CN111996112B - 微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法 - Google Patents
微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111996112B CN111996112B CN201910944454.7A CN201910944454A CN111996112B CN 111996112 B CN111996112 B CN 111996112B CN 201910944454 A CN201910944454 A CN 201910944454A CN 111996112 B CN111996112 B CN 111996112B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- layer
- culture chamber
- pneumatic control
- culture
- chamber
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明涉及一种微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法,微流控芯片装置由下至上依次设置微电极基片层、培养腔室层以及气动控制层;培养腔室层包括一列或多列流道,每列流道上设有一个或多个培养腔室,流道包括与培养腔室常通的第一流道和与培养腔室常闭的第二流道,第二流道设置在第一流道与培养腔室之间,第二流道为向下凸设而成的凸体,凸体的底端与微电极基片层抵接;气动控制层包括气动控制腔室,每个气动控制腔室位于细胞培养腔室的正上方,且覆盖到细胞培养腔室两侧的第二流道;该微流控芯片装置能够在可控且独立的微环境下直接对雨生红球藻细胞进行电场刺激和培养,可以有效地提高微藻高价值生物质虾青素的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术/生物医学工程领域,特别是涉及一种微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法。
背景技术
微藻是广泛分布于淡水和海水中的重要光合微生物,能有效利用光能和CO2进行光合作用生产生物燃料、食品、饲料和高价值的生物质材料。此外,作为一种高效光合作用微型细胞工厂,微藻的生长速率远远高于其他的陆生植物。因此,微藻作为天然生物质材料的微生物反应器有着巨大的研究和市场应用价值,近年来在生产可再生生物燃料和高价值产品方面被广泛研究。目前微藻的研究通常是在实验室规模中,利用烧瓶、培养板或光生物反应器中进行培养。这些培养体系对了解藻类的基本生物特性,以及各种培养条件(如光照强度、光照周期、温度、培养基浓度、CO2浓度、pH值)对藻类生长和生物质产量的影响作出了重要贡献。然而,要进一步优化各种藻类生物质产量,则需要监测不同培养条件与生物质产量之间的关系,而现有手段却难以实现多种培养条件变量的复合优化。
虾青素(3,3′二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮)是一种类胡萝卜素,是很多植物、藻类以及海洋生物都能够生产的一种纯天然抗氧化物质。据报道,虾青素可以用于药理作用的研究如抗氧化、消炎、免疫调节、抗癌以及抗糖尿病。其抗氧化能力是β-胡萝卜素的38倍,是维他命E的500倍。由于其有效的抗氧化能力以及广泛的药理学应用潜力,虾青素近来备受青睐。但是,即使有如此多潜在的优点,天然的虾青素产量非常低导致市场价格超高。2013年,虾青素的市场价格达到了每千克5800美金。在自然界中,雨生红球藻(H.pluvialis)是虾青素含量最高(1%~5%干重)的水生植物之一,其生长周期包括:营养增长期(绿色)、孢囊形成期(未成熟孢囊/褐色)、孢囊成熟期(孢囊/红色)和细胞萌发期,四个周期不断循环。不利的生长环境会促使雨生红球藻细胞内发生应激反应,使其从营养增长期转化至孢囊形成期,从而开始逐渐累积虾青素。研究人员试图通过各种方法如控制光照条件,去除培养基中的硝酸盐,调高温度或提供二氧化碳来提高雨生红球藻中的虾青素产量。然而这些方法只是单纯改变雨生红球藻生长环境的影响因素,效果有限。因此,探索新的刺激方式直接作用于雨生红球藻并优化其培养条件以获得更高虾青素产量是目前要解决的关键问题。
发明内容
基于此,有必要提供一种微流控芯片装置。
此外,还提供了一种微流控芯片装置的制备方法、微藻生产生物质的方法。
一种微流控芯片装置,所述微流控芯片装置由下至上依次设置微电极基片层、培养腔室层以及气动控制层;
所述培养腔室层包括在所述培养腔室层和所述微电极基片层之间形成的一列或多列流道,每列流道上设有一个或多个培养腔室,所述流道包括常通的第一流道和设置在常通的第一流道与培养腔室之间的常闭的第二流道,所述第二流道为向下凸设而成的凸体,所述凸体的底端与微电极基片层抵接;
