CN105543072B - 基于微流控芯片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选共培养模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于微流控芯片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型，该共培养模型由四层芯片叠加而成，所述四层芯片自下而上依次是玻璃片支撑层、PDMS接种细胞层、PDMS供液层以及PDMS气动阀门控制层，通过基于等离子清洗技术的键合工艺组装成一体；其中，所述PDMS接种细胞层上设有三个细胞共培养腔室，共培养腔室一边接正常细胞，另一边接癌细胞，中间设微流道阵列。本发明主要用于研究癌细胞和正常细胞不同比例下癌细胞的迁移情况，也可以在此模型下进行抗癌药物的筛选，尤其是可以进行抗癌细胞迁移的药物研究。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术和癌症研究等领域，具体地，是一种基于微流控芯片研究不同程度癌症癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型。
背景技术
恶性肿瘤是目前严重困扰人类健康的世界性难题，据国际肿瘤研究机构公布的数据显示每年全球约800万人死于恶性肿瘤，其中90％恶性肿瘤患者死于肿瘤转移，研究显示肿瘤侵袭和转移过程为能更好地阐明肿瘤细胞迁移的机制和筛选出抑制肿瘤细胞迁移的药物，建立一种灵活、可靠、低成本的细胞迁移模型具有重要意义。
细胞迁移模型分为体内和体外模型，体外细胞迁移模型相比体内模型成本低、操作简单，可避免动物实验所涉及到的伦理问题，同时也可避免人类与实验动物种属特异性差异造成实验结果不一致的现象。
微流控芯片具有结构设计灵活和规模集成的优势，具有高通量、低消耗和操作自动化的特点，是细胞操控和分析的有利技术平台。用于生物细胞培养的微流控装置多用硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃等制作。其中聚二甲基硅氧烷不仅具有生物兼容性、毒性低、较高的化学和热稳定性、透光性、对水的渗透性低以及电导性低等特点。
此外，近年来国内外在肿瘤转移研究方面进展较快，尤其是阐明了肿瘤转移的某些关键环节和相关机理，但至今尚无广泛用于临床预防治疗肿瘤转移的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型，本模型为研究癌细胞迁移的体外共培养模型，通过控制癌细胞与正常细胞的比例，从而建立轻度、中度和重度的癌症模型，研究癌症的不同时期癌细胞的迁移状况。本模型也可用于抗癌药物的筛选，尤其是抗癌细胞迁移的药物筛选，从而更好的拟制癌细胞的扩散。
本发明的目的通过以下技术方案来实现 ：
一种基于微流控芯片研究不同程度癌症癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型，该共培养模型由四层芯片叠加而成，所述四层芯片自下而上依次是玻璃片支撑层（1）、PDMS接种细胞层（2）、PDMS供液层（3）以及PDMS气动阀门控制层（4），通过基于等离子清洗技术的键合工艺组装成一体；其中，所述PDMS接种细胞层（2）上设有三个细胞共培养腔室，用于研究癌细胞和正常细胞不同比例下癌细胞迁移或抗癌药物筛选。
优选实施例中，所述三个细胞共培养腔室的每个细胞共培养腔室包括两个接细胞腔室，一个腔室接入癌细胞，另一个腔室接入正常细胞，该两个接细胞腔室中间设置微流道阵列（11），由集成于所述PDMS供液层（3）和PDMS气动阀门控制层（4）上的一个气动控制阀门（18）控制该微流道阵列（11）实现两个接细胞腔室的连通和闭合；控制所述三个细胞共培养腔室中癌细胞和正常细胞比例分别模拟轻度癌症、中度癌症和重度癌症，研究癌细胞的迁移。
