离心、洗涤，终产物用缓冲液重新溶解，并在4℃下储存；
接着向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟，
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1× PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号。
6.一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的临床肿瘤患者血液样品中的KRAS基因单/多碱基突变检测方法，其特征在于：
过程如下：
①临床肿瘤患者血液经商品化总RNA提取试剂盒处理得到总RNA提取物；
②取总RNA提取物品1μL，加入44 .5μL超纯水中，并加入2 .5μL 20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③首先制备标记捕捉探针的金岛玻片：将玻璃片浸没在3 mM HAuCl4中，按1ml HAuCl4中加入20 μl氢氧化铵的比例，加入氢氧化铵，快速震荡，使金离子被玻璃片上的正电荷吸收；冲洗处理过的玻璃片，以除去未结合的游离金离子；取1mM NaBH4，将玻璃片浸入其中，使金离子还原为金纳米种子；将玻璃片冲洗，放入HAuCl4和羟胺摩尔比例为1:1的溶液中振荡、孵育，完成金岛生长步骤；巯基标记的捕捉探针与金岛室温搅拌，将捕捉探针通过Au-S键连接到金岛上；
然后向步骤②所得混合物中加入标记捕捉探针的金岛玻片，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与目标核酸充分杂交；
④向步骤③体系中加入磁珠混匀30分钟，50nM捕捉探针对应1mg/ml磁珠，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟；
⑤先制备3种量子点信号探针：将生物素标记的ssDNA探针和链霉亲和素标记的量子点：QDs1、QDs 2、QDs3，三种量子点均是1 μM，以探针：量子点=30:1的摩尔比混合反应，能够在525nm、585nm 和650nm处形成信号探针；过滤、离心、洗涤，终产物用缓冲液重新溶解，并在4℃下储存；
接着向步骤④所得产物加入3种量子点信号探针，37℃情况下孵育15分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1× PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终经紫外光激发后使用荧光分光光度计检测荧光信号。
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