CN106754241B - 一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法 - Google Patents
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Abstract
发明了一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法。包括第一步清洗、第二步实验进样、第三步给药及筛选检测、第四步实验结束清洗。本发明操作利用发明的一种带有气室的药物筛选生物芯片，具有良好的细胞培养的基础，通过结构的改进，将微流控技术与细胞培养技术相结合将其应用于药物筛选领域，在一个芯片上提供了相同的细胞生长环境。操作实现了在其他变量都不改变的条件下，单一改变给药物种类或给药量，通过观察在药物作用下的细胞形态等生理指标的变化，筛选药物的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型药物筛选的生物微分析芯片的使用方法，从使用上讲，是一种运用在活细胞培养系统中的，一种新型带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法。
背景技术
高通量药物筛选是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。高通量药物筛选体系在创新药物筛选中是新药开发研究的一个重要领域，已经被广泛应用于候选化合物生物活性的筛选。高通量药物筛选模型不仅可以用于发现新药，也可用于药物研究。但是传统药物筛选芯片不能实时观测药物作用下的细胞形态变化。解决此问题，需将药物的添加、实验细胞的培养、药物效果的检测等多个步骤集成到一块芯片，实现药物筛选的自动化分析，减少即时观测的实验时间和误差。
为此，本发明一种带有气室的药物筛选的生物微分析芯片及其使用方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用气室设计活细胞培养的药物筛选生物微分析芯片的使用方法，在一块芯片上实现药物的给样、细胞培养、药物效果检测等多个实验功能。
本实验的技术方案为：提供一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法。芯片由两组进样口、两个培养区、一个共用气室、一个废液池和弯曲连接通道组成。在芯片的上片加工有从气体入口开始的，连通气室通道、气室、到气体出口结束的结构，这些结构呈一条连接直线排布；对应上片这条连接直线的两侧，在下片对称加工有两组“V”型进样通道、两个培养区，对应上片这条连接直线上，在下片加工有废液池、排出通道、出口。沿一条连接直线排布，以及沿这条直线对称排布，可以很好地集约化利用芯片的空间，并且可以用发明的一种带有气室的药物筛选生物芯片作为功能单元，连接组成不同形状的、扩充实验数目或功能的生物芯片。在芯片体的下片上加工有两组进样口，每组进样口具有包括细胞及其培养液进口、或者药物进口的“V”型进样口一和“V”型进样口二，进样口与连接直通道相连。当药物注入后，药物与细胞样品在“V”型通道处充分混合并作用于细胞。两个培养区同时与气室相连，气室通过气室与培养区连接的通气道输送细胞培养所需气体并保证供给量相同。两个培养区内部各有一个“U”型结构，当培养液和药物到达时，“U”型结构可以将细胞拦截，保证细胞在固定的区域生长，而培养液和药物等液体可以自由流通。一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法，特征在于。
第一步，清洗：先堵住气体出口，在气体入口通入高纯氮气0.5h-1h，气体经气室通道到达气室，再经通气道到两个“V”型进样口一和“V”型进样口二，以及出口排出；随后打开气体出口，封堵两个“V”型进样口一和“V”型进样口二，以及出口，继续通入高纯氮气0.5h-1h，气体由气体出口14排出；气体通入全部结束后，关闭气体，封堵气体入口和气体出口；再用注射泵在芯片的两个“V”型进样口一和“V”型进样口二通入三级去离子水，去离子水在出口用泵吸出；连续通入三级去离子水2h-3h。