所述气动控制层包括对应于培养腔室层上的一个或多个培养腔室设置的一个或多个气动控制腔室,各气动控制腔室位于各培养腔室的上方,且覆盖培养腔室和培养腔室两侧的常闭的第二流道;
所述微电极基片层包括基片和所述基片上的对应于培养腔室层上的一个或多个培养腔室和气动控制层上的一个或多个气动控制腔室设置的一个或多个微电极对,各微电极对位于各培养腔室内;
对所述气动控制腔室施加负压时,所述常闭的第二流道可因气动控制腔室中施加的负压而向上抬起,从而使培养腔室与第一流道连通;
对所述气动控制腔室未施加负压时,所述第二流道抵接微电极基片层,从而阻断培养腔室与第一流道之间的连通。
在其中一些实施例中,所述气动控制层的厚度大于培养腔室层;优选地,所述气动控制层的厚度为60~160μm,所述培养腔室层的厚度为50~150μm。
在其中一些实施例中,每列流道的两端处分别设有入口和出口,优选地,所述入口与出口的直径为1mm~2mm。
在其中一些实施例中,所述培养腔室自顶端向下设有一个或多个微柱,所述微柱的底端与微电极基片层抵接。
在其中一些实施例中,所述培养腔室为内部凹设形成的凹槽,优选地,所述凹槽的形状为长方形、正方形、圆形或椭圆形,优选地,所述凹槽的高度为40~60μm。
在其中一些实施例中,所述气动控制层还包括与各气动控制腔室相连通的气体管道;所述气体管道具有气体出口并且能够连接负压装置。
在其中一些实施例中,所述培养腔室层以及气动控制层采用弹性材料制备而成,所述弹性材料选自聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸、环烯烃聚合物、聚酰亚胺、聚萘二甲酸乙二醇、聚偏氟乙烯、聚酯、硅胶、及热塑性聚氨酯弹性体橡胶中的至少一种,及/或,所述微电极基片层的基片采用玻璃基片。
一种所述的微流控芯片装置的制备方法,包括以下步骤:
制备培养腔室层以及气动控制层的模板以及微电极基片层;
将气动控制层的材料于所述气动控制层的模板上成型,得到成型件,并在气体出口处打孔;
将培养腔室层的材料于所述培养腔室层的模板上成型,并与已成型的气动控制层进行对准封接,确保气动控制层的各气动控制腔室在各培养腔室的上方并且能够覆盖培养腔室和培养腔室两侧的常闭的第二流道;
在向气动控制腔室施加负压以使气动控制腔室下方的培养腔室层的第二流道向上抬起的同时,将封接在一起的培养腔室层和气动控制层与微电极基片层对准封接,使得各微电极对位于各培养腔室内,并且气动控制腔室下方的培养腔室层的培养腔室及流道部分并不与微电极基片层的基片相封接;得到所述的微流控芯片装置。
一种对微藻进行电刺激培养以生产生物质的方法,所述方法采用所述的微流控芯片装置对微藻进行电刺激培养。
在其中一些实施例中,所述生物质为虾青素,及/或所述微藻为雨生红球藻。
本发明的微流控芯片装置的每一个培养腔室都是一个独立的细胞培养单元,培养腔室之间细胞、培养液和电极刺激互不干扰,微藻电刺激微流控芯片能够在可控且独立的微环境下直接对雨生红球藻细胞进行电场刺激和培养,可以有效地提高微藻高价值生物质虾青素的产量。
所述的芯片装置可以高通量自动化地实现对电刺激参数条件的最佳优化,大大地降低了工作量,从而得到了雨生红球藻产生高产量虾青素的最佳电刺激培养条件。
本发明的气动控制层的气体管道的进气口与注射器相连,当施加负压时,气动控制腔室下方细胞培养腔室两侧的第二流道向上抬起,培养腔室两侧的流道与培养腔室相连通,可以接种细胞。当不施加负压时,气动控制腔室下方细胞培养腔室两侧第二流道与底下的微电极基片相连接,培养腔室与两侧的流道断开,形成一个独立的细胞培养单元。该芯片装置集成的常闭式气动控制腔室不需要连接外部的压力泵,简单快速地实现细胞培养腔室与流道的连通或断开,保证了每一个细胞培养腔室都成为一个独立的培养单元。
附图说明
图1为未施加负压时的培养腔室与两侧的流道断开的剖面示意图;
图2为施加负压后的培养腔室与两侧的流道连通的剖面示意图;
图3是微流控芯片装置的结构示意图以及A-A处的放大示意图;
图4为微电极基片层的结构示意图以及A-B处的放大示意图;
图5为气动控制层的结构示意图以及A-C处的放大示意图;
图6为培养腔室层的结构示意图以及A-D处的放大示意图;
图7为雨生红球藻在微藻电刺激微流控芯片中生长的显微镜图像;
图8为雨生红球藻内虾青素在使用本发明装置电刺激后以及未电刺激拉曼光谱仪图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是,当元件被称为“固定于”另一个元件,它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件,它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
一实施方式的微流控芯片装置,请参阅图1,图2,该微流控芯片装置由下至上依次设置有微电极基片层1、培养腔室层2以及气动控制层3,其中,微电极基片层1、培养腔室层2以及气动控制层3均为阵列式结构;微电极基片层1、培养腔室层2以及气动控制层3通过等离子体键合封接在一起。