所述三个细胞共培养腔室中，一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（5）和腔室（8），另一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（6）和腔室（9），第三个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（7）和腔室（10），腔室（5）、（6）、（9）及（10）的面积相等，腔室（8）与腔室（7）的面积相等并且是腔室（5）面积的两倍；腔室（5）、（6）、（7）分别接低浓度、中等浓度及高浓度癌细胞，腔室（8）、（9）、（10）分别接入高浓度、中等浓度及低浓度的正常细胞，腔室（5）和腔室（8）作为轻度癌症模型，腔室（6）和腔室（9）作为中度癌症模型，腔室（7）和腔室（10）作为重度癌症模型。
其中，所述微流道阵列（11）具有30-50个微通道，相邻微通道间隔40μm，每一个微通道的尺寸是40μm25μm400μm（宽高长）。所述三个细胞共培养腔室采用相同规格的微流道阵列，便于在一个标准下评价三个细胞共培养腔室癌细胞的迁移能力。
所述PDMS供液层（3）和PDMS气动阀门控制层（4）上集成了与所述三个细胞共培养腔室对应的三个气动控制阀门（18）。所述气动控制阀门（18）包括位于所述PDMS气动阀门控制层（4）中的一充气腔室（20），与该充气腔室20连通的入气口（19）；以及，设置于所述PDMS供液层（3）的对应流道上的条状突起（16），借助有无气体压力使该条状突起（16）下压接触或脱离所述微流道阵列（11）实现细胞共培养腔室的两个接细胞腔室的闭合和连通。所述条状突起（16）的高度为130μm。所述充气腔室（20）大小是（长宽高）。
所述PDMS供液层（3）的设计基于三个目标而进行：首先要确保接入细胞的均匀性，使细胞能够均匀分布在细胞培养腔室；其次是为了保证供给培养液的均匀性，同时降低培养液流速对细胞的影响；最后要保证营养液的供给充分。在所述PDMS供液层（3）下表面（即与PDMS接种细胞层（2）相邻的一面）上设置与所述三个细胞共培养腔室分别对应的流道，用于接入细胞和供给培养液；在每个流道与其进夜口（14）、出液口（15）之间分别设有若干柱状突起（17），以保证供给培养液的均匀性，同时降低培养液流速对细胞的影响。
所述PDMS供液层（3）的厚度可以为0.25-0.3mm，设置于PDMS供液层（3）上的供液流道的深度是150μm。所述PDMS供液层（3）上的流道适应于静态或动态地供给细胞培养液。
当采用动态的供给培养液培养时，本共培养模型可以研究不同的培养液供给速度下，癌细胞的迁移能力，进而模拟人体不同部位的癌细胞的迁移情况。
本共培养模型可用于模拟癌细胞和正常细胞不同比例下癌细胞的迁移情况，以此来用于不同程度的癌症的研究。也可以在此模型下进行抗癌药物的筛选，从而针对不同程度的癌症选用不同剂量的药物，减少对正常细胞的杀伤，更好的治疗癌症；本模型可以进行抗癌细胞迁移的药物研究。
本共培养模型可直接放到二氧化碳培养箱中进行培养，从而保证稳定无菌的细胞生长环境。
与现有技术相比，本发明具有以下优点 ：
本发明在四层芯片的设计上综合考虑了目前微流控片的加工工艺，具有多个细胞共培养腔室、用于细胞迁移评价的微流道阵列以及集成于芯片的多个气动控制阀门，结构设计精巧，制作工艺简单，可以实现批量化制作。
在芯片的操作上，本模型控制简单易行，接种细胞和供给培养液方便，细胞生长和迁移情况在显微镜下观察方便，芯片可直接放到二氧化碳培养箱中进行培养，从而保证稳定无菌的细胞生长环境。
在芯片的功能上，本芯片是正常细胞和癌细胞的共培养装置，更加仿生地模拟了癌细胞再人体内的生长环境。同时集多种功能于一体，可以用于癌细胞迁移能力的研究和抗癌药物的筛选，尤其是可以用于抗癌细胞迁移的药物研究；可以实现动态或静态的共培养等。
附图说明
图1为本发明用于研究癌细胞迁移的体外共培养模型的结构示意图；
图2 为图1中PDMS接种细胞层的结构示意及局部图；
图3为图1中PDMS供液层下面向上翻转后的结构示意及局部图；