第二步，实验进样：用注射泵在芯片内通入细胞培养液0.5h-2h，然后，依据药物筛选的药物和药物对象的病理癌症细胞，将生长状态良好的癌症细胞从培养皿中吹打均匀，通过注射泵，从“V”型进样口一或“V”型进样口二导入芯片的各个培养区，进行等量癌症细胞培养；或者，从“V”型进样口一加入实验癌症细胞，从“V”型进样口二加入实验药物，导入芯片的各个培养区，进行等量癌症细胞培养。打开气体入口和气体出口，按细胞培养规定，实时连续通入所需气体；每24h通过注射泵和吸液泵更换一次细胞培养液；实验癌症细胞培养48h后，关闭芯片的细胞培养液供给。
第三步，给药及筛选检测：从“V”型进样口一或“V”型进样口二，依次注入浓度呈梯度变化的抗癌药物培养液，药物作用癌症细胞后立即、或者24h后，用显微镜观察培养区内的癌症细胞；开启高清摄像机或DVD，记录细胞形态变化和繁殖情况。
第四步，实验结束清洗：药物筛选检测实验结束后，重复第一步的清洗步骤，清洗生物芯片。
进一步的，所述培养区，两个培养区尺寸一致，均为深1mm-2mm、直径2mm-5mm的圆桶形。这样设计保证细胞培养区域的大小一致。气室俯视为菱形，高度0.5mm，边长≥2mm。这样设计便于各个连接管的连接刚好在菱形的四个角上，避免气室因有边角，产生气体涡流，不利于废气的排除。废液池为长方体形，深为1mm-2mm、短边长≥5mm。设计保证了废液池至少能够容纳两个培养区的一次产生的废液。上述技术方案中，所述芯片的上片、下片、和芯片基底均为透明材料。废液池俯视呈长方体形，与废液的排出通道和气体出口相连，它是将两个培养区内细胞的代谢产物或者是多余的注射物质暂时储存的空间，保证细胞的正常培养环境。
进一步的，所述培养区，在两个培养区与废液池相连的弧形通道二一侧，与圆柱形培养区内壁相距5μm处，各加工有一个“U”型结构，“U”型结构是宽为30μm -60μm，等高于培养区的半圆弧形墙；所述弧形通道一和弧形通道二均为1/4圆弧形，并两两成对，对称分布在上片连接直线的两侧。培养区内部的“U”型结构的功能，使细胞在固定的区域生长，便于实时观测在不同药物（或不同浓度的药物）作用下细胞形态的变化情况。
进一步的，所述涡轮结构为两个半圆错位相对形成“S”形通道；涡轮结构位于2条“V”型通道汇流相交为1条通道的“V”字的底尖处，两个半圆间隔距离为“V”型通道宽度的1/2，利于液体的混合。“V”型通道内嵌有混合通道内液体的涡轮结构，当药物注入后与细胞样品在“V”型通道处充分混合，保证药物与细胞充分接触并发生作用；或者同时加入两种药物，在“V”型通道处充分混合，保证药物混合均匀。
上述技术方案中，所述下片加工的通道，全部高为800μm-1000μm，宽为300μm-600μm。通道尺寸是根据实验所需细胞大小和数量确定的，目的保持实验的同一性，也有利于不同细胞实验的要求。
上述技术方案中，所述生物芯片分为3层，最上一层是上片，为进样装置及气体通道，包括、气体入口、气室通道、通气道、气室、气体出口，和贯通上片和中片的“V”型进样口一、“V”型进样口二、出口；中间一层是下片，主要为液体流通管道，包括“V”型通道、涡轮结构、直通道、弧形通道一、培养区、弧形通道二、废液池、 “U”型结构；底层为芯片基底。本发明利用生物芯片，具有良好的细胞培养的基础，通过结构的改进，将微流控技术与细胞培养技术相结合将其应用于药物筛选领域。在一种芯片上提供了相同的细胞生长环境，在其他变量都不改变的条件下，单一改变给药物种类或给药量，通过观察在药物作用下的细胞形态变化，达到药物筛选的目的。
本发明的效果特点：本发明芯片将药物的添加、实验细胞培养、药物效果检测等多个步骤集成到一块芯片体上，可在有限的面积内检测多个指标，达到即时、有效、微量检测。能够在检测的时间段内进行实时监测，控制营养物质的输入速率，保证检测的可靠性，使得结果更能反应真实的细胞生长环境，达到最终药物筛选目的。
附图说明
图1为本发明的俯视结构示意图。
