CN106940351B - 一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法，该方法包括：制备微流控芯片；中药质量的检测；a)将磁珠和靶酶依次注入第一通道内进行反应，获得磁珠‑酶复合物；b)将磁珠‑酶复合物转移至第二通道，向第二通道内注入样品溶液，混合、孵育后，再加入酶底物，进行反应，得到反应液；c)测定反应液吸光度，通过计算样品的酶抑制率判断中药的质量；生物活性成分的测定。该方法不仅能够更加快速、经济、高效、全面地评价中药的质量，还能够有效提高分析效率，降低检测成本，方便、快速地发现中药内的生物活性成分。

Description

一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的 方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法。

背景技术

自中药现代化战略实施以来，中药产业取得了巨大的成就，国际影响力也日益扩大。但是，我国中药产业的发展仍存在较多问题；中药安全事件时有发生，其有效性和安全性备受质疑。中药质量控制是制约中药现代化和国际化的一个重要因素。

因此，发展中药质控技术，不仅对于保证药材及其产品的安全性、有效性和一致性有着现实意义，同时也具有重大的工业应用价值，是中药发展战略顺利实施的重要技术支撑。

目前，中药质量评价方法主要以化学分析为主，包括化学成分定量分析(药效成分、活性成分、指标成分或主要化学成分以及有毒有害成分)、色谱指纹图谱和其他鉴别分析(显微、理化和薄层色谱等)。这些方法极大地推动了中药质量控制的发展，为保障中药质量做出了巨大的贡献。

然而，由于中药成分复杂、物理化学性质差异大且活性成分不清，现有的检测指标难以确切反映其临床疗效。因此，中药生物活性检测已成为中药质控技术的研究热点。已有一些生物评价方法应用于中药质量控制，如基因芯片、酶联免疫吸附实验、微热量法和RT-PCR等，但这些方法重复性较差、实验流程长、分析成本大，仍需进一步改进。此外，这些方法也难以发现中药的活性成分。

微流控芯片是一项将样品制备、反应、分离、检测等操作单元集成到一块数平方厘米的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的技术。与传统的试管或微孔板分析相比，微流控芯片具有样品量小、反应速度快、自动化程度高、便携性好等特点。此外，微流控芯片具有良好的集成性，易于与其他设备或装置联用。

因此，如何将微流控芯片很好地应用于中药质量评价及其活性成分的检测中，是一个非常值得深入的研究方向。

发明内容

本发明提供了一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法，该方法不仅能够更加快速、经济、高效、全面地评价中药的质量，还能够有效提高分析效率，降低检测成本，方便、快速地发现中药内的生物活性成分。

一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法，包括以下步骤：

(1)制备微流控芯片：

所述微流控芯片上设有第一通道、第二通道和转移通道；所述第一通道与第二通道通过转移通道进行连通；

(2)中药质量的检测：

a)将磁珠缓冲液和靶酶缓冲液依次注入第一通道内进行反应，获得磁珠-酶复合物；

b)将磁珠-酶复合物转移至第二通道，向第二通道内注入样品溶液，混合、孵育后，再加入酶底物，进行反应，得到反应液，作为样品组；

c)采用等量缓冲液替代样品溶液，并重复步骤(a)、(b)，制得的反应液作为对照组，分别测定样品组和对照组的反应液吸光度，通过计算样品的酶抑制率判断中药的质量；

(3)生物活性成分的测定：从所述反应液内样品与靶酶结合的化合物中，解离获得中药样品的生物活性成分。

上述微流控芯片的制备方法采用常规方法制备，主要为：先通过光刻法制作微流控芯片模具，再配制芯片胶，通过注塑、脱模、打孔、键合以及置于恒温烘箱内干燥，得检测所需的微流控芯片。

所述微流控芯片采用的材料可以为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、环烯烃共聚物(COC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC)；其中，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

进一步地，所述微流控芯片上还设有气道，气道与转移通道上的气阀连通，用于控制转移通道的开闭。

气阀的开启和关闭通过气道的压力控制，当压力维持在20PSI时，既可使转移通道维持良好的闭合状态，又可以防止压力过大使气阀破损。

作为优选，所述磁珠缓冲液为含磁珠的磷酸盐缓冲液，所述磁珠的粒径为100～150nm，表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺基团；无需活化即可与生物配体形成碳氮共价键，实现快速、温和偶联。

