CN115198376A - 微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法，在金属镀膜玻璃片上，覆盖一层微孔膜；所述微孔膜为生物兼容性薄膜，采用微纳加工工艺覆盖在金属镀膜玻璃片上；单个细胞由于微孔阵列芯片材料的疏水特性形成了单细胞微液滴，在微孔内固定，实现单细胞捕获，便于进行后续的单细胞分选。大大增加了液体单细胞拉曼光谱的稳定性和信噪比，为单细胞液体拉曼识别分选奠定基础。

Description

微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法
技术领域
本发明专利涉及材料、光学和生物医学工程等新兴交叉类技术领域，尤其是微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法。
背景技术
细胞是生物有机体的基本单位。随着生命科学的深入研究，科学家发现基于单细胞的科学研究能够全面解读细胞异质性，从更深层次透析生命的本质和规律，为研究生命起源，疾病的演变与治疗，提供科学依据。因此，单细胞分选技术是单细胞研究的前提条件。单细胞分选技术包括荧光激活细胞分选(FACS)，磁激活细胞分选(MACS)，激光捕获显微切割(LCM)，激光诱导向前转移(LIFT)，光镊，人工显微和微流控。
在FACS或MACS中，细胞用荧光激活的抗原或蛋白质标记。然后，基于从细胞获得的散射和荧光信号，分别通过流体力或磁力进行分类。但是，这些方法不能从少量细胞群中分离出单个细胞，不能用于获得缺少已知抗原的单个细胞或贴壁细胞。
在LCM中，采用高功率激光切割介质薄层来获取目标细胞，而高功率激光对细胞的损伤是致命的。光镊利用光阱力捕获悬浮液中的单细胞，单细胞捕获效率低，分选获取的通量低。人工显微是实验员在显微镜下通过高精度器具从细胞群体中挑选细胞的技术，通量低，操作难度大，自动化程度低。微流控技术是基于特定种群细胞的尺寸、形状、介电常数、蛋白表型等特征，设计精密微纳结构，进行同种群细胞批量分选；样品用量小，自动化程度高，试剂成本低，应用广泛,但其要求细胞必须是悬浮在微流体中，细胞的浓度很难控制，很难精准进行单细胞筛分，而且过量细胞常导致微通道阻塞。
激光诱导前向转移(Laser Induced Forward Transfer,LIFT)利用激光与物质的相互作用，可直接通过显微成像精准定位到目标物，通过脉冲激光照射牺牲层瞬间弹射分选下来。利用LIFT进行单细胞分选时，激光经由物镜作用传统金属镀膜芯片产生驱动力，使上样在金属镀膜表面的样品被弹射到接收衬底上。这种分选技术满足较低样品上样量，有利于稀有样本中目标细胞的采集；在满足常规尺寸细胞分选的同时，对较小的微生物细胞(1-5um)或不规则形状的细胞进行精准分选具有显著优势。
单细胞分选技术研究是当前国内外生物学研究热点。基于激光诱导前向转移(Laser Induced Forward Transfer,LIFT)原理的单细胞分选技术，能够在显微条件下，精准分选指定的单细胞用于基因分析，在生物、医学、食品等领域研究中应用广泛。
然而，LIFT技术存在一定局限性，在LIFT分选过程中无法在液体中实现单细胞捕获，一次可能分选多个细胞，并且激光作用牺牲层产生高温的蒸汽，生成的热量被牺牲层附近的细胞吸收，导致细胞损伤、死亡，这使得单细胞活体分选成功率大大降低，失去较大科研价值。
目前，尚无一种在液体中有效实现单细胞捕获和降低分选损伤的可视化精准单细胞活体分选方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法，实现单细胞捕获，解决在分选过程中对细胞活性的损伤，实现活体液体的有效单细胞分选，为在液体下测单细胞拉曼提供了契机。
为解决上述技术问题，本发明提供微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法，其中：
微孔阵列芯片，包括：
在金属镀膜玻璃片上，覆盖一层微孔膜；