图2为本发明的俯视结构示意图A-A剖视图。
图3为局部“V”型连接通道中的混合涡轮结构放大图。
其中：1.“V”型进样口一；2.“V”型通道；3.气体入口；4.气室通道；5.涡轮结构；6.弧形通道一；7.培养区；8.通气道；9.气室；10.废液池；11.排出通道；12.出口；13.芯片基底；14.气体出口；15.弧形通道二；16.“U”型结构；17.“V”型进样口二；18.直通道；
19.上片；20.下片。
具体实施方式
下面结合附图1-3和实施例进一步对本发明加以说明。
具体实施例一
参照图1的芯片形状结构，芯片下片20的流体的通道高为800µm，宽为300µm。每个培养区7直径5mm，中间有一个宽为60μm半圆弧形墙的“U”型结构16，其与圆柱形培养区7内壁相距5μm处。
操作步骤如下：
第一步，清洗：先堵住气体出口14，在气体入口3通入高纯氮气1h，气体经气室通道4到达气室9，再经通气道8到两个“V”型进样口一1和“V”型进样口二17，以及出口12排出。随后打开气体出口14，封堵两个“V”型进样口一1和“V”型进样口二17，以及出口12，继续通入高纯氮气1h，气体由气体出口14排出。以达到清除芯片内杂质气体的目的。气体通入全部结束后，封堵气体入口3和气体出口14。再用注射泵在芯片的两个“V”型进样口一1和“V”型进样口二17通入三级去离子水，去离子水通过涡轮结构5、弧形通道一6进入培养区7，绕过“U”型结构16、通过弧形通道二15进入废液池10，继续流入排出通道11，在出口12用泵吸出。连续通入三级去离子水3h，以排除芯片内残余的物质。
第二步，实验进样：再用注射泵在芯片内通入细胞培养液2h，以排除芯片内残留的三级去离子水；然后，依据药物筛选的药物和药物对象的病理癌症细胞，将生长状态良好的癌症细胞从培养皿中吹打均匀，通过注射泵，从“V”型进样口一1或“V”型进样口二17导入芯片的各个细胞培养区7，进行等量癌症细胞培养；每24h通过注射泵更换一次细胞培养液，以保证细胞培养时的营养更新和代谢物的排除；芯片细胞培养48h后，关闭芯片的细胞及其培养液。
第三步，给药及筛选检测：从“V”型进样口一1或“V”型进样口二17依次注入浓度呈梯度变化的抗癌药物培养液，药物作用癌症细胞24h后，用显微镜观察培养区7内的癌症细胞；开启高清摄像机或DVD，记录细胞形态变化和繁殖情况。
第四步，实验结束清洗：药物筛选检测实验结束后，重复第一步的清洗步骤，清洗生物芯片。
具体实施例二
参照图1-图3的芯片形状结构，芯片下片20的流体的通道高为800µm，宽为300µm。每个培养区7直径5mm，中间有一个宽为60μm半圆弧形墙的“U”型结构16，其与圆柱形培养区7内壁相距5μm处。
操作同具体实施例一，区别在于：第一步通入高纯氮气总计1h，连续通入三级去离子水2h。第二步通入细胞培养液0.5h。
Claims (4)
1.一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法，使用的带有气室的药物筛选生物芯片分为3层，最上一层是上片（19），为进样装置及气体通道，包括、气体入口（3）、气室通道（4）、通气道（8）、气室（9）、气体出口（14），和贯通上片（19）和中片（20）的“V”型进样口一（1）、“V”型进样口二（17）、出口（12）；中间一层是下片（20），主要为液体流通管道，包括“V”型通道（2）、涡轮结构（5）、直通道（18）、弧形通道一（6）、培养区（7）、弧形通道二（15）、废液池（10）、“U”型结构（16）；底层为芯片基底（13）；在芯片的上片（19）加工有从气体入口（3）开始的，连通气室通道（4）、气室（9）、到气体出口（14）结束的结构，这些结构呈一条连接直线排布；对应上片（19）这条连接直线的两侧，在下片（20）对称加工有两组“V”型进样通道、两个培养区（7），对应上片（19）这条连接直线上，在下片（20）加工有废液池（10）、排出通道（11）、出口（12）；每组“V”型进样通道是由“V”型进样口一（1）、“V”型进样口二（17）2个进样口，和2条“V”型通道（2）连接汇流而成；两组“V”型进样通道的开口以上片（19）的连接直线为对称轴，开口向外呈“水”字对称排布；在每组2条“V”型通道（2）汇流处，加工有涡轮结构（5）；涡轮结构（5）是两个半圆错位相对形成“S”形通道；涡轮结构位于2条“V”型通道（2）汇流相交为1条通道 