CN112746012B - 单细胞操纵系统及方法、单克隆细胞系构建方法、单细胞液滴生成系统及方法 - Google Patents

单细胞操纵系统及方法、单克隆细胞系构建方法、单细胞液滴生成系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于声流体镊的单细胞操纵系统及方法、单克隆细胞系的构建方法、单细胞液滴的生成方法。包括：样品缓存装置，用于不同类型样品的固定及存储；超高频体声波谐振器，与样品缓存装置通液态介质连接，作用于样品缓存装置中的目标细胞；多自由度运动装置，与超高频体声波谐振器机械连接，控制其移动；PLC控制器，通过控制多自由度移动装置来调节超高频体声波谐振器与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率以及频率，以实现稳定的贴壁单细胞的剥离以及悬浮细胞的捕捉；以及控制多自由度移动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的单细胞的释放。

Description

单细胞操纵系统及方法、单克隆细胞系构建方法、单细胞液滴 生成系统及方法
技术领域
本发明涉及生命科学与医学领域，并且特别地，涉及一种基于声流体镊的单细胞操纵系统及方法、单克隆细胞系的构建方法、单细胞液滴的生成方法。
背景技术
生物颗粒物的微尺度操作是一项最基本的生物技术，同时也是前沿研究的基石技术。随着人类认知的不断拓展，单细胞研究不断引导人们理解细胞物理和功能的异质性，是生物医学研究和临床诊断的重要途径。精准的单细胞操纵技术单细胞操控为细胞分析提供了基础，并在后续的各种处理过程中起着举足轻重的作用。随着干细胞、肿瘤细胞的发展，基于单细胞水平的研究越来越受到重视并成为一种研究趋势。如何得到符合要求的目标的单细胞是研究的关键。
目前，能够实现单细胞操纵可以通过机械接触的方法，也可以通过外加力场的方式实现(光镊，磁镊，电泳等)。但是机械接触的方法的缺点是对操作人员的熟练度要求较高，设备复杂。光镊容易对细胞造成不可逆的伤害，从而影响后续的遗传物质的扩增。磁镊需要对细胞进行标记，这个过程也可能带来污染，电泳等方法的缺点是对操纵的介质有特殊的要求。
因此，目前亟需一种用于单细胞操纵的系统及方法。以解决或者部分解决上述技术问题，以实现有效地分离获取得到目标单细胞并进行各种形式的操纵。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于声流体镊的选择性单细胞操纵的系统及方法。以实现有效地剥离、捕捉、移动以及释放目标单细胞。
本申请提供一种基于声流体镊的选择性单细胞操纵的系统，其特征在于，包括：
样品缓存装置，用于进行样品的固定及存储；其中包括：用于将包含有单细胞的样品接种培养于所述样品缓存装置；
超高频体声波谐振器，其与样品缓存装置通过液态介质连接，用于作用于所述样品缓存装置中的样品，以对样品中的单细胞进行操纵；
多自由度移动装置，其与超高频体声波谐振器机械连接，控制其多个自由度移动；
PLC控制器，用于通过控制多自由度移动装置调节超高频体声波谐振器与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，以实现贴壁单细胞剥离以及悬浮单细胞捕捉；以及控制多自由度运动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的单细胞的释放。
由上，本申请通过超高频体声波谐振器产生的声波作用于所述样品缓存装置中的样品，可以在液态环境下产生涡旋，从而使得样品中的单细胞被捕捉，并且，当样品中存在贴壁细胞，可以通过声波作用产生的旋涡使得所述贴壁细胞剥离，并进一步地通过控制超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面的距离，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率(具体地，对于捕捉不同类型以及生长条件的细胞会进行不同功率的调整)以控制涡旋的作用范围，以捕捉贴壁生长的细胞；以及当捕捉至指定数目的单细胞时，通过控制高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面的距离以及施加于超高频体声波谐振器的功率，以控制作用于被捕捉的单细胞的涡旋强度，以使得剥离的单细胞稳定捕捉并移动。
优选地，所述PLC控制器，还用于：通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的时间以捕捉不同状态的单细胞；当细胞数量累积至目标数量时，通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率及施加功率的时间使得捕捉后的细胞聚集以进行细胞团聚物的组装；以及当确认该细胞团聚物组装成功之后，通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制组装后的细胞团聚物的释放。
由上，有利于实现将捕捉的单细胞组装成细胞团聚物。
优选地，所述PLC控制器具体用于：
