DE102019110748B3

DE102019110748B3 - Einrichtung und Verfahren zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen

Info

Publication number: DE102019110748B3
Application number: DE102019110748.2A
Authority: DE
Inventors: Andreas Winkler; Cynthia Richard; Melanie Colditz; Friedrich Striggow; Armaghan Fakhfouri
Original assignee: Leibniz Institut fuer Festkorper und Werkstofforschung Dresden eV
Current assignee: Leibniz Institut fuer Festkorper und Werkstofforschung Dresden eV
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-09-03
Anticipated expiration: 2039-04-26

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die technischen Gebiete der Mikrofluidik, der Mikroanalytik und der akustischen Oberflächenwellentechnik und betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen.Aufgabe ist es, eine Einrichtung bereitzustellen, mit der eine genaue und quantitative hochwertige Sortierung ermöglicht wird und die kostengünstig herstellbar ist. Zudem ist es die Aufgabe ein Verfahren bereitzustellen, das flexibel an wechselnde experimentelle Randbedingungen angepasst werden kann und geringe Scherkräfte ausübt.Die Aufgabe wird durch eine Einrichtung gelöst, die ein akustofluidisches Bauteil mit einem piezoelektrischen Substrat enthält, auf dem ein Fluid-führender Mikrokanal, bestehend aus zwei Seitenwänden und einer Abdeckung, und mindestens zwei in Flussrichtung des Fluides nacheinander angeordnete Interdigitalwandler-Paare angeordnet sind.Die Einrichtung und das Verfahren kann beispielsweise in den Bereichen der Lebensmittelwissenschaft, der Abwassertechnik oder der Bioreaktionstechnik eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die technischen Gebiete der Mikrofluidik, der Mikroanalytik und der akustischen Oberflächenwellentechnik und betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zum Sortieren und Trennen unterschiedlicher Fraktionen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen unter Nutzung von angeregten akustischen Oberflächenwellen und den spezifischen Material- oder Geometrieeigenschaften der Partikel oder Zellen. Die erfindungsgemäße Einrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise für den Feldeinsatz in den Bereichen der Lebensmittelwissenschaft, der Abwassertechnik, der Bioreaktionstechnik oder für die extrakorporale Untersuchung von Blutbestandteilen des menschlichen oder tierischen Blutes eingesetzt werden.
Das Trennen und Sortieren von Zell- und/oder Mikropartikelpopulationen unterschiedlicher Größe ist eine bekannte und wesentliche fluide Grundoperation auf dem Gebiet der Mikrofluidik und Mikroanalytik. Hierfür werden elektrische und akustische Elemente in mikrofluide Sensor- und Aktor-Systemen in Laboraufbauten meist auf planaren Chipsubstraten angeordnet und mikrofluide Strukturen durch mikrosystemtechnische Verfahren hergestellt.
Bekannt aus dem Stand der Technik sind planare Chipsubstrate beispielsweise aus Borsilikatglas, SiO₂, Keramiken, Polymeren oder auch piezoelektrische Substrate aus LiNbO₃, LiTaO₃, AIN, ZnO, Silizium oder GaAs.
Bekannte Anwendungsfelder der Aktorik mit elektrischen und/oder akustischen Feldern in Verbindung mit Mikrofluidiksystemen sind beispielsweise die elektromagnetische Separation, akustische Pinzetten und Mischer, die Dielektrophorese wie auch elektroosmotische Pumpen, die Elektrolyse und auch künstliche Muskeln.
Bekannte Anwendungsfelder der Sensorik mit elektrischen und/oder akustischen Feldern in Mikrofluidiksystemen sind beispielsweise die mikroakustische Viskositätsmessung, die Messung der elektrischen Leitfähigkeit, der Temperatur, der Feuchtigkeit, des pH-Werts, der Ionenstärke, des elektrochemischen Potentials, oder auch die Impedanzspektroskopie, Gassensorik oder auch die Massebeladung der Oberfläche für Molekülsensoren hinsichtlich Schichtwachstum und Reaktionskinetik.
Bekannte Materialien für die Ausbildung der Kanäle in der Mikrofluidik sind durch Bonden aufgebrachtes PDMS, durch Umformung strukturierte, thermoplastische Polymere wie beispielsweise Polystyrol, Polycaprolacton, Polycarbonat, COC, PMMA, Polyimid oder PEEK. Auch bekannt ist das Ätzen von strukturiertem Glas beziehungsweise Silizium, insbesondere in Verbindung mit Bond- und Laminierverfahren.
Allgemein sind verschiedene Verfahren zur Partikelseparation in der Mikrofluidik bekannt. Hauptaufgabe der bekannten Verfahren ist dabei die spezifische Trennung von unterschiedlichen Partikelsorten aus einem Fluidstrom (Partikelseparation) und die Auftrennung der unterschiedlichen Partikel in Partikelfraktionen mit bestimmten Eigenschaften (Partikelfraktionierung). Bekannte Methoden für die Partikelseparation und Partikelfraktionierung sind auf elektrischen oder magnetischen Feldern basierende Trennmethoden wie die Magnetophorese, Dielektrophorese, Akustophorese oder auch die Free Flow Elektrophorese. Zudem sind geometrische Separationsverfahren in der Mikrofluidik wie beispielsweise die Pinched-Flow Fractionation oder die hydrodynamische Fraktionierung bekannt.
Aus Zhang, Z. et al.: „Sharp-edged geometric obstacles in microfluidics promote deformability-based sorting of cells", Phys. Rev. Fluids 4, 024201, published 13 February 2019, ist bekannt, dass sich die Deformierbarkeit von roten Blutkörperchen in mikrofluidischen Apparaten durch eine Modifikation sogenannter „Deterministic lateral displacement“ (DLD) Systeme günstig, schnell und einfach messen lässt. So ist angegeben, dass DLD eine relativ einfache und für den klinischen Alltag relevante Methode ist, mit der sich Zellen gemäß ihrer Größe trennen lassen. Bei dem Verfahren strömen Zellen in einer Fluid durch eine gitterartige Anordnung von stabförmigen Hindernissen. Je nach Größe durchlaufen sie dabei unterschiedliche Bahnen. Partikel, die deutlich kleiner sind als die Abstände zwischen den Hindernissen, strömen praktisch ungehindert zwischen diesen hindurch. Objekte, die ähnlich groß oder größer sind, werden dagegen seitlich abgelenkt und „herausgesiebt“. Es handelt sich dabei um ein auf hydrodynamischen Kräften basierendes passives Mikrofluidiksystem ohne äußere Kraftfelder.
Nachteilig bei allen bekannten rein hydrodynamisch betriebenen Einrichtungen und Verfahren zum mikroakustischen Sortieren von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen ist, dass sie sehr hohe Anforderungen an die Konstanz aller experimenteller Randbedingungen, z.B. der Temperatur, der Flüssigkeits- und Partikeleigenschaften aufweisen und sehr aufwendig in der Durchführung sind. Ein aktives Nachregeln bei Abweichung der Randbedingungen ist nicht möglich, sodass mit den bereitgestellten Mikrostrukturen eine nur unzureichend genaue und quantitativ unzureichende Sortierung von Mikropartikeln und/oder Zellen garantiert werden kann. Zudem können in diesen Verfahren große Scherkräfte auf die empfindlichen biologischen Zellen wirken, die die Eigenschaften der Mikropartikel und/oder Zellen beeinflussen und verändern.
