CN103389237B - 一种简易低成本微阵列芯片点样器的使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简易低成本微阵列芯片点样器及使用方法，所述点样器由一个包含微通孔阵列和一组微管道的硅橡胶芯片构成，芯片上每个微通孔至少与一条微管道相通，各条微管道之间相互独立，且每条微管道至少连接一个进样口。使用时，首先将点样器置于真空环境中进行脱气处理，然后将脱气处理后的点样器与待点样基片贴合，点样器中包含微通孔阵列的一面接触待点样基片，并在各进样口滴加相应待固定样品，利用脱气硅橡胶块体吸收微管道中空气形成的负压驱动进样口液样充满微管道和微通孔阵列，经过一定时间的静置，待微通孔阵列中液样与基片表面完成交联反应后，剥离点样器，并清洗基片，即可得到完成点样的微阵列芯片。

Description

一种简易低成本微阵列芯片点样器的使用方法

技术领域

本发明涉及一种微阵列芯片点样器及使用方法，更确切地说所述微阵列芯片点样器具有简易和低成本特点，所述的点样器可应用于生物医学的高通量分析和筛选等领域。

背景技术

微阵列芯片（Microarray）是近年发展起来的一种新的分子生物学研究工具，它通过在基片表面有序地排列大量具有生物识别功能的分子或生物样品，利用生物分子间特异相互作用，实现对核酸、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。微阵列芯片技术可以在一次实验中特异性检出样品中的多种成分或致病因子，在基因研究、临床诊断、新药开发、环境保护等多个领域都具有广泛的应用价值，已成为当前生物医学领域的革命性前沿技术之一。虽然微阵列芯片技术具有非常突出的技术上的优势，虽也经历了近二十年的发展，但是目前并未能获得到广泛应用，主要原因在于微阵列芯片价格太高，限制了其用户规模。所以，要实现微阵列芯片技术的广泛应用，关键在于降低微阵列芯片的应用成本。目前微阵列芯片制作技术主要包括：接触式点样技术和非接触式点样技术；接触式点样技术一般是利用点样针头与基片表面直接接触，实现样品在基片表面的有序分配；而非接触式点样技术类似于喷墨打印技术，利用压电、静电或热膨胀等方法将微喷头中的样品喷射至基片表面，实现微阵列芯片制作。虽然这两种技术均已相当成熟，但市场上也有不少相关产品，但是这两种技术在实际应用中均存在以下局限：1.点样设备所用点样针头（或喷头）和点样机器人价格昂贵，导致微阵列芯片制作成本居高不下；2.点样设备精密复杂，需要经过专门培训的技术人员操作，增加了人力成本；3.点样设备体积庞大，且对环境条件有较高要求，需要专门的存放空间；4.点样设备所用点样针头（或喷头）均为重复使用，存在样品交叉污染的危险；5.点样过程对样品的表面张力和粘度等性质敏感，易造成不同样品在最终点样效果的不均一和不一致，从而影响数据分析的可靠性和可信度[Barbulovic-NadI,LucenteM,SunY,ZhangM,WheelerAR,BussmannM.Bio-microarrayfabricationtechniques--areview.CritRevBiotechnol.2006,26(4):237-59;DufvaM.Fabricationofhighqualitymicroarrays.BiomolEng.2005,22(5-6):173-84.]。此外，这两种技术虽然在大批量芯片制作中，具有自动化和速度方面的优势，但是不适宜用于微阵列芯片的小批量、DIY（Doityourself）制作，因此在众多普通实验室中难以得到推广应用。为了实现微阵列芯片技术的广泛应用，将微阵列芯片用户范围从大型科研单位扩大到数量众多的医院和普通实验室，真正发挥微阵列技术在临床诊断、基因研究、新药开发等领域的优势，迫切需要发展一种新型、低成本、简易的微阵列芯片制备装置，以大幅度降低微阵列芯片的制作成本，拓展其应用规模，直接为亿万病人和众多中小实验室服务。这无疑成为本发明的构思。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简易低成本微阵列芯片点样器，所提供的点样器无需精密昂贵的机械装置和外接供能单元，可简便、迅速地制备高质量的微阵列芯片，具有操作简便、成本低廉的特点，从而可望实现微阵列芯片技术在临床和高通量生化分析方面的的普及应用。

