CN216149778U - 一种微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
一种微流控芯片,所述微流控芯片包括微流道,以及至少一个内嵌于微流道中的双层微粒捕获腔室;各双层微粒捕获腔室包括第一微粒捕获腔室和位于其下方的第二微粒捕获腔室,且第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室的顶部相互连通;第一微粒捕获腔室底部截面直径大于第二微粒捕获腔室顶部开口截面直径;且第二微粒捕获腔室顶部开口截面直径等于底部截面直径。使用本实用新型的微流控芯片,可有效防止捕获的微粒因后续操作导致的溶液扰动而再次溢出,并能够防止捕获腔室之间信息的交叉污染。
Description
技术领域
本实用新型涉及微流控芯片领域,具体涉及一种微流控芯片。
背景技术
细胞是生命组成及生命活动的基本单位。复杂生命体通过细胞之间相互协作实现复杂的生命功能。但是传统基于群体的细胞生物学研究方法平均化了细胞的信息,掩盖了细胞之间的异质性以及稀少细胞的信息,使人们无法清晰的认识每个细胞在生命体中扮演的不同角色。随着高通量测序以及微流控技术的进步,单细胞测序技术也得到了巨大的进展,使人们能够揭露细胞之间的异质性有了更全面的了解。从单细胞水平进行分析,能够使人们对细胞活动,疾病产生与治疗以及生命的本质的理解提供更丰富和可靠的信息。
目前对单细胞测序技术来说,面临着单细胞个体小,很难高效快速分隔单细胞;物质含量低,物质在分析处理过程中很容易损失等挑战。
微流控芯片又称为芯片实验室,指的是一种将化学和生物等实验中涉及到的样品的前处理、样品的分离、反应、检测、分析、输送、贮存等步骤集成到一块只有平方厘米级别的微型芯片上的操作平台上。它由于具备的体积小、试剂消耗少、通量高、分析速度快、和集成化等优点在单细胞分析方面有着广泛的应用。
但是现在的单细胞测序技术在分隔细胞时,依然存在着大量单细胞丢失,需要复杂的仪器精准操控,成本高等问题。比如在Cell上发表的文章(Macosko et al.,2015,cell:161,1202-1214;Klein et al.,2015,Cell 161,1187-1201)报道的液滴微流控与编码微球相结合的方法,通过泊松分布实现细胞与编码微球的配对。但是这种基于泊松分布方式的配对方法只能分析大量细胞样品中少量细胞的分析,存在着大量的细胞损失。并且该方法需要精准的仪器对流体进行操控实现微液滴的生成,增加了样品制备的复杂度,并且也增加了成本。
除了使用液滴微流控,还有一些利用微阵列的方法对细胞或者微球进行分隔。比如发表在Science上的文章(Fan et al.,2015,science:347,1258367),以及相对应的专利(Fan et al.,WO 2015031691)通过泊松分布的方式将细胞分隔在微阵列中,并且在阵列中与编码微球进行配对,实现了大量单细胞基因表达的同时分析。比如发表在NatureMethods上的文章(Gierahn et al.,2017,Nature Methods:14,395-398)以及相对应的专利(Gierahn et al.,US 2019/0144936),通过泊松分布的方式将细胞分隔在微阵列中,并且在阵列中与编码微球进行配对。与Cyto-Seq不同的是,该方法通过将一张半透膜覆盖着芯片表面,阻止了mRNA分子扩散,增加了编码微球对mRNA 分子的捕获效率。比如发表在Cell上的文章(Han et al.,2018,Cell:172,1091–1107),通过泊松分布的方式将细胞分隔在微阵列中,并且在阵列中与编码微球进行配对,实现了单细胞水平上的图谱分析。
但是以上的方法都存在一个问题,为了保证每个孔中单细胞的存在,必须通过泊松分布的方式在阵列上分隔细胞。这样会导致大量的微孔没有被利用,造成大量的浪费。另外,由于阵列上需要细胞与编码微球进行配对,因此阵列的尺寸明显大于细胞,所以有可能会导致一些由多个细胞组成的细胞团会进入微孔。因此在分隔细胞前,需要对细胞样品进行过滤处理,去掉悬浮液中的细胞团,而这一过程会导致细胞的丢失。另外在细胞与微球配对完后,后续的操作也会造成溶液的扰动,这些都有可能导致已经入微孔的细胞从微孔中出来,导致细胞的进一步丢失。这对于单细胞分析,尤其是稀少细胞的分析是及其不利的。
实用新型内容
为了解决现有技术中存在的问题,本实用新型提供以下微流控芯片,其可有效防止捕获腔室中捕获的微粒因后续操作导致的溶液扰动而再次溢出,并能够防止捕获腔室之间遗传信息的交叉污染。