Ein erstes aktives, SAW-basiertes akustofluidisches Verfahren zum Sortieren von Blutzellen in Mikrofluidiksystemen ist aus Nam, J. et al.: „Separation of platelets from whole blood using standing surface acoustic waves in a microchannel“, (Lab on a Chip 11, 2011, p.3361) bekannt. Hier konnte ein Abtrennen der größeren Blutbestanteile von unverdünntem Vollblut gezeigt werden mit dem Ergebnis einer Aufreinigung der kleineren Thrombozyten. Durch den Einsatz von akustischen Oberflächenwellen können einzelne Blutkomponenten auf unterschiedliche Flussbahnen im Mikrokanal geleitet und somit sortiert werden. Erythrozyten und Leukozyten werden dann durch die Seitenauslässe aus dem Mikrokanal geleitet, während die Thrombozyten im Zentrum des Kanals bleiben. Die Methode zeigt ein Scherstress-sensibles Trennen ohne Veränderung der Zellen durch Marker. Nachteilig bei diesem Verfahren sind die Nutzung eines Silikons (Polydimethylsiloxan) für die Herstellung des Mikrokanals, wodurch ein hoher Herstellungsaufwand durch Abguss- und Bondverfahren mit exakter Ausrichtung der PDMS-Struktur zum Chip, sowie eine geringe Präzision der Maßhaltigkeit zur akustischen Welle und eine vergleichsweise hohe Leistungsaufnahme. Darüber hinaus interagiert das Silikon mit der Flüssigkeit, beispielsweise durch Quellen und Lösen, wodurch eine Veränderung der Geometrie des Mikrokanals während des Betriebes erfolgt, was zu einer Verschlechterung der Verfahrensparameter und Filterwirkung führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Einrichtung zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen bereitzustellen, mit der eine genaue und quantitative hochwertige Sortierung von Mikropartikeln und/oder Zellen ermöglicht wird und die kostengünstig, präzise und reproduzierbar über Verfahren der Mikrotechnik in großen Stückzahlen herstellbar ist. Zudem ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Sortierung und Trennung von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen bereitzustellen, das flexibel an wechselnde experimentelle Randbedingungen angepasst werden kann und das geringe Scherkräfte auf die Mikropartikel und Zellen ausübt.
Die Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche, wobei die Erfindung auch Kombinationen der einzelnen abhängigen Schutzansprüche im Sinne einer Und-Verknüpfung mit einschließt, solange sie sich nicht gegenseitig ausschließen.
Die erfindungsgemäße Einrichtung zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen enthält mindestens ein akustofluidisches Bauteil mit mindestens einem piezoelektrischen Substrat, auf dem mindestens ein Fluid-führender Mikrokanal, bestehend aus mindestens zwei Seitenwänden und einer stoff- und/oder kraftschlüssig mit den zwei Seitenwänden verbundenen Abdeckung, und mindestens zwei in Flussrichtung des Fluides nacheinander angeordnete Interdigitalwandler-(IDT)-Paare zur Anregung von akustischen Oberflächenwellen angeordnet sind, wobei die IDT eines IDT-Paars zur Anregung von akustischen Rayleigh-Oberflächenwellen mit der Wellenlänge λ im Bereich von 25 µm bis 400 µm ausgelegt sind, und wobei der Mikrokanal mindestens einen kanalförmigen Einlass und mindestens zwei kanalförmige Auslässe aufweist, und wobei die mindestens zwei Seitenwände des mindestens einen Mikrokanals durch direkte lithografische Strukturierung mindestens einer lichtempfindlichen Polymerschicht hergestellt worden sind, und wobei die Breite des mindestens einen Mikrokanals λ/4 bis λ/2, die Höhe des mindestens einen Mikrokanals λ/8 bis λ/2 und die Breite der mindestens zwei Seitenwände des Mikrokanals λ/16 bis λ/2 entspricht, und wobei der mindestens eine Mikrokanal im Wesentlichen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der akustischen Oberflächenwellen und mindestens teilweise innerhalb des Ausbreitungspfades der durch die mindestens zwei IDT-Paare angeregten akustischen Oberflächenwellen auf dem mindestens einen piezoelektrischen Substrat angeordnet ist, und wobei die Apertur der IDT 5*λ bis 25* λ entspricht, und wobei mindestens eine Einlassöffnung oder mindestens eine Auslassöffnung mit mindestens einer Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport verbunden ist, und wobei mindestens eine Einlassöffnung oder mindestens eine Auslassöffnung mit mindestens einem Fluidreservoir verbunden ist, und wobei die Abdeckung des mindestens einen Mikrokanals an dem mindestens einen Einlass und den mindestens zwei Auslässen für die Zu- und Abfuhr von Fluiden zur mindestens einen Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport und zum mindestens einen Fluidreservoir hin geöffnet ist.
Die erfindungsgemäße Einrichtung enthält zudem mindestens eine Hochfrequenz-Signalquelle mit mindestens einem Signalausgang, wobei die elektrische Impedanz von mindestens einem IDT oder die Impedanz von mindestens einem IDT-Paar, bei Parallelschaltung aus zwei IDT mit gleicher Impedanz, an die elektrische Impedanz des mindestens einen Signalausgangs der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle angepasst ist, und wobei die IDT direkt oder über zusätzliche elektrische Baugruppen mit mindestens einem Signalausgang der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle verbunden sind, und wobei die mindestens eine Hochfrequenz-Signalquelle eine Ausgangsleistung von 5 mW bis 1 W je Signalausgang bei der Synchronfrequenz oder Resonanzfrequenz der IDT bereitstellt.
Außerdem enthält die erfindungsgemäße Einrichtung mindestens ein Fluid mit mindestens zwei dispergierten Sorten von Mikropartikeln und/oder Zellen, wobei die jeweils größte geometrische Abmessung der mindestens zwei dispergierten Sorten Mikropartikel oder Zellen maximal λ/10 entspricht und mindestens eine der mindestens zwei dispergierten Sorten Mikropartikel oder Zellen eine geometrische Abmessung von mindestens 5*λ/1000 aufweist, und wobei das mindestens eine Fluid eine dynamische Viskosität unter 50 mPas aufweist.
Vorteilhafterweise sind die mindestens zwei dispergierten Sorten von Mikropartikeln und/oder Zellen hinsichtlich der Dichte, Elastizität, Kompressibilität, elektrischer Leitfähigkeit, Permittivität, Porosität, magnetischer Permeabilität, Remanenz, Sättigungspolarisation, Größe, Volumen und/oder geometrischen Abmessung voneinander unterscheidbar.
Ebenfalls vorteilhafterweise sind die IDT eines IDT-Paares fluchtend in Wellenausbreitungsrichtung mit einem Abstand von 1 bis 10 Ganzzahligen der Wellenlänge λ zueinander angeordnet oder mit einem Abstand von 1 bis 10 Halbganzzahligen der Wellenlänge λ zueinander angeordnet.
Die IDT mindestens eines IDT-Paares sind erfindungsgemäß so angeordnet, dass ein IDT durch Rotation des zweiten IDT am Mittelpunkt zwischen den beiden IDT abgebildet ist oder ein IDT durch Spiegelung des zweiten IDT an der Mittellinie zwischen den beiden IDTs quer zur Wellenausbreitungsrichtung abgebildet ist.
Vorteilhaft ist auch, wenn mindestens die IDT von mindestens einem IDT-Paar über einen Hochfrequenz-Signalteiler mit dem einem Signalausgang der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle verbunden sind.
Und auch vorteilhaft ist es, wenn die beiden IDT eines IDT-Paares mit einem elektrischen Signal mit gleicher Phasenlage angesteuert sind.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn eine Diffusionsbarriere, Haftschicht, Passivierungsschicht, fluidkompatible Deckschicht und/oder biokompatible Deckschicht mit einer Schichtdicke von jeweils 5 nm bis 1000 nm mindestens im Bereich der Fluid-beaufschlagten Oberfläche des mindestens einen piezoelektrischen Substrats vorhanden ist.
Ebenfalls vorteilhafterweise ist die mindestens eine lichtempfindliche Polymerschicht für die Seitenwände des mindestens einen Mikrokanals vor der lithographischen Strukturierung mittels Schleuderverfahren oder Laminierverfahren auf das piezoelektrische Substrat aufgebracht.
Vorteilhafterweise besteht die mindestens eine lichtempfindliche Polymerschicht für die Seitenwände des mindestens einen Mikrokanals aus einem Epoxidharz, einem Acrylharz, einem glasharten Polymer und/oder einer Fotolackfolie, insbesondere aus SU-8, ATLAS, Ordyl, ADEX, SUEX, TMMF und/oder DF-1000.
Ebenfalls vorteilhaft ist es, wenn die Abdeckung des Mikrokanals aus einem Material mit geringerer akustischer Impedanz als das Fluid besteht und vorteilhafterweise aus einem Silikon, Polydimethylsiloxan (PDMS) und/oder aus einem Hydrogel besteht.
Die Abdeckung des Mikrokanals ist vorteilhafterweise durch Aufpressen oder Laminieren mit den Seitenwänden des Mikrokanals verbunden.
In einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung sind IDT vom Typ gerader IDT, λ/4, λ/8, bidirektionaler IDT, unidirektionaler IDT, slanted-finger IDT, SPUDT und/oder 2-Tor-Resonator vorhanden.