所述样品溶液的制备方法，包括：取中药样品，经甲醇水溶液超声提取浓缩后，获得中药提取物，用缓冲液溶解中药提取物，得到样品溶液。

上述方法中，所述的靶酶是一类会受到中药抑制，能够反映中药药效的酶；例如：凝血酶、血管紧张素转换酶(ACE)、α葡萄糖苷酶、DPP-4、SIRT1等。

本发明实施案例中以芪参益气滴丸作为检测对象，其主要成分为：黄芪、丹参、三七；所以，当所述样品为黄芪、丹参、三七中至少一种时，作为优选，所述靶酶为凝血酶、血管紧张素转换酶中的一种。当然，也可以利用多种靶酶的评价结果来综合考虑中药的质量。

作为优选，本发明采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。

进一步优选，所述靶酶为凝血酶时，缓冲液采用pH值为6.5的磷酸盐缓冲液；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，缓冲液采用pH值为8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

在上述适宜的缓冲液pH值下，凝血酶或血管紧张素转换酶的活性最佳。

进一步地，所述靶酶为凝血酶时，靶酶底物为S-2238；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，靶酶底物为FAPGG。

作为优选，所述孵育的时间为0.5～2h。更优选，所述靶酶为凝血酶时，孵育的时间为1h；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，孵育的时间为1.5h。

作为优选，所述靶酶为凝血酶时，反应液中的凝血酶终浓度为0.2～0.4U/mL，靶酶底物终浓度为0.2～0.4mmol/L，样品终浓度为0.5～100mg/mL；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，反应液中的血管紧张素转换酶终浓度为0.02～0.04U/mL，靶酶底物终浓度为0.6～0.8mmol/L，样品终浓度为0.5～100mg/mL。

具体地，所述酶抑制率的计算方法为：

若靶酶为凝血酶，测定靶酶与底物反应后的反应液吸光度；酶抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/对照组吸光度)]×100％；

若靶酶为血管紧张素转换酶，先测定底物刚加入时反应前的反应液吸光度，再测定靶酶与底物反应后的反应液吸光度；酶抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度差值/对照组吸光度差值)]×100％，所述吸光度差值为反应前和反应后的吸光度差值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用微流控芯片作为中药质量检测的平台，提高了分析效率，减少了试剂和样品用量，从而降低了检测成本，方便、快速地发现了中药内的生物活性成分；并从中药的作用机制出发，通过测定中药对靶酶的抑制程度，来计算靶酶抑制率，将靶酶抑制率作为质控指标反映中药的质量，使质控指标与药品的临床疗效更相关，能够更加快速、经济、高效、全面地评价中药的质量，为提高中药质量标准、中药新药开发提供了有益参考。

附图说明

图1为本发明所述微流控芯片的结构示意图；

其中，1为第一通道；2为第二通道；3为转移通道；4为第一进样孔；5为第一出样孔；6为第二进样孔；7第二出样孔；8为气阀；9为气道；

图2为不同批次的芪参益气滴丸对凝血酶和ACE的抑制率；

图3为不同批次的芪参益气滴丸中间体对凝血酶和ACE的抑制率。

具体实施方式

下面通过具体实施案例对本发明做进一步描述。

一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法，具体步骤如下：

(1)制备微流控芯片：

采用光刻方法制作芯片模具，硅片分别用超纯水、无水乙醇、丙酮清洗干净，在200℃将硅片烘干；在硅片表面甩上SU-8光刻胶，烘干后用紫外线进行曝光，并再次烘干；之后用显影剂漂洗，显影后取出硅片，用氮气吹干，得到微流控芯片模具。

按10:1调聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物，在真空中将胶搅拌均匀，去除气泡；将硅片模具置于洁净的锡纸上，用镊子将硅片压实后倒胶，在烘箱中85℃干燥，剥下PDMS，用打孔机在芯片上打出进样孔和出样孔，将载玻片和PDMS置于等离子处理机中活化表面，取出，对准，将表面贴合，最后把芯片放入65℃烘箱中干燥，得到微流控芯片。

该微流控芯片的结构如图1所示，其包括：第一通道1、第二通道2和转移通道3，第一通道1与第二通道2通过转移通道进行连通；

第一通道1的两端分别设有第一进样孔4和第一出样孔5；第二通道2两端分别设有第二进样孔6和第二出样孔7；第一进样孔4与第二出样孔7位于同侧；第一出样孔5与第二进样孔6位于同侧。转移通道3设有气阀8，气阀8与气道9连通，气阀8的开启和关闭通过气道9的压力控制，当压力维持在20psi时，即可使转移通道3维持良好的闭合状态，又可以防止压力过大使气阀破损。

(2)中药质量的检测：

样品溶液的制备：取中药样品，加溶剂提取，提取液离心去除杂质颗粒，上清液经离心浓缩或减压浓缩干燥，得中药提取物；取提取物适量，精密称定，用与靶酶相同的缓冲液溶解，离心，取上清液待用。