如图1、图2、图4所示,微电极基片层1用于给细胞进行电刺激,同时可起支撑和细胞贴附作用,微电极基片层1包括基板11以及镀于基板11上的微电极层12;基板11为如玻璃等硬性透明材料制成,采用玻璃基底利于拉曼光谱仪对微藻产生的虾青素进行定量的检测;微电极层12通过电子束镀膜制备,为具有导电功能的材料电极对,如金微电极对、ITO电极对或者Al电极对,优选地,采用金微电极对;微电极层12通过与外置的电刺激发生器(例如,八通道刺激发生器(STG-4008,多通道系统))相连接,通过设有多列微电极层,可对不同列的微电极层上的细胞的进行不同电刺激条件的刺激。微电极层12的厚度可根据实际环境需要进行设置,进一步,微电极层12的厚度为50~200nm,宽度为50~150μm,进一步优选地,微电极层12的厚度为150nm,宽度为100μm。
如图1、图2、图5所示,培养腔室层2用于培养细胞,培养腔室层2的厚度为50~150μm;该培养腔室层2包括若干个培养腔室21、若干列流道22,若干个培养腔室21、若干列流道22形成阵列结构,每一列的流道22与该列上的间隔设置的一个或多个培养腔室21为可连通连接;每个培养腔室21的两侧分别与流道22可连通连接,每一列流道22的两端分别设置有入口223和出口224,培养腔室21与微电极层12对应设置,且培养腔室21能够覆盖微电极层12,使得每一对微电极在培养腔室里面;进一步,培养腔室21为由内向上凹设形成的一凹槽,凹槽的形状不作具体的限制,优选地,凹槽的形状为长方形、正方形、圆形或椭圆形,进一步优选地,凹槽为长方形形状;培养腔室的高度是根据细胞的大小进行设定,例如可以是40~60μm。在一个实施方式中,培养腔室21的凹槽结构自顶端向下间隔设有若干个微柱23,微柱23的底端与微电极层12抵接,能够起到支撑培养腔室21的作用,从而可防止培养腔室21塌陷;微柱的长度根据细胞培养腔室21的高度进行设置,进一步,微柱的长度可以为40~60μm;其中,微柱的形状可以是任何形状,在优选地实施方式中,微柱为椭圆形。
流道22包括常通的第一流道221和常闭的第二流道222,每个细胞培养腔室21两侧通过常闭的第二流道222与常通的第一流道221形成可连通的连接,流道22用于输送样本至细胞培养腔室21;在每一列流道22的两端处分别设有入口223和出口224;进一步地,入口与出口的直径为1~2mm;
第二流道222用于控制第一流道221的样品进入培养腔室或者阻断于培养腔室外,即第二流道222可以对第一流道起封闭或流通的作用,第二流道222为在培养腔室21与第一流道221之间部分向下凸设而成的凸体,在常态下(气动控制层中不施加负压时)第二流道222的下端与基板11抵接(第二流道222不与基板进行封接)从而阻断培养腔室21与第一流道221之间的连通,第二流道222可因气动控制层中施加的负压而向上抬起,从而使培养腔室21与第一流道221之间连通;第一流道221与第二流道222的宽度根据实际环境需求进行设置;优选地,第一流道221与第二流道222的宽度为90~200μm;第二流道222的长度为40~70μm。
进一步地,所述培养腔室层2的流道21、培养腔室22均由弹性材料制成,具体地,弹性材料选自聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸、环烯烃聚合物、聚酰亚胺、聚萘二甲酸乙二醇、聚偏氟乙烯、聚酯、聚酰亚胺、硅胶、聚碳酸酯树脂及热塑性聚氨酯弹性体橡胶中的至少一种。优选地,采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制成,其具有良好的透气性和透光性、良好的粘附性、化学惰性,利于细胞的生长和观察,且价格低廉。
如图1、图2、图6所示,气动控制层3用于控制流道与培养腔室22的连通与断开;气动控制层3采用弹性材料制成,优选地,其采用PDMS材料制成,其厚度为60~160μm。气动控制层3包括若干个气动控制腔室31、若干个气体管道32;每个气动控制腔室31连接有气体管道32,气体管道32上设有一气体出口321,气体出口321连接负压装置。
气动控制腔室31为向内凹设形成的凹槽,气动控制腔室31位于细胞培养腔室的上方,且覆盖到细胞培养腔室21两侧的第二流道222;使得第二流道222位于气动控制腔室31正下方,气动控制腔室31的形状不作具体的限制,优选地,气动控制腔室31的形状为长方形、正方形、圆形或椭圆形,进一步优选地,气动控制腔室31为长方形形状;气动控制腔室31的面积大于细胞培养腔室,进一步地,气动控制腔室31的长度为800~1000μm,宽度为250~500μm;为了便于抽负压,气动控制腔室31要稍高于培养腔室,可选择为60~100μm;其中,气体管道32的宽度为60~200μm。