就此,提供一种微流控芯片,其包括微流道,以及至少一个内嵌于所述微流道中的双层微粒捕获腔室;其中,
每个双层微粒捕获腔室包括分别用于捕获第一微粒和第二微粒的第一微粒捕获腔室和第二微粒捕获腔室,所述第一微粒捕获腔室位于第二微粒捕获腔室的上方,且第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室的顶部相互连通,所述第二微粒捕获腔室顶部开口的截面面积等于第二微粒捕获腔室底部的截面面积。
所述第一微粒捕获腔室底部截面的面积大于所述第二微粒捕获腔室顶部开口的截面面积。
所述捕获流道用于分别使包含第一微粒的流体和包含第二微粒的流体流至所述双层微粒捕获腔室,以使所述第一微粒和第二微粒分别被所述第一微粒捕获腔室和第二微粒捕获腔室捕获。
于第一微粒捕获腔室捕获的微粒体积通常大于第二微粒捕获腔室捕获的微粒体积。通过限定第一和第二微粒捕获腔室的大小,可保证上下两层微粒捕获腔室均只能捕获一个微粒。第一微粒捕获腔室的存在可以降低流体于第二微粒捕获腔室中的流速,这因为芯片微通道中的流体以层流方式流动,微流道中的流体对第一微粒捕获腔室中的流体扰动影响很小,因此第一微粒捕获腔室里的流速与芯片微流道的流速大大降低。同理,第一微粒捕获腔室里的流速对第二微粒捕获腔室的流体影响也很小,第二微粒捕获腔室中的流体速度同样降低,使得微粒被捕获后逃逸的可能性大大减小。
在一些实施方案中,所述第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室顶部共用同一开口。另一些实施方案中,所述第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室顶部通过连接通道连通。
在一些实施方案中,所述第一微粒捕获腔室与所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为圆形或者多边形(例如三角形、四边形、五边形、六边形等),优选为圆形、四方形、六边形。当第一微粒捕获腔室的横截面形状为多边形,特别是六边形时,适于在相同芯片大小下设置更多的捕获腔室。当横截面为圆形时,内切圆及其本身。
所述第一微粒捕获腔室与所述第二微粒捕获腔室的截面形状可以是相同的,也可以是不同的。
在优选的方案中,所述第一微粒捕获腔室顶部和底部的横截面形状均为圆形,且直径相同;另一些方案中,所述第一微粒捕获腔室与所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为四边形;另一些方案中,所述第一微粒捕获腔室横截面形状为圆形,所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为四边形;另一些方案中,所述第一微粒捕获腔室横截面形状为六边形,所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为四边形,例如方形。所述第一微粒捕获腔室顶部开口和底部的横截面形状均为四边形,且顶部开口四边形面积小于底部开口四边形面积。
在一些实施方案中,所述第一微粒捕获腔室截面的内切圆直径为5微米~1000微米,优选20微米~200微米;所述第二微粒捕获腔室顶部开口截面和底部截面的内切圆直径分别为1微米~500微米,优选10微米~100微米。
在一些实施方案中,当所述双层微粒捕获腔室为多个时,其布置于流道中构成微阵列,并呈并列或交叉排布。
在一些实施方案中,所述微粒捕获芯片还包括位于所述微流道之上的盖板,盖板及微流道间构成间隔空间,供流体(例如微粒载液)通入流动。
一些实施方案中,所述微粒捕获芯片还包括用于支撑所述微流道的底板。
一些实施方案中,所述第一微粒为微球,所述第二微粒为细胞。优选地,所述微球为编码微球。
本实用新型所述微粒,是本领域熟知的,需要进行捕获、分析、反应的颗粒,所述微粒的粒径大小处于5微米~1000微米的范围内,例如5微米-200微米。本领域熟知的微粒包括但不限于细胞、细胞团簇、微生物、微生物团簇、胶束和微球。其中微球包括但不限于聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚苯乙烯、聚酯(如:PLGA和PLA)、二氧化硅和石墨烯等微球,所述微球表面含有实现预期检测目的的物质,如:但不限于核酸适体等化合物,以及核酸、蛋白质和多肽等生物大分子。一些实施方案中,所述微球是人造微球,其修饰有用于RNA捕获的核酸序列、用于基因捕获的核酸序列,以及核酸适体或抗体等分子中的一种或多种。本领域技术人员能够根据待捕获微粒的粒径,选择合适的芯片规格用以实施本实用新型。
