CN112646701A - 一步式单细胞分离分配系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种一步式单细胞分离分配系统。该系统包括液路板、声表面波芯片、第一微流控芯片和第二微流控芯片，其中，液路板接入驱动气体；第一微流控芯片和声表面波芯片依次附接在液路板的侧面；第二微流控芯片贴合在液路板的下方；声表面波芯片设有三级声场，分别促使第一微流控芯片样品流道中的细胞进行排列和逐步筛分；第一微流控芯片的流道末端为图像识别区，用于对上游分离出的细胞进行无标记图像识别；第二微流控芯片接收到图像识别区域的单细胞信号触发后，从喷口精准喷出包含该细胞的纳升体积液滴，当接收到非单细胞信号触发后，移动至废液池上方喷出。本发明集成细胞声分离、图像识别和单细胞分配，实现一步式单细胞制备。

Description

一步式单细胞分离分配系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种一步式单细胞分离分配系统。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)，是原发灶或转移灶中播散到体液循环系统的一类肿瘤细胞，负责转移的开始和将癌症传播到远处。CTCs作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”，应用在实体瘤患者的转移复发监控、预后判断、疗效评价和个体化治疗等方面，针对CTCs进行分析具有非常重要的价值。同时，与原发肿瘤相比，转移性和复发性肿瘤的癌细胞有新的体细胞变异，而在临床实践中，通常难以获得来自转移性或复发性肿瘤的再活检，这导致治疗期间的诊断结果不清晰。而对循环肿瘤细胞进行测序可以使研究人员在没有实体瘤活检测序的情况下清晰观察到肿瘤谱中的体细胞变化。随着下一代测序(NGS)和单细胞测序(SCS)技术的进步，科学家们已经可以获得CTC的完整基因组，将其与相应的原发性和转移性肿瘤进行比较，推断在治疗期间肿瘤的演变，从而制定更加精准的治疗策略。一般来说，CTC测序工作流程可分为四个步骤：CTC富集，CTC分离(特别是纯的或单个CTC分离)，基因组或转录组扩增，测序和分析。
与实体瘤活检测序相比，CTC基因组和转录组的测序所面临的技术上的挑战主要是：从大量的白细胞背景中富集稀少的肿瘤细胞，无损的分离和分配单个细胞而不损害或失去DNA和RNA，从而使全基因组无偏差的扩增，获得无偏见的测序数据。
目前，对于肿瘤细胞的分离，传统方法包含依据形态学原理的膜过滤法、密度梯度离心法、免疫磁性分离法。有标记的方法如Miltenyi Biotec公司研发的MACSFlowCytometry采用荧光标记目标细胞，光学识别和微阀分选结合的方法逐个分离单细胞。无标记的方法如采用微流控技术，通过内部物理结构筛分不同尺寸的细胞，捕获率和特异性达到80％以上。随着声学在生命健康领域的快速发展，借由声表面波和微流体介质中微粒的相互作用受到粒子本身的大小、密度、形状及可压缩性等因素影响的特性，逐步出现了采用声表面波对肿瘤细胞进行分离的多种技术。
在现有技术中，主要存在以下的细胞分离或细胞分配技术：
1)单细胞的按需分配
Fluidigm C1TM单细胞自动制备系统是第一个商业化的用于基因组学研究的自动化单细胞分离制备系统。通过采用创新的微流控技术，使用多个泵阀阵列控制流体，将样本中的单细胞并行分配于多个微腔室中；德国Cytena公司开发的单细胞打印机CloneSelectSCP将细胞检测传感器和按需滴定印刷技术相结合。通过手动上样法将极大稀释后的细胞悬液灌入微腔室，在毛细力的作用下，当单个细胞缓慢下沉至剂量室末端的图像识别区时，挤压腔室使含有单细胞的液滴喷出；监测到多个细胞或者无细胞时，废液则被喷口旁边的管道吸走；Scienion公司采用了与Cytena公司类似的方案，研发的cellenONE X1系统采用毛细管进样和图像识别相结合的方法制备单细胞阵列。在驱动方式上，LABCYTE和PolyPico公司采用了声波驱动液滴的方式来规避其它常见方式带来的流体剪切力、电压等因素对细胞的损伤。
2)集成式的分离分配