负压装置包括不锈钢针头、硅胶管和注射器;通过注射器进行施加负压,当施加负压时,气动控制腔室31下方培养腔室两侧第二流道222向上抬起,培养腔室两侧的第一流道与培养腔室21相连通,可以接种细胞。当不施加负压时,气动控制腔室31下方培养腔室两侧的第二流道与底下的微电极玻璃基片相抵接,培养腔室与两侧的流道断开,形成一个独立的细胞培养单元。
本实施方式的微流控芯片装置中,一个培养腔室21、培养腔室两侧流道22、一个气动控制腔室31、与气动控制腔室连接的气体管道32以及位于培养腔室21底端的微电极层12形成一个独立的细胞培养单元,本实施方式的微流控芯片装置是由多个细胞培养单元构成。
上述微流控芯片装置实现细胞的培养的操作如下:
首先,微流控芯片装置的气动控制层的气体管道入口用注射器对气动控制腔室施加负压,让气动控制腔室下方的培养腔室两侧第二流道222向上抬起(如图2所示),第一流道221与培养腔室21相连通,在第一流道入口处用注射泵接种细胞;
其次,当每个培养腔室内接种了细胞后,气体管道32不再施加负压,气动控制腔室下方的培养腔室两侧第二流道222恢复与底下微电极玻璃基片相连接,第一流道与培养腔室断开连通(如图1所示),每个细胞培养腔室成为一个独立的培养和刺激单元;
再次,细胞接种后第二天,将培养腔室底部的微电极层与电刺激装置相连接,对培养腔室内的细胞分别进行不同电刺激参数条件的刺激;
最后,从培养的第一天采用倒置显微镜实时监测细胞的状态和行为。
上述微流控芯片装置至少有以下优点:
1)传统的微藻培养方式如烧瓶、培养板或光生物反应器由于其通量低不足以作为优化电刺激参数条件的系统,而且不能简单地通过改良现有培养系统的通量来解决,与传统方式相比,微流控芯片具有尺寸小、集成度高、可以实现多种场力的自动化复杂操作等特点以实现低成本和高通量地分析及监测生物样品的优势。本实施方式的微流控芯装置通过设有多个细胞培养单元构成可以更加快速和高效地批量培养,进而优化提高雨生红球藻产生虾青素的电刺激培养条件。并同时通过细胞的流速和接种方式确保每个微流控芯片培养腔室内具有相同的细胞密度。因此,在施加电场刺激之前所有细胞培养腔室内的培养条件都是相同的。而传统的微藻培养方式无法控制这些微藻生长微环境,微流控芯片成为解决这些技术难题的新工具,从而更加有效地优化雨生红球藻生产生物质的最佳电刺激培养条件,以提高虾青素的产量,并对积极研究各种不同类型生物质的有益应用作出贡献。
2)本实施方式提供微流控芯片装置能够在可控且独立的微环境下直接对雨生红球藻细胞进行电场刺激和培养,可以有效地提高微藻高价值生物质虾青素的产量。
3)微流控芯片装置可以高通量自动化地实现对电刺激参数条件的最佳优化,大大地降低了工作量,从而得到了雨生红球藻产生高产量虾青素的最佳电刺激培养条件。
4)微流控芯片装置集成的常闭式气动控制腔室不需要连接外部的压力泵,简单快速地实现细胞培养腔室与流道的连通或断开。同时保证了每一个细胞培养腔室都成为一个独立的培养单元;装置简单,可方便操作人员进行携带进行检测。
一实施方式的微流控芯片装置的制备方法,为上述微流控芯片装置的一种制备方法,该微流控芯片装置的制备方法包括如下步骤:
步骤S1:制作曝光掩膜版
按照图3~6所示的结构,需要把微流控芯片结构图分成三个图层,分别是微电极基片层1、培养腔室层2、气动控制层3。每个图层制作一个光刻掩膜。根据图形结构的尺寸大小和后续使用的光刻胶类型,培养腔室层和常闭阀气动控制层制作成菲林负片掩膜版(结构内部为透光,外部不透光),而微电极阵列层制作成菲林正片掩模版(结构内部为不透光,外部透光)。
步骤S2:气动控制层和培养腔室层模板以及微电极基片层的制备
具体地,步骤S2包括步骤S21:在基板上形成负性光刻胶,依次经烘烤和紫外光刻、后烘、显影、蚀刻,得到具有图案的图形层。
具体地,基板为硅片;负性光刻胶为MicroChem的SU-8 2005负性光刻胶SU-8 2015负性光刻胶、SU-8 2050负性光刻胶、SU-8 3050负性光刻胶等。
在其中的一个实施例中,基片为采用3英寸硅片上匀上一层45μm厚的负性光刻胶,经过烘烤和紫外光刻、后烘、显影、蚀刻,得到具有细胞培养腔室的图形层;
在另一个实施例中,基片为采用3英寸硅片上匀上一层65μm厚的负性光刻胶,经过烘烤和紫外光刻、后烘、显影、蚀刻,得到具有气动控制层的图形层。
具体地,步骤S2还包括步骤S22:在基板上形成导电层。
具体地,基板为玻璃基片;导电层的材质可以为具有良好的导电性的材料。具体地,导电层的材质选自铬、金、铝及ITO中的一种;在其中一些实施例中,在基板上形成导电层的方法为电子束蒸镀,镀上一层150nm厚的金,其粘附层是30nm的铬。
步骤步骤S2还包括步骤S23:在导电层上形成正性光刻胶,依次经烘烤和紫外光刻和显影蚀刻,得到具有微电极基片的图形。使用金的刻蚀液(Gold etchant TFA,Transene)和铬的刻蚀液(Chrome etchant 1020,Transene)进行湿法刻蚀,去掉正性光刻胶之后得到金微电极基片层。
在其中一些实施例中,正性光刻胶为苏州瑞红的rzj-304正性光刻胶。