Auch vorteilhafterweise weist der Mikrokanal einen zentralen Einlass in Richtung des Mikrokanals zur Zuführung des Fluids und mindestens zwei unter einem Winkel von 10° bis 90° zum Mikrokanal angeordnete Seiten-Einlässe zur Zuführung eines Hüllfluides auf.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Mikrokanal mindestens drei Auslässe aufweist, bei dem ein zentraler Auslass in Richtung des Mikrokanals und mindestens zwei Seiten-Auslässe unter einem Winkel von 10° bis 65° zum Mikrokanal angeordnet sind und die Breite der Auslässe λ/10 bis λ/3 der Wellenlänge durch die in Flussrichtung des Fluids angeordneten zweiten IDT-Paares angeregten akustischen Oberflächenwelle beträgt.
Weiterhin vorteilhaft ist, wenn die mindestens eine Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport eine Spritzenpumpe, eine Osmosepumpe, eine Einweg- oder Mehrwegpumpe, eine durch elektrische Signale oder chemische Reaktion angesteuerte Einweg-Membranpumpe, eine auf Kapillarkräften basierende Einrichtung zur Erzeugung eines Unterdrucks im Mikrokanal in Form eines Vlieses, Schwammes, einem porösen und/oder hydrophilen Materials oder eine druckbeaufschlagte Verdrängungspumpe ist.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird mit einem Verfahren zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen gelöst, bei dem eine kontinuierliche und gerichtete Strömung mindestens eines Fluides mit mindestens zwei darin dispergierten unterschiedlichen Sorten von Mikropartikeln und/oder Zellen und mit einer dynamischen Viskosität unter 50 mPas durch mindestens einen Mikrokanal geleitet wird, der aus mindestens zwei Seitenwänden und einer Abdeckung besteht und eine Höhe von λ/8 bis λ/2, eine Breite von λ/4 bis λ/2 und eine Breite der Seitenwände λ/16 bis λ/2 aufweist, nachfolgend die Mikropartikel und/oder Zellen im Fluid mittels einer von einem ersten IDT-Paar angeregten, stehenden akustischen Oberflächenwelle im zentralen Bereich des Mikrokanals auf 10% bis 25% der Mikrokanalbreite fokussiert werden, wobei die IDT der IDT-Paare Rayleigh-Oberflächenwellen mit gleicher Wellenlänge λ im Bereich von 25 µm bis 400 µm anregen, und nachfolgend mindestens eine Fraktion der fokussierten Mikropartikel und/oder Zellen im Fluid aufgrund mindestens ihrer zur weiteren Fraktion abweichenden Material- oder Geometrieeigenschaften mittels einer von einem zweiten IDT-Paar angeregten stehenden akustischen Oberflächenwelle mit gleicher Wellenlänge λ und einer Phasenverschiebung von 180° gegenüber der akustischen Oberflächenwelle des ersten IDT-Paares vom zentralen Bereich des Mikrokanals zu den Mikrokanalwänden abgelenkt und damit sortiert werden, sodass mindestens zwei getrennte Fraktionen unterschiedlicher Mikropartikel und/oder Zellen innerhalb der Fluidströmung im Mikrokanal erzeugt werden, wobei die Fokussierung und Sortierung der Mikropartikel und/oder Zellen durch elektrische Beschaltung der jeweils zwei Paare von IDT oder durch Rotation eines IDT des ersten IDT-Paares am Mittelpunkt zwischen den beiden IDT und durch Spiegelung eines IDT des zweiten IDT-Paares an der Kanalmittellinie des Mikrokanals realisiert wird, und nachfolgend eine der sortierten Fraktionen der Mikropartikeln und/oder Zellen aus dem Mikrokanal über einen zentralen Auslass und mindestens eine weitere Fraktion der Mikropartikeln und/oder Zellen über mindestens einen Seiten-Auslass abgeführt werden, und mindestens eine Fraktion in einem Fluidreservoir aufgefangen wird.
In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird über mindestens zwei Seiten-Einlässe ein Hüllfluid am Mikrokanaleingang zugeführt wird.
Und ebenso vorteilhafterweise werden IDT vom Typ gerader IDT, λ/4, λ/8, bidirektionaler IDT, unidirektionaler IDT, slanted-finger IDT, SPUDT oder 2-Tor-Resonator eingesetzt.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird erstmals eine Einrichtung zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen bereitgestellt, mit der eine genaue und quantitative hochwertige Sortierung von Mikropartikeln und/oder Zellen ermöglicht wird und die kostengünstig, präzise und reproduzierbar über Verfahren der Mikrotechnik in großen Stückzahlen herstellbar ist. Zudem wird ein Verfahren zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen bereitgestellt, das flexibel durch die elektrische Signalgebung an wechselnde experimentelle Randbedingungen angepasst werden kann und geringe Scherkräfte auf die Mikropartikel oder Zellen ausübt. und kostengünstig ist.
Erfindungsgemäß ist es gelungen, die in einem Fluid dispergierten und aus mindestens zwei unterschiedlichen Sorten bestehenden Mikropartikel und/oder Zellen unter Nutzung von angeregten akustischen Oberflächenwellen in Mikrofluidstrukturen in unterschiedlichen Fraktionen innerhalb eines Fluides in einfacher Weise zu sortieren und nachfolgend durch Ausleitung in verschiedene Auslässe zu trennen.
Die erfindungsgemäße Einrichtung zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen enthält mindestens ein piezoelektrisches Substrat, auf dem mindestens ein Mikrokanal, der ein Fluid führt, und mindestens zwei in Flussrichtung des Fluides nacheinander angeordnete Interdigitalwandler-Paare vorhanden sind.
Das piezoelektrische Substrat kann beispielsweise aus bekannten piezoelektrischen Materialien wie LiNbO₃, LiTaO₃, AIN, ZnO, Cantangasit (CTGS), Langasit (LGS), Silizium oder GaAs hergestellt sein und als ein piezoelektrischer Chip auf einem Chiphalter ausgebildet sein, oder als piezoelektrische Schicht auf einem nichtpiezoelektrischen Substrat ausgebildet sein, auf dem die weiteren Einrichtungsbestandteile wie elektrische und fluidische Kontaktstrukturen, Sensoren und Aktoren, angeordnet sind.
Der mindestens eine Mikrokanal besteht aus mindestens zwei Seitenwänden und einer Abdeckung, wobei die Wände des Mikrokanals mittels optischer Lithographie direkt aus einem lichtempfindlichen Fotolack beispielsweise auf Basis eines Epoxidharzes oder Acrylharzes oder einer Fotolackfolie hergestellt sind. Auf diesem Weg werden die akustisch besonders relevanten Seitenwände des Mikrokanals mit hoher Maßhaltigkeit in allen drei Dimensionen und mit hoher Positioniergenauigkeit in Bezug auf die angeregten akustischen Oberflächenwellen bereitgestellt. Darüber hinaus ist das verwendete Material chemisch deutlich stabiler, wodurch die Maßhaltigkeit auch während des Betriebes der Einrichtung konstant bleibt. Da diese Materialien eine im Vergleich zum Fluid deutlich größere akustische Impedanz aufweisen, wodurch Reflexionen an den Kanalwänden das Wellenfeld maßgeblich beeinflussen ist es notwendig, dass die Geometrie des Mikrokanals auf die akustische Wellenlänge der von den IDTS angeregten akustischen Oberflächenwellen abgestimmt wird, um eine genaue und quantitative hochwertige Funktion der Einrichtung zu gewährleisten.
Die mindestens zwei Seitenwände des Mikrokanals bestehen aus einem lichtempfindlichen Polymermaterial, das als Schicht vor der lithographischen Strukturierung mittels Schleuderverfahren oder Laminierverfahren auf dem piezoelektrischen Substrat aufgebracht ist und nachfolgend direkt fotolithographisch strukturiert ist. Die lithographische Strukturierung der mindestens zwei Seitenwände des Mikrokanals hat den wesentlichen Vorteil, dass die Seitenwände eine besonders hohe Genauigkeit und Reinheit aufweisen und so im Zusammenwirken mit den durch die IDT angeregten akustischen Oberflächenwellen zu einer besonders vorteilhaften örtlichen Ausbildung von exakt definierten Reflexionen mit Entstehung von definierten Wellenknoten innerhalb des im Mikrokanals strömenden Fluides führen.