图4为本发明用于研究癌细胞迁移的体外共培养芯片组装后的剖面图和一气动控制阀门的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明详细说明。
如图1所示，本发明共培养模型为四层芯片结构，自下而上依次是玻璃片支撑层（1）、PDMS接种细胞层（2）、PDMS供液层（3）以及PDMS气动阀门控制层（4）。PDMS接种细胞层上设三个细胞共培养腔室，在PDMS供液层与PDMS接种细胞层相邻的一面上配置与所述三个细胞共培养腔室对应的流道，PDMS供液层和PDMS气动阀门控制层上集成了相应的三个气动控制阀门（18）。
芯片的加工组装通过以下步骤来实现：
首先，玻璃片支撑层（1）选用常用的光学玻璃，尺寸是（长宽高），在芯片组装前，必须对玻璃片进行充分的清洗，然后烘干使用。
其次，PDMS接种细胞层（2）、PDMS供液层（3）以及PDMS气动阀门控制层（4）的加工是采用常用的软光刻加工方法，这三层结构先是用SU-8光刻胶再硅片上用光刻机制作出设计好的图案；然后用PDMS 硅橡胶（如现有的道康宁Sylgard DC184产品），将其主剂和固化剂分别以 10:1 、20：1、5：1的比例配制成浇注液，浇注在各自的硅片模版上，即可制得带有微通道的芯片基片。最终加工出来的PDMS接种细胞层（2）、PDMS供液层（3）以及PDMS气动阀门控制层（4）的外形尺寸分别是、、（长宽高）。最后通过基于等离子清洗技术的键合工艺来完成芯片的组装。
如图2所示，PDMS接种细胞层（2）上设有三个细胞共培养腔室，深度是25μm。三个细胞共培养腔室中，每个细胞共培养腔室包括两个接细胞腔室，一个腔室接入癌细胞，另一个腔室接入正常细胞，两个接细胞腔室中间设微流道阵列（11），由集成在芯片上的气动控制阀门（18）控制微流道阵列（11）进而实现两个接细胞腔室的连通和闭合。三个细胞共培养腔室均配置一个微流道阵列（11），微流道阵列（11）具有40个微通道，相邻微通道间隔40μm排列，每一个微通道尺寸是40μm×25μm×400μm（宽高长）。三个细胞共培养腔室采用相同规格的微流道阵列，便于在一个标准下评价三个细胞共培养腔室癌细胞的迁移能力。
三个细胞共培养腔室中，左边的一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（5）和腔室（8），中间的细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（6）和腔室（9），右边的细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为腔室（7）和腔室（10），腔室（5）、（6）、（9）及（10）的面积相等，腔室（8）与腔室（7）的面积相等并且是腔室（5）面积的两倍。腔室（5）、（6）、（7）分别接低浓度、、癌细胞，腔室（8）、（9）、（10）分别接入浓度为、、的正常细胞；腔室（5）和（8）作为轻度癌症模型，腔室（6）和（9）、腔室（7）和（10）分别作为中度和重度癌症模型。
图3为PDMS供液层的结构示意及局部图。PDMS供液层（3）的与PDMS接种细胞层（2）相邻的面设置有与上述三个细胞共培养腔室对应的流道，用于接入细胞和供给培养液，供液层的曲线设计，确保接入细胞的均匀性；PDMS供液层（3）上用于供液的流道深度是。每个流道上设计了条状突起（16），其自外表面的深度为，即条状突起（16）的高度为，作为控制细胞共培养腔室两边的接细胞腔室连通的阀体。为了保证供给培养液的均匀性，在每个流道与其进夜口（14）之间间隔设有柱状突起（17），图示柱状突起（17）分两排交错排列。同样，在每个流道与其出液口（15）之间也间隔设有柱状突起（17）。
参照图3、图1，PDMS供液层（3）和PDMS气动阀门控制层（4）上用技术打孔器于上述各流道周围制作出贯通的进夜口（14）、出液口（15）、加细胞入口（12）和加细胞出口（13），进夜口（14）、出液口（15）、加细胞入口（12）和加细胞出口（13）与对应的流道连通。其中PDMS供液层（3）上加细胞入口（12）和加细胞出口（13）的直径为0.75mm, 进夜口（14）、出液口（15）的直径为1mm；PDMS气动阀门控制层（4）上加细胞入口（12）和加细胞出口（13）的直径为1.5mm， 进夜口（14）、出液口（15）的直径为2mm。