磁珠-酶复合物的制备：取粒径100～150nm的磁珠用偶联缓冲液(pH＝7.35的PBS)清洗3次，用微量注射泵注入微流控芯片第一通道1内；取凝血酶/ACE等靶酶用缓冲液溶解，注入已加有磁珠的第一通道1中，并通过外加磁场控制磁珠在通道内来回移动加快反应速率。室温下孵育2小时，以形成磁珠-酶复合物，撤去气道压力，使芯片中间的转移通道处于开放状态，再通过磁场使磁珠-酶复合物向芯片的第二通道2移动。当复合物转移完毕时，气道恢复20PSI的压力，使转移通道闭合。

中药质量的检测：取中药样品适量注入第二通道2与磁珠-酶复合物共孵育0.5～2小时，孵育后，注入靶酶相应的靶酶底物，反应0.5～1小时后，测定吸光度，计算酶抑制率，进而对中药的质量进行评价。

(3)中药活性成分的检测：用缓冲溶液冲洗第二通道2，冲洗掉未结合的化合物和反应的水解产物。之后，通过微量注射泵注入有机试剂使酶变性，解离中药中与酶结合的化合物，收集溶液离心浓缩/减压浓缩干燥，加适量溶剂复溶，离心，取上清液注入液质联用仪中分析，鉴定与酶结合的活性化合物。

实施例1 应用凝血酶和评价芪参益气滴丸质量

芪参益气滴丸由黄芪、丹参、三七、降香(油)四味药材组成，临床上主要用于冠心病、心绞痛等心血管疾病。本实施例以凝血酶抑制率评价5个不同批次芪参益气滴丸的质量。

一种基于微流控芯片的检测芪参益气滴丸质量及其生物活性成分的方法，具体步骤如下：

(1)制备微流控芯片(如上文所述)。

(2)中药质量的检测：

a)芪参益气滴丸样品溶液的制备：取5g芪参益气滴丸样品，加体积比为70％甲醇水溶液40mL，超声提取40min，提取液离心去除杂质颗粒，将上清液50℃下离心浓缩干燥，得芪参益气提取物；取提取物适量，精密称定，用pH＝6.5的PB缓冲液(含0.1％DMSO)溶解提取物，离心，取上清液待用。

b)磁珠-酶复合物的制备：取粒径在100～150nm之间的磁珠用偶联缓冲液(pH＝7.35的PBS)清洗3次，用微量注射泵注入微流控芯片的第一通道内；取凝血酶用pH＝6.5的PB缓冲液溶解，注入已加有磁珠的第一通道中，通过外加磁场控制磁珠在通道内来回移动加快反应速率。

室温下孵育2小时，形成磁珠-凝血酶复合物，撤去气道压力，使芯片中间的转移通道处于开放状态，再通过磁场使磁珠-酶复合物向芯片的第二通道移动；当复合物转移完毕时，气道恢复20psi的压力，使转移通道闭合。

c)芪参益气滴丸样品质量的检测：取芪参益气滴丸样品溶液适量，注入第二通道与磁珠-凝血酶复合物共孵育1小时；孵育后，注入凝血酶底物S-2238与凝血酶反应，获得反应液，其中，样品溶液、凝血酶溶液和S-2238的终浓度分别为40mg/mL，0.2U/mL，0.3mmol/L。

d)加入凝血酶底物S-2238后，反应30min，测定反应液的吸光度；以等量的缓冲液替代样品溶液制备得到的反应液作为对照组，计算不同批次芪参益气滴丸对凝血酶的抑制率。

凝血酶抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/对照组吸光度)]×100％

结果如图2所示。

实施例2 应用血管紧张素转换酶(ACE)评价芪参益气滴丸质量

本实施例以血管紧张素转换酶(ACE)抑制率评价5个不同批次芪参益气滴丸的质量(批号与实施例3相同)。

一种基于微流控芯片的检测芪参益气滴丸质量及其生物活性成分的方法，具体步骤如下：

(1)制备微流控芯片(如上文所述)。

(2)中药质量的检测：

a)芪参益气滴丸样品溶液的制备：取5g芪参益气滴丸样品，加体积比为70％甲醇水溶液40mL，超声提取40min，提取液离心去除杂质颗粒，将上清液50℃下离心浓缩干燥，得芪参益气提取物；取提取物适量，精密称定，用pH＝8.3的Tris-HCl缓冲液(含0.1％DMSO)溶解提取物，离心，取上清液待用。

b)磁珠-酶复合物的制备：取粒径在100～150nm之间的磁珠用偶联缓冲液(pH＝7.35的PBS)清洗3次，用微注射泵注入微流控芯片的第一通道内；取ACE用pH＝8.3的Tris-HCl缓冲液溶解，注入已加有磁珠的第一通道中，通过外加磁场控制磁珠在通道内来回移动加快反应速率。