进一步的，所述微孔膜为生物兼容性薄膜，采用微纳加工工艺覆盖在金属镀膜玻璃片上；
单个细胞由于微孔阵列芯片材料的疏水特性形成了单细胞微液滴，在微孔内固定，实现单细胞捕获，便于进行后续的单细胞分选。
作为一种举例说明，所述金属镀膜玻璃片是指：通过磁控溅射方式将纳米级金属薄膜涂覆在玻璃片上。
作为一种举例说明，所述微纳加工工艺包括三种方法：
方法一：
①使用聚对二甲苯(Parylene)沉积仪器将所需厚度的聚对二甲苯C层沉积到金属镀膜玻璃片上；
②在聚对二甲苯C层上旋涂光刻胶，通过光刻图案方法在金属镀膜玻璃上制备所需微孔的孔径、形状、密度，形成密排微孔阵列；
③对显影后漏出的聚对二甲苯C层进行反应离子蚀刻(RIE)，直到暴露出金属层；
④通过将制备的微孔阵列芯片浸泡在丙酮中，将光刻胶从分选芯片上洗掉，得到微孔阵列芯片。
作为一种举例说明，所述光刻胶用作Parylene的刻蚀模版，最后会被完全洗掉；
作为一种举例说明，所述密排微孔阵列中每个微孔均是：大小相等、形状相同、间距相等；
作为一种举例说明，所述微孔的形状为：等六边形、圆形或其他形状；
方法二：
①使用光刻和深反应离子刻蚀(DRIE)制作Si负型母版；
②使用PDMS翻模得到带有密排微柱结构的微流芯片模具，将其与玻璃片键合后通过注入成膜材料(PDMS,紫外固化材料等)进行固化，固化后去掉模具得到微孔阵列芯片；
③通过等离子体作用将其与金属镀膜玻璃片结合得到微型扩散室。
方法三：
金属镀膜玻璃片上旋涂光刻胶，通过光刻图案化显影得到微型扩散室；
微型扩散室孔径在20um-80um时便于使每个扩散微室装载单个细胞，则所得培养物是单特异性的；微型扩散室厚度在3um-15um时便于微生物生长后进行分离成纯培养物。
基于微孔阵列芯片的激光诱导向前转移的单细胞分选方法，包括：
步骤一、LIFT分选装置的结构设计：
LIFT分选装置包括：单细胞分选模块，白光(或荧光)成像模块，芯片固定装置和接收装置；
作为一种举例说明，所述单细胞分选模块包括：532nm脉冲激光器、半波片、偏振分束器、第一扩束镜、第二扩束镜、第一反射镜、第二反射镜和第一显微镜物镜；
作为一种举例说明，所述532nm脉冲激光器的持续时间为5ns；
作为一种举例说明，所述白光成像模块包括：第二显微镜物镜、第三反射镜、凸透镜、分束器、多通道滤光片、LED和相机；
作为一种举例说明，所述芯片固定装置为3D运动平台；
作为一种举例说明，所述接收装置为接收皿，放置在微孔阵列芯片下方的机械加工槽中通过电控移动；
步骤二、通过LIFT分选装置结合微孔阵列芯片，进行单细胞活体分选：
首先，将所述LIFT分选装置和微孔阵列芯片暴露在紫外线下至少30分钟，以消除其他细菌污染；
其次，微孔阵列芯片在O2等离子体作用下进行亲水处理；再将2-3ul细胞悬液滴加在微孔阵列芯片上进行单细胞捕获，时间约为10s；
然后，把微孔阵列芯片放置在3D运动平台；
最后，所有分选和收集过程都通过CCD相机进行观察和记录，CCD相机连接到计算机；上述该分选操作一键控制，将目标细胞分选到接收装置中。
与现有技术金属镀层芯片点样分选相比，微孔阵列芯片克服了液体表面张力的影响，使细胞分散成单细胞微液滴，实现了单细胞的固定，并具有稳定高效的单细胞捕获效率；
进一步的，与在传统金属镀层芯片点样分选相比，所述通孔膜表面无液层阻碍分选，大大克服了液体表面张力对单细胞分选的束缚；
作为一种举例说明，通过模拟芯片牺牲层光热转化过程，探究分选温度对单细胞活性的影响，结果证实，与传统的LIFT分选方法相比，新型分选方法极大地降低了分选热损伤；因此通孔膜结合LIFT单细胞分选技术可实现精准的液体活体单细胞分选。
本发明的有益效果：
在传统拉曼信号增强的芯片上，液体中的细胞无法固定，使得获取稳定的信噪比高的单细胞拉曼光谱成了难题。通过利用通孔膜与金属镀层芯片结合的方式，实现了单细胞的固定，大大增加了液体单细胞拉曼光谱的稳定性和信噪比，为单细胞液体拉曼识别分选奠定基础。
