CN110199859B - 用于研究根际微域的方法及所用的微流控芯片装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置，包括载玻片(1)和微流控芯片(2)，在微流控芯片(2)的底部设有空腔(202)，从而使微流控芯片(2)形成芯片上(201)和芯片下，载玻片(1)紧贴空腔(202)；在空腔(202)内，分别设置左微柱群(203)和右微柱群(204)；左微柱群(203)和右微柱群(204)之间的空隙自然形成了供根系生长的植物通道(22)；芯片上(201)的内部分别设置与空腔(202)相连通的进液孔(23)、出液孔(24)、植物孔(25)；植物孔(25)的出口对应植物通道(22)。本发明还同时公开了利用上述微流控芯片装置进行的研究根际微域的方法。

Description

用于研究根际微域的方法及所用的微流控芯片装置

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种通过微流控技术手段研究根际微域的芯片和相应方法。

背景技术

根际一般指离根轴表面数毫米范围之内，植物、土壤和环境条件形成的特定的微生态系统，也是土壤根系-微生物相互作用最活跃的区域。

由于土壤不透明的性质，研究根际微域一直存在阻碍。传统上使用根箱，如通过三室多隔的根箱可进行毫米级采样，但这种破坏性采样对微生物群落结构的影响难以忽略。

微流控芯片在20世纪90年代初由A.Manz提出，是一项不断发展重要的科学技术，在2006年Nature杂志发表了“芯片实验室”的专辑，从多个角度阐述了微流控芯片广阔的应用前景。相较于传统的研究方法，将微流控的技术手段能够更加精确控制微环境，为更深入的根际微域研究提供了有力的技术支撑。

目前的微流控芯片为使用具有独立空腔的芯片进行植物根际微域的研究，其忽略了土壤物理结构对根际和微生物的影响；而同样在一定程度上模拟了土壤结构的微流控芯片，少有选择加入植物因素进行根际微域的探索。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于研究根际微域的方法及所用的微流控芯片装置。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置，包括载玻片和位于载玻片之上的微流控芯片，

在微流控芯片的底部设有空腔(底部设有凹槽，从而形成空腔)，从而使微流控芯片形成芯片上和芯片下，载玻片紧贴空腔；

在芯片下的空腔内，于微流控芯片长度方向的中心线的两侧分别设置左微柱群和右微柱群；左微柱群和右微柱群之间的空隙自然形成了供根系生长的植物通道；

左微柱群、右微柱群的结构均为如下：

由若干个(一定数量)的位于空腔内的微柱组成，相邻微柱的间距为40～60μm；微柱的直径为50～300μm，高度为50～100μm；

微柱为实心微柱，其作用是构建模拟的土壤根际微域结构；植物通道的作用是供根系生长；

芯片上的内部分别设置进液孔、出液孔、植物孔；上述进液孔、出液孔、植物孔均分别与空腔相连通；且植物孔的出口对应植物通道。

进液孔、出液孔、植物孔均贯穿芯片上的厚度方向，进液孔、出液孔、植物孔的数量且以及在芯片上的平面方向的位置，可基于实际需要(基于微柱结构框架)自行设定。利用进液孔、出液孔实现对芯片装置进行对营养液的添加和去除。

作为本发明的用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置的改进：芯片上的内部还分别设有至少一个的接种孔和至少一个的取样孔，接种孔、取样孔均与空腔相连通。利用接种孔、取样孔，可实现对芯片内生成的水稻根系进行微生物的接种和取样。

作为本发明的用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置的进一步改进：植物孔与载玻片的夹角为10～30°，进液孔、出液孔均垂直于载玻片。接种孔和取样孔，也垂直于载玻片。