需要说明的是,芯片模板的制备不限于采用上述方法制备。
步骤S3:芯片本体的制备
将PDMS的A液与B液按质量10:1比例搅拌混匀;
将气动控制层的SU-8模板固定在平底培养皿上,倒入PDMS溶液,真空除气泡后烘烤;具体地,倒入约2~3毫米厚的PDMS溶液,真空除气泡后放入80~90摄氏度烘箱烘烤0.5~2个小时;
将固化的PDMS从气动控制层SU-8模板上剥离并在气体入口处打孔;
在培养腔室层SU-8模板上匀上一层PDMS溶液,烘箱烘烤;具体地,倒入50~100μm厚的的PDMS溶液,80~90摄氏度烘箱烘烤0.5~2个小时。
打好孔的气动控制层和培养腔室层进行封准对接,确保气动控制层的常闭阀在培养腔室层的上方并且能够使得培养腔室两边的流道相连通。具体地,气动控制层和培养腔室层进行等离子机清洗。
将等离子封接之后的双层PDMS从培养腔室层的SU-8模板上剥离,在培养腔室层流道的进口和出口打孔;
将等离子封接好的双层PDMS和微电极基片层一起放入等离子清洗机中处理一分钟。在向气动控制腔室施加负压以使气动控制腔室下方的培养腔室层的第二流道向上抬起的同时,将封接在一起的培养腔室层和气动控制层与微电极基片层对准封接,使得各微电极对位于各培养腔室内,并且气动控制腔室腔室下方的培养腔室层的培养腔室及流道部分并不与微电极基片层的基片相封接;得到所述的微流控芯片装置。
实施例1
本实施例的微流控芯片装置在AutoCAD软件中完成设计,结构如图3~6所示,该微流控芯片装置由下至上分别包括微电极基片层1、培养腔室层2以及气动控制层3,其中,微电极基片层1、培养腔室层2以及气动控制层3均为5x10阵列式结构;微电极基片层1、培养腔室层2以及气动控制层3通过等离子体键合封接在一起。
微电极基片层1包括玻璃基板11以及镀于基板11上的金微电极阵列层12;镀于基板11上的金微电极阵列层12为5x10阵列式结构,微电极阵列层12通过电子束镀膜制备,微电极层12与外置的八通道刺激发生器(STG-4008,多通道系统)相连接,微电极层12的厚度为150nm,宽度为100μm。
培养腔室层2采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制成,培养腔室层2的厚度为80μm;该培养腔室层2包括5x10列的长方形培养腔室21、5x10列的流道22,每个培养腔室21的两侧分别与流道22连通,培养腔室21与微电极层对应设置,且培养腔室21能够覆盖微电极层12,使得每一对微电极在培养腔室里面;培养腔室21为由内向上凹设形成的一长方形凹槽,凹槽的高度为50μm。培养腔室21自顶端向下一体间隔设有3个椭圆形微柱23,微柱23的底端与微电极层12抵接,微柱的长度为50μm。
流道22包括常通的第一流道221和常闭的第二流道222;在每一列流道22的两端处设有一个入口223和一个出口224;第一流道221可与流道的入口223和流道的出口224分别联通(如图5所示)。样本通过第一流道的入口223与出口224流通;进一步地,入口与出口的直径为1mm;
第二流道222为在培养腔室21与第一流道221之间部分向下凸设而成的凸体,在常态下(气动控制层中不施加负压时)第二流道222的下端与玻璃基板11抵接(第二流道222不与基板进行封接)从而阻断培养腔室21与第一流道221之间的连通,第二流道222可因气动控制层中施加的负压而向上抬起,从而使培养腔室21与第一流道221之间连通;第一流道221与第二流道222的宽度为150μm;第二流道222的长度为50μm。
气动控制层3采用PDMS材料制成,其厚度为130μm。气动控制层3包括5x10阵列气动控制腔室31,5x10阵列气体管道32;气动控制腔室与培养腔室对应设置,每个气动控制腔室31连接有气体管道32,气体管道32上设有一气体出口321,气体出口321连接负压装置。
气动控制腔室31为向内凹设形成一凹槽,气动控制腔室31位于细胞培养腔室的正上方,且覆盖到细胞培养腔室21两侧的第二流道222;使得第二流道222位于气动控制腔室31正下方,气动控制腔室31为长方形形状;气动腔室层311的面积大于细胞培养腔室,进一步地,气动腔室层311的长度为920μm,宽度为500μm;气动控制腔室31高度为65μm;其中,气体管道32的宽度为100μm。
负压装置包括不锈钢针头、硅胶管和注射器;
本实施例的微流控芯片装置的制作方法,包括以下步骤:
(1)制作曝光掩膜版
按照图3~6所示的结构,需要把微流控芯片结构图分成三个图层,分别是微电极基片层1、培养腔室层2、气动控制层3。每个图层制作一个光刻掩膜。根据图形结构的尺寸大小和后续使用的光刻胶类型,培养腔室层和常闭阀气动控制层制作成菲林负片掩膜版(结构内部为透光,外部不透光),而微电极阵列层制作成菲林正片掩模版(结构内部为不透光,外部透光)。
(2)气动控制层和培养腔室层模板以及微电极基片层的制备
1、在清洗干净烘干后的3英寸硅片上匀上一层45μm厚的负性光刻胶SU-82025(MicroChem)前烘、紫外光刻、后烘、显影后得到5x10阵列细胞培养腔室的图形;