本发明提供的一种简易低成本微阵列芯片点样器，其特征在于：所述点样器为一个包含微通孔阵列和一组微管道的硅橡胶芯片，芯片上微通孔阵列的每个通孔至少与一条微管道相通，各条微管道之间相互独立，且每条微管道至少连接一个进样口。所述点样器包含至少一个微通孔阵列，且每个微通孔阵列所有通孔几何形状尺度均一致，通孔的几何形状可以为圆形、椭圆形和多边形中任意一种。对于简单的样品点阵排布来说，点样器的各条微管道可以位于同一层；对于复杂的点阵排布来说，为了防止样品分配过程中各条管道中样品的交叉混合，点样器的各条微管道可以位于二层及以上不同层，不同层的微管道均与对应的进样口和微通孔相连。

依据使用过程中的作用，所述点样器包含上下两个功能表面（如图2所示），上表面包含进样口，用于加样；下表面包含微通孔阵列，用于限定待固定样品与基片接触反应区域。而且，点样器下表面除微通孔区域外其余为平整平面，以保证点样过程中点样器与基片的紧密贴合；下表面面积应等于或小于待点样基片面积，以保证点样过程中所有微通孔阵列均坐落于基片上。

本发明所述的微阵列芯片点样器的使用方法如下：首先，将点样器置于真空容器（压强<10kPa）中进行至少40分钟脱气处理，脱气处理后的点样器从真空容器中取出后可直接应用，也可密封于真空袋中随时备用；经过脱气处理后的点样器从真空容器或真空密封袋中取出，与待点样基片对准贴合，其中点样器下表面（即包含微通孔阵列的一面）接触基片，由于硅橡胶具有良好的柔顺性，通过范德华力作用可以很好地贴附于平整玻璃表面，实现完美密封；完成贴合组装后，在点样器上表面各进样口滴加待固定样品溶液，使样品溶液封住各微管道进样口，形成微管道封闭体系，由于脱气处理后的硅橡胶块体具有较高的溶解气体特性，因此点样器微管道中的空气会持续被其硅橡胶管壁吸收，使封闭微管道体系中产生负压，形成流体驱动力，驱动液体样品充满微管道和微通孔阵列；待样品液体充满点样器微管道和微阵列后，以油滴密封各进样口，以防止样品液水分挥发，并将组装点样器的基片置于合适的温度和湿度环境中，静置至少30分钟以上，最后从基片上剥离点样器，并将基片浸入合适的清洗液中清洗，去除未反应的样品分子，吹干。由于点样器中填充的液体样品仅在通孔处与基片表面接触，发生交联反应，因此最终剥离点样器、清洗未反应样品分子后，基片表面仅在与点样器通孔接触处形成样品点，即基片表面形成与点样器微通孔阵列对应的样品点微阵列，制得基于点样器微通孔阵列定义的微阵列芯片。

对于传统的针式接触点样技术和非接触的喷墨式点样技术来说，在点样过程中，分配至基片表面的每个样品微液滴，除了底面受基片限制外，其余各个方向均处于开放状态，可以自由流动，因此当液滴的体积、密度、表面张力以及基片的表面能等出现变化和差异时会影响液滴与基片的接触面积（即样品固定结合面积）；另外，针式接触点样技术基于毛细作用实现取样，其取样体积也受样品液表面张力影响，而喷墨式点样技术分配液滴过程中，喷射液滴大小也受样品液表面张力和粘度的影响。因此，对于传统的针式接触点样技术和非接触的喷墨式点样来说，由于样品液表面张力、粘度等性质的差异以及基片表面性质的不稳定性等因素的影响，导致难以制作具有良好均一性和一致性的微阵列芯片，从而限制了微阵列芯片技术的应用。而本发明提供的点样方法使得样品液与基片的接触区域（即固定结合区域）受微通孔开口限制，因此所形成样品点的形状和面积大小仅与微通孔开口相关，而不受样品液表面张力、粘度、密度和基片表面能等因素影响，故利用该技术只需制作均一的微通孔阵列，即可轻易制备具有良好均一性和一致性的微阵列芯片。

本发明提供的基于硅橡胶芯片的微阵列芯片点样器，与现有的基于机械手的微阵列点样装置相比，无需精密昂贵的机械装置和专业的操作人员，也无需外接供能设备和庞大的放置空间，可大幅度降低微阵列芯片的制作成本，且该点样器具有较高的灵活性，适用于普通实验室进行微阵列芯片的小批量和DIY制备，因此有望实现微阵列芯片技术的普及应用；同时，该点样器的点样效果不受待点样液体的表面张力、粘度等因素的影响，保证了微阵列芯片制作的一致性，且可一次性使用，避免交叉污染，可大大提高微阵列芯片技术应用的可靠性。

本发明所述点样器无需精密昂贵的机械装置，也无需外接供能设备和专业的操作人员，可大幅度降低微阵列芯片的制作成本，实现微阵列芯片技术的普及应用；同时，该点样器的点样效果不受待点样的液体表面张力、粘度等性质的影响，可大大提高微阵列芯片制作的一致性和可靠性。

附图说明

图1为本发明基于单层微管道连通的微通孔阵列的点样器结构示意图，图中：(a)点样器，(b)为A剖面放大图，(c)为B剖面放大图，(d)为C剖面局部放大图。

图2为图1所示点样器上表面结构示意图（图(a)）和下表面结构示意图（图(b)）。

图3为图1所示点样器使用流程，图中：(a)点样器脱气处理，(b)脱气后点样器与玻片贴合，(c)进样口液体填充，(d)完成微阵列芯片制作。

图4为本发明基于多层微管道连通的微通孔阵列的点样器结构示意图。。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性特点和显著的进步。

实施例1

如图1所示，本发明提供的简易、低成本微阵列芯片点样器，其特征在于所述点样器（1）为一个包含微通孔阵列和一组微管道的硅橡胶芯片，芯片上微通孔阵列的每个通孔（2）至少与一条微管道（3）相通，各条微管道之间相互独立，且每条微管道至少连接一个进样口（4）。又如图2包含上、下两个功能表面的点样器结构示意图(a)为上表面，(b)为下表面。

实施例2

首先将点样器（1）置于真空容器（5）（压强<10kPa）进行脱气处理（如图3a所示），脱气1小时后，取出点样器，并将其包含微通孔阵列的一面与醛基修饰的玻片（6）贴合（如图3b所示），然后在每个进样口分别滴加1μL不同抗体溶液（7），在脱气硅橡胶吸收微管道中空气形成负压的作用下，进样口液体填充微管道和微通孔阵列（如图3c所示），待所有抗体溶液充满微管道和微通孔阵列后，在各进样口滴加2μL石蜡油，并将点样器和玻片的组合体，放置于25℃环境中，静置24小时。最后，从玻片上剥离点样器，并将玻片浸入清洗液中震荡10min，以去离子水漂洗，氮气吹干，完成抗体微阵列芯片（8）的制备（如图3d所示）。

实施例3

对于复杂的微阵列点样图形来说，上述基于单层微管道的点样器往往难以实现，因为各条微管道与微通孔阵列连接排布中不可避免出现相互交叉。为了保持各条微管道之间相互独立，防止各条微管道的交叉导致的相互间样品串扰混合，实现复杂微阵列点样图形，可以采用多层微管道结构构建，将单层排布中相互交叉的微管道分布在不同的结构层。比如对于每个微阵列含36个点样位点，且要求单个微阵列中每个点样位点固定不同样品的点样要求来说，可以采用如图4所示的三层结构构建的点样器来实现，该点样器由通孔层（9）、第一管道层（10）和第二管道层（11）构成，图4左边结构(a)为爆炸示意图，(b)为组装图。

Claims (2)

1.一种简易低成本微阵列芯片点样器的使用方法，所述的点样器为一个包含微通孔阵列和一组微管道的硅橡胶芯片，芯片上微通孔阵列的每个通孔至少与一条微管道相通，各条微管道之间相互独立，且每条微管道至少连接一个进样口；其特征在于包含以下步骤：

a)将点样器置于真空容器中进行至少40分钟脱气处理；

b)将脱气处理后的点样器与待点样基片对准贴合，其中点样器包含微通孔阵列的一面接触基片；

c)在各进样口滴加待固定样品溶液，使各微管道形成封闭体系，利用脱气硅橡胶块体吸收微管道中空气形成负压，驱动液体样品充满微管道和微通孔阵列；

d)静置至少30分钟后，从基片上剥离点样器，并将基片浸入清洗液中清洗，吹干，完成微阵列芯片制备。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)脱气处理后的点样器或从真空容器中取出直接应用或密封于真空袋中随时备用。