本实用新型的微流控芯片可采用本领域公知的材料与方法制备,例如可参考微流控芯片实验室[P],北京:科学出版社,2006;图解微流控芯片实验室[P],北京:科学出版社,2008。
本实用新型中,所述微流控芯片的使用流程为:
首先将含有第二微粒的微粒载液通入所述芯片中,其中所述第二微粒的粒径与第二微粒捕获腔室容积相匹配。在重力作用下,经静置、振荡或离心,单个第二微粒沉降至入下层第二微粒捕获腔室。随后通过液流的清洗,上层较大的第一捕获腔室中液流扰动大,流体呈漩涡状态,其中残留的第二微粒可以随液体扰动而被清洗掉;而下层第二微粒捕获腔室中的液流扰动小,可以保证沉入的第二微粒不因清洗而溢出。当清洗完毕后,通入第一微粒悬浮液,同样在重力作用下,或经离心,第一微粒沉降进入上层第一捕获腔室中。然后通过液流的清洗,去掉所述芯片上层表面残余的第一微粒。通过上述的步骤,实现了单个小颗粒与大颗粒的配对共同捕获。
在第一微粒为编码微球,第二微粒为细胞的方案中,当实现第一微粒和第二微粒捕获后,进而对第二微粒进行细胞裂解,释放出mRNA,而后该mRNA被上层的第二微粒编码微球捕获。回收微球后,可进行反转录、PCR、建库、测序等,实现单细胞测序。
1.本实用新型微流控芯片的结构设置,使其可用于防止待捕获第二微粒在清洗或加入第一微粒时逃逸,大大增强微粒捕获和配对精准度及效率,使更为准确获取单细胞或稀少细胞遗传信息成为可能。
2.本实用新型的微流控芯片,可直接用于处理含有细胞团的难分散细胞悬浮液,其中每个第二微粒捕获腔室只能容纳一个微粒,且其受上层流体扰动影响小,因此含有细胞团的难分散细胞悬浮液等微粒溶液在通入所述芯片前,可不经过滤、流式分筛等预处理步骤而直接进行细胞捕获,提高了使用效率。
3.对于普通单层微流控芯片,微粒通过重力作用进入捕获腔室,但总会有一些微粒没有进入捕获腔室。如果通过液流扰动,使没有进入微孔的微粒重悬在溶液中,再次通过重力沉降进入捕获腔室,这同样会导致进入捕获腔室中的微粒很可能会从捕获腔室中脱出,因此达不到累积沉降的效果。
本实用新型的微流控芯片,由于微粒进入下层第二微粒捕获腔室后,下层捕获腔室的液流扰动很小,因此即使进行液体扰动进行微粒的二次沉降,已进入下层捕获腔室的微粒不会从中脱出,而尚未进入下层捕获腔室的微粒可以重悬而再次通过重力沉降,从而达到累积沉降的效果,进一步增加了微粒的捕获率、配对率,并简化了操作步骤,进一步使细胞高通量分析成为可能。
4.使用普通单层微流控芯片同时装载两种不同微粒时,无法保证每个捕获腔室中只进入一种微粒,因此需要通过泊松分布方式装载,这样会导致大量捕获腔室空置,并造成试剂浪费。
本实用新型的微流控芯片,由于其具有双层捕获腔室结构,下层第二微粒捕获腔室可以保证只有一个小颗粒进入,而上层微孔可以保证只有一个大颗粒进入。因此捕获腔室仅可容纳一个微粒,可以保证每个独立捕获腔室单元中一个小微粒与一个大微粒的有效配对装载,为后续单细胞分析提供保证。
附图说明
图1a为实施例1微流控芯片的侧俯视示意图。
图1b为实施例1微流控芯片的侧视剖面示意图。
图1c为实施例1微流控芯片中单个双层捕获腔室的侧视剖面示意图。
图1d为实施例1微流控芯片中单个双层捕获腔室的俯视示意图。
图1e为另一实施例中,微流控芯片中单个双层捕获腔室的俯视示意图。
图2为实施例1微流控芯片的局部俯视光学显微镜照片。
图3a和图3b分别为实施例2细胞捕获和微球捕获后,微流控芯片的局部俯视光学显微镜照片。
图4为实施例2对应微流控芯片使用方法的流程示意图。
图5a、5b分别为实施例2细胞裂解前后,微流控芯片的局部俯视光学显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐明本实用新型。应理解,这些实例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。此外,应理解,在阅读了本实用新型讲授的内容之后,本领域技术人员可对本实用新型作各种改动或修改,这些等价形式同样落入本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