2、在另外的清洗干净烘干后的3英寸硅片上匀上一层65μm厚的负性光刻胶SU-82025(MicroChem)前烘、紫外光刻、后烘、显影后得到5x10阵列的常闭阀气动控制层的图形;
3、利用电子束蒸镀在清洗干净烘干后的2x2英寸玻璃基片上镀上一层150nm厚的金,其粘附层是30nm的铬;
4、在镀了金的玻璃基片上匀上一层1μm厚的正性光刻胶rzj-304(苏州瑞红)、前烘、紫外光刻、显影后得到微电极阵列的图形;3)使用金的刻蚀液(Gold etchant TFA,Transene)和铬的刻蚀液(Chrome etchant 1020,Transene)进行湿法刻蚀,去掉正性光刻胶之后得到金微电极阵列层。
2)芯片本体的制备:
1、将PDMS的A液与B液按质量10:1比例搅拌混匀;
2、将常闭阀气动控制层的SU-8模板固定在平底培养皿上,倒入2~3毫米厚的PDMS溶液,真空除气泡后放入80摄氏度烘箱烘烤1个小时;
3、将固化的PDMS从常闭阀气动控制层SU-8模板上剥离并在气体入口处打孔(直径1mm);
4、使用匀胶机在培养腔室层SU-8模板上匀上一层约80μm厚的PDMS溶液,静止10分钟后80摄氏度烘箱烘烤1个小时;
5、打好孔的常闭阀气动控制层PDMS和培养腔室层同时放入等离子清洗机中处理1分钟后对准封接,确保气动控制层的气动控制腔室在培养腔室层的上方并且能够使得培养腔室两边的流道相连通。
6、将等离子封接之后的双层PDMS从培养腔室层的SU-8模板上剥离,在培养腔室层流道的进口和出口打孔(直径1mm);
7、将等离子封接好的双层PDMS和2x2英寸的金微电极阵列玻璃基片一起放入等离子清洗机中处理一分钟。将10ml的注射器、针头、硅胶管与气动控制层的气道出口连接,利用抽真空的方法使得气动控制腔室连接的下方培养腔室层的流道PDMS薄膜向上抬起,同时双层PDMS与金微电极阵列基片对准封接,同时等离子封接时确保每一对金微电极在培养腔室里面,并且气动控制腔室下方的培养腔室层的流道部分并不与微电极层玻璃基片相封接。制备得到本实施例的微流控芯片装置。
实施例2
将上述实施例制备得到的微流控芯片装置上进行电刺激提高微藻虾青素产量的方法实验,步骤如下:
1)收集处于营养增长期的雨生红球藻H.Pluvialis(购买来源NIES-144,Japan)进行培养和电刺激;
2)在微流控芯片装置的气动控制层的气体管道出口用10ml注射器施加负压,让气动控制腔室下方细胞培养腔室两侧第二流道向上抬起,第一流道与培养腔室相连通,在培养腔室层的入口处用注射泵接种浓度为3x107/ml的雨生红球藻细胞;
3)当每个细胞培养腔室内接种了适量(养腔室40%的面积接种了细胞)的雨生红球藻细胞后,气体管道不再施加负压,气动控制腔室下方的培养腔室两侧第二流道恢复与底下微电极玻璃基片相抵接,同时第一流道与培养腔室断开连通,每个细胞培养腔室成为一个独立的培养和刺激单元;
4)细胞接种后第二天,将培养腔室底部的金微电极阵列与八通道刺激发生器(STG-4008,多通道系统)相连接,对细胞培养腔室内的微藻进行1V、0.5Hz电刺激参数条件的刺激;
5)从培养的第一天采用倒置显微镜实时监测雨生红球藻细胞的状态和行为;
6)使用共聚焦拉曼光谱仪可以定量分析雨生红球藻中虾青素在不同电刺激培养条件下的产量。
实验结果如图7~8所示,图7中的深色的细胞为虾青素,可看出,随着培养的时间的增加,细胞生长良好,且虾青素的含量逐渐增加。图8中day1为第一天虾青素的拉曼光谱仪测试图,图8中的day6(with stimulation)为进行电刺激(1V,0.5HZ)的雨生红球藻虾青素的含量,图8中的day6(w/o with stimulation)为没有进行电刺激的雨生红球藻虾青素含量,虾青素的拉曼吸收峰出现在1516cm-1和1157cm-1,在波长1516cm-1的强度分别是进行电刺激的为7630.1和没有进行电刺激为2831.9,进行电刺激的雨生红球藻虾青素含量是没有电刺激的2.7倍。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.一种用于微藻生产生物质的微流控芯片装置,其特征在于,所述微流控芯片装置由下至上依次设置微电极基片层、培养腔室层以及气动控制层,所述培养腔室层以及气动控制层采用弹性材料制备而成;
所述培养腔室层包括在所述培养腔室层和所述微电极基片层之间形成的一列或多列流道,每列流道上设有一个或多个培养腔室,所述培养腔室为内部凹设形成的凹槽,所述微流控芯片装置的每一个培养腔室都是一个独立的细胞培养单元,培养腔室之间细胞、培养液和电极刺激互不干扰,所述流道包括常通的第一流道和设置在常通的第一流道与培养腔室之间的常闭的第二流道,所述第二流道为向下凸设而成的凸体,所述凸体的底端与微电极基片层抵接;