经微孔结构捕获的单细胞分选原理结合了流体动力学和表面润湿性，因此不同于传统金属镀膜芯片上利用LIFT技术的精准稳定单细胞分选方法。在传统的分选芯片上，细胞存在横向迁移导致无法精准分选，或分选过程存在射流使多个细胞一起被分选。微孔阵列芯片与传统的分选芯片不同，单个细胞由于芯片材料的疏水特性形成了单细胞微液滴，在微孔内固定，实现单细胞捕获，便于进行后续的单细胞分选和培养。因此，这就是采用微孔阵列结合LIFT的分选方法进行单细胞捕获和单细胞分选的重要因素。
本发明不仅实现单细胞活体液体分选和培养，而且为在液体中获取稳定的单细胞拉曼光谱信号提供帮助。在传统芯片上，液体中的细胞无法固定，使得获取稳定的信噪比高的单细胞拉曼光谱成了难题。利用微孔阵列芯片提供的单细胞固定和单细胞捕获方式，将大大增加了液体中采集单细胞拉曼光谱信号的稳定性，降低液体扰动的信号干扰，为单细胞液体拉曼识别分选奠定基础。
附图说明
图1是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之活体液体单细胞弹射分选光路图。
图2是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之微孔阵列芯片结构示意图。
图3是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之分选温度对单细胞活性影响的仿真分析图。
图4是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之分选前的细胞上样示意图。
图5是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之细胞捕获示意图。
图6是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之单细胞识别分选过程图。
图7是本发明微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法之单细胞分选接收图，直接用于培养。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明。
参照图1至图7所示，微孔阵列芯片及其激光诱导向前转移的单细胞分选方法，其中：
微孔阵列芯片，包括：
在金属镀膜玻璃片上，覆盖一层微孔膜；
进一步的，所述微孔膜为生物兼容性薄膜，采用微纳加工工艺覆盖在金属镀膜玻璃片上；单个细胞由于微孔阵列芯片材料的疏水特性形成了单细胞微液滴，在微孔内固定，实现单细胞捕获，便于进行后续的单细胞分选。
作为一种举例说明，所述金属镀膜玻璃片是指：通过磁控溅射方式将纳米级金属薄膜涂覆在玻璃片上。
作为一种举例说明，所述微纳加工工艺包括三种方法：
方法一：
①使用聚对二甲苯(Parylene)沉积仪器将所需厚度的聚对二甲苯C层沉积到金属镀膜玻璃片上；
②在聚对二甲苯C层上旋涂光刻胶，通过光刻图案方法在金属镀膜玻璃上制备所需微孔的孔径、形状、密度，形成密排微孔阵列；
③对显影后漏出的聚对二甲苯C层进行反应离子蚀刻(RIE)，直到暴露出金属层；
④通过将制备的微孔阵列芯片浸泡在丙酮中，将光刻胶从分选芯片上洗掉，得到微孔阵列芯片。
作为一种举例说明，所述光刻胶用作Parylene的刻蚀模版，最后会被完全洗掉；
作为一种举例说明，所述密排微孔阵列中每个微孔均是：大小相等、形状相同、间距相等；
作为一种举例说明，所述微孔的形状为：等六边形或圆形；
方法二：
①使用光刻和深反应离子刻蚀(DRIE)制作Si负型母版；
②使用PDMS翻模得到带有密排微柱结构的微流芯片模具，将其与玻璃片键合后通过注入成膜材料(PDMS,紫外固化材料等)进行固化，固化后去掉模具得到微孔阵列芯片；
③通过等离子体作用将其与金属镀膜玻璃片结合得到微型扩散室，获得微孔阵列芯片。
方法三：
金属镀膜玻璃片上旋涂光刻胶，通过光刻图案化显影得到微型扩散室，获得微孔阵列芯片；