Miltenyi Biotec采用将自己的MACS FlowCytometry分离系统和Scienion公司的cellenONE X1分配系统两相结合的方式；Nanocellect公司则分别研发了分离系统WOLFCell sorter和分配系统N1 single cell dispenser两台仪器来实现；Namocell公司采用双色或三色荧光标记的流式细胞仪的分选方法和微喷口打印相结合的模式，实现单个荧光细胞打印；Adam Abate研究组使用液滴包裹单个荧光标记细胞以增强光学信号，采用光学检测和电场分离的方式来富集单细胞液滴，采用按需打印的方式在油内喷出含有单细胞的液滴。
综上，在现有技术中，尽管集成分离分配方式的系统，在朝着一步式分离分配的方向上前进，但是它们或者采用分离与分配系统拼接的方式，或者采用类似于流式细胞仪的荧光标记方法，存在细胞转移损失或标记繁琐的问题，离理想的一步式、无标记单细胞制备需求仍然存在较大距离。
发明内容
本发明的目的在于填补上述技术空白，提供一种一步式单细胞分离分配系统，以声场分离、图像识别、微流分配相结合的方式，无需荧光标记细胞、无需两台仪器拼接和转移步骤，能够实现一步式无标记单细胞制备。
本发明的技术方案是提供一种一步式单细胞分离分配系统。该系统的核心部件包括液路板、第一微流控芯片及其外封膜、声表面波芯片、第二微流控芯片及喷口膜，其中，所述液路板用于接入驱动气体并连接第一微流控芯片和第二微流控芯片的流路；所述第一微流控芯片及其外封膜和所述声表面波芯片依次附接在所述液路板的侧面；所述第一微流控芯片上设置有用于细胞排列和分离的样品流道；所述声表面波芯片设置有三级声场，分别促使所述第一微流控芯片样品流道中的细胞进行排列和逐步筛分；所述第一微流控芯片的流道末端为图像识别区域，用于对上游分离出的细胞进行无标记图像识别；所述第二微流控芯片及其喷口膜层贴合在所述液路板的下方；所述第二微流控芯片在接收到所述第一微流控芯片的图像识别区域的单细胞信号触发后，喷出包含该细胞的纳升体积液体，至液滴接收容器收集；当接收到非单细胞信号触发后，移动至废液池上方喷出并收集。
在一个实施例中，所述声表面波芯片设置有一对标准叉指电极、第一斜向叉指电极和第二斜向叉指电极，所述一对标准叉指电极分别布置于所述第一微流控芯片的样品流道两侧的非中心对称位置，所述第一斜向叉指电极和所述第二斜向叉指电极分别布置于所述第一微流控芯片的样品流道两侧的相对上下错开的位置。
在一个实施例中，所述液路板对接外部驱动气源、样本管、所述第一微流控芯片及其外封膜、所述第二微流控芯片及其喷口膜，并在内部带有储存废液功能。
在一个实施例中，所述第一微流控芯片的分叉形样品流道包括中心流道、与中心流道连通的第一分支流道和第二分支流道，所述第二微流控芯片上设有螺旋形微流道和喷口。
在一个实施例中，所述液路板采用3D打印光敏树脂材料来形成内部毫米级沟槽；所述第一微流控芯片和第二微流控芯片采用激光切穿双面胶的方法加工形成；所述喷口膜由激光切割PMMA薄膜形成；所述液路板、所述第一微流控芯片和所述第二微流控芯片及其各自膜层集成在一起，形成一个可无菌处理的、可一次性使用的、低成本塑料芯片耗材。
在一个实施例中，该系统还包括外设的图像识别装置，所述外设的图像识别装置用于监测所述第一微流控芯片的样品流道的中心流道末端，识别是否有目标粒子或细胞经过，并判断该粒子或细胞是否符合设定的要求和启动触发信号。
在一个实施例中，驱动细胞样本流动的气压由一个减压阀输出，气压量在0-10psi之间；驱动细胞打印的气压由另一个减压阀输出，气压量在0-10psi之间；两个气压由程序联控，经由外部连接件传递给所述核心部件。
在一个实施例中，所述液路板的两侧分别设置第一孔道和第二孔道，所述第一孔道用于引入气体进而驱动细胞样品在所述第一微流控芯片和所述第二微流控芯片流道进行流动和补充，所述第二孔道用于引入可控的气体量推动所述第二微流控芯片喷口正上方的细胞进行喷出。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)运用统一的驱动源和易于集成的声表面波部件及微流控元件，无缝对接细胞分离与细胞分配两个需求部分，实现从全血样本中一步式的制备单个循环肿瘤细胞。这是其它技术所不能轻易达到的；2)使用声表面波分离、微量气体驱动和喷印的方法，双重保护了输出细胞的活性；3)芯片采用模块化设计，易于模块制备和集成组装；4)芯片低成本制造工艺和外围设备小型化，有利于降低仪器开发成本和占地面积。