PDMS气动阀门控制层（4）中设有与上述三个细胞共培养腔室对应的充气腔室（20），腔室大小是，深度为；每一个充气腔室（20）连通内径为0.75mm的入气口（19），用于通入气体产生气压。
图4为四层芯片结构组装后的剖面图（经过中间的细胞共培养腔室和气动控制阀门）和气动控制阀门的结构示意图。如图4，气动控制阀门（18）包括位于PDMS气动阀门控制层（4）中的一个充气腔室20，与充气腔室20连通的入气口（19）；以及，设置于PDMS供液层（3）的流道上的条状突起（16），借助有、无气体压力使该条状突起（16）下压接触或脱离微流道阵列（11），实现细胞共培养腔室的两个接细胞腔室的闭合和连通。气动控制阀门（18）的通过以下操作来实现控制：通过给PDMS气动阀门控制层（4）的入气口（19）通气，使PDMS供液层（3）变形，使PDMS供液层（3）上的条状突起（16）下压接触到微流道阵列（11），细胞共培养腔室的两个接细胞腔室闭合；当两个细胞腔室需要连通时，打开入气口（19）撤掉压力，或者给一个负压力。
癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型在四层芯片上的实现步骤如下：
微流控芯片的前处理操作：先将微流控芯片置于浓度为 75% 的乙醇中进行初步消毒；然后将微流控芯片置于紫外线下照射 1h，杀菌处理；再用PBS 缓冲液（磷酸缓冲液，PH值为 7.4）通入芯片的共培养腔室和微流道，清洗3遍，去除酒精消毒时的残留酒精；将浓度是0.1mg/m的多聚氖氨酸注入芯片的共培养腔室和微流道，在细胞培养箱中放置24h，增强细胞的贴壁能力；最后，再用PBS 缓冲液通入芯片的共培养腔室和微流道，清洗3遍，去除多余的多聚氖氨酸。
细胞的接种及培养 : 先给PDMS气动阀门控制层（4）的入气口（19）通气，使气动控制阀门18关闭，并堵住进夜口（14）和出液口（15）；将培养的正常细胞和癌细胞以胰酶消化，制成细胞悬浮液，分别用注射器吸取细胞悬浮液从加细胞入口（12）处垂直注入各自的培养腔室，直至有悬浮液从加细胞出口（13）冒出。放入细胞培养箱中培养6h使细胞贴壁后，取出，取新鲜培养基从加细胞入口（12）注入，冲去位于流体微通道中未贴壁的细胞，在加细胞出口（13）用注射器吸取多余培养液。将进夜口（14）和出液口（15）打开，在进夜口（14）接入新鲜培养液，同时堵住加细胞入口（12）和加细胞出口（13），然后打开气动阀门，使共培养腔室连通，然后将芯片放入细胞培养箱中培养。如果要加药物进行药物试验，则在细胞贴壁实现共培养后，在进夜口（14）供给混入抗癌药物的培养液。如果要实现动态供液培养，则需要在进夜口（14）接上管路，用蠕动泵进行动态供液培养。
癌细胞迁移及抗癌药物应答的检测：每隔8小时，在显微镜下观察癌细胞和正常细胞的形态及生长状态、癌细胞的迁移状况和抗癌药物应答情况，拍照对比。
以上结合具体的实施例对本发明做了比较详细的说明，但这些具体的说明不应理解为对本发明的限制。应当理解，本领域普通技术人员在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于微流控芯片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选的共培养模型，其特征在于，该共培养模型为体外共培养模型，由四层芯片叠加而成，所述四层芯片自下而上依次是玻璃片支撑层(1)、PDMS接种细胞层(2)、PDMS供液层(3)以及PDMS气动阀门控制层(4)，通过基于等离子清洗技术的键合工艺组装成一体；其中，所述PDMS接种细胞层(2)上设有用于细胞贴壁培养的三个细胞共培养腔室，每一个细胞共培养腔室包括两个接细胞腔室，一个腔室接入癌细胞，另一个腔室接入正常细胞，中间设置微流道阵列(11)，由集成于所述PDMS供液层(3)和PDMS气动阀门控制层(4)上的一个气动控制阀门(18)控制该微流道阵列(11)实现两个接细胞腔室的连通和闭合；控制所述三个细胞共培养腔室中癌细胞和正常细胞比例实现轻度癌症、中度癌症和重度癌症，研究癌细胞的迁移；所述三个细胞共培养腔室中的三个微流道阵列(11)采用相同规格的微流道阵列，用于在同一个标准下评价三个细胞共培养腔室癌细胞的迁移能力。