图1a为实施例1微流控芯片的俯视示意图。图1b为实施例1微流控芯片的侧视剖面示意图。图1c为实施例1微流控芯片中单个双层捕获腔室的侧视剖面示意图。图1d为实施例1微流控芯片中单个双层捕获腔室的俯视示意图。图2为实施例1微流控芯片的局部俯视光学显微镜照片。如图1和图2所示,本实用新型的微流控芯片包括微流道200、内嵌于其中的双层微粒捕获腔室300和盖板400。盖板400覆盖于微流道200上,并与微流道200构成间隔空间,供微粒载液流动。盖板400上可设有入口401和出口402,供微粒载液、油相等液体的流入和流出。入口401和出口402还可设有上盖,防止芯片使用时液体的溢出。
一些方案中,不需要底板,微流道及捕获腔室厚度已具有足够刚性支撑芯片结构。一些实施方案中,微流控芯片还可进一步包括位于微流道及捕获腔室下部的底板。用于底板 100、微流道200、捕获腔室300和盖板400的材质例如,但不限于聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚碳酸酯等。
如图1b所示,一个或多个双层微粒捕获腔室300内嵌于微流道200中;每个双层微粒捕获腔室300包括分别用于捕获第一微粒和第二微粒的第一微粒捕获腔室301和第二微粒捕获腔室302,第一微粒捕获腔室301位于第二微粒捕获腔室302的上方,第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室的顶部相互连通。
第一微粒捕获腔室的底部3011面积大于第二微粒捕获腔室的顶部面积。第一微粒捕获腔室的底部3011与第二微粒捕获腔室顶部共用同一开口3021。
第二微粒捕获腔室302顶部开口3021的截面内切圆直径等于第二微粒捕获腔室302底部截面的内切圆直径。也即,顶部开口截面积等于底部截面积。
第一微粒捕获腔室301与所述第二微粒捕获腔室302的截面形状可以是相同的,也可以是不同的。例如,第一微粒捕获腔室301与第二微粒捕获腔室302的截面形状可以分别为圆形或者多边形(如图1e)。
优选方案中,第一微粒捕获腔室301的横截面形状为圆形,第二微粒捕获腔室302顶部开口横截面形状与底部截面形状为四边形,更优选为方形。
第一微粒捕获腔室301截面的内切圆直径为5微米~1000微米,优选20微米~200微米;第二微粒捕获腔室302顶部开口3021截面和底部截面3022的内切圆直径分别为1微米~500微米,优选10微米~100微米。
双层微粒捕获腔室为多个时,其布置于流道中构成微阵列,并呈并列或交叉排布。
本实施例的微流控芯片可采用PDMS材质制备,具体制备方式可为:
1.使用标准光刻方法制作SU-8芯片模板,具体为利用软件Auto CAD设计芯片的掩膜版图形,再使用标准光刻方法在洁净室百级间进行模板的制作,包括硅片前处理、光刻胶SU-8 2050的涂覆、硅片模板前烘、硅片模板曝光、硅片模板后烘、硅片显影、高温烘焙坚膜、第二层结构套刻等步骤。
2、制作聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片,具体为将PDMS(Dow Corning 184)和配套的固化剂按10:1比例进行混合,真空除去气泡。将混合物倾倒于刻有图案硅片表面,95℃加热20min后,PDMS即可固化,然后用手术刀切出带有图案的PDMS厚块。另外将混合物导入一个平底的凹槽中制作出另一PDMS厚块,用手术刀切除。随后将一块完整的PDMS 薄膜中间挖空,将该PDMS薄膜与经由平底凹槽制得的PDMS厚块键合在一起,内部形成凹槽结构。然后利用打孔笔在槽的两端区进行打孔用于液体的流入与流出。然后该含有凹槽的PDMS厚块与之前做好的含有图案的PDMS薄膜键合在一起,得到完整芯片。
本实施例中所有键合操作均利用等离子体键合仪处理芯片表面,产生硅羟基而后贴合实现的。
实施例2利用上述微流控芯片进行微粒捕获配对及检测的方法,包括:
向实施例1中制备的微流控芯片中通入细胞(K562,中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)悬浮液(1×pbs缓冲液)(钙黄绿素染色(Thermo Fisher,C3099)),将芯片平放入离心管中,进行30s,1000rpm离心沉降后,细胞进入下层微孔,然后用PBS缓冲进行清洗,将未沉入下层微孔的细胞洗去,利用荧光显微镜(Nikon)进行成像,从图3a中可以看到细胞在芯片上的占有率高达70%以上。然后再向芯片中通入编码微球(ChemGenes, Macosko-2011-10(V+))沉降30s,然后用PBS缓冲进行清洗除去芯片微流道表面残存的微球。最终微球在芯片上的占有率高达95%以上(图3b)。