附图说明
以下附图仅对本发明作示意性的说明和解释，并不用于限定本发明的范围，其中：
图1是根据本发明一个实施例的一步式单细胞分离分配系统的示意图；
图2是根据本发明一个实施例的一步式细胞分离分配系统中各部件的位置关系图；
图3是根据本发明一个实施例的一步式细胞分离分配系统中各部件的组装示意；
图4是根据本发明一个实施例的细胞分离过程的示意图；
附图中：SSAW-驻波声场；TSAW-行波声场；Red blood cells-红细胞；White bloodCells-白细胞；CTC-循环肿瘤细胞；Recognition-图像识别；Inlet-入口；SAW chip-声表面波芯片；Membrane-膜；Microfluidic chip-微流控芯片；Milli chip-毫米级流道尺寸的液路板；Nozzle membrane-带有喷口的膜层。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案、设计方法及优点更加清楚明了，以下结合附图通过具体实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
在本文示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明提供的一步式细胞分离分配系统结合声表面波线性排列细胞、分离循环肿瘤细胞、单细胞图像识别、单细胞按需打印四个过程，集成为一个一步式的单细胞制备系统，结合外部光学与软硬件设备，实现高通量的肿瘤细胞群高效分离与单个肿瘤细胞的快速分配。
参见图1，并结合图2和图3所示，本发明提供的细胞分离分配系统包括集成的核心部件100，该核心部件100包含声表面波芯片210、膜层220、微流控芯片230、液路板240、微流控芯片250和膜层260，其中微流控芯片230、膜层220和声表面波芯片210依次设置在液路板240的一侧面，微流控芯片250和膜层260依次设置在液路板240的下表面，形成如图1所示的结构100。此外，图1还示出了外部对应的连接件101、设置在连接件101内的气道开口103、设置在液路板240两侧与气道开口103对接的小孔102、液滴接收板104和样本管105，并示意了液滴接收板104上的一个小孔106。
本发明提供的细胞分离分配系统的工作过程是，当两侧的连接件101夹紧核心部件100时，气体将经由液路板240左侧孔道引入上方样本管105内，推动管内血液进入侧面的微流控芯片230；血液经由一个驻波声场和两个行波声场后，红、白细胞分别引入液路板240内部的废液池(两个废液池的位置如图2中标记的270和280)，肿瘤细胞得以逐步分离出来，流经末端的图像识别区(参见图4标记为Recognition的区域)。在图像识别区，当识别到单个细胞经过时，发出一个触发信号给二维移动平台，使下方液滴接收板104中的一个空白接收管/孔移动到核心部件100正下方。在这段固定的毫秒级延迟时间内，该细胞进入到底部的微流控芯片250，并流到膜层260的喷口上方。启动右侧的脉冲气压，将包括肿瘤细胞的液体从喷口垂直向下喷出，分配到平面移动的液滴接收板104的空白管/孔中。未识别到细胞或识别到多个细胞时，将此类液体集中分配到下方的一个或多个固定位置的废液收集池中。
具体地，对于微流控芯片230和250流道中血液的补充，可采用连续或脉冲气压驱动的方法，将气体经由液路板240左侧流道推入样本管105，使血液从样本管105中源源不断引入侧面微流控芯片230和底部微流控芯片250。
微流控芯片230上设置有样品流道，样品流道的设置能够用于接收样品溶液并逐步导流出红细胞、白细胞和肿瘤细胞，例如设计为如图4所示的分叉形式，包括中心流道，以及与中心流道连通的第一分支流道和第二分支流道。
液路板240可采用3D打印光敏树脂材料或机械加工多层透明板材并对准封接的方式来形成内部毫米级沟槽，微流控芯片230和微流控芯片250可采用激光切穿双面胶的方法加工特定尺寸的微米级流道，其后使用PMMA或其它透明薄膜如膜层220和260，对外表面进行封闭。膜层上的微米直径喷口可由激光切割或机械加工形成。由此形成的核心部件100为一次性的、低成本的集成式芯片。