微型扩散室孔径在20um-80um时便于使每个扩散微室装载单个细胞，则所得培养物是单特异性的；微型扩散室厚度在3um-15um时便于微生物生长后进行分离成纯培养物。
基于微孔阵列芯片的激光诱导向前转移的单细胞分选方法，包括：
步骤一、LIFT分选装置的结构设计：
LIFT分选装置包括：单细胞分选模块，白光(或荧光)成像模块，芯片固定装置116和接收装置117；
作为一种举例说明，所述单细胞分选模块包括：532nm脉冲激光器(持续时间5ns)101、半波片102、偏振分束器103、第一扩束镜104,第二扩束镜105、第一反射镜106、第二反射镜107和第一显微镜物镜108；
作为一种举例说明，所述白光成像模块包括：第二显微镜物镜109、第三反射镜110、凸透镜111、分束器112、多通道滤光片113、LED114和相机115；
作为一种举例说明，所述微孔阵列芯片固定装置116为3D运动平台；
作为一种举例说明，所述接收装置117为接收皿，放置在微孔阵列芯片下方的机械加工槽中，通过电控移动；
步骤二、通过LIFT分选装置结合微孔阵列芯片，进行单细胞活体分选：
首先，将所述LIFT分选装置和微孔阵列芯片暴露在紫外线下至少30分钟，以消除其他细菌污染；
其次，微孔阵列芯片在O2等离子体作用下进行亲水处理；再将2-3ul细胞悬液滴加在微孔阵列芯片上进行单细胞捕获，时间约为10s；
然后，把微孔阵列芯片放置在3D运动平台；
最后，所有分选和收集过程都通过CCD相机进行观察和记录，CCD相机连接到计算机；上述该分选操作一键控制，将目标细胞分选到接收装置中。
与现有技术金属镀层芯片点样分选相比，微孔阵列芯片克服了液体表面张力的影响，使细胞分散成单细胞微液滴，实现了单细胞的固定，并具有稳定高效的单细胞捕获效率；
进一步的，与在传统金属镀层芯片点样分选相比，所述通孔膜表面无液层阻碍分选，大大克服了液体表面张力对单细胞分选的束缚；
参照图3所示，通过模拟芯片牺牲层光热转化过程，探究分选温度对单细胞活性的影响，结果证实，与传统的LIFT分选方法相比，新型分选方法极大地降低了分选热损伤；因此通孔膜结合LIFT单细胞分选技术可实现精准的液体活体单细胞分选。
作为一种举例说明，所述图6和图7的培养皿可换成接收基板，可以是盖玻片放在距离微孔膜500um处或其他距离值，方便观察单细胞从微孔中精准分选下来的一种操作；
在传统拉曼信号增强的芯片上，液体中的细胞无法固定，使得获取稳定的信噪比高的单细胞拉曼光谱成了难题。通过利用通孔膜与金属镀层芯片结合的方式，实现了单细胞的固定，大大增加了液体单细胞拉曼光谱的稳定性和信噪比，为单细胞液体拉曼识别分选奠定基础。
经微孔结构捕获的单细胞分选原理结合了流体动力学和表面润湿性，因此不同于传统金属镀膜芯片上利用LIFT技术的精准稳定单细胞分选方法。在传统的分选芯片上，细胞存在横向迁移导致无法精准分选，或分选过程存在射流使多个细胞一起被分选。微孔阵列芯片与传统的分选芯片不同，单个细胞由于芯片材料的疏水的特性形成了单细胞微液滴，在微孔内固定，实现单细胞捕获，便于进行后续的单细胞分选和培养。因此，这就是采用微孔阵列结合LIFT的分选方法进行单细胞捕获和单细胞分选的重要因素。
本发明不仅实现单细胞活体液体分选和培养，而且为在液体中获取稳定的单细胞拉曼光谱信号提供帮助。在传统芯片上，液体中的细胞无法固定，使得获取稳定的信噪比高的单细胞拉曼光谱成了难题。利用微孔阵列芯片提供的单细胞固定和单细胞捕获方式，将大大增加了液体中采集单细胞拉曼光谱信号的稳定性，降低液体扰动的信号干扰，为单细胞液体拉曼识别分选奠定基础。
以上所述的仅为本发明的优选实施例，所应理解的是，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的思想和原则之内所做的任何修改、等同替换等等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.微孔阵列芯片，其特征在于，包括：
在金属镀膜玻璃片上，覆盖一层微孔膜；
