CN107570246B - 一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片及其微流控方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片及其微流控方法，芯片由三层的PDMS组成，上层是集成外部管路的连接层，中间是气动阀控制层，下层是微通道流体层。气动阀控制层可实现将大量的线虫单个分配到各个培养室；陷阱式结构的培养室可以有效捕获线虫进行长期培养；药物分配器可以在线配制多个药物浓度。与传统的微孔板筛选方法相比，本发明创新性地将整个活体动物抗菌药物筛选实验集成到一块芯片上按流程自动地和连续地进行，大大节省了分发自由活动的线虫这种极耗时的手工操作，以及线虫接种、感染和培养皿之间转换等繁琐操作，能够以更简单、高效的操作方式进行活体动物水平的抗菌药物活性筛选实验。

Description

一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片及其微流控方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术领域，特别涉及一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片及其微流控方法。

背景技术

细菌耐药性问题已经成为全世界的公共卫生危机，随着越来越多耐药菌的出现，现阶段的抗菌药物研发速度难以应对日渐严重的抗感染治疗需求，开发高效的筛选方法去寻找新型抗菌药物具有非常重要的意义。目前，基于线虫水平的抗菌药物筛选方法主要是以培养皿或微孔板为实验平台，一般是先在琼脂培养皿上涂布病原菌，然后再接种线虫进行感染实验，用培养液将感染线虫清洗干净后转移到含有候选药物的微孔板上进行救治实验。但这些常规方法都需要大量繁琐耗时的手工操作或者昂贵的辅助设备，是一种低效率、高成本的筛选方法。因此，有必要开发一种高效率、低成本的抗菌药物筛选方法以及相应的芯片，用于连续地、自动地完成整个活性筛选。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片，该芯片通过集成气动控制阀的线虫分发器、陷阱式培养室和药物分配器，可以连续和自动地进行整个抗菌活性筛选实验，具有成本低和效率高的优点。

本发明的另一个目的在于提供一种基于上述用于抗菌药物筛选的线虫芯片的筛选方法，该方法控制简单且精确，能够自动完成整个抗菌活性筛选实验。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片，为三层结构，上层是连接层，设有线虫进样口、药物进样口、气动阀连接口和废液出口；中间是气动阀控制层，设有气动阀；下层是微通道流体层，设有若干个培养模块，每个培养模块的入口端分别与线虫进样口和药物进样口相连，出口端与废液出口相连，每个培养模块内设有单个线虫进样通道和培养室，单个线虫进样通道只允许一个线虫进入；气动阀设置在单个线虫进样通道和培养室的连接处，气动阀连接口一端与气动阀相连，一端与空气泵相连，气动阀采用具有一定弹性的薄膜；在线虫进样前，开启空气泵加压，气动阀膨胀，防止线虫进入培养室，待每个单个线虫进样通道均占据一个线虫后，关闭空气泵减压，气动阀恢复薄膜状态，线虫被流体推送进培养室。

优选的，所述线虫进样口处连接一个同样口径的移液枪吸头，用来线虫输入。

优选的，所述气动阀采用具有一定弹性的PDMS(聚二甲基硅氧烷)薄膜，形状为斜T-型结构。采用斜T-型结构有利于增加其与进样通道的接触面积。

更进一步的，所述气动阀采用PDMS单体与引发剂重量比为18～22:1的PDMS薄膜。最优为20:1。这种比例可以制备出固定形状但又可以保持高弹性的薄膜阀，容易挤压变形。

更进一步的，所述PDMS薄膜的厚度为单个线虫进样通道深度的15～25％，最优为20％。这种尺寸可以保证加压时有效阻塞进样通道，而不加压力时，线虫可以顺利通过阀门进入培养室。

优选的，所述每个培养模块中所有单个线虫进样通道呈鱼刺状，且单个线虫进样通道与线虫进样方向成钝角，120°为最优，便于线虫进入单个线虫进样通道。

所述单个线虫进样通道的尺寸大小可以根据线虫的大小进行调节，优选的，设计为：长度为线虫体长，宽度和深度为线虫体径的1.2～1.5倍。这种结构可保证单个线虫能够顺利进入通道且不会对线虫形成挤压。

