CN101629143B - 用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片、制备方法及应用。其特征在于所述的芯片从上向下依次为阀控制通道层，流体通道层和适合细胞贴壁生长的玻璃层。该芯片可用于不同浓度药物并行作用多种细胞，进行高通量细胞药物筛选。所述的芯片采用多次曝光，一次显影的Su-8负性光刻胶工艺以及多层PDMS键合，制作了具有高深宽比的多层结构的芯片。本发明提供的微流控细胞阵列芯片可以实现低试剂消耗、高通量的多种细胞共培养，并行分析不同药物浓度对不同细胞的刺激作用及其在片的实时观察与检测，为高通量药物筛选和细胞-药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。

Description

用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片、方法及应用

技术领域

本发明涉及用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片、制备方法及应用，属于微流控芯片技术领域，。

背景技术

高通量药物分析技术主要用于药物研究的发现阶段，这一阶段也是药物研究的基础和关键。自20世纪90年代以来因现代技术的发展而出现的以96孔板为基础的高通量筛选由于其快速、高效等特点，适合初步筛选，被国际大多数药物研究机构广泛采用，并得到快速的发展，已成为药物筛选的主要技术手段之一。但是基于这种方式的细胞水平药物筛选存在一些局限，如高通量筛选一般通过多孔板(96孔和384孔板)进行，消耗的试剂量比较大，虽然微孔板可以减少试剂的用量，可其微体积的溶液易蒸发，而且微量样品液体的分配和操作难度大、精度要求高，此外高通量筛选的设备体积庞大、价格昂贵。这些很大程度限制了高通量筛选的普及应用。因此，高通量筛选技术的微型化、自动化和成本化是未来发展的必然趋势。

微流控芯片技术是20世纪90年代初由瑞士的Manz和Widmer首次提出的，由于其具有分析速度快、试剂消耗少、易于集成和高通量分析等诸多优点，在过去的二十年里，微流控芯片在生物和化学样品的分析处理方面取得了显著的进展，近几年来微流控芯片技术的研究人员把研究方向转移到了更为复杂的生物系统，例如利用微流控芯片进行细胞分析的研究.这样微流控芯片对于细胞生物学、神经学、药学和组织工程等领域的探索研究起到越来越重要的作用。

微流控芯片技术在细胞研究方面具有特殊的优势，例如微通道的尺寸与细胞尺寸相当，可以精确的控制微环境的成分、温度等因素，模拟体内细胞外基质的情况，同时增强实验的操作性。而且在微流控芯片中可以通过设计特定的二维甚至三维结构和精密加工集成微阀微电极等器件实现细胞的培养、操纵、定位、溶解、检测等多种功能，设计灵活多样，各具特色。目前，将微流控芯片技术用于细胞研究和药物筛选等方面已有不少报道，如Hung P.J.等在文献(Hung P.J.，Lee P.J.，Sabounchi P.，Aghdam N.，Lin R.，Lee L.P.， A novel high aspect ratio microfluidic design to provide a stable and uniformmicroenvironment for c

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片及其制备方法，即通过对微系统加工技术的SU-8模具制作和PDMS芯片制作等工艺的研究，设计制作具有多层结构的可以实现对细胞和微流体进行操控的的微流控细胞阵列芯片，构建成高通量的细胞药物筛选的平台。本发明采用微加工技术，即“多次曝光一次显影”的SU-8双层模具工艺和双层PMDS粘合工艺，设计和制作微流控细胞阵列芯片，在芯片上制作独特的培养腔阵列及其微通道，进行多种细胞的固定分布和共培养，集成微阀单元实现对芯片微流体的控制，并在芯片上设计药物浓度梯度结构，形成不同浓度的药物溶液，不同浓度的药物并行作用不同的细胞，获得多参数的药物细胞参数，为了药物筛选和药物细胞研究提供了一个理想的研究方法和平台。从而建立高通量的细胞药物筛选的平台。

具体地说，本发明的目的是通过微流控阵列芯片设计和制造、芯片内细胞的导入、区域分布和固定培养及药物梯度的形成和刺激、细胞培养活性和药物作用的检测三个主要步骤实现的。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

1)根据细胞培养技术和高通量药物筛选结合微流控芯片技术的特点，设计细胞阵列芯片，通过对“多次曝光，一次显影”的SU-8负性光刻胶工艺以及多层PDMS(聚二甲基硅氧烷)键合工艺的研究，设计并制作了具有高深宽比的多层结构的微流控细胞阵列芯片，该芯片由三层结构组成，自上而下依次为阀控制通道层、流体通道层和适合细胞贴壁生长的玻璃层，包含以下核心单元：C型坝结构的细胞培养池阵列，细胞进样和培养液微通道，药物梯度浓度通道网络，阀控制通道以及进出口等。