植物孔与载玻片设计成上述夹角，以便于植物根系更好的由纵向生长转化为横向生长，从而顺利进入植物通道之中。

本发明还同时提供了利用上述微流控芯片装置进行的研究根际微域的方法，依次进行以下步骤：

1)、将水稻生长所需的营养液由进液孔注入空腔内，将带根的水稻种子(刚长出根的水稻种子)放在植物孔处；

将整个微流控芯片装置放入含水稻生长所需营养液的培养皿中，进行培育；从而使得水稻根系在植物通道内生长，进而进入微柱之间的间隙内；即，进入左微柱群和右微柱群内；

2)、通过接种孔对水稻根系进行微生物的接种，进行后续观察(显微镜下观察)。

本发明建立了一种模拟土壤根际环境的微流控芯片，微流控芯片由PDMS(聚二甲基硅氧烷)制作。

在本发明中：

1、设置了植物通道，通过液体培养的方式进行植物根系的培养；

2、芯片上设定了一系列微柱阵列(左微柱群、右微柱群)模拟土壤颗粒，不同直径的微柱可代表不同类型的土壤，从而实现结合植物根系建立芯片上的根际微域。

每一微柱的直径可统一、也可不统一，可根据实验所需模拟的根际微域中的土壤特性做相应调整。微柱的高度与微柱直径的比值≤1。

3、设置植物孔与载玻片的角度为10°～30°，有助于植物根系纵向到横向生长的衔接。

4、植物通道的高度可根据实际需要进行设定。植物通道的的高度一般为0.1～1.0cm，具体高度可根据所选择的植物种类决定。

相对于现有技术而言，本发明具有如下的技术优势：相较于传统的研究根际微域的方法，微流控技术使精准控制实验条件成为可能，并在一定程度上解决了土壤不透明特性所带来的研究障碍。土壤根际微域环境结构的构建与植物根系的组合，更加真实的反映了自然条件中土壤根际环境的状况，有助于人们对土壤根际-微生物相互作用等进行更深入的探索。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的俯视示意图。

图2为图1中B-B的剖视示意图；

图3为图2中I部的局部放大示意图；

图4为图2去除载玻片1之后的仰视示意图。

图5为实际使用状态下，芯片在激光共聚焦显微镜下观察结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置，包括载玻片1和微流控芯片2，载玻片1为标准载玻片，微流控芯片2由PDMS浇注而成；微流控芯片2位于载玻片1的上表面。

在微流控芯片2的底部设有凹槽，形成了空腔202，从而使微流控芯片2自然形成了芯片上201和芯片下，载玻片1紧贴空腔202，从而使得空腔202形成一个相对密封的腔体。即，PDMS浇注的微流控芯片2可看成是由上下两部分组成；即，由微流控芯片上部实心部分(芯片上201)和微流控芯片下部(内含微柱21的空腔202)组成(上部下部实则为一个整体)。

整个微流控芯片2的长度约为70mm，宽带约为20mm，厚度约为1cm，其中空腔202的高度约为50μm，芯片上201(微流控芯片上层实心部分)的厚度约为950μm。

在空腔202内，于微流控芯片2长度方向的中心线的两侧分别设置左微柱群203和右微柱群204；左微柱群203和右微柱群204之间的空隙作为植物通道22，实际使用时，可根据实验的需要，在植物通道22处使用不锈钢毛细管进行垫高处理。

左微柱群203和右微柱群204的结构均为如下：

由一定数量的位于空腔内的微柱21组成，相邻微柱21的间距为50μm；微柱21的直径为100μm，高度为40～50μm。

微柱21的作用是构建模拟的土壤根际微域结构；植物通道22的作用是供根系生长。

芯片上201的内部分别设置均贯穿整个芯片上201厚度的进液孔23、出液孔24、植物孔25；上述进液孔23、出液孔24、植物孔25均与空腔202相连通。且植物孔25的出口对应植物通道22。

芯片上201的内部还分别设有均贯穿整个芯片上201厚度的接种孔和取样孔，接种孔、取样孔均与空腔202相连通。接种孔和取样孔的设置数量可按照实际需要进行相应设置(此为常规技术)。

进液孔23直径0.5mm；出液孔24直径0.5mm；植物孔25直径2mm；接种孔直径0.5mm；取样孔直径0.5mm；植物孔25与载玻片1的夹角分别为30°，其余孔均垂直于载玻片1。

整个微流控芯片2由聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注而成。

按照上文给出的微流控芯片2的结构和尺寸，例如可按照如下微流控芯片的制备方法(常规)进行制作：准备工作(根据实验参数通过Auto CAD设计芯片，将CAD文件发送给相关公司进行掩膜定制，即光刻所需的模板)；光刻；显影；浇注；打孔；芯片键合。

上述微流控芯片装置的使用方法为依次进行以下步骤：

1)、由于载玻片1紧贴微流控芯片2的空腔202；因此，微流控芯片2的空腔202形成一个相对密封的腔体；

使用1mL注射器(或注射泵)将适宜水稻生长的营养液注由进液孔23注入微流控芯片2的空腔202内；

将刚长出根的水稻种子放在植物孔25上，使水稻的根系对准植物孔25，将整个芯片装置放在含水稻生长所需营养液的培养皿中，在适宜条件下培育。

适宜水稻生长的营养液的配方可参照国际水稻研究所《水稻生理研究实验手册》(Yoshida et al.,1976)。适宜条件具体为：25℃-12h日照恒温培养箱。

2)、大约在2天后可观察到水稻根系在芯片的植物通道22内生长，待根系生长到实验所需条件(一般为3cm长左右)下即可利用接种孔进行微生物的接种工作。接种已标记荧光蛋白的微生物更有利于本装置的观测工作。

实际使用状态下，芯片在激光共聚焦显微镜下观察结果如图5所述，可观察到植物根毛与微柱21之间紧密的联系，即建立了基于微流控芯片的水稻根际微域；根据图5，可观察到接种含绿色荧光蛋白的细菌后，细菌迅速定殖于根系，这对于研究根系-微生物之间相互作用具有重大意义。

对比例1、将实施例1中植物孔25与载玻片1的夹角由30°改成90°(即，垂直于载玻片1)。水稻根系可在根系内生长，但生长效果不好。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置，其特征在于：包括载玻片(1)和位于载玻片(1)之上的微流控芯片(2)，

在微流控芯片(2)的底部设有空腔(202)，从而使微流控芯片(2)形成芯片上(201)和芯片下，载玻片(1)紧贴空腔(202)；

在芯片下的空腔(202)内，于微流控芯片(2)长度方向的中心线的两侧分别设置左微柱群(203)和右微柱群(204)；左微柱群(203)和右微柱群(204)之间的空隙自然形成了供根系生长的植物通道(22)；

左微柱群(203)、右微柱群(204)的结构均为如下：

由若干个的位于空腔(202)内的微柱(21)组成，相邻微柱(21)的间距为40～60μm；微柱(21)的直径为50～300μm，高度为50～100μm；

芯片上(201)的内部分别设置进液孔(23)、出液孔(24)、植物孔(25)；上述进液孔(23)、出液孔(24)、植物孔(25)均分别与空腔(202)相连通；且植物孔(25)的出口对应植物通道(22)。

2.根据权利要求1所述的用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置，其特征在于：

芯片上(201)的内部还分别设有至少一个的接种孔和至少一个的取样孔，接种孔、取样孔均与空腔(202)相连通。

3.根据权利要求1或2所述的用于研究水稻根际微域的微流控芯片装置，其特征在于：

植物孔(25)与载玻片(1)的夹角为10～30°，进液孔(23)、出液孔(24)均垂直于载玻片(1)。

4.利用如权利要求1～3任一所述的微流控芯片装置进行的研究根际微域的方法，其特征在于依次进行以下步骤：

1)、将水稻生长所需的营养液由进液孔(23)注入空腔(202)内，将带根的水稻种子放于植物孔(25)处；

将整个微流控芯片装置放入含水稻生长所需营养液的培养皿中，进行培育；从而使得水稻根系在植物通道(22)内生长，进而进入微柱(21)之间的间隙内；

2)、通过接种孔对水稻根系进行微生物的接种，进行后续观察。

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