优选的，所述培养室采用比单个线虫进样通道表面低陷的陷阱式结构。以便于捕获线虫。

更进一步的，所述培养室的出口设有栅栏状的通道。从而进一步防止线虫进入连接通道。

优选的，所述微通道流体层上设有用于在线分配多种药物浓度梯度并传输到培养室内的药物分配器，药物分配器的进药口与药物进样口相连。

优选的，所述线虫芯片采用PDMS材料制作而成。

一种基于上述用于抗菌药物筛选的线虫芯片的筛选方法，包括步骤：

(1)芯片的线虫进样口插入一个同样口径的移液枪吸头，药物进样口连接微量注射泵，关闭所有废液出口，打开空气泵，打开气动阀加压；

(2)打开微量注射泵，调节适当流速，通过导管往线虫进样口加入线虫悬浮液；

(3)线虫在流体的推动下进入芯片进样主通道，并随着流体的流动方向，在牵引力作用下进入单个线虫进样通道；

(4)待每个单个线虫进样通道已经占据一个线虫时，打开废液出口，将多余的线虫排出芯片外；

(5)关闭废液出口，关闭空气泵，关闭气动阀，用移液枪往线虫进样口快速加入培养液，将单个线虫进样通道中的线虫推送进培养室。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

(1)利用气动阀实现线虫分发，可以在短时间内完成大量的单个线虫自动分流到各个培养室，有效地节省了人工分发活线虫的工作量。

(2)芯片集成了多种功能单元，可以在线、连续完成线虫的培养、细菌感染、药物救治等整个抗菌药物筛选实验，有利于降低实验误差和提高实验的效率。

(3)芯片上培养室的体积比普通的微孔板小，且可以在线更换溶液和洗涤样品，极大地降低实验试剂和分析时间的消耗。能够有效、长期捕获线虫在培养室内且不影响其身体的自由活动。

(4)芯片是采用PDMS制作而成，制作和操作都很简单，适合非专业的技术人员使用，有利于商业推广。

附图说明

图1为实施例1芯片的结构示意图。

图2为实施例1培养模块处的局部放大示意图。

图3为实施例2中单个线虫的进样示意图，气动阀开启状态。

图4为实施例2中单个线虫的进样示意图，气动阀关闭状态。

图5为实施例3采用临床抗生素验证抗菌药物筛选芯片可靠性的实验结果图。

其中，1为线虫进样口；2为药物进样口；3为废液出口；4为气动阀连接口；5为气动阀；6为单个线虫进样通道，7为培养室；8为药物分配器；9为栅栏状通道。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例提供一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片，该芯片由三层PDMS材料制成。芯片的结构见图1，芯片结构的局部放大示意图见图2。

上层是芯片与外管路的连接层。它包含：(1)一个线虫进样口1，连接一个同样口径的移液枪吸头，用来线虫输入；(2)两个药物进样口2，用于病原菌、培养液和药物的输入；(3)四个废液出口3，用于线虫进样后排出多余的线虫和残余物；(4)四个气动阀连接口4，用于连接微型的空气泵。

中间层是气动阀控制层。上面设有气动阀5。本实施例中气动阀采用PDMS单体与引发剂重量比为20:1特制的PDMS薄膜。形状为斜T-型结构。厚度为单个线虫进样通道深度的20％。设置在进样通道与培养室连接处，通过外部的空气泵填充空气实现膨胀变形，主要用来控制线虫的分发与捕获。

下层是微通道流体层。它包括：(1)鱼刺状的单个线虫进样通道6。单个线虫进样通道结构特别设计为：长度为线虫体长，宽度和深度为线虫体径的1.25倍；(2)陷阱结构的培养室7。培养室设计为比通道表面低陷的陷阱式结构，用来捕获线虫；(3)四种浓度的药物分配器8。用来在线分配多种药物浓度梯度并传输到培养室内的线虫。

本实施例中，所述单个线虫进样通道，尺寸大小可以根据线虫的大小进行调节，例如采用青年期线虫，进样通道尺寸为：长1.0mm，宽和深均为50μm，这种结构保证单个线虫进入通道但不会对线虫形成挤压。

本实施例中，所述培养室，尺寸大小可以根据线虫的大小调节，例如采用青年期线虫，设计为低于表面0.5mm的深度可以有效捕获线虫。所述培养室的出口，设有栅栏状的通道9，防止线虫进入连接通道。

本发明创新性地将整个活体动物抗菌药物筛选实验集成到一块芯片上按流程自动地和连续地进行，能显著地降低实验试剂和分析时间的消耗，极大地提高抗菌药物筛选的效率。与传统的微孔板筛选方法相比，本发明大大节省了分发自由活动的线虫这种极耗时的手工操作，以及线虫接种、感染和培养皿之间转换等繁琐操作，能够以更简单、高效的操作方式进行活体动物水平的抗菌药物活性筛选实验。