其中，

(a)所述流体通道层和玻璃层通过离子键合构成流体通道单元，所述流体通道单元包括细胞培养池构成的细胞培养池阵列，相应数目的横向进样管道和出样管道，相应数目的纵向进样管道和出样管道；所述横向进样管道和出样管道分别用于药物的进样及排出，纵向进样管道和出样管道分别用于待检测细胞的进样及排出；所述细胞培养池中有一个C型坝结构，所述C型坝开口朝向细胞进样方向，坝顶(底)与玻璃层间有一小于细胞直径的狭缝，以控制进样细胞的分布；

(b)所述阀控制通道层与流体通道层通过PDMS热键合构成阀控制单元，所述阀控制单元为位于相邻细胞培养池之间的管道上方、用于阻断细胞培养池间的联系的横向阀组和纵向阀组，所述横向阀组和纵向阀组均为由PDMS与PDMS薄膜构成的密闭的空腔，所述空腔分别与压力施加装置相连，当对阀空间施加压力后，PDMS薄膜发生形变，阻挡流体通道层的液体流动，从而实现相应阀组对流体通道层横向或纵向通道的封闭；当压力移除后，PDMS薄膜恢复原形，从而恢复流体层通道横向或纵向的液体流通；

(c)所述芯片的流体通道单元还包括药物浓度梯度网络，所述药物浓度梯度网络为多级通道组组成的网络，所述通道组的通道数量从进样孔向细胞培养池阵列依次增加至与纵向阀垂直的细胞培养池阵列方向的细胞培养池数目相同，所述进样孔的数目大于1个小于纵向阀垂直的细胞培养池阵列方向的细胞培养池数目；

(d)所述进样孔的数目为2；

(e)所述细胞培养池阵列为6×6细胞培养池阵列；

(f)所述流体层的通道高为50μm；宽为100μm；培养池为一边长600μm的正6边形，中间有一个半径为200μm的C型坝结构，坝高45μm，宽50μm；

(g)所述压力施加装置为注射器。

2)采用微量注射泵将培养液、多种细胞(血管内皮细胞，正常肝细胞和肝癌细胞)及其它成分导入芯片中，利用设计的C型坝结构及微流体特性以及阀控制作用将细胞分布在特定的区域，利用细胞培养箱的条件进行细胞在片培养。

3)导入治疗肿瘤的药物，药物在芯片的药物梯度浓度网络中形成6个不同浓度的药物成分，分别与芯片的培养池阵列的细胞作用，通过荧光探针和荧光显微镜检测细胞的活性，分析特异荧光探针标记的胞内物质各个参数(线粒体膜电位和细胞膜等)的改变，通过这些参数的变化的分析来研究药物对细胞的药物作用机理。

本发明构建的微流控细胞阵列芯片能够很好地控制细胞在芯片内的生长分布，有效地解决阵列芯片细胞分布无序的难题。通过双层PDMS键合将微阀器件集成到芯片上，通过对阀控制网络的操控实现阵列芯片流体的控制。这些工艺的研究有效地解决了微流控芯片在基于细胞研究方面的一些关键问题。芯片还设计了药物浓度梯度网络，形成稳定的梯度药物浓度，以便研究不同浓度药物对细胞的毒性作用。微流控细胞阵列芯片可用于细胞药物筛选的高通量、低成本的快速筛选，同时也可用于一些细胞相关的研究。

本发明不仅阐述了一种基于微流控技术的高通量药物筛选平台的构建方法，还提供了多层多结构的细胞培养阵列芯片的制作方法(详见实施例1)。

本发明提供的用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片可用于不同浓度药物并行作用多种细胞，进行高通量细胞药物筛选。芯片通过C型的三维坝结构将进样细胞拦截在芯片的细胞培养的固定区域，设计了药物浓度梯度结构，产生6个不同浓度的药物刺激细胞，同时芯片还集成了PDMS微阀网络实现了芯片通道内微流体的操控。微流控细胞阵列芯片可以实现低试剂消耗、高通量的多种细胞共培养，并行分析不同药物浓度对不同细胞的刺激作用及其在片的实时观察与检测，为高通量药物筛选和细胞-药物研究提供了一个全新的技术平台和方法。