Der mindestens eine Mikrokanal weist zudem eine Abdeckung auf, die mit den Seitenwänden des Mikrokanals stoff- und/oder kraftschlüssig verbunden ist.
Um eine Fokussierung und Sortierung der Mikropartikel und/oder Zellen innerhalb des strömenden Fluides zu realisieren, ist es erfindungsgemäß notwendig, dass unter anderem die geometrische Abmessung des Mikrokanals, die Wellenlänge der durch die IDT angeregten akustischen Oberflächenwelle und die Größe der zu sortierenden Mikropartikel oder Zellen aufeinander abgestimmt sind.
Die Breite des mindestens einen Mikrokanals beträgt erfindungsgemäß λ/4 bis λ/2, die Höhe λ/8 bis λ/2 und die Breite der mindestens zwei Seitenwände des Mikrokanals λ/16 bis λ/2 der Wellenlänge der durch die IDT angeregten akustischen Oberflächenwelle.
Von Bedeutung ist zudem, dass der Mikrokanal auf dem piezoelektrischen Substrat zwischen den paarweise gegenüberliegend angeordneten Interdigitalwandlern angeordnet ist und im Wesentlichen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der akustischen Oberflächenwellen verläuft. Im Rahmen der Erfindung soll unter im „Wesentlichen senkrecht“ verstanden werden, das eine Abweichung der Anordnung des Mikrokanals zur Ausbreitungsrichtung der akustischen Oberflächenwellen von max. ± 10° zur Senkrechten vorliegen kann.
Zudem befindet sich Mikrokanal erfindungsgemäß mindestens teilweise innerhalb des Ausbreitungsbereiches der von den IDT-Paaren angeregten akustischen Oberflächenwellen. Mit der Anordnung des Mikrokanals mindestens teilweise innerhalb des Ausbreitungsbereiches der von den IDT-Paaren angeregten akustischen Oberflächenwellen wird erreicht, dass eine von den IDT angeregte stehende Rayleigh-Oberflächenwelle und im Fluid im Mikrokanal stehende longitudinale Druckwelle erzeugt wird. Die im Mikrokanal auftretenden Wellenknoten der stehenden Rayleigh-Oberflächenwelle entstehen dabei durch Überlagerung zweier gegenläufig fortschreitender akustischer Oberflächenwellen gleicher Frequenz und gleicher Amplitude. Die Wellenknoten der longitudinalen Druckwellen entstehen durch Überlagerung der fortschreitenden Longitudinalwellen miteinander und mit Reflexionen an den Kanalwänden beziehungsweise an der Mikrokanalabdeckung und mit gebeugten Anteilen der Longitudinalwellen. Der Ort der entstehenden Wellenknoten im Mikrokanal wird dabei insbesondere durch die von den IDT angeregte Welleneigenschaften, die im Mikrokanal auftretenden Reflexionen der longitudinalen Volumenwelle im Zusammenwirken mit der geometrischen Ausbildung des Mikrokanals bestimmt.
Der Abstand, die Position und die elektrische Ansteuerung der beiden Interdigitalwandler eines jeden Interdigitalwandler-Paares sind dabei so gewählt, dass im Bereich des ersten Interdigitalwandler-Paares ein Wellenknoten der stehenden Rayleigh-Oberflächenwelle sowie der stehenden longitudinalen Druckwelle im Kanalzentrum sowie bei dem in Flussrichtung des Fluides danach angeordneten Interdigitalwandler-Paar zwei Wellenknoten der stehenden Rayleigh-Oberflächenwelle mit einem Abstand der halben Wellenlänge der stehenden Rayleigh-Oberflächenwelle zur Kanalmitte quer zur Flussrichtung und zwei Wellenknoten der longitudinalen Druckwelle nahe den Mikrokanalwänden entstehen. Die beiden Interdigitalwandler des jeweiligen Interdigitalwandler-Paares sind gegenüberliegend fluchten zueinander und vorteilhafterweise mit einem Abstand von 1 bis 10 Ganzzahligen der Wellenlänge λ zueinander oder mit einem Abstand von 1 bis 10 Halbganzzahligen der Wellenlänge λ zueinander angeordnet sind. Die Apertur der IDT, also der Überlappungsbereich der Fingerelektroden eines IDT beträgt dabei 5* λ bis 25*λ.
Unter Nutzung der angeregten akustischen Oberflächenwellen des ersten IDT-Paares werden die im Fluid dispergierten Mikropartikel und/oder Zellen durch die in einem zentralen Bereich des Mikrokanals vorhandenen Wellenknoten der stehenden Longitudinalwellen innerhalb des Mikrokanals im Fluid zuerst fokussiert. Im Rahmen der Erfindung soll unter einem „zentralen Bereich des Mikrokanals“ der Bereich in der Mitte des Mikrokanals verstanden werden, der 10% bis 25 % der Breite des Mikrokanals entspricht.
Nach der Fokussierung der Mikropartikel und/oder Zellen werden durch das in Fließrichtung nachfolgend angeordnete Interdigitalwandler-Paar im Ausbreitungsbereich der akustischen Oberflächenwellen die Mikropartikel und/oder Zellen in zwei Fraktionen unter Nutzung der spezifischen Materialeigenschaften, wie Größe, Kompressibilität, Elastizität, Dichte, elektrischen Leitfähigkeit, Permittivität und/oder elektromagnetischer Eigenschaften sortiert und zum Austrag aus dem Mikrokanal über unterschiedliche Auslässe getrennt.
Die IDT erzeugen akustische Rayleigh-Oberflächenwellen mit einer Wellenlänge λ im Bereich von 25µm bis 400µm. Akustische Oberflächenwellen vom Rayleigh-Typ regen im fluidgefüllten Halbraum auf der Substratoberfläche longitudinale Druckwellen an und verlieren dabei Energie („leaky Rayleigh-SAW“). Die ebenfalls angeregten Scherwellen können bei Fluiden mit geringer Viskosität aufgrund ihrer geringen Intensität vernachlässigt werden. Wenn sich Partikel im Fluid befinden wirkt vor allem die akustische Strahlungskraft beziehungsweise deren Gradienten auf diese, welche unter anderem direkt proportional zur Größe, Dichte und Kompressibilität der Zellen und/oder Mikropartikel ist. Außerdem wirken die akustische Strömungskraft, welche besondere Beachtung bei kleineren Wellenlängen findet, sowie Bjerkness-Kräfte, die bei hohen Zell- und/oder Mikropartikelkonzentrationen eine Rolle spielen. Durch die erfindungsgemäß definierte, spezielle geometrische Ausbildung des mindestens einen Mikrokanales in Bezug auf die akustische Wellenlänge wird die Wirkung der akustischen Strömungskraft stark verringert.
Durch die unterschiedlichen Welleneigenschaften der akustischen Oberflächenwellen zwischen den Interdigitalwandler-Paaren bilden sich Wellenknoten an unterschiedlichen Orten innerhalb des Mikrokanals aus, die zur Fokussierung und nachfolgenden Trennung und Sortierungen der Mikropartikel und/oder Zellen führen.
Es wurde auf Basis von Experimenten und numerischen Simulationen überraschenderweise festgestellt, dass ein erfindungsgemäßes Reflexionsverhalten der angeregten akustischen Oberflächenwellen mit Bildung von örtlich definierten Wellenknoten im Mikrokanal dann erreicht werden, wenn der Mikrokanal eine Breite von λ/4 bis λ/2 und eine Höhe von λ/8 bis λ/2 aufweist und die Breite der mindestens zwei Seitenwände des Mikrokanals λ/16 bis λ/2 der von den Interdigitalwandler-Paaren angeregten akustischen Oberflächenwellenlänge aufweist. Ein derart ausgebildeter Mikrokanal führt dazu, dass Wellenknoten der angeregten akustischen Oberflächenwellen innerhalb des Mikrokanals an besonders günstigen Orten erzeugt werden, die im Ausbreitungsbereich des ersten IDT-Pares eine besonders starke Fokussierung der Mikropartikel und/oder Zellen in der Mikrokanalmitte und nachfolgend in der zweiten Stufe im Ausbreitungsbereich des zweiten IDT-Paares ein zuverlässiges Sortieren der Mikropartikel und/oder Zellen ermöglicht. Durch das Vorfokussieren werden die zu sortierenden Mikropartikel und/oder Zellen bei der laminaren Strömung des Fluides von den Seitenwänden des Mikrokanals ferngehalten, sodass die Mikropartikel und/oder Zellen ungehindert und von den Seitenwänden des Mikrokanals unbeeinflusst im Mikrokanal strömen können.