实施例2

参见图3、4，本实施例采用实施例1所述芯片，用于同时操作大量的单个线虫进入培养室，操作步骤是：

(1)芯片的线虫进样口1插入同样口径的移液枪吸头，两个药物进样口2连接微量注射泵，关闭四个关闭废液出口3，打开气动阀连接口4，对气动阀5加压。

(2)打开微量注射泵，调节适当流速，通过导管往进样口1加入线虫悬浮液。

(3)线虫在流体的推动下进入芯片主通道，并随着流体的流动方向，在牵引力作用下进入单个线虫进样通道6。

(4)单个线虫进样通道6的特殊结构只允许一个线虫进入，待每个进样通道已经占据一个线虫，打开废液出口3，多余的线虫将随着液体排出芯片外。

(5)关闭废液出口3，关闭气动阀5，气动阀5恢复薄膜状态，用移液枪往线虫进样口1快速加入培养液，将单个线虫进样通道6中的线虫推送进培养室7。

通过上述步骤，可以在短时间内完成大量的单个线虫自动分流到各个培养室，有效地节省了人工分发活线虫的工作量。

实施例3

本实施例采用实施例1所述芯片，采用临床抗生素验证抗菌药物筛选芯片的可靠性，图5显示了临床抗生素美罗培南治疗感染了铜绿假单胞菌的线虫的存活率情况。

具体操作步骤是：

(1)将线虫输送进培养室7后，静置15分钟，线虫沉降至培养室7的井底。

(2)通过药物进样口2灌注含有铜绿假单胞菌的线虫液体培养基到培养室内感染线虫6小时。

(3)通过药物进样口2灌注无菌的培养液清洗线虫，直至培养室内液体澄清，除去病原菌。

(4)药物进样口2分别连接无菌空白培养液和含有30mg/L美罗培南的培养液，调节适当流速，通过药物分配器8，自动生成30、20、10、0mg/L四种浓度梯度的药物溶液输送到培养室，持续给药10分钟。

(5)关闭所有的进样口和出口，芯片盖上透气膜，静置于25℃培养箱内4天。

(6)在显微镜下观察线虫的存活情况，计算存活率。

从图5可以看出，美罗培南可以有效救治感染了铜绿假单胞菌的线虫，线虫通过抗生素救治后存活率比对照组提高了2倍以上，且在一定的浓度范围内呈现剂量依赖性。实施例3表明了本发明提出的微流控药物筛选芯片可以用于抗菌活性研究。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，为三层结构，上层是连接层，设有线虫进样口、药物进样口、气动阀连接口和废液出口；中间是气动阀控制层，设有气动阀；下层是微通道流体层，设有若干个培养模块；

每个培养模块的入口端分别与线虫进样口和药物进样口相连，出口端与废液出口相连，每个培养模块内设有单个线虫进样通道和培养室，单个线虫进样通道只允许一个线虫进入；

气动阀设置在单个线虫进样通道和培养室的连接处，气动阀连接口一端与气动阀相连，一端与空气泵相连，气动阀采用具有一定弹性的薄膜；在线虫进样前，开启空气泵加压，气动阀膨胀，阻碍线虫进入培养室，待每个单个线虫进样通道均占据一个线虫后，关闭空气泵减压，气动阀恢复薄膜状态，线虫被流体推送进培养室；

所述线虫芯片采用PDMS材料制作而成；

所述微通道流体层上设有用于在线分配多种药物浓度梯度并传输到培养室内的药物分配器，药物分配器的进药口与药物进样口相连。

2.根据权利要求1所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述气动阀采用具有一定弹性的PDMS薄膜，形状为斜T-型结构。

3.根据权利要求2所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述气动阀采用PDMS单体与引发剂重量比为18~22:1的PDMS薄膜。

4.根据权利要求2所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述PDMS薄膜的厚度为单个线虫进样通道深度的15~25%。

5.根据权利要求1所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述每个培养模块中所有单个线虫进样通道呈鱼刺状，且单个线虫进样通道与线虫进样方向成钝角；

所述单个线虫进样通道的尺寸大小设计为：长度为线虫体长，宽度和深度为线虫体径的1.2~1.5倍。

6.根据权利要求1所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述培养室采用比单个线虫进样通道表面低陷的陷阱式结构。

7.根据权利要求1所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述培养室的出口设有栅栏状的通道。

8.根据权利要求1所述的用于抗菌药物筛选的线虫芯片，其特征在于，所述线虫进样口处连接一个同样口径的移液枪吸头。

9.一种基于权利要求1-8任一项所述用于抗菌药物筛选的线虫芯片的筛选方法，其特征在于，包括步骤：

（1）芯片的线虫进样口插入一个同样口径的移液枪吸头，药物进样口连接微量注射泵，关闭所有废液出口，打开空气泵，打开气动阀加压；

（2）打开微量注射泵，调节适当流速，通过移液枪吸头往线虫进样口加入线虫悬浮液；

（3）线虫在流体的推动下进入芯片主通道，并随着流体的流动方向，在牵引力作用下进入单个线虫进样通道；

（4）待每个单个线虫进样通道已经占据一个线虫时，打开废液出口，将多余的线虫排出芯片外；

（5）关闭废液出口，关闭空气泵，关闭气动阀，用移液枪往线虫进样口快速加入培养液，将单个线虫进样通道中的线虫推送进培养室。

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