所述微孔膜为生物兼容性薄膜，采用微纳加工工艺覆盖在金属镀膜玻璃片上；单个细胞由于微孔阵列芯片的疏水特性形成了单细胞微液滴，在微孔内固定，实现单细胞捕获，便于进行后续的单细胞分选；
所述金属镀膜玻璃片是指：通过磁控溅射方式将纳米级金属薄膜涂覆在玻璃片上。
2.根据权利要求1所述的微孔阵列芯片，其特征在于，所述微纳加工工艺包括：方法一、
①使用聚对二甲苯沉积仪器将所需厚度的聚对二甲苯C层沉积到金属镀膜玻璃片上；
②在聚对二甲苯C层上旋涂光刻胶，通过光刻图案方法在金属镀膜玻璃上制备所需微孔的孔径、形状、密度，形成密排微孔阵列；
③对显影后漏出的聚对二甲苯C层进行反应离子蚀刻，直到暴露出金属层；
④通过将制备的微孔阵列芯片浸泡在丙酮中，将光刻胶从分选芯片上洗掉，得到微孔阵列芯片。
3.根据权利要求2所述的微孔阵列芯片，其特征在于，所述光刻胶用作聚对二甲苯的刻蚀模版，最后会被完全洗掉。
4.根据权利要求2所述的微孔阵列芯片，其特征在于，所述密排微孔阵列中每个微孔均：大小相等、形状相同、间距相等。
5.根据权利要求1所述的微孔阵列芯片，其特征在于，所述微纳加工工艺还包括：
①使用光刻和深反应离子刻蚀制作Si负型母版；
②使用PDMS翻模得到带有密排微柱结构的微流芯片模具，将其与玻璃片键合后通过注入成膜材料进行固化，固化后去掉模具得到微孔阵列芯片；
③通过等离子体作用将其与金属镀膜玻璃片结合得到微型扩散室，获得微孔阵列芯片。
6.根据权利要求1所述的微孔阵列芯片，其特征在于，所述微纳加工工艺还包括：
金属镀膜玻璃片上旋涂光刻胶，通过光刻图案化显影得到微型扩散室，获得微孔阵列芯片；微型扩散室孔径在20um-80um时便于使每个扩散微室装载单个细胞，则所得培养物是单特异性的；微型扩散室厚度在3um-15um时便于微生物生长后进行分离成纯培养物。
7.基于权利要求1-6所述的微孔阵列芯片的激光诱导向前转移的单细胞分选方法，其特征在于，包括：
步骤一、LIFT分选装置的结构设计：
LIFT分选装置包括：单细胞分选模块，白光(或荧光)成像模块，芯片固定装置和接收装置；
所述单细胞分选模块包括：532nm脉冲激光器、半波片、偏振分束器、第一扩束镜、第二扩束镜、第一反射镜、第二反射镜和第一显微镜物镜；
所述白光成像模块包括：第二显微镜物镜、第三反射镜、凸透镜、分束器、多通道滤光片、LED和相机；
步骤二、通过LIFT分选装置结合微孔阵列芯片，进行单细胞活体分选：
首先，将所述LIFT分选装置和微孔阵列芯片暴露在紫外线下至少30分钟，以消除其他细菌污染；
其次，微孔阵列芯片在O2等离子体作用下进行亲水处理；再将2-3ul细胞悬液滴加在微孔阵列芯片上进行单细胞捕获，时间约为10s；
然后，把微孔阵列芯片放置在3D运动平台；
最后，所有分选和收集过程都通过CCD相机进行观察和记录，CCD相机连接到计算机；上述该分选操作一键控制，将目标细胞分选到接收装置中。
8.根据权利要求7所述的单细胞分选方法，其特征在于，所述芯片固定装置为3D运动平台，所述接收装置为接收皿，放置在微孔阵列芯片下方的机械加工槽中通过电控移动。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111676132A (zh) * 2020-06-17 2020-09-18 长春长光辰英生物科学仪器有限公司 一种用于激光诱导转移的芯片保护层及细胞分选方法
CN111676132B (zh) * 2020-06-17 2023-07-18 长春长光辰英生物科学仪器有限公司 一种用于激光诱导转移的芯片保护层及细胞分选方法
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FR3141091A1 (fr) * 2022-10-20 2024-04-26 Poietis Impression d’objets a partir d’un puits

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