在实现贴壁单细胞剥离时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-2000mW；以及控制所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离的范围是0-5mm；
在实现悬浮细胞捕捉及移动时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-1000mW，控制所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离的范围是3-5mm；
在实现细胞团聚物的组装时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-500mw；其中，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率至少保持1分钟不变。
由上，有利于分别实现单细胞稳定的剥离，以及剥离的单细胞的稳定捕捉及稳定移动，以及细胞团聚物的组装。
优选地，所述超高频体声波谐振器，包括：
至少一个体声波产生部件，包括由下往上依次设置的底电极、压电层及顶电极；
与体声波产生部件的一面接触设置的声波反射部；
所述底电极、压电层、顶电极及声波反射部相重叠区域构成体声波产生区域；
用于支撑所述体声波产生部件的底衬层；
其中，所述样品缓存装置中的液体覆盖了至少一个体声波产生区域的声波作用区域。
由上，上述声波作用区域的边缘会产生声流体涡旋，而涡旋的速度梯度会产生一个势能阱，使得细胞从壁面剥离并被捕捉。这些涡旋由超高频体声波谐振器激发并随其移动，使得被捕捉的细胞随着声波作用区域产生的涡旋而移动。
优选地，所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面平行设置；或者所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面夹角小于60°设置。
优选地，PLC控制器还用于：PLC控制器还用于：在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离每提高100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率降低[0-1/3]倍；以及
在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离每降低100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率提高[0-1/3]倍。
由上，有利于实现对剥离的单细胞的剥离。
优选地，所述多自由度移动系统在单一平移自由度的速度范围为0-10mm/s,在单一旋转自由度地角速度范围为0-0.5π/s。
基于前述系统，本申请还提供一种单细胞操控方法，包括：
A、将缓冲液注入培养有目标单细胞的样品缓存装置，并控制超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离；
B、通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于目标单细胞上方的液体，以使所述液体产生涡旋，以使得目标单细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离；
其中，通过控制施加于超高频体声波谐振器的不同的功率，以及超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离，以剥离不同类型及生长条件的目标单细胞以及剥离不同数量的目标单细胞；
C、通过将施加于超高频体声波谐振器的功率减小以及扩大超高频体声波谐振器与样品缓存装置壁面的距离，以控制作用于被捕捉的目标单细胞的涡旋强度，以使得被剥离的目标单细胞被涡旋稳定捕捉，进而对剥离后的捕捉的目标单细胞进行移动。
由上，有利于实现对单细胞的操控。
优选地，步骤C之后，还包括：
D、将目标单细胞移动至指定位置，关闭施加于超高频体声波谐振器的功率释放所述目标单细胞，以使所述目标单细胞在重力作用下落在其下方位置；
或者所述步骤C之后，包括：
E、当捕捉至目标数目的目标单细胞时，所述PCL控制器通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率不变进行组装，时间大于等于1分钟；
F、当确认目标细胞团聚物成功组装后，停止对超高频体声波谐振器施加功率，进行细胞团聚物的释放。
由上，所述步骤D有利于根据需要实现对细胞的位置的重新布置，对不同种类及数量的细胞进行位置的重新设定后，重新布置的细胞所呈现出不同的功能几何图案的示意图。所述步骤E、F有利于进行细胞团聚物的组装和释放。
基于前述系统，本申请还提供一种单克隆细胞系的构建方法，包括步骤：
S1、将转染后的单细胞注入样品缓存装置；
S2、将所述样品缓存装置中的单细胞剥离，并捕捉移动到相应的孔板中；
S3、将所述孔板中的单细胞进行相应的遗传筛选以确保目标单细胞可以在孔板中进行单克隆分裂；
S4、将单克隆分裂后的生成的细胞团簇重新进行单细胞剥离以及分选；
S5、重复执行S2-S5过程以确保生成稳定的单克隆细胞系。
由上，有利于构建并生成稳定的单克隆细胞。
基于前述系统，本申请还提供一种单细胞液滴的生成系统，包括：
样品缓存装置，用于进行样品的固定及存储；其中包括：用于将包含有单细胞的样品接种培养于所述样品缓存装置；
超高频体声波谐振器，其与样品缓存装置通过液态介质连接，用于作用于所述样品缓存装置中的样品，以对样品中的单细胞进行操纵；其中，在超高频体声波谐振器周围构建围绕所述超高频体声波谐振器的凸起；
多自由度移动装置，其与超高频体声波谐振器机械连接，控制其多个自由度移动；
PLC控制器，用于通过控制多自由度移动装置调节超高频体声波谐振器与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，以实现贴壁单细胞剥离以及悬浮单细胞捕捉；以及控制多自由度运动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的单细胞的释放。
一种单细胞液滴的生成方法，基于前述单细胞液滴的生成系统，其特征在于，包括步骤：
A、通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于其下方的样品缓存装置中的液体中的目标单细胞上方的液体，以使所述液体产生涡旋，以使得所述液体中的目标单细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离并捕捉所述目标单细胞；
B、减小施加于超高频体声波谐振器的功率并将超高频体声波谐振器的移出液体环境置于另一种液相上方；其中，在移动过程中，在由于液体表面张力的作用下，在所述超高频体声波谐振器周围构建的围绕所述超高频体声波谐振器的凸起中保留一部分液体环境，所述目标单细胞留存于此凸起中保留的液体环境中并由于重力作用沉积在该凸起中保留的液体环境的底部的中心；
C、将该凸起中保留的液体环境与所述另一种液相相接触的同时快速施加于超高频体声波谐振器的功率，以使沉积在该凸起中保留的液体环境的底部的中心的目标单细胞在由于超高频体声波谐振器产生的声波的声学推力以及表面张力的共同作用下进入到所述另一种液相中，形成包裹有所述目标单细胞的液滴。
综上所述，本申请有利于根据需要进行细胞的剥离和目标单细胞的捕捉，且在对捕捉的细胞进行分离时可以根据需要对捕捉的单细胞进行释放。
附图说明
图1为本申请提供的单细胞操纵的系统原理图；
图2为本申请提供的单细胞操纵的流程示意图；
图3为本申请提供的单细胞操纵中二维移动示意图；
图4为本申请提供的单细胞空间捕捉以及三维移动示意图；
图5为本申请提供的不同数目的单细组装为细胞团聚物的组装结果示意图；
图6为本申请提供的不同种类及数量的细胞进行位置的重新设定后，重新布置的细胞所呈现出不同的功能几何图案的示意图；
图7为本申请提供的细胞剥离以及单细胞剥离的具体实施图；
图8为本申请提供的构建单克隆细胞系示意图；
图9为本申请提供的生成单细胞液滴示意图；
图10为本申请提供的超高频体声波谐振器的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的区间。
实施例一
如图1所示，本申请提供一种基于声流体镊的选择性单细胞操纵系统，包括：
样品缓存装置101，用于进行样品的固定及存储；其中包括：用于将包含有单细胞的样品接种培养于所述样品缓存装置；
超高频体声波谐振器102，其与样品缓存装置通过液态介质连接，用于作用于所述样品缓存装置中的样品，以对样品中的单细胞进行操纵；其中，超高频体声波谐振器102产生的频率为GHZ。
多自由度移动装置103，其与超高频体声波谐振器机械连接，控制其多个自由度移动；
PLC控制器104，用于通过控制多自由度移动装置103调节超高频体声波谐振器102与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，以实现贴壁单细胞剥离以及悬浮单细胞捕捉；以及控制多自由度运动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的细胞的释放。
其中，PLC控制器104控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，具体为：可以通过控制与所述PLC控制器104连接的信号发生器105，信号发生器105通过信号放大器106与超高频体声波谐振器102连接，从而控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率。
其中，所述PLC控制器，还用于：通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的时间以捕捉不同状态的单细胞；当细胞数量累积至目标数量时，通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率及施加功率的时间使得捕捉后的细胞聚集以进行细胞团聚物的组装；以及当确认该细胞团聚物组装成功之后，通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制组装后的细胞团聚物的释放。
所述PLC控制器具体用于：在实现贴壁单细胞剥离时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-2000mW；以及控制所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离的范围是0-5mm；
在实现悬浮细胞捕捉及移动时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-1000mW；
在实现细胞团聚物的组装时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-500mW；其中，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率保持至少1分钟不变。
所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面平行设置；或者所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面夹角小于60°设置。
其中，PLC控制器还用于：在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离每提高100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率降低[0-1/3]倍；其中，不同类型及生长条件的细胞剥离条件不同。
其中，所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面平行设置；或者所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面夹角小于60°设置。
其中，PLC控制器还用于：在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离每提高100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率降低[0-1/3]倍；以及
在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离每降低100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率提高[0-1/3]倍。
其中，PLC控制器还用于，在实现剥离后单细胞被捕捉时，控制所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离的范围提升至3-5mm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率降低至200mW。
所述多自由度移动系统在单一平移自由度的速度范围为0-10mm/s,在单一旋转自由度地角速度范围为0-0.5π/s。所述单细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动，作为案例，我们使用的三维平移位移台，但是其他可用于多自由度运动的方式，例如六轴位移台，机械手等手段都应该在本专利的保护之内。
其中，所述超高频体声波谐振器，包括：
至少一个体声波产生部件，包括由下往上依次设置的底电极层、压电层及顶电极层；
与体声波产生部件的一面接触设置的声波反射部；
所述底电极层、压电层、顶电极层及声波反射部相重叠区域构成体声波产生区域；
用于支撑所述体声波产生部件的底衬层。
具体地，如图10所示，底衬层21，设置于所述底衬层21上的声波反射层22；其中，本实施例的所述声波反射层为声阻抗层。所述声阻抗层包括：低声阻抗层221和高声阻抗层222。其中，所述低声阻抗层和所述高声阻抗层相间叠加设置。一层所述低声阻抗层和一层所述高声阻抗层为一组，该组数设置为大于或等于三。高声阻抗层221和低声阻抗层222则可以由声阻抗不同的硅、二氧化硅、氮化铝、钼等金属、派瑞林等材料搭配组成。设置于所述声波反射层22上的底电极层23；底电极层23可由金、铝、钼、铁、钛、铜等金属及合金等材料组成。所述底电极层的厚度为800A，此处的厚度单位A的中文名称为埃，其含义为1A等于十分之一纳米。设置于所述底电极层23上的压电层24；压电层24可以由氮化铝、氧化锌、锆钛酸铅、铌酸锂等压电材料构成。所述压电层厚度为100A-100000A，此处的厚度单位A的中文名称为埃，其含义为1A等于十分之一纳米。设置于所述压电层上的顶电极层25。顶电极层23可由金、铝、钼、铁、钛、铜等金属及合金等材料组成。所述顶电极的厚度为2000A，此处的厚度单位A的中文名称为埃，其含义为1A等于十分之一纳米。至少一个流道结构26；所述流道结构的流道腔体261覆盖接触设置在所述声波反射层22、底电极层23、压电层24、顶电极层25彼此叠加形成的体声波产生区域之上。
实施例二
本申请还提供一种基于声流体镊的选择性单细胞操控方法，基于实施例的单细胞操纵的系统，包括步骤：
S201，将缓冲液注入培养有细胞的样品缓存装置，以使目标细胞有适合操纵的液态环境；并控制超高频体声波谐振器与细胞的距离约0-5mm(对应图2中的a)；可选的，为0-2mm。