所述气动控制层包括对应于培养腔室层上的一个或多个培养腔室设置的一个或多个气动控制腔室,各气动控制腔室位于各培养腔室的上方,且覆盖培养腔室和培养腔室两侧的常闭的第二流道,所述气动控制层还包括与各气动控制腔室相连通的气体管道;所述气体管道具有气体出口并且能够连接负压装置;
所述微电极基片层包括基片和所述基片上的对应于培养腔室层上的一个或多个培养腔室和气动控制层上的一个或多个气动控制腔室设置的一个或多个微电极对,各微电极对位于各培养腔室内;
对所述气动控制腔室施加负压时,所述常闭的第二流道可因气动控制腔室中施加的负压而向上抬起,从而使培养腔室与第一流道连通;
对所述气动控制腔室未施加负压时,所述第二流道抵接微电极基片层,从而阻断培养腔室与第一流道之间的连通。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述气动控制层的厚度大于培养腔室层。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述气动控制层的厚度为60~160μm,所述培养腔室层的厚度为50~150μm。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片装置,其特征在于,每列流道的两端处分别设有入口和出口。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述入口与出口的直径为1mm~2mm。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述培养腔室自顶端向下设有一个或多个微柱,所述微柱的底端与微电极基片层抵接。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述凹槽的形状为长方形、正方形、圆形或椭圆形。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述凹槽的高度为40~60μm。
9.根据权利要求1~8任一项所述的微流控芯片装置,其特征在于,所述弹性材料选自聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸、环烯烃聚合物、聚酰亚胺、聚萘二甲酸乙二醇、聚偏氟乙烯、聚酯、硅胶、及热塑性聚氨酯弹性体橡胶中的至少一种,及/或,所述微电极基片层的基片采用玻璃基片。
10.一种如权利要求1~9任一项所述的微流控芯片装置的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
制备培养腔室层以及气动控制层的模板以及微电极基片层;
将气动控制层的材料于所述气动控制层的模板上成型,得到成型件,并在气体出口处打孔;
将培养腔室层的材料于所述培养腔室层的模板上成型,并与已成型的气动控制层进行对准封接,确保气动控制层的各气动控制腔室在各培养腔室的上方并且能够覆盖培养腔室和培养腔室两侧的常闭的第二流道;
在向气动控制腔室施加负压以使气动控制腔室下方的培养腔室层的第二流道向上抬起的同时,将封接在一起的培养腔室层和气动控制层与微电极基片层对准封接,使得各微电极对位于各培养腔室内,并且气动控制腔室腔室下方的培养腔室层的培养腔室及流道部分并不与微电极基片层的基片相封接;得到所述的微流控芯片装置。
11.一种对微藻进行电刺激培养以生产生物质的方法,其特征在于,所述方法采用如权利要求1~9任一项所述的微流控芯片装置对微藻进行电刺激培养。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述生物质为虾青素,及/或所述微藻为雨生红球藻。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910944454.7A CN111996112B (zh) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910944454.7A CN111996112B (zh) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111996112A CN111996112A (zh) | 2020-11-27 |
CN111996112B true CN111996112B (zh) | 2023-05-30 |
Family
ID=73461744