附图说明

图1为本发明的微流控细胞阵列芯片总体结构图，其中，1为6×6细胞培养池阵列；2为药物梯度浓度网络；3和4分别为纵向阀组和横向阀组。

图2为本发明的微流控细胞阵列芯片三层结构截面图；其中，5为阀控制通道层；6为流体通道层；7为玻璃层。

图3为本发明的微流控细胞阵列芯片的细胞进样、阀阵列控制的示意图；其中，8为C型环坝结构；9为细胞进样时纵向阀的控制的示意图；10为药物梯度浓度作用细胞时时横向阀的控制的示意图；11为进样后被固定在C型环坝内的细胞的示意图。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的一种具体实施过程。

如图2所示，微流控细胞阵列芯片有三层结构，分别为：阀控制通道层(图2中的5)(第一层)，流体通道层(图2中的6)(第二层)和适合细胞贴壁生长的玻璃层(图2中的7)(第三层)，其中阀控制通道层与流体通道层通过PDMS热键合构成阀控制单元，流体通道层和玻璃层通过氧等离子键合构成流体通道单元。

流体通道单元包括6×6细胞培养池阵列(图1中的1)以及横向进样管道和出样管道、纵向进样管道和出样管道；其中，横向进样管道和出样管道用于药物的进样，纵向进样管道和出样管道用于检测细胞的进样。流体通道层的通道高为50μm；宽为100μm，每个培养池为600μm×600μm，中间有一个半径为200μm的C型坝结构，坝高45μm，宽50μm，该C型坝的开口朝向细胞进样方向，坝顶部与玻璃层之间有一高度小于细胞直径的狭缝(通常为5μm)，该结构可以将细胞拦截在坝内，保证细胞在固定的区域生长，而培养基和药物等液体可以自由流通。(红色标识的数值最好为一范围而不是单点数值)

阀控制通道层有2组位于相邻细胞培养池之间、用于阻断细胞培养池间的联系的控制阀，分别是横向阀组(图1中的4)和纵向阀组(图1中的3)。这两种阀的结构是由第一层阀控制通道层的PDMS与第二层流体通道层的PDMS薄膜构成密闭的空腔，并分别与压力施加装置相连(即图1中的注射器)，当通过注射器对阀空间加压力时，下层的PDMS因杨氏模量小且厚度薄，易发生形变，阻挡第二层流体通道层液体流动，从而实现横向阀组或纵向阀组阀对流体通道层通道的封闭效果；当压力移除后，PDMS薄膜恢复原形变，从而恢复流体通道层横向或纵向通道的液体的流通。

如图3所示，通过C型坝结构和微阀阵列实现了芯片的操控，即对细胞培养区域的分布，通道微流体的控制。细胞进样时在芯片内的分布是通过芯片培养池的C型坝(图3中的8)结构的物理拦截来实现的。坝顶部与玻璃层之间构成一个5μm的狭缝，而细胞的直径一般为10-20μm，因此，细胞进入培养腔，由于狭缝的拦截作用和微流体的流动，细胞只分布在培养腔的中心区域，即C型坝内，而其它区域的细胞会随着流体流走，这样细胞阵列芯片可以有效地控制进样细胞的分布区域，以便实验的观察和分析。

为获得不同浓度梯度的药物的试验结果，在上述微流控细胞阵列芯片中还可以加入一个如图1中2所示的药物浓度梯度网络，该网络为由多级通道组组成的网络，所述通道组的通道的数量从进样孔向细胞培养池阵列依次增加，至与纵向阀垂直的细胞培养池阵列方向的细胞培养池数目相同。在图1所示的微流控细胞阵列芯片中，该药物梯度网络包含2个进样孔和5级浓度梯度通道(图1中的2)，可产生6个不同浓度的药物溶液。

虽然在本实施例中，细胞培养池阵列为一6×6细胞培养池阵列，但对于本领域的技术人员而言，根据本发明的内容和教导，为试验的需要，而使用其他规格的细胞培养池阵列，能达到其相应的试验目的，是显而易见的，因此，也是本方面需要保护的内容。

实施例1、芯片的制备

该微流控芯片采用多次软光刻技术以及模塑法制作。芯片采用具有良好的透光透气性和生物相容性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料与常规载玻片键合形成细胞培养池阵列及其微通道网络结构。芯片制作的关键工艺是通过制作双层的SU-8负性光刻胶的流体通道层模具形成坝结构以及热键合法制作双层的PDMS(聚二甲基硅氧烷)芯片。具体步骤如下：

1)在清洗干净的硅片基底上甩涂上稀释配成的SU8-2005(MicroChemCorp，MA，USA，用SU8-2025与环戊酮按体积比100：53稀释而成)，厚约5μm，放在热板上65℃烘1min然后升温至95℃保持2min，缓慢降温到室温，在光刻机上第一次曝光后，将硅片放到热板上进行PEB(Post exposed bake)，即65℃加热烘1min，然后升温到95℃保持2min，之后缓慢降至室温，用SU-8负胶专用显影液显影后，得到第一层的SU-8光刻胶模具；

2)接着将SU8-2050甩涂到具有第一层SU-8结构的基片上，厚度约为50μm，完成前烘，将第二层掩模板与第一层光刻图形对准，第二次曝光和PEB，最后超声辅助显影就形成双层图形结构的流体通道层SU-8模具；

3)采用步骤1)和2)中的方法，用SU8-2050完成单层的阀控制通道图形的SU-8模具的制作；

4)为了制作双层的PDMS芯片，先将PDMS(Dow Corning，Michigan，USA)单体与固化剂按重量比20:1均匀混合，抽真空进行脱气处理后，倒入双层图形结构的SU-8模具中，在甩胶台上转速800rpm甩涂30s，然后放置在热板上70℃加热10min，形成厚约150μm的PDMS薄层；接着调配单体与固化剂比为10:1的PDMS，真空脱气处理后，浇注在阀控制通道层的SU-8模具中，厚为5mm，在热板70℃加热20min，冷却后从硅片剥离，将剥离的阀控制PDMS层在显微镜下与流体通道层的PDMS薄层对准贴合，然后移至热板上90℃加热1h，完成双层PDMS的热键合。

5)最后将双层PDMS从硅片上剥离，打好孔并切割合适大小，与清洗干净的玻璃片进行氧等离子键合，形成芯片通道的封闭，完成微流控细胞阵列芯片的制作。

实施例2、芯片的应用

芯片培养的细胞采用人肝癌细胞SMMC-7721，人肝正常细胞HL-7702和脐静脉内皮细胞。细胞培养液为RMPI1640(Gibco)，添加10％的胎牛血清(杭州四季青)和1％的链青双抗(杭州吉诺生物医药技术有限公司)，细胞消化液为0.25％的胰酶和0.02％的EDTA(杭州吉诺生物医药技术有限公司)。

芯片通入75％乙醇，用紫外线照射1h，进行消毒处理。先用注射泵在芯片内通入细胞培养液2h，以排除芯片内残余的乙醇和气泡，有利于细胞在培养腔内贴壁生长。通过注射泵将三种细胞分别导入芯片的各纵列细胞培养腔，进行细胞培养。每24h通过注射泵更换一次细胞培养液，以保证细胞培养时的营养更新和代谢物的排除。

在芯片集成微阀以实现对芯片通道微流体的控制。当多种细胞进样时，横向阀(图3中的10)打开，纵向阀(图3中的9)关闭，不同的细胞分别进入纵向的细胞培养腔，由于纵向阀阻隔了横向通道的液体流动，各个纵向的细胞不会进入别的纵向细胞培养腔，从而实现多种细胞在片共培养。

细胞成功培养后，药物浓度梯度结构产生的6种含不同浓度药物的细胞培养液从横向通道进入细胞培养腔，横向阀关闭，纵向阀打开，药物溶液可以保持稳定的浓度作用于横向的不同细胞的培养腔。因此芯片两组阀的操控可以进行对芯片通道内的微流体的控制，实现了芯片多种细胞的共培养和不同浓度的药物分别对不同的细胞进行刺激的功能。

本发明构建的微流控细胞阵列芯片能够很好地控制细胞在芯片内的生长分布，有效地解决阵列芯片细胞分布无序的难题。通过双层PDMS键合将微阀器件集成到芯片上，通过对阀控制网络的操控实现阵列芯片流体的控制。这些工艺的研究有效地解决了微流控芯片在基于细胞研究方面的一些关键问题。芯片还设计了药物浓度梯度网络，形成稳定的梯度药物浓度，以便研究不同浓度药物对细胞的毒性作用。微流控细胞阵列芯片可用于细胞药物筛选的高通量、低成本的快速筛选，同时也可用于一些细胞相关的研究。

本发明不仅阐述了一种基于微流控技术的高通量药物筛选平台的构建方法，还提供了多层多结构的细胞培养阵列芯片的制作方法。

Claims (9)

1.一种用于高通量药物筛选的微流控细胞阵列芯片，其特征在于，所述芯片从上向下依次为阀控制通道层，流体通道层和适合细胞贴壁生长的玻璃层；

所述流体通道层和玻璃层通过离子键合构成流体通道单元，所述流体通道单元包括细胞培养池构成的细胞培养池阵列，相应数目的横向进样管道和出样管道，相应数目的纵向进样管道和出样管道；所述横向进样管道和出样管道分别用于药物的进样及排出，纵向进样管道和出样管道分别用于待检测细胞的进样及排出；所述细胞培养池中有一个C型坝结构，所述C型坝开口朝向细胞进样方向，坝顶或坝底与玻璃层间有一小于细胞直径的狭缝，以控制进样细胞的分布；

所述阀控制通道层与流体通道层通过PDMS热键合构成阀控制单元，所述阀控制单元为位于相邻细胞培养池之间的管道上方、用于阻断细胞培养池间的联系的横向阀组和纵向阀组，所述横向阀组和纵向阀组均为由PDMS与PDMS薄膜构成的密闭的空腔，所述空腔分别与压力施加装置相连，当对阀空间施加压力后，PDMS薄膜发生形变，阻挡流体通道层的液体流动，从而实现相应阀组对流体通道层横向或纵向通道的封闭；当压力移除后，PDMS薄膜恢复原形，从而恢复流体层通道横向或纵向的液体流通。

2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片的流体通道单元还包括药物浓度梯度网络，所述药物浓度梯度网络为多级通道组组成的网络，所述通道组的通道数量从进样孔向细胞培养池阵列依次增加至与纵向阀垂直的细胞培养池阵列方向的细胞培养池数目相同，所述进样孔的数目大于1个小于纵向阀垂直的细胞培养池阵列方向的细胞培养池数目。

3.如权利要求2所述的芯片，其特征在于，所述进样孔的数目为2。

4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述细胞培养池阵列为6×6细胞培养池阵列。

5.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述流体层的通道高为50μm；宽为100μm；培养池为一边长600μm的正6边形，中间有一个半径为200μm的C型坝结构，坝高45μm，宽50μm。 

6.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述压力施加装置为注射器。

7.制备如权利要求1所述的微流控细胞阵列芯片的方法，其特征在于采用多次曝光、一次显影的Su-8负性光刻胶工艺以及多层PDMS键合，制作了具有高深宽比的多层结构的芯片，所述方法包括以下步骤：

a)在清洗干净的硅片基底上甩涂上稀释配成的5μm厚的SU8-2005，于65℃烘1min，升温至95℃保持2min，缓慢降温到室温，在光刻机上第一次曝光后，将硅片放到热板上，于65℃加热烘1min，升温到95℃保持2min，之后缓慢降至室温，用SU-8负胶专用显影液显影后，得到第一层的SU-8光刻胶模具；

b)将SU8-2050甩涂到具有第一层SU-8结构的基片上，厚度约为50μm，完成前烘，将第二层掩模板与第一层光刻图形对准，第二次曝光和PEB操作，最后超声辅助显影就形成双层图形结构的流体通道层SU-8模具；

c)采用步骤1)和2)中的方法，用SU8-2050完成单层的阀控制通道图形的SU-8模具的制作；

d)为了制作双层的PDMS芯片，先将PDMS单体与固化剂按重量比20:1均匀混合，抽真空进行脱气处理后，倒入双层图形结构的SU-8模具中，在甩胶台上转速800rpm甩涂30s，放置在热板上70℃加热10min，形成厚约150μm的PDMS薄层；接着调配单体与固化剂比为10:1的PDMS，真空脱气处理后，浇注在阀控制通道层的SU-8模具中，厚为5mm，在热板70℃加热20min，冷却后从硅片剥离，将剥离的阀控制PDMS层在显微镜下与流体通道层的PDMS薄层对准贴合，然后移至热板上90℃加热1h，完成双层PDMS的热键合。

e)最后将双层PDMS从硅片上剥离，打好孔并切割合适大小，与清洗干净的玻璃片进行氧等离子键合，形成芯片通道的封闭，完成微流控细胞阵列芯片的制作。

8.按权利要求7所述的微流控细胞阵列芯片的制备方法，其特征在于步骤a中所述的稀释配成的Su 8-2005是用Su 8-2005与环戊酮按100:53的体积比稀释而成。

9.如权利要求1—6中任一项所述的芯片，其特征在于用于不同浓度的药物并行作用于多种细胞进行高通量细胞药物筛选。

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