需说明的是，驱动细胞样本流动的气压由一个减压阀输出，气压量在0-10psi之间；驱动细胞打印的气压由另一个减压阀输出，气压量在0-10psi之间；两个气压由程序联控，经由外部连接件101传递给核心部件100。
声表面波芯片210用于产生声表面波，是一种由射频信号在压电基片上激发的弹性波，其波长处于微米量级，可用于在微纳米尺度进行细胞操控和处理。声表面波芯片210采用集成化的平面半导体工艺加工工艺。首先，在掩膜版上制作出方阵排布的叉指图形，再通过匀胶、光刻、显影、镀膜、剥离等工艺进行大批量加工，将图形复制为压电基片上的金属叉指电极。
在声表面波芯片210形成的多级声场中，存在着阵列式波腹与波节和不均匀的压力场，当血细胞在声场中受到不平衡的压力，将会向波节或波腹位置移动，位置精度可达微米级别。在驻波声场中，通过叉指电极频率的不同设计，可以调整细胞排列定位的位置和精度；在行波声场中，通过叉指电极频率的不同设计，可以选择性的分离不同尺寸的细胞。
例如，声表面波芯片210的声场控制采用四个叉指电极在同一个基底上形成三个声场，该四个叉指电极包括一对标准叉指电极和两个斜向叉指电极，其中一对标准叉指电极相互关联，形成一级驻波声场，用于线性排列血细胞；两个斜向叉指电极，形成两级行波声场，分别实现红白细胞的分离，对肿瘤细胞逐步富集。具体地，首先使用一对标准叉指电极，平行布置于微流控芯片230的样品流道两侧的非中心对称位置(即两个电极与流道中轴线距离不同)，使其驻波波节处于靠近通道内壁的某一侧。在声场作用下，流动的细胞逐渐聚集于波节的位置，呈现线性排列流动的状态，流向一侧流道；其后，使用一个高频的斜向叉指电极产生的行波将尺寸较大的白细胞和肿瘤细胞从流动细胞线中推出，小尺寸的红细胞继续流入侧向流道，进入液路板240的废液池270；最后，使用另一种高频的斜向叉指电极，将肿瘤细胞与白细胞再次分离，使肿瘤细胞最终从中心流道流出，白细胞流入另一侧流道，进入液路板240的废液池280。在实际应用中，电极的频率可在1Mhz-100Mhz之间。应理解的是，本文所描述的叉指电极位置，指的是当声表面波芯片210和微流控芯片230相互贴合时，叉指电极与样品中心流道的相对位置。本发明基于细胞尺寸的声场筛选方法，无需对细胞进行荧光标记，即可实现细胞的分离；声波对细胞无损，不会带来诸如流体剪切力、激光或电压损伤的问题；且声表面波芯片大小仅厘米见方，易于小型化和集成化。
单细胞的识别问题采取显微放大、图像识别的方案解决。例如将微流控芯片230的样品流道的中心流道末端作为监测区，当有粒子经过该区域时，通过图像识别装置判断其形态特征、尺寸、圆度、伸长率、核质比等来识别该粒子是否是目标细胞种类，以及是否是单个细胞。其中图像识别装置可采用外部设置的图像分析和处理系统实现，例如通过相机拍摄样品流道的中心流道末端的图片，并对图片进行快速分析，以识别图片中是否有单个肿瘤细胞。当图像识别区识别到单个肿瘤细胞之后，在固定的毫秒级延迟时间后，自动开启喷口上方的脉冲气压，将带有单细胞的液体从喷口处向下喷入液滴接收板104的一个小孔(例如孔106)中，液滴接收板104可采用96孔板。在识别细胞前后过程中，会连续拍取多张细胞图片，证实来自于单个细胞。这些图片会根据孔板的位置进行命名，并存储在硬盘中，以便后续追踪。
微流控芯片250的样品流道的尺寸设计为适合承载微流控芯片230分类出的细胞并利于将其通过喷口喷出，例如设置为特定长度和宽度的流道。
最下方膜层260带有一个微米级小孔，用于将带有单细胞的液滴从小孔中喷出。
综上所述，本发明运用统一的驱动源和易于集成的声表面波部件及微流控元件，无缝对接细胞分离与细胞分配两个部分，实现从全血样本中一步式的制备单个循环肿瘤细胞。这是现有技术方案所不能轻易达到的；本发明的系统解决了现有技术中由于驱动方式、流速的难以统一，模块之间难以有效对接等导致单细胞分离与分配两个模块难以集成的难题。
另外，相对于现有技术，本发明在分离方面采取声波这种无损的方式，在图像识别方面无需标记染色，在驱动和喷出液体方面均使用微量气压，从而使得分离后的细胞活性强、存活率高，有利于后续的应用，如单细胞测序和细胞培养；其次，在原理设计上避免有复杂的微流道，声分离方法可兼容毫米或百微米量级流道，因此可以用3D打印和激光切割的方法加工塑料元件，从而避免精密尺寸加工带来的高成本；再者，各个部件采取模块化设计，易于批量制备和集成组装。外围设备小型化，易于降低仪器开发成本和占地面积；最后，在实际使用方面，声表面波芯片只需要贴合到集成芯片的外表面即可，操作便利。使用完毕后，未收到样本污染的声表面波芯片可以取下重复使用，装载有血液EP管和内部废液的集成芯片可以作为医疗垃圾集中销毁，从而避免了样本间交叉污染和血液暴露安全等问题。