室温下孵育2小时，形成磁珠-ACE复合物，撤去气道压力，使芯片中间的转移通道处于开放状态，再通过磁场使磁珠-酶复合物向芯片的第二通道移动；当复合物转移完毕时，气道恢复20psi的压力，使转移通道闭合。

c)芪参益气滴丸样品质量的检测：取芪参益气滴丸样品溶液适量，注入第二通道与磁珠-ACE复合物共孵育1.5小时；孵育后，注入ACE底物FAPGG与ACE反应，获得反应液，其中，样品溶液、ACE溶液和FAPGG的终浓度分别为10mg/mL，0.03U/mL，0.7mmol/L。

d)加入ACE底物FAPGG后，反应30min，测定反应液的吸光度；以等量的缓冲液替代样品溶液制备得到的反应液作为对照组，计算不同批次芪参益气滴丸对ACE的抑制率。

ACE抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/对照组吸光度)]×100％，

结果如图2所示。

结合实施例1和实施例2，图2以散点图的形式同时显示了5个不同批次芪参益气滴丸对凝血酶和ACE的抑制率。5个不同批次的滴丸制剂样品对凝血酶和ACE的抑制率在20％-35％之间，批次间一致性较好。

实施例3

本实施例以凝血酶抑制率评价11个不同批次芪参益气滴丸中间体的质量。中间体批次信息见表1。

表1 不同批次芪参益气中间体批次信息

芪参益气滴丸中间体样品溶液的制备：取滴丸中间体样品适量，精密称定，用pH＝6.5的PB缓冲液(含0.1％DMSO)溶解，离心，取上清液待用。

含磁珠-凝血酶复合物的微流控芯片制备：该步骤与实施例1相同。

取中间体样品溶液适量注入芯片反应通道2与磁珠-凝血酶复合物共孵育1小时。孵育后注入底物S-2238与凝血酶反应，反应30分钟后在405nm波长处检测吸光度，计算酶抑制率对芪参益气滴丸中间体的质量进行评价。

结果见图3。

实施例4 应用ACE评价芪参益气滴丸中间体质量

本实施例以ACE抑制率评价11个不同批次芪参益气滴丸中间体质量(批次与实施例5相同)。

芪参益气滴丸样品溶液的制备：取滴丸中间体样品适量，精密称定，用pH＝8.3的Tris-HCl缓冲液(含0.1％DMSO)溶解，离心，取上清液待用。

含磁珠-ACE复合物的微流控芯片制备：该步骤与实施例2相同。

取芪参益气滴丸中间体样品溶液适量注入芯片反应通道2与磁珠-ACE复合物共孵育1.5小时。孵育后注入底物FAPGG与ACE酶反应，反应30分钟后在340nm波长处测定吸光度，计算酶抑制率对芪参益气滴丸的质量进行评价。

结果见图3。

结合实施例3和实施例4，图3采用散点图的方式同时显示样品对凝血酶和ACE的抑制率。可以看出，I1-I5样品对两种酶的抑制率比较接近，而I6、I7和I8对酶的抑制率，相比于I1，明显下降：I6中丹参药材异常，它对凝血酶和ACE的抑制率均显著下降，因此可以推断丹参对两种酶均有一定抑制率；I7中黄芪药材异常，它对ACE的抑制率显著下降，可以推断黄芪对ACE有抑制率；I8中三七异常，对凝血酶抑制率显著下降，可以推断三七对凝血酶有抑制作用。此外，当样品中添加降香油时，可以看到I9，I10和I11三个样品对凝血酶的抑制率均明显提高，说明降香油对凝血酶有抑制作用。

上述实施例证实本发明可用于评价不同批次中药的生物活性，通过酶抑制率可以较好地反映药品质量的波动。

实施例5 芪参益气滴丸活性成分发现

传统的化学分离法发现中药活性成分耗时费力，且命中率低，因此如何快速发现活性成分是中药研究中的热点问题。能与酶特异性结合是化合物有相应活性的前提之一，本发明利用微流控芯片，通过洗脱酶上结合的中药成分来快速发现中药活性成分。

实施例3和4测定结束后，以PB缓冲液或Tris-HCl缓冲液冲洗反应通道3次，冲洗掉未结合的化合物与反应的水解产物。之后，通过微量注射泵注入体积分数80％的甲醇溶液用于酶变性，解离芪参益气中与酶结合的化合物。孵育1小时后，收集溶液，于离心浓缩仪中干燥，再以体积分数80％的甲醇溶液复溶，10000rpm离心10分钟后注入液相色谱-质谱仪中分析。