S202，通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于目标细胞上方的液体，以使所述液体产生涡旋，以使得目标细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离(对应图2中的b)。
其中，通过控制施加于超高频体声波谐振器的不同的功率，以及超高频体声波谐振器与细胞的距离，以剥离不同类型及生长条件的细胞(对应图2中的c)。
S203，通过将施加于超高频体声波谐振器的功率减小以及扩大高频体声波谐振器与样品缓存装置壁面的距离，以控制作用于被捕捉的单细胞的涡旋强度，以使得被剥离的单细胞被涡旋捕捉(对应图2中的d)，进而对剥离后的单细胞进行移动(对应图2中的e)。
S204，将细胞移动至指定位置，关闭施加于超高频体声波谐振器的功率以释放细胞，此时细胞在指定位置的基质中位置保持不变(对应图2中的f)。
依次重复S201-S204过程，如图6所示，可以将不同种类及数量的细胞进行位置的重新设定，重新布置的细胞可以呈现出不同的功能几何图案(例如图6中的TJU)。
实施例三
本申请还提供一种细胞团聚物组装方法，该方法也基于声流体镊的选择性单细胞操控，基于实施例的单细胞操纵的系统，包括步骤：
S301，将缓冲液注入培养有目标单细胞的样品缓存装置，并控制超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离；超高频体声波谐振器与目标单细胞的范围是0-5mm；可选的范围是0-2mm。
S302，通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于目标单细胞上方的液体，以使所述液体产生涡旋，以使得目标单细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离；
其中，通过控制施加于超高频体声波谐振器的不同的功率，以及超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离，以剥离不同类型及生长条件的目标单细胞以及剥离不同数量的目标单细胞；
S303，通过将施加于超高频体声波谐振器的功率减小以及扩大超高频体声波谐振器与样品缓存装置壁面的距离，以控制作用于被捕捉的目标单细胞的涡旋强度，以使得被剥离的目标单细胞被涡旋稳定捕捉，进而对剥离后的捕捉的目标单细胞进行移动。为了捕捉不同数量的细胞，超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面的距离的范围相应扩大。
S304，当捕捉至目标数目的目标单细胞时，为了增加不同数量细胞的团聚状态，施加于超高频体声波谐振器的功率范围适当减少，功率范围10-500mw。以及所述PCL控制器通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率不变进行组装，时间大于等于1分钟。
S305，当确认目标细胞团聚物成功组装后，停止对超高频体声波谐振器施加功率，进行细胞团聚物的释放。例如通过观察手段(荧光显微镜105等)确认目标细胞团聚物是否成功组装，当确认组装成功之后，停止对超高频体声波谐振器施加功率，可以进行细胞团聚物的释放。如图5所示，为不同数目单细胞的细胞团聚物的组装结果示意图。
实施例四
本申请还提供一种用于单克隆细胞系构建的方法，基于实施例的单细胞操纵的系统，包括步骤：
S401，将转染后的单细胞注入样品缓存装置，此装置推荐使用带有微孔阵列的细胞培养皿，注入细胞后保证每个微孔中存在且至多存在一个单细胞；
S402，利用实施例一中的单细胞操控系统以及实施例二中的单细胞操控方法，将所述样品缓存装置中的单细胞剥离，并捕捉移动到相应的孔板中；
S403，进行相应的遗传筛选以确保目标单细胞可以在孔板中进行单克隆分裂；其中，所述遗传筛选可以通过例如显微镜目检，抗生素筛选等方法进行。
S404，将克隆后的细胞团簇重新进行单细胞剥离以及分选；
S405，重复S402-S404过程以确保生成稳定的单克隆细胞系，使得每个得到的单细胞都具有转染后的特征的表达。一般需要重复20次以上，可以获取得到稳定的单克隆细胞系。
实施例五
本申请还提供一种单细胞液滴的生成系统，基于实施例一所述的系统，包括：
样品缓存装置，用于进行样品的固定及存储；其中包括：用于将包含有单细胞的样品接种培养于所述样品缓存装置；
超高频体声波谐振器，其与样品缓存装置通过液态介质连接，用于作用于所述样品缓存装置中的样品，以对样品中的单细胞进行操纵；其中，本实施例中构建围绕所述超高频体声波谐振器的凸起(如图9所示的901)，其中，所述凸起可以直接围绕所述超高频体声波谐振器构建，也可以构建在所述超高频体声波谐振器所在的芯片上并围绕所述所述超高频体声波谐振器设置；
多自由度移动装置，其与超高频体声波谐振器机械连接，控制其多个自由度移动；
PLC控制器，用于通过控制多自由度移动装置调节超高频体声波谐振器与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，以实现贴壁单细胞剥离以及悬浮细胞捕捉；以及控制多自由度运动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的单细胞的释放。
实施例六
本申请还提供一种单细胞液滴的生成方法，基于实施例四的单细胞液滴的生成系统，包括步骤：
S501，通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于其下方的样品缓存装置中的含有目标单细胞的液体，以使所述液体产生涡旋，以使得所述液体中的目标单细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离并捕捉所述目标单细胞。
S502，减小施加于超高频体声波谐振器的功率并将超高频体声波谐振器的移出液体环境置于另一种液相(一般为油相)上方；其中，在移动过程中，在由于液体表面张力的作用下，在所述超高频体声波谐振器周围构建的围绕所述超高频体声波谐振器的凸起中保留一部分液体环境，所述目标单细胞留存于此凸起中保留的液体环境中并由于重力作用沉积在该凸起中保留的液体环境的底部的中心。
S503，将该凸起中保留的液体环境与所述另一种液相(一般为油相)相接触的同时快速施加于超高频体声波谐振器的功率，以使沉积在该凸起中保留的液体环境的底部的中心的目标单细胞在由于超高频体声波谐振器产生的声波的声学推力以及表面张力的共同作用下进入到所述另一种液相中，形成包裹有所述目标单细胞的液滴(如图9所示)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种基于声流体镊的单细胞操纵系统，其特征在于，包括：
样品缓存装置，用于进行样品的固定及存储；
超高频体声波谐振器，其与样品缓存装置通过液态介质连接，用于作用于所述样品缓存装置中的样品，以对样品中的单细胞进行操纵；其中，超高频体声波谐振器产生的频率为GHZ；所述超高频体声波谐振器，包括：至少一个体声波产生部件，包括由下往上依次设置的底电极、压电层及顶电极；与体声波产生部件的一面接触设置的声波反射部；所述底电极、压电层、顶电极及声波反射部相重叠区域构成体声波产生区域；用于支撑所述体声波产生部件的底衬层；其中，所述样品缓存装置中的液体覆盖了至少一个体声波产生区域的声波作用区域；
多自由度移动装置，其与超高频体声波谐振器机械连接，控制所述超高频体声波谐振器多个自由度移动；
PLC控制器，用于通过控制多自由度移动装置调节超高频体声波谐振器与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，以实现贴壁单细胞剥离以及悬浮单细胞捕捉；以及控制多自由度运动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的细胞的释放。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述PLC控制器，还用于：通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的时间以捕捉不同状态的单细胞；当细胞数量累积至目标数量时，通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率及施加功率的时间使得捕捉后的细胞聚集以进行细胞团聚物的组装；以及当确认该细胞团聚物组装成功之后，通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制组装后的细胞团聚物的释放。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述PLC控制器具体用于：
在实现贴壁单细胞剥离时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-2000mW；以及控制所述超高频体声波谐振器与目标单细胞的范围是0-5mm；
在实现悬浮细胞捕捉及移动时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-1000mW，控制所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离的范围是3-5mm；
在实现细胞团聚物的组装时，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率范围是10-500mw；其中，控制施加于所述超高频体声波谐振器的功率至少保持1分钟不变。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面平行设置；或者所述超高频体声波谐振器与样品缓存装置底部壁面夹角小于60°设置。
5.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，PLC控制器还用于：在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离每提高100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率降低[0-1/3]倍；以及
在实现细胞的剥离时，当所述超高频体声波谐振器与所述样品缓存装置底部壁面的距离每降低100μm，控制施加于超高频体声波谐振器的功率比当前功率提高[0-1/3]倍。