Das Sortieren und damit örtliche Trennen der Mikropartikel und/oder Zellen innerhalb des Fluides im Bereich des in Flussrichtung nachfolgend angeordneten IDT-Paares wird durch eine 180° Phasenverschiebung der angeregten akustischen Oberflächenwellen des zweiten IDT-Paares gegenüber dem ersten IDT-Paar erreicht. Dies kann auf verschiedene Wege erfolgen.
Zur Beeinflussung der akustischen Phasenlage der von den IDT eines IDT-Paares angeregten fortschreitenden akustischen Oberflächenwelle kann sowohl die Position der IDT eines IDT-Paares zueinander in Ausbreitungsrichtung der Oberflächenwelle als auch die elektrische Ansteuerung der Fingerelektroden und die Anordnung der Fingerelektroden im IDT variiert werden.
In einer erfindungsgemäßen Variante sind die IDT mindestens eines IDT-Paares so angeordnet, dass ein IDT durch Rotation des zweiten IDT am Mittelpunkt zwischen den beiden IDT abgebildet ist. In einer weiteren erfindungsgemäßen Variante ist ein IDT durch Spiegelung des zweiten IDT an der Mittellinie zwischen den beiden IDTs quer zur Wellenausbreitungsrichtung abgebildet. Außerdem ist es möglich, die beiden IDT eines IDT-Paares mit einem elektrischen Signal mit gleicher Phasenlage angesteuert sind. In allen drei Varianten wird eine 180° Phasenverschiebung der angeregten akustischen Oberflächenwellen des zweiten IDT-Paares gegenüber dem ersten IDT-Paar erreicht werden.
Eine eher weniger vorteilhafte Lösung ist hingegen die Phasenverschiebung des elektrischen Ansteuersignals, da dies nur mit deutlich höherem technologischem Aufwand möglich ist.
Von Vorteil bei der erfindungsgemäßen Einrichtung ist, wenn mindestens im Bereich der fluid-beaufschlagten Oberfläche des piezoelektrischen Substrats mindestens eine Funktionsschicht in Form einer Diffusionsbarriere, Haftschicht, Passivierungsschicht, fluidkompatible Deckschicht und/oder biokompatible Deckschicht mit einer Schichtdicke von jeweils 5 nm bis 1000 nm vorhanden ist, wobei die Funktionsschicht besonders vorteilhaft eine biokompatible Funktionsschicht ist. Eine zusätzliche Funktionsschicht und insbesondere biokompatible Funktionsschicht auf dem piezoelektrischen Substrat hat den Vorteil, dass chemisch-physikalische Einflüsse und Reaktionen des piezoelektrischen Substrates mit dem im Mikrokanal strömenden Fluid sowie den darin dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen verhindert werden.
Die Abdeckung des Mikrokanals besteht vorteilhafterweise aus einem Material mit geringerer akustischer Impedanz gegenüber dem fließenden Fluid. Derartige Materialien sind beispielsweise PDMS, Silikon oder ein Hydrogel, welche entweder zur Herstellung einer kraftschlüssigen Verbindung zusammen aufgepresst oder für eine materialschlüssige Verbindung aufgebondet sind. Der Einsatz einer Abdeckung mit einem Material mit geringerer akustischer Impedanz als das genutzte Fluid hat den Vorteil das nur geringere Reflexionen der longitudinalen Welle an der Abdeckung in das Fluid und geringere Abstrahlung akustischer Wellen in das Fluid und ein damit weniger komplexes Druckfeld mit definierten Wellenknoten verursacht wird, welches zudem auch weniger von Änderungen der Kanaloberfläche, z.B. Verunreinigungen, beeinflusst wird. Der Einsatz einer Abdeckung des Mikrokanals aus einem Material mit geringer akustischer Impedanz als das genutzte Fluid bewirkt zudem, dass akustische Oberflächenwellen, die auf das Deckmaterial treffen, eher absorbiert als ins Fluid zurück reflektiert werden. Dadurch wird die Bildung von zusätzlichen Wellenknoten bzw. eine Verschiebung der Wellenknoten verhindert.
Erfindungsgemäß weist der Mikrokanal an seinem Ende mindestens zwei Auslässe auf, wobei die Auslässe dazu dienen, die zuvor sortierten Mikropartikel und/oder Zellen aus dem gemeinsamen Fluidstrom getrennt abzuleiten. In einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung kann die Einrichtung einen Mikrokanal aufweisen, der mindestens drei Auslässe aufweist. Der Vorteil eines Mikrokanals mit mindestens drei Auslässen besteht darin, dass neben der separaten Abführung der im Fluidstrom sortierten Mikropartikel und/oder Zellen das verbleibende partikel- oder zellfreie Fluid über den dritten Auslass abgeführt wird.
Zur besseren Trennung der zuvor im Mikrokanal befindlichen, akustisch sortierten Mikropartikel und/oder Zellen ist es vorteilhaft, wenn ein zentraler Auslass und mindestens zwei in einem Winkel von 10° bis 90° zum Mikrokanal angeordnete Seiten-Auslässe vorhanden sind.
Die Geometrie der Auslässe ist in einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung so entworfen, dass die Position der einzelnen Partikel- oder Zellfraktionen in der fluiden Strömung im Mikrokanal nicht gestört wird und diese zu unterschiedlichen Auslässen geleitet werden. Das wird dadurch erreicht, indem der Mikrokanal mindestens drei Auslässe aufweist, bei dem ein zentraler Auslass und mindestens zwei Seiten-Auslässe unter einem Winkel von 10° bis 65° zum Mikrokanal angeordnet sind und die Breite der Auslässe λ/10 bis λ/3 der Wellenlänge durch die in Flussrichtung des Fluids angeordneten zweiten IDT-Paares angeregten akustischen Oberflächenwelle beträgt.
Ebenfalls vorteilhaft ist, wenn der Mikrokanal mindestens drei Einlässe mit einem zentralen Einlass und mindestens zwei Seiten-Einlässe aufweist. Während über den zentralen Einlass das Fluid mit den dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen dem Mikrokanal zugeführt wird, können über die mindestens zwei Seiten-Einlässe ein Hüllfluid zugeführt werden. Ein derartiges Hüllfluidfluid kann in einer besonders vorteilhaften Ausführung ein biokompatibles Hüllfluid sein. Das Hüllfluid beziehungsweise biokompatible Hüllfluid bewirkt und unterstützt die hydrodynamische Fokussierung der Mikropartikel und/oder Zellen und verhindert deren Anhaftung an den Kanalwänden im zentralen Bereich des Mikrokanals bereits vor dem Bereich, in dem die akustischen Oberflächenwellen des ersten IDT-Paares im Mikrokanal angeregt sind.
Zur Anregung der akustischen Oberflächenwellen sind die IDT-Paare jeweils mit einer Hochfrequenz-Signalquelle verbunden. Die jeweilige Hochfrequenz-Signalquelle weist mindestens einen Signalausgang und eine feste Frequenz auf, die auf den Resonanzbereich der jeweiligen IDT abgestimmt ist.
Die mindestens eine Hochfrequenz-Signalquelle stellt erfindungsgemäß eine Ausgangsleistung von 5 mW bis 1 W je Signalausgang bei der Synchronfrequenz oder Resonanzfrequenz der IDT bereit, wobei die Impedanz der einzelnen IDT oder die Impedanz bei einer Parallelschaltung der IDT von mindestens einem IDT-Paar an die elektrische Impedanz der Signalausgänge der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle angepasst ist. So ist es möglich, dass die jeweils zwei IDT der mindestens zwei IDT-Paare einzeln mit einem Ausgang der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle verbunden sind.
Zur Bereitstellung einer gleichmäßigen Leistungsaufteilung auf beide IDT eines IDT-Paares kann die Hochfrequenz-Signalquelle vorteilhafterweise auch einen Signalausgang mit zwischengeschaltetem Impedanz-angepassten Signalteiler (T-Splitter) bei einer Ausgangsleistung aufweisen. Zudem ist es möglich, das vorteilhafterweise der Hochfrequenz-Signalteiler auf die Chipfläche integriert ist, indem die elektrische Impedanz der parallel zusammengeschalteten IDT von mindestens einem IDT-Paar mit gleicher Impedanz an die Signalquelle angepasst ist.