2.根据权利要求1所述共培养模型，其特征在于，采用所述共培养模型实现细胞接种和贴壁培养的方法如下：先给PDMS气动阀门控制层(4)的入气口(19)通气，使气动控制阀门(18)关闭，并堵住进夜口(14)和出液口(15)；用注射器吸取正常细胞悬浮液、癌细胞悬浮液分别从加细胞入口(12)垂直注入各自的接细胞腔室，直至有细胞悬浮液从加细胞出口(13)冒出；放入细胞培养箱中培养6h使细胞贴壁后，取出，取新鲜培养基从加细胞入口(12)注入，冲去位于流体微通道中未贴壁的细胞，在加细胞出口(13)用注射器吸取多余培养液；将进夜口(14)和出液口(15)打开，在进夜口(14)接入新鲜培养液，同时堵住加细胞入口(12)和加细胞出口(13)，然后打开气动阀门(18)使各细胞共培养腔室中的两个接细胞腔室连通，然后将所述共培养模型放入细胞培养箱中贴壁培养。
3.据权利要求1所述的共培养模型，其特征在于，所述三个细胞共培养腔室中，一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为第一腔室(5)和第二腔室(8)，另一个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为第三腔室(6)和第四腔室(9)，第三个细胞共培养腔室的两个接细胞腔室为第五腔室(7)和第六腔室(10)，第一腔室(5)、第三腔室(6)、第四腔室(9)及第六腔室(10)的面积相等，第二腔室(8)与第五腔室(7)的面积相等并且是第一腔室(5)面积的两倍；第一腔室(5)、第三腔室(6)、第五腔室(7)分别接低浓度、中等浓度及高浓度癌细胞，第二腔室(8)、第四腔室(9)、第六腔室(10)分别接入高浓度、中等浓度及低浓度的正常细胞；第一腔室(5)和第二腔室(8)作为轻度癌症模型，第三腔室(6)和第四腔室(9)、第五腔室(7)和第六腔室(10)分别作为中度癌症和重度癌症模型。
4.根据权利要求1所述的共培养模型，其特征在于，所述微流道阵列(11)具有30-50个微通道，相邻微通道间隔40μm，每一个微通道的宽为40μm、高为25μm、长为400μm。
5.根据权利要求1所述的共培养模型，其特征在于，所述气动控制阀门(18)包括位于所述PDMS气动阀门控制层(4)中的一个充气腔室(20)，与该充气腔室(20)连通的入气口(19)；以及，设置于所述PDMS供液层(3)的对应流道上的条状突起(16)，借助有无气体压力使该条状突起(16)下压接触或脱离所述微流道阵列(11)实现细胞共培养腔室的两个接细胞腔室的闭合和连通。
6.根据权利要求5所述的共培养模型，其特征在于，所述充气腔室(20)的长为4.6mm、宽为2mm、高为0.15mm。
7.根据权利要求1所述的共培养模型，其特征在于，所述细胞共培养腔室的深度为25μm。
8.根据权利要求1所述的共培养模型，其特征在于，在所述PDMS供液层(3)下表面上设置与所述三个细胞共培养腔室分别对应的流道，用于接入细胞和供给培养液；在每个流道与其进夜口(14)、出液口(15)之间分别设有若干柱状突起(17)，以保证供给培养液的均匀性，同时降低培养液流速对细胞的影响。
9.根据权利要求8所述的共培养模型，其特征在于，所述PDMS供液层(3)厚度为0.25-0.3mm，所述流道的深度为150μm。
10.根据权利要求9所述的共培养模型，其特征在于，所述PDMS供液层(3)上的流道适应于静态或动态地供给细胞培养液。
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