的“V”字的底尖处，两个半圆间隔距离为“V”型通道（2）宽度的1/2；每组对称的“V”型通道（2）汇流后，分别与2条平行于上片（19）连接直线的直通道（18）相连，直通道（18）与弧形通道一（6）连接；弧形通道一（6）的另一端与培养区（7）一端连接，培养区（7）另一端通过弧形通道二（15）连接到废液池（10）；废液池（10）通过排出通道（11）与出口（12）连接；气室（9）通过两条通气道（8）分别与两个培养区（7）相连，即两个培养区（7）通过两条通气道（8）共用气室（9）；一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法，其特征在于：
第一步，清洗：先堵住气体出口（14），在气体入口（3）通入高纯氮气0.5h-1h，气体经气室通道（4）到达气室（9），再经通气道（8）到两个“V”型进样口一（1）和“V”型进样口二（17），以及出口（12）排出；随后打开气体出口（14），封堵两个“V”型进样口一（1）和“V”型进样口二（17），以及出口（12），继续通入高纯氮气0.5h-1h，气体由气体出口14排出；气体通入全部结束后，关闭气体，封堵气体入口（3）和气体出口（14）；再用注射泵在芯片的两个“V”型进样口一（1）和“V”型进样口二（17）通入三级去离子水，去离子水在出口（12）用泵吸出；连续通入三级去离子水2h-3h；
第二步，实验进样：用注射泵在芯片内通入细胞培养液0.5h-2h，然后，依据药物筛选的药物和药物对象的病理癌症细胞，将生长状态良好的癌症细胞从培养皿中吹打均匀，通过注射泵，从“V”型进样口一（1）或“V”型进样口二（17）导入芯片的各个培养区（7），进行等量癌症细胞培养；或者，从“V”型进样口一（1）加入实验癌症细胞，从“V”型进样口二（17）加入实验药物，导入芯片的各个培养区（7），进行等量癌症细胞培养；打开气体入口（3）和气体出口（14），按细胞培养规定，实时连续通入所需气体；每24h通过注射泵和吸液泵更换一次细胞培养液；实验癌症细胞培养48h后，关闭芯片的细胞培养液供给；
第三步，给药及筛选检测：从“V”型进样口一（1）或“V”型进样口二（17），依次注入浓度呈梯度变化的抗癌药物培养液，用显微镜观察培养区（7）内的癌症细胞；开启高清摄像机或DVD，记录细胞形态变化和繁殖情况；
第四步，实验结束清洗：药物筛选检测实验结束后，重复第一步的清洗步骤，清洗生物芯片。
2.根据权利要求1所述的一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法，所述培养区（7），两个培养区（7）尺寸一致，均为深1mm-2mm、直径2mm-5mm的圆桶形，气室（9）俯视为菱形，高度0.5mm，边长≥2mm，废液池（10）为长方体形，深为1mm-2mm、短边长≥5mm。
3.根据权利要求1所述的一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法，所述的培养区（7），在两个培养区（7）与废液池（10）相连的弧形通道二（15）一侧，与圆柱形培养区（7）内壁相距5μm处，各加工有一个“U”型结构（16），“U”型结构（16）是宽为30μm-60μm，等高于培养区（7）的半圆弧形墙；所述弧形通道一（6）和弧形通道二（15）均为1/4圆弧形，并两两成对，对称分布在上片（19）连接直线的两侧。
4.根据权利要求1所述的一种带有气室的药物筛选生物芯片的使用方法，所述的下片（20）加工的通道，全部高为800μm -1000μm，宽为300μm-600μm。
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