Zur Bereitstellung eines kontinuierlichen Fluidstromes im Mikrokanal ist erfindungsgemäß mindestens eine Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport vorhanden, die mit mindestens einer Einlassöffnung oder mit mindestens einer Auslassöffnung fluiddicht verbunden ist. Die Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport kann vorteilhaft auch eine passive Einrichtung sein, wie beispielsweise ein am Auslass angeordnetes saugfähiges Material.
Eine kontinuierliche Fluidströmung im Mikrokanal ist nach der Fokussierung der Mikropartikel und/oder Zellen für ein zuverlässiges Sortieren und nachfolgendes Trennen der sortierten Fluidströme in die mindestens zwei Auslässe von Bedeutung. Vorteilhaft hierbei ist der Einsatz einer pulsfreien Mikropumpe, wie beispielsweise einer Spritzenpumpe, Osmosepumpe, Einweg- oder Mehrwegpumpe, durch elektrische Signale oder chemische Reaktion angesteuerte Einweg-Membranpumpe oder einer druckbeaufschlagte Verdrängungspumpe.
Zum Bereitstellen des Fluids mit Mikropartikeln und/oder Zellen sowie zum getrennten Auffangen der sortierten Fraktionen ist mindestens ein Fluidreservoir vorhanden, dass mit mindestens einer Einlassöffnung oder mindestens einer Auslassöffnung verbunden ist. Das mindestens eine Fluidreservoir bietet den Vorteil, dass die erfindungsgemäße Einrichtung als Lab-on-a-Chip oder Mikroanalysesystem im Feldeinsatz verwendet werden kann und die sortierten Mikropartikel und/oder Zellen für eine nachfolgende Mikroanalyse und Diagnose getrennt aufgefangen werden.
Mit der erfindungsgemäßen Lösung wird erstmals ein Verfahren bereitgestellt, mit dem in einfacher Art und Weise ein zuverlässiges und effektives Sortieren von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen ermöglicht wird.
Das wird dadurch erreicht, indem ein Fluid mit mindestens zwei Fraktionen unterschiedlicher Mikropartikel und/oder Zellen durch mindestens einen Mikrokanal geleitet wird, wobei eine kontinuierliche und gerichtete Strömung im Mikrokanal erzeugt wird, nachfolgend die Mikropartikel und/oder Zellen mittels einer von einem ersten Interdigitalwandlern-Paar angeregten akustischen Oberflächenwelle in einem Bereich des Mikrokanals fokussiert werden, und nachfolgend die im Fluid fokussierten Mikropartikel und/oder Zellen mittels von einem in Fließrichtung des Fluides nachgeordneten zweiten Interdigitalwandler-Paar angeregten akustischen Oberflächenwellen getrennt und sortiert werden, sodass mindestens zwei getrennten Fraktionen unterschiedlicher Mikropartikel und/oder Zellen innerhalb der Fluidströmung im Mikrokanal erzeugt werden, wobei die Fokussierung und Sortierung der Mikropartikel und/oder Zellen durch elektrische Beschaltung der jeweils zwei Paare von IDT oder durch Rotation eines IDT des ersten IDT-Paares am Mittelpunkt zwischen den beiden IDT und durch Spiegelung eines IDT des zweiten IDT-Paares an der Kanalmittellinie des Mikrokanals realisiert wird, und nachfolgend die mindestens zwei Sorten mit dem Fluid in mindestens zwei Auslässe angeführt werden.
Zur einfachen und verbesserten Fokussierung der Mikropartikel und/oder Zellen kann über mindestens zwei Seiten-Einlässe ein Hüllfluid, und insbesondere biokompatibles Hüllfluid am Mikrokanaleingang über zwei Seiten-Einlässe zugeführt werden. Dies führt dazu, dass eine hydrodynamische Fokussierung der Mikropartikel und/oder Zellen im Zentrum des Mikrokanals bereits vor dem Bereich, in dem die akustischen Oberflächenwellen des ersten Interdigitalwandler-Paares im Mikrokanal angeregt werden, erfolgt. Damit werden die Mikropartikel und/oder Zellen in einfacher Weise von der Seitenwandung des Mikrokanals fern gehalten.
Besonders vorteilhaft werden dabei die Mikropartikel und/oder Zellen in einem zentralen Bereich auf 10% bis 25% der Mikrokanalbreite fokussiert.
Zum Erreichen einer kontinuierlichen Fluidströmung im Mikrokanal wird in einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens ein Fluid mit mindestens zwei Fraktionen unterschiedlich großer Mikropartikel und/oder Zellen mit einer dynamischen Viskosität von < 10mPas eingesetzt. Der Einsatz von Fluiden mit einer dynamischen Viskosität von < 10mPas führt zu einer verbesserten Fließfähigkeit und geringen Beeinflussung der laminaren Strömung im Mikrokanal.
Ausführungsbeispiel
Nachfolgend wir die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Dabei zeigen die

1 den Aufbau der erfindungsgemäßen Einrichtung zum kontinuierlichen Trennen bzw. Sortieren von zwei Fraktionen von Blutzellen aus Vollblut und
2 eine Detailansicht des akustofluidischen Bauteiles.

Die gezeigte Einrichtung besteht aus einem akustofluidischen Bauteil 1, einem Halter für das akustofluidische Bauteil mit elektrischen und fluidischen Kontaktplatten 2, einer Abdeckung 3, zwei mit den Einlässen verbundenen Spritzenpumpen (Cetoni neMESYS) 4a und 4b, einer Hochfrequenz-Signalquelle mit zwei Signalausgängen (BelektroniG PSG) für die erste (I) und zweite (II) Stufe der Zellmanipulation und zwei, jedem der Ausgänge nachgeschalteten Signalteilern 5 (Minicirquits SYS-2-52 HP+), zwei Fluidreservoiren 6a und 6b für die getrennten Zellfraktionen mit kleineren Zellen bzw. Zellbestandteilen (Fraktion B) und größeren Zellen (Fraktion A), Vollblut als Zelldispersion 7a und PBS als Hüllfluid 7b in Kunststoffspritzen (BD Plastipak).
Das akustofluidische Bauteil besteht aus einem Chip aus doppelseitig-poliertem, 500 µm dicken, piezoelektrischen Substrat „black“ LiNbO₃ 128°YX mit auf der Oberseite angeordneten mikrofluidischen Strukturen aus SU-8 Fotopolymer und zwei Paaren Interdigitalwandler zur Anregung von akustischen Oberflächenwellen (SAW).
Die einzelnen, geraden Interdigitalwandler 8 der zwei IDT-Paare sind als Lambda/4-IDT in Form von ineinander greifenden, kammförmigen Elektroden aus 295 nm Al auf 5 nm Ti ausgebildet und weisen jeweils eine Apertur von 3 mm, eine Fingerpaaranzahl von 20 und eine Breite sowie einen Abstand der einzelnen Fingerelektroden zueinander von 75 µm auf. Dadurch ist jeder IDT einzeln für die Anregung von akustische Oberflächenwellen (SAW) mit einer Wellenlänge von 300 µm erzeugt ausgelegt. Da die IDT eines IDT-Paares fluchtend mit einem Stirnabstandabstand (SA_IDT) von 600 µm zueinander angeordnet sind, formen die von jedem der beiden IDT angeregten fortschreitenden SAW im Bereich zwischen den IDT eine stehende SAW mit halber Wellenlänge. Auf der Chipoberfläche und den IDT befindet sich flächig eine 100 nm dicke SiO₂ Schicht mit Aussparungen für die elektrischen Kontaktstellen der IDT.
In Flussrichtung der zu trennenden Bestandteile in der Flüssigkeit dient das erste IDT-Paar zum Fokussieren der Partikel (Stufe I) und das zweite IDT-Paar zum Trennen der Partikel (Stufe II). Die IDT sind so auf dem Substrat angeordnet, dass ein IDT in Stufe I durch Rotation des anderen IDT um Punkt (P1) erhalten wird, während ein IDT in Stufe II durch Spiegelung des anderen IDT um die Mittellinie des Chips (ML) erhalten wird. Die elektrische Beschaltung der IDT erfolgt durch Verbindung der Bus-Bars, d.h. der seitlichen Zuleitungselektroden an den Fingerelektroden der IDT mit der Signalquelle. Die in Richtung der Chipmitte befindlichen Elektroden werden dabei mit dem Massekontakt verbunden und die Außen befindlichen Elektroden eines IDT-Paares werden mit den zwei Ausgängen eines Signalteilers verbunden.