应理解的是，本文在描述位置关系时，“上”、“下”、“侧面”、“底部”等是以附图或系统的使用状态为参考，除非根据上下文另有所指。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (8)

1.一种一步式单细胞分离分配系统，该系统的核心部件包括液路板、第一微流控芯片及其外封膜、声表面波芯片、第二微流控芯片及其喷口膜，其中，所述液路板用于接入驱动气体并连接第一微流控芯片和第二微流控芯片的流路；所述第一微流控芯片及其外封膜和所述声表面波芯片依次附接在所述液路板的侧面；所述第二微流控芯片及其喷口膜依次贴合在所述液路板的下方；所述第一微流控芯片上设置有用于细胞排列和分离的样品流道；所述声表面波芯片设置有三级声场，分别促使所述第一微流控芯片样品流道中的细胞进行排列和逐步筛分；所述第一微流控芯片的样品流道末端为图像识别区域，用于对上游分离出的细胞进行无标记图像识别；所述第二微流控芯片在接收到所述第一微流控芯片的图像识别区域的单细胞信号触发后，经由喷口膜层精准喷出包含该细胞的纳升体积液体，至液滴接收容器收集，当接收到非单细胞信号触发后，移动至废液池上方喷出并收集。
2.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，所述声表面波芯片设置有一对标准叉指电极、第一斜向叉指电极和第二斜向叉指电极，所述一对标准叉指电极分别布置于所述第一微流控芯片的样品流道两侧的非中心对称位置，所述第一斜向叉指电极和所述第二斜向叉指电极分别布置于所述第一微流控芯片的样品流道两侧的相对上下错开的位置。
3.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，所述液路板对接外部驱动气源、样本管、所述第一微流控芯片及其外封膜、所述第二微流控芯片及其喷口膜，并在内部带有储存废液功能。
4.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，所述第一微流控芯片的分叉形样品流道包括中心流道、与中心流道连通的第一分支流道和第二分支流道，所述第二微流控芯片上设有螺旋形微流道和喷口。
5.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，所述液路板采用3D打印光敏树脂材料或机械加工多层透明板材并对准封接的方式来形成内部毫米级沟槽；所述第一微流控芯片和所述第二微流控芯片采用激光切穿双面胶的方法加工形成；所述喷口膜由激光切割PMMA薄膜形成；所述液路板、所述第一微流控芯片和所述第二微流控芯片及其各自膜层集成在一起，形成一个可无菌处理的、可一次性使用的、低成本塑料芯片耗材。
6.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，包括外设的图像识别装置，所述外设的图像识别装置用于监测所述第一微流控芯片的样品流道的中心流道末端，识别是否有目标粒子或细胞经过，并判断该粒子或细胞是否符合设定的要求和启动触发信号。
7.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，驱动细胞样本流动的气压由一个减压阀输出，气压量在0-10psi之间；驱动细胞打印的气压由另一个减压阀输出，气压量在0-10psi之间；两个气压由程序联控，经由外部连接件传递给所述核心部件。
8.根据权利要求1所述的一步式单细胞分离分配系统，其特征在于，所述液路板的两侧分别设置第一孔道和第二孔道，所述第一孔道用于引入气体进而驱动细胞样品在所述第一微流控芯片和所述第二微流控芯片流道进行流动和补充，所述第二孔道用于引入可控的气体量推动所述第二微流控芯片喷口正上方的细胞进行喷出。
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