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述多自由度移动装置在单一平移自由度的速度范围为0-10mm/s,在单一旋转自由度地角速度范围为0-0.5π/s。
7.一种使用权利要求1-6任一所述基于声流体镊的单细胞操纵系统的单细胞操控方法，其特征在于，包括：
A、将缓冲液注入培养有目标单细胞的样品缓存装置，并控制超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离；
B、通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于目标单细胞上方的液体，以使所述液体产生涡旋，以使得目标单细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离；其中，使超高频体声波谐振器产生的频率为GHZ；
其中，通过控制施加于超高频体声波谐振器的不同的功率，以及超高频体声波谐振器与目标单细胞的距离，以剥离不同类型及生长条件的目标单细胞以及剥离不同数量的目标单细胞；
C、通过将施加于超高频体声波谐振器的功率减小以及扩大超高频体声波谐振器与样品缓存装置壁面的距离，以控制作用于被捕捉的目标单细胞的涡旋强度，以使得被剥离的目标单细胞被涡旋稳定捕捉，进而对剥离后的捕捉的目标单细胞进行移动。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤C之后，还包括：
D、将目标单细胞移动至指定位置，关闭施加于超高频体声波谐振器的功率释放所述目标单细胞，以使所述目标单细胞在重力作用下落在其下方位置；
或者，所述步骤C之后，包括：
E、当捕捉至目标数目的目标单细胞时，所述PLC控制器通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率在指定时间内不变进行组装；
F、当确认目标细胞团聚物成功组装后，停止对超高频体声波谐振器施加功率，进行细胞团聚物的释放。
9.一种单克隆细胞系构建方法，其特征在于，包括步骤：
S1、将转染后的单细胞注入样品缓存装置；
S2、使用权利要求7或8所述的方法，将所述样品缓存装置中的单细胞剥离，并捕捉移动到相应的孔板中；
S3、将所述孔板中的单细胞进行相应的遗传筛选以确保目标单细胞可以在孔板中进行单克隆分裂；
S4、将单克隆分裂后的生成的细胞团簇重新进行单细胞剥离以及分选；
S5、重复执行S2-S5过程直到每个得到的单细胞都具有转染后的特征的表达以确保生成稳定的单克隆细胞系。
10.一种单细胞液滴生成系统，其特征在于，包括：
样品缓存装置，用于进行样品的固定及存储；
超高频体声波谐振器，其与样品缓存装置通过液态介质连接，用于作用于所述样品缓存装置中的样品，以对样品中的单细胞进行操纵；其中，在超高频体声波谐振器周围构建围绕所述超高频体声波谐振器的凸起；超高频体声波谐振器产生的频率为GHZ；所述超高频体声波谐振器，包括：至少一个体声波产生部件，包括由下往上依次设置的底电极、压电层及顶电极；与体声波产生部件的一面接触设置的声波反射部；所述底电极、压电层、顶电极及声波反射部相重叠区域构成体声波产生区域；用于支撑所述体声波产生部件的底衬层；其中，所述样品缓存装置中的液体覆盖了至少一个体声波产生区域的声波作用区域；
多自由度移动装置，其与超高频体声波谐振器机械连接，控制所述超高频体声波谐振器多个自由度移动；
PLC控制器，用于通过控制多自由度移动装置调节超高频体声波谐振器与细胞的空间位置，以及控制施加于超高频体声波谐振器的功率和频率，以实现贴壁单细胞剥离以及悬浮单细胞捕捉；以及控制多自由度运动装置实现细胞随超高频体声波谐振器的移动而移动；以及通过控制施加于超高频体声波谐振器的功率的开关，以控制被捕捉的单细胞的释放。
11.一种使用权利要求10所述的单细胞液滴生成系统的单细胞液滴生成方法，其特征在于，包括步骤：
A、通过超高频体声波谐振器的声波作用区域作用于其下方的样品缓存装置中的液体中的目标单细胞上方的液体，使超高频体声波谐振器产生的频率为GHZ，以使所述液体产生涡旋，以使得所述液体中的目标单细胞在所述涡旋的作用下从样品缓存装置壁面剥离并捕捉所述目标单细胞，并使所述目标单细胞进入所述超高频体声波谐振器周围构建的围绕所述超高频体声波谐振器的凸起中；
B、减小施加于超高频体声波谐振器的功率并将超高频体声波谐振器的移出液体环境置于另一种液相上方；其中，在移动过程中，在由于液体表面张力的作用下，在所述超高频体声波谐振器周围构建的围绕所述超高频体声波谐振器的凸起中保留一部分液体环境，所述目标单细胞留存于此凸起中保留的液体环境中并由于重力作用沉积在该凸起中保留的液体环境的底部的中心；
C、将该凸起中保留的液体环境与所述另一种液相相接触的同时快速施加于超高频体声波谐振器的功率，以使沉积在该凸起中保留的液体环境的底部的中心的目标单细胞在由于超高频体声波谐振器产生的声波的声学推力以及表面张力的共同作用下进入到所述另一种液相中，形成包裹有所述目标单细胞的液滴。
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