在捕获细胞和微球后,向微流控芯片中通入细胞裂解液,细胞释放mRNA被微球捕获,回收微球,进行后续测序分析。细胞裂解前后微流控芯片的局部俯视光学显微镜照片如图 5a、5b所示。相应流程示意图具体请见图4。
Claims (10)
1.一种微流控芯片,包括微流道,其特征在于:还包括至少一个内嵌于所述微流道中的双层微粒捕获腔室;其中,
每个所述双层微粒捕获腔室包括分别用于捕获第一微粒和第二微粒的第一微粒捕获腔室和第二微粒捕获腔室,所述第一微粒捕获腔室位于第二微粒捕获腔室的上方,且第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室的顶部相互连通,所述第二微粒捕获腔室顶部开口的截面面积等于第二微粒捕获腔室底部的截面面积。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,
所述第一微粒捕获腔室底部截面的面积大于所述第二微粒捕获腔室顶部开口截面面积。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室顶部共用一个开口;或者
所述第一微粒捕获腔室的底部与第二微粒捕获腔室顶部通过连接通道连通。
4.根据权利要求1或2或3所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室与所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为圆形或者多边形。
5.根据权利要求1或2或3所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室与所述第二微粒捕获腔室的横截面形状是相同的或不同的。
6.根据权利要求4所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室与所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为四边形、五边形或六边形。
7.根据权利要求4所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室横截面形状为圆形,所述第二微粒捕获腔室的横截面形状分别为四边形。
8.根据权利要求1或2或3所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室截面的内切圆直径为5微米~1000微米,所述第二微粒捕获腔室顶部开口截面和底部截面的内切圆直径分别为1微米~500微米。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片,其特征在于,所述第一微粒捕获腔室截面的内切圆直径为20微米~200微米,所述第二微粒捕获腔室顶部开口截面和底部截面的内切圆直径分别为10微米~100微米。
10.根据权利要求1或2所述的微流控芯片,其特征在于,所述双层微粒捕获腔室为多个,其布置于流道中构成微阵列,呈并列或交叉排布。
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CN202122250210.4U CN216149778U (zh) | 2021-09-16 | 2021-09-16 | 一种微流控芯片 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN115287189A (zh) * | 2022-08-18 | 2022-11-04 | 重庆大学 | 一种用于细胞球快速制备的微流控芯片及细胞球制备方法 |
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2021
- 2021-09-16 CN CN202122250210.4U patent/CN216149778U/zh active Active
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN115287189A (zh) * | 2022-08-18 | 2022-11-04 | 重庆大学 | 一种用于细胞球快速制备的微流控芯片及细胞球制备方法 |
CN115287189B (zh) * | 2022-08-18 | 2023-12-12 | 重庆大学 | 一种用于细胞球快速制备的微流控芯片及细胞球制备方法 |
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