液相色谱-质谱分析条件为：Agilent 1100高效液相色谱仪，串联LCQ DecaXP^plus离子阱质谱仪，配备ESI离子源。

色谱条件：Zorbax SB-C₁₈柱(4.6mm×100mm，1.8μm)，流动相：A相(0.1％甲酸水溶液)，B相乙腈，梯度洗脱：0-15min,5-23％B；15-25min,23-24％B；25-40min,24-40％B；40-44min,40-58％B；44-55min,58-58％B；55-60min,58-95％B；60-66min,95％B，流速：0.4mL/mn；柱温30℃，进样体积15μL。

质谱条件：扫描模式：负离子扫描模式，扫描范围：m/z为100-1500，毛细管电压-15V，离子源电压-3kV，离子源温度350℃，鞘气流速：60arb，辅助气流速：20arb。

同时设置对照组，即相同条件处理但不加酶，以减少非特异性吸附造成的假阳性结果。

样品进样后，通过提取离子流图来获取色谱峰的峰面积，同时按公式：结合率(％)＝[(As-Ac)/As]×100％(As和Ac分别是化合物在样品组和对照组中的峰面积)来判断与酶特异性结合的化合物。

为了进一步验证筛选的准确性，以化学对照品进行相应酶的抑制实验确证筛选结果，抑制率高于70％的进一步测定IC₅₀。

实验结果如表2所示，有9个化合物的结合率较高，验证实验结果也表明，其中丹参素有较好的凝血酶和ACE抑制作用，迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸C有较强的凝血酶抑制活性，芒柄花苷有一定的ACE抑制活性。

表2 芪参益气凝血酶和血管紧张素转换酶筛选结果

该实施例证实本发明可在中药质量评价的同时，快速、高效、准确地发现中药的活性化合物，为提高中药质量标准和新药开发水平提供了可行技术。

Claims (9)

1.一种基于微流控芯片的检测中药质量及其生物活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备微流控芯片：

所述微流控芯片上设有第一通道、第二通道和转移通道；所述第一通道与第二通道通过转移通道进行连通；所述微流控芯片上还设有气道，气道与转移通道上的气阀连通，用于控制转移通道的开闭；

(2)中药质量的检测：

a)将磁珠缓冲液和靶酶缓冲液依次注入第一通道内进行反应，获得磁珠-酶复合物；

b)将磁珠-酶复合物转移至第二通道，向第二通道内注入样品溶液，混合、孵育后，再加入酶底物，进行反应，得到反应液，作为样品组；

c)采用等量缓冲液替代样品溶液，并重复步骤(a)、(b)，制得的反应液作为对照组，分别测定样品组和对照组的反应液吸光度，通过计算样品的酶抑制率判断中药的质量；

(3)生物活性成分的测定：从所述反应液内样品与靶酶结合的化合物中，解离获得中药样品的生物活性成分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠缓冲液为含磁珠的磷酸盐缓冲液，所述磁珠的粒径为100～150nm，表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺基团。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品溶液的制备方法，包括：取中药样品，经甲醇水溶液超声提取浓缩后，获得中药提取物，用缓冲液溶解中药提取物，得到样品溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为黄芪、丹参、三七中至少一种；所述靶酶为凝血酶、血管紧张素转换酶中的一种。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶酶为凝血酶时，缓冲液采用pH值为6.5的磷酸盐缓冲液；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，缓冲液采用pH值为8.3的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述靶酶为凝血酶时，靶酶底物为S-2238；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，靶酶底物为FAPGG。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为0.5～2h。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶酶为凝血酶时，反应液中的凝血酶终浓度为0.2～0.4U/mL，靶酶底物终浓度为0.2～0.4mmol/L，样品终浓度为0.2～2mg/mL；所述靶酶为血管紧张素转换酶时，反应液中的血管紧张素转换酶终浓度为0.02～0.04U/mL，靶酶底物终浓度为0.6～0.8mmol/L，样品终浓度为0.5～2mg/mL。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶抑制率的计算方法为：

若靶酶为凝血酶，测定靶酶与底物反应后的反应液吸光度；酶抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/对照组吸光度)]×100％；

若靶酶为血管紧张素转换酶，先测定底物刚加入时反应前的反应液吸光度，再测定靶酶与底物反应后的反应液吸光度；酶抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度差值/对照组吸光度差值)]×100％，所述吸光度差值为反应前和反应后的吸光度差值。