Die mikrofluidischen Strukturen bestehen aus zwei je 50 µm breiten (B_MKW) und 50 µm hohen Seitenwänden 9 auf einer 25 nm dicken Titan-Haftschicht, welche in einer doppelt-symmetrischen Anordnung zur Mitte des Chips eine Mikrokanalstruktur mit einem zentralen Mikrokanal, drei Kanal-Einlässen und drei Kanal-Auslässen formen und die zu trennende Flüssigkeit seitlich begrenzen. Der zentrale Mikrokanal befindet sich dabei mittig zwischen den IDT der IDT-Paare und weist eine Breite (B_MK) von 150 µm auf. Die Kanal-Einlässe und Kanal-Auslässe sind doppeltsymmetrisch zum Chipmittelpunkt (P2) angeordnet, wobei auf jeder Chipseite einer zentraler Ein- bzw. Auslass mit einer Breite von 50 µm und zwei in einem Winkel von 65° zum zentralen Kanal angeordneten Ein- bzw. Auslässe mit einer Breite von 100 µm angeordnet sind. Das Kanalmaterial der beiden Wände besteht aus dem Polymer SU-8 und weist durch lithografische Strukturierung eine Maßhaltigkeit aller geometrischen Abmessungen von besser als 5 µm auf. Die IDT befinden sich in einem Stirnabstand (SA_MK) von 300 µm zur Mittellinie des zentralen Mikrokanals, sodass die stehende SAW sich im Mikrokanal ausbildet.
Der Chip ist auf dem Chiphalter 2 aufgebracht. Auf diesen werden über Schraubverbindungen ebenfalls Leiterplatten (PCB) mit vergoldeten Federstiftkontakten und SMA-Kontakten zur elektrischen Verbindung des Chips zur Signalquelle und Fluidkontaktplatten mit Dichtungsringen und ¼"-28 UNF Fluidadaptern zur fluidischen Verbindung von Chip und Reservoir bzw. zur Spritzenpumpe aufgebracht.
Eine Abdeckung 3 aus PDMS-Silikon (Sylgard 184, Dow Corning Corporation) mit 4 mm Dicke und gestanzten zylinderförmigen Aussparungen an den äußeren Enden der Ein- bzw. Auslässe wird aufgelegt und mit einer Abdeckung aus PMMA mit gleichen Aussparungen über eine Schraubverbindung angepresst.
Das Verfahren zum größenselektiven Trennen der Zellen wird mit der beschriebenen Einrichtung anhand von Vollblut als Fluid mit Zellen unterschiedlicher Größe beschrieben. Die Fraktion A ist größer als 5 µm und beinhaltet rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen, Blutstammzellen, zirkulierende Tumorzellen und Blutzellen und Fraktion B ist kleiner als 5µm und beinhaltet Blutplättchen, Exosome, Liposome, DNA, Antikörper, Bakterien und Plasma.
Zum Sortieren und Trennen der Bestandteile des Vollblutes wird die unverdünnte Probe durch den zentralen Einlass mit einer Flussrate von 2 µL/min in den Mikrokanal geleitet. Durch die beiden seitlichen Kanaleinlässe wird zusätzlich ein Hüllfluid aus phosphatgepufferter Salzlösung zugeführt mit einer Flussrate von 0,5 µL/min. Die elektrische Anregung der IDT-Paare erfolgt bei der zum Minimum des Eingangsreflexionsfaktors des Signalteilers in Richtung der Signalquelle zugehörigen Frequenz. Im Bereich des ersten IDT-Paares wird die Strömung der Blutkomponenten dabei mit einer elektrischen Leistung von 120 mW auf eine Breite von 20% der Kanalbreite in der Mitte des zentralen Mikrokanals fokussiert. Im Bereich des in Flussrichtung danach angeordneten zweiten IDT-Paares wird die Fraktion A der Blutbestandteile dabei mit einer elektrischen Leistung von 150 mW zu den Kanalwänden und damit zu den seitlichen Kanalauslässen geleitet, während die Fraktion B der Blutbestandteile zum zentralen Auslass geleitet wird.
Die so sortierten und getrennten Fraktionen A und B werden dann über den zentralen Kanalauslass und die seitlichen Kanalauslässe in Fluidreservoiren aufgefangen und stehen für weitere Analysen und Untersuchungen getrennt zur Verfügung.
Bezugszeichenliste

1: akustofluidisches Bauteil
2: Halter für elektrische und fluidische Kontaktplatten
3: Abdeckung
4a, 4b: Spritzenpumpe
5: Signalteiler
6: Hochfrequenz-Signalquelle mit Signalteiler
6a, 6b: Fluidreservoir
7a: Zelldispersion
7b: Hüllfluid
8: Interdigitalwandler
9: Seitenwände
I: IDT-Paar erste Stufe
II: IDT-Paar zweite Stufe
B_F: Breite der Fingerelektroden
B_L: Abstand der Fingerelektroden
B_MKW: Breite Mikrokanalwand
B_MK: Breite Mikrokanal
IDT: Interdigitalwandler
ML: Mittellinie des Chips
P1: Rotationspunkt
P2: Chipmittelpunkt
SA_IDT: Stirnabstand IDT
SA_MK: Stirnabstand Mikrokanal
SAW: akustische Oberflächenwelle
W: Apertur

Claims

Einrichtung zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen, enthaltend A. mindestens ein akustofluidisches Bauteil (1) mit mindestens einem piezoelektrischen Substrat, auf dem mindestens ein Fluid-führender Mikrokanal, bestehend aus mindestens zwei Seitenwänden (9) und einer stoff- und/oder kraftschlüssig mit den zwei Seitenwänden (9) verbundenen Abdeckung (3), und mindestens zwei in Flussrichtung des Fluides nacheinander angeordnete Interdigitalwandler-(IDT)-Paare (I,II) zur Anregung von akustischen Oberflächenwellen angeordnet sind, - wobei die IDT (8) eines IDT-Paars (I,II) zur Anregung von akustischen Rayleigh-Oberflächenwellen mit der Wellenlänge λ im Bereich von 25 µm bis 400 µm ausgelegt sind, und - wobei die IDT (8) mindestens eines IDT-Paares (I,II) so angeordnet sind, dass ein IDT (8) durch Rotation des zweiten IDT (8) am Mittelpunkt zwischen den beiden IDT (8) abgebildet ist oder ein IDT (8) durch Spiegelung des zweiten IDT (8) an der Mittellinie (ML) zwischen den beiden IDT (8) quer zur Wellenausbreitungsrichtung abgebildet ist, und - wobei der Mikrokanal mindestens einen kanalförmigen Einlass und mindestens zwei kanalförmige Auslässe aufweist, und - wobei die mindestens zwei Seitenwände (9) des mindestens einen Mikrokanals durch direkte lithografische Strukturierung mindestens einer lichtempfindlichen Polymerschicht hergestellt worden sind, und - wobei die Breite des mindestens einen Mikrokanals (B_MK) λ/4 bis λ/2, die Höhe des mindestens einen Mikrokanals λ/8 bis λ/2 und die Breite (B_MKW) der mindestens zwei Seitenwände (9) des Mikrokanals λ/16 bis λ/2 entspricht, und - wobei der mindestens eine Mikrokanal im Wesentlichen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der akustischen Oberflächenwellen und mindestens teilweise innerhalb des Ausbreitungspfades der durch die mindestens zwei IDT-Paare (I,II) angeregten akustischen Oberflächenwellen auf dem mindestens einen piezoelektrischen Substrat angeordnet ist, und - wobei die Apertur (W) der IDT (8) 5*λ bis 25*λ entspricht, und - wobei mindestens eine Einlassöffnung oder mindestens eine Auslassöffnung mit mindestens einer Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport verbunden ist, und - wobei mindestens eine Einlassöffnung oder mindestens eine Auslassöffnung mit mindestens einem Fluidreservoir (6a,6b) verbunden ist, und - wobei die Abdeckung (3) des mindestens einen Mikrokanals an dem mindestens einen Einlass und den mindestens zwei Auslässen für die Zu- und Abfuhr von Fluiden zur mindestens einen Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport und zum mindestens einen Fluidreservoir (6a,6b) hin geöffnet ist, und B. mindestens eine Hochfrequenz-Signalquelle mit mindestens einem Signalausgang, - wobei die elektrische Impedanz von mindestens einem IDT (8) oder die Impedanz von mindestens einem IDT-Paar (1,11), bei Parallelschaltung aus zwei IDT (8) mit gleicher Impedanz, an die elektrische Impedanz des mindestens einen Signalausgangs der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle angepasst ist, und - wobei die IDT (8) direkt oder über zusätzliche elektrische Baugruppen mit mindestens einem Signalausgang der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle verbunden sind, und - wobei die mindestens eine Hochfrequenz-Signalquelle eine Ausgangsleistung von 5 mW bis 1 W je Signalausgang bei der Synchronfrequenz oder Resonanzfrequenz der IDT (8) bereitstellt, und C. mindestens ein Fluid mit mindestens zwei dispergierten Sorten von Mikropartikeln und/oder Zellen, - wobei die jeweils größte geometrische Abmessung der mindestens zwei dispergierten Sorten Mikropartikel oder Zellen maximal λ/10 entspricht und mindestens eine der mindestens zwei dispergierten Sorten Mikropartikel oder Zellen eine geometrische Abmessung von mindestens 5*λ/1000 aufweist, und - wobei das mindestens eine Fluid eine dynamische Viskosität unter 50 mPas aufweist.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei die mindestens zwei dispergierten Sorten von Mikropartikeln und/oder Zellen hinsichtlich der Dichte, Elastizität, Kompressibilität, elektrischer Leitfähigkeit, Permittivität, Porosität, magnetischer Permeabilität, Remanenz, Sättigungspolarisation, Größe, Volumen und/oder geometrischen Abmessung voneinander unterscheidbar sind.
Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die IDT (8) eines IDT-Paares (I,II) fluchtend in Wellenausbreitungsrichtung mit einem Abstand von 1 bis 10 Ganzzahligen der Wellenlänge λ zueinander angeordnet oder mit einem Abstand von 1 bis 10 Halbganzzahligen der Wellenlänge λ zueinander angeordnet sind.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der mindestens die IDT (8) von mindestens einem IDT-Paar (I,II) über einen Hochfrequenz-Signalteiler (5) mit dem einem Signalausgang der mindestens einen Hochfrequenz-Signalquelle (6) verbunden sind.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die beiden IDT (8) eines IDT-Paares (I,II) mit einem elektrischen Signal mit gleicher Phasenlage angesteuert sind.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der mindestens eine Diffusionsbarriere, Haftschicht, Passivierungsschicht, fluidkompatible Deckschicht und/oder biokompatible Deckschicht mit einer Schichtdicke von jeweils 5 nm bis 1000 nm mindestens im Bereich der Fluid-beaufschlagten Oberfläche des mindestens einen piezoelektrischen Substrats vorhanden ist.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine lichtempfindliche Polymerschicht für die Seitenwände (9) des mindestens einen Mikrokanals vor der lithographischen Strukturierung mittels Schleuderverfahren oder Laminierverfahren auf das piezoelektrische Substrat aufgebracht ist.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine lichtempfindliche Polymerschicht für die Seitenwände (9) des mindestens einen Mikrokanals aus einem Epoxidharz, einem Acrylharz, einem glasharten Polymer und/oder einer Fotolackfolie, insbesondere aus SU-8, ATLAS, Ordyl, ADEX, SUEX, TMMF und/oder DF-1000 besteht.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Abdeckung (3) des Mikrokanals aus einem Material mit geringerer akustischer Impedanz als das Fluid besteht.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Abdeckung (3) des Mikrokanals aus einem Silikon, Polydimethylsiloxan (PDMS) und/oder einem Hydrogel besteht.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Abdeckung (3) des Mikrokanals durch Aufpressen oder Laminieren mit den Seitenwänden (9) des Mikrokanals verbunden ist.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die IDT (8) vom Typ gerader IDT, λ/4, λ/8, bidirektionaler IDT, unidirektionaler IDT, slanted-finger IDT, SPUDT und/oder 2-Tor-Resonator vorhanden sind.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikrokanal einen zentralen Einlass in Richtung des Mikrokanals zur Zuführung des Fluids und mindestens zwei unter einem Winkel von 10° bis 90° zum Mikrokanal angeordnete Seiten-Einlässe zur Zuführung eines Hüllfluides (7b) aufweist.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikrokanal mindestens drei Auslässe aufweist, bei dem ein zentraler Auslass in Richtung des Mikrokanals und mindestens zwei Seiten-Auslässe unter einem Winkel von 10° bis 65° zum Mikrokanal angeordnet sind und die Breite der Auslässe λ/10 bis λ/3 der Wellenlänge durch die in Flussrichtung des Fluids angeordneten zweiten IDT-Paares (II) angeregten akustischen Oberflächenwelle beträgt.
Einrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Einrichtung zum pulsationsfreien Fluidtransport eine Spritzenpumpe (4a, 4b), eine Osmosepumpe, eine Einweg- oder Mehrwegpumpe, eine durch elektrische Signale oder chemische Reaktion angesteuerte Einweg-Membranpumpe, eine auf Kapillarkräften basierende Einrichtung zur Erzeugung eines Unterdrucks im Mikrokanal in Form eines Vlieses, Schwammes, einem porösen und/oder hydrophilen Materials oder eine druckbeaufschlagte Verdrängungspumpe ist.
Verfahren zum Sortieren und Trennen von in Fluiden dispergierten Mikropartikeln und/oder Zellen, bei dem eine kontinuierliche und gerichtete Strömung mindestens eines Fluides mit mindestens zwei darin dispergierten unterschiedlichen Sorten von Mikropartikeln und/oder Zellen und mit einer dynamischen Viskosität unter 50 mPas durch mindestens einen Mikrokanal geleitet wird, der aus mindestens zwei Seitenwänden (9) und einer Abdeckung (3) besteht und eine Höhe von λ/8 bis λ/2, eine Breite (B_MK) von λ/4 bis λ/2 und eine Breite (B_MKW) der Seitenwände (9) λ/16 bis λ/2 aufweist, nachfolgend die Mikropartikel und/oder Zellen im Fluid mittels einer von einem ersten IDT-Paar (I) angeregten, stehenden akustischen Oberflächenwelle im zentralen Bereich des Mikrokanals auf 10% bis 25% der Mikrokanalbreite fokussiert werden, wobei die IDT (8) der IDT-Paare (I,II) Rayleigh-Oberflächenwellen mit gleicher Wellenlänge λ im Bereich von 25 µm bis 400 µm anregen, und nachfolgend mindestens eine Fraktion der fokussierten Mikropartikel und/oder Zellen im Fluid aufgrund mindestens ihrer zur weiteren Fraktion abweichenden Material- oder Geometrieeigenschaften mittels einer von einem zweiten IDT-Paar angeregten stehenden akustischen Oberflächenwelle mit gleicher Wellenlänge λ und einer Phasenverschiebung von 180° gegenüber der akustischen Oberflächenwelle des ersten IDT-Paares vom zentralen Bereich des Mikrokanals zu den Mikrokanalwänden abgelenkt und damit sortiert werden, sodass mindestens zwei getrennte Fraktionen unterschiedlicher Mikropartikel und/oder Zellen innerhalb der Fluidströmung im Mikrokanal erzeugt werden, wobei die Fokussierung und Sortierung der Mikropartikel und/oder Zellen durch elektrische Beschaltung der jeweils zwei Paare von IDT (1,11) oder durch Rotation eines IDT des ersten IDT-Paares (8) am Mittelpunkt zwischen den beiden IDT (8) und durch Spiegelung eines IDT des zweiten IDT-Paares (II) an der Kanalmittellinie des Mikrokanals realisiert wird, und nachfolgend eine der sortierten Fraktionen der Mikropartikeln und/oder Zellen aus dem Mikrokanal über einen zentralen Auslass und mindestens eine weitere Fraktion der Mikropartikeln und/oder Zellen über mindestens einen Seiten-Auslass abgeführt werden, und mindestens eine Fraktion in einem Fluidreservoir (6a,6b) aufgefangen wird.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem über mindestens zwei Seiten-Einlässe ein Hüllfluid (7b) am Mikrokanaleingang zugeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, bei dem IDT (8) vom Typ gerader IDT, λ/4, λ/8, bidirektionaler IDT, unidirektionaler IDT, slanted-finger IDT, SPUDT oder 2-Tor-Resonator eingesetzt werden.