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910944454.7A Active CN111996112B (zh) | 2019-09-30 | 2019-09-30 | 微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111996112B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115612609A (zh) * | 2022-09-26 | 2023-01-17 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种集成器官芯片及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2823999B1 (fr) * | 2001-04-27 | 2003-06-27 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif miniature de separation et d'isolement d'objets biologiques et utilisations |
CN103937665A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-23 | 东南大学 | 一种基于微流控装置的产电微生物筛选平台及其制备方法 |
CN105543072B (zh) * | 2016-01-05 | 2018-05-25 | 清华大学深圳研究生院 | 基于微流控芯片的癌细胞迁移及抗癌药物筛选共培养模型 |
CN106497771B (zh) * | 2016-10-21 | 2018-08-31 | 辽宁中医药大学 | 一种用于多种药物及细胞同时筛选的多功能微流控芯片 |
CN108517284A (zh) * | 2018-03-19 | 2018-09-11 | 复旦大学 | 一种用于研究藻类生长和生殖的微流控芯片 |
-
2019
- 2019-09-30 CN CN201910944454.7A patent/CN111996112B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111996112A (zh) | 2020-11-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Wang et al. | Biofilm based attached cultivation technology for microalgal biorefineries—a review | |
CN102580794B (zh) | 可定位细胞及生物体的微流控芯片及其应用 | |
US7618813B2 (en) | Multi-layered photobioreactor and method of culturing photosynthetic microorganisms using the same | |
US8658421B2 (en) | Circulatory photobioreactor | |
CN102827766B (zh) | 用于规模化红球藻生产虾青素的光生物反应器 | |
CN105524832A (zh) | 细胞培养装置及方法 | |
CN1213139C (zh) | 一种微藻工业化生产用光合生物反应器系统 | |
CN106801072B (zh) | 低频低强度超声促进微藻油脂合成的方法 | |
CN110199859B (zh) | 用于研究根际微域的方法及所用的微流控芯片装置 | |
CN111996112B (zh) | 微流控芯片装置及其制备方法、微藻生产生物质的方法 | |
CN108359580A (zh) | 一种用于经济微藻培养的微泡光生物反应器 | |
CN102428168A (zh) | 生物反应器系统 | |
CN204999909U (zh) | 内置光源气升式内环流光合生物反应器 | |
CN109097264B (zh) | 一种用于细胞膜片钳的微流控细胞吸附芯片 | |
CN207108986U (zh) | 一种防止微藻贴壁的微藻连续培养装置 | |
CN209940990U (zh) | 微流控芯片及细胞培养设备 | |
CN202898398U (zh) | 一种微藻培养及收集的光生物反应器 | |
CN101942383B (zh) | 一种光生物反应器 | |
US20160130546A1 (en) | Photobioreactor system and method | |
CN107988053A (zh) | 一种实现固定化培养及废水深度净化的微藻培养系统 | |
KR102359971B1 (ko) | 미생물의 유용물질 생산용 미세유체 칩 | |
CN107460129A (zh) | 生物质与培养液分离的工业化微藻培养方法 | |
CN109401971B (zh) | 一种多功能自动化独立/联合共培养装置 | |
CN108537333B (zh) | 一种集成微流控神经网络芯片及仿生实现方法 | |
CN203429184U (zh) | 多种附壁细胞共培养装置 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |