CN114276930A - 气液培养式器官芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种气液培养式器官芯片，包括一个或多个培养单元，每一培养单元包括多个培养孔，每一培养孔包括由上至下设置的储液孔、第一种植孔，第二种植孔和半透膜，其中，储液孔呈阶梯状孔，在其阶梯面上设置储液通槽；第一种植孔与储液孔连通；第二种植孔与第一种植孔连通，且储液通槽向下延伸与第二种植孔连通。半透膜设置于第一种植孔与第二种植孔连通的端面。其中，每一培养单元中，多个培养孔的储液孔通过第一连通通道连通。一个培养单元的多个储液孔通过第一连通通道进行连通，实现更高效的动态物质交换。能够实现传统液相培养或者气液培养模式。本申请还提供一种应用。

Description

气液培养式器官芯片及其应用

技术领域

本申请涉及生物组织工程技术领域，例如涉及一种气液培养式器官芯片及其应用。

背景技术

类器官(Organoid)原代组织来源的成体干细胞体外自组装成3D器官型结构，与人类器官拥有高度相似的组织学特征，重现其生理功能，其具有稳定的表型和遗传学特征，能够在体外长期培养。肿瘤微环境包含肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞等多种类型的细胞。

在实现本公开实施例的过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：现有3D类器官培养方式，无法更好地模拟肿瘤微环境，也无法保留更原始的结构分布特性。

发明内容

为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键/重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。

本公开实施例提供一种气液培养式器官芯片及其应用，以解决现有器官芯片在构建器官模型过程中，无法更好地模拟肿瘤微环境，也无法保留更原始的结构分布特性的问题。

在一些实施例中，所述气液培养式器官芯片，包括芯片本体，其上设置有一个或多个培养单元，每一培养单元包括多个培养孔，每一所述培养孔，包括储液孔，第一种植孔，第二种植孔和半透膜；其中，储液孔呈阶梯状孔，且储液孔的大尺寸段端口位于芯片本体的上表面；且在储液孔的阶梯面上沿轴向设置有储液通槽。第一种植孔位于储液孔下方且与储液孔的小尺寸段端口连通。第二种植孔位于第一种植孔下方且与第一种植孔连通，且储液通槽向下延伸至与第二种植孔连通。半透膜设置于第一种植孔的与第二种植孔连通的端面。其中，每一培养单元中，多个培养孔的储液孔通过第一连通通道连通。

在一些实施例中，前述的气液培养式器官芯片用于采用液相培养构建类器官模型的应用；或者，用于采用气液界面培养构建气液界面类器官(Air-Liquid interface类器官，ALI类器官)3D模型或2D单层模型的应用。

本公开实施例提供的气液培养式器官芯片及其应用，可以实现以下技术效果：

本公开实施例的气液培养式器官芯片中将两个或两个以上的培养孔划分为一个培养单元，在同一培养单元中，多个储液孔通过第一连通通道进行连通，实现更高效的动态物质交换，以更好地模拟肿瘤微环境，也能够保留更原始的结构分布特性。在细胞培养过程中，可以根据实验需求，利用该器官芯片进行培养基覆盖式的传统液相培养，也可以进行培养基通过半透膜与细胞发生物质交换的气液培养模式，即，可以满足细胞的不同培养需求，如传统胶滴式类器官培养或者气液界面式类器官的生长。

以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明和附图并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件示为类似的元件，附图不构成比例限制，并且其中：

图1是本公开实施例提供的一种气液培养式器官芯片的一个培养单元的结构示意图；

图2是本公开实施例提供的一种气液培养式器官芯片的一个培养单元的结构示意图；

图3是本公开实施例提供的一个培养单元的俯视结构示意图；

图4是图3中A-A向剖视结构示意图；

图5是本公开实施例提供的另一中培养单元的以图3中的A-A向剖视结构示意图；

图6至图11是本公开实施例提供的一种气液培养式器官芯片的第一储液层、第二储液层、第一种植层、半透膜层、第二种植层和第三储液层的结构示意图；

图12和图13是本公开实施例构建得到ALI结肠癌类器官培养模型形态图；

图14-a至图14-d是本公开实施例构建得到ALI结肠癌类器官的细胞核染料图、ALI样本细胞骨架图和免疫细胞的免疫荧光图；

图15是本公开实施例构建得到的ALI结肠癌类器官培养模型的细胞流式检测结果图；

图16是本公开实施例构建得到ALI结直肠2D单层模型的形态结构图。

附图标记：

10、培养单元；100、培养孔；101、储液孔；1010、阶梯面；1011、大尺寸段；1012、小尺寸段；1013、第三储液孔；102、储液通槽；103、第一种植孔；104、贯穿槽孔；105、第二种植孔；106、半透膜；107、第一连通通道；1071、第一连通通槽Ⅰ；1072、第一连通通槽Ⅱ；108、第二连通通道；110、第一储液层；120、第二储液层；130、第一培养层；140、半透膜层；150、第二培养层；160、底板；170、第三储液层。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本公开实施例的特点与技术内容，下面结合附图对本公开实施例的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本公开实施例。在以下的技术描述中，为方便解释起见，通过多个细节以提供对所披露实施例的充分理解。然而，在没有这些细节的情况下，一个或多个实施例仍然可以实施。在其它情况下，为简化附图，熟知的结构和装置可以简化展示。

本公开实施例的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本公开实施例的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。

本公开实施例中，术语“上”、“下”、“内”、“中”、“外”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本公开实施例及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本公开实施例中的具体含义。

另外，术语“设置”、“连接”、“固定”应做广义理解。例如，“连接”可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本公开实施例中的具体含义。

除非另有说明，术语“多个”表示两个或两个以上。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开实施例中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

结合图1至图15所示，本公开实施例提供一种气液培养式器官芯片，包括芯片本体，其上设置有一个或多个培养单元10，每一培养单元10包括多个培养孔100，每一所述培养孔100，包括储液孔101，第一种植孔103，第二种植孔105和半透膜106。其中，储液孔101呈阶梯状孔，且储液孔101的大尺寸段1011端口位于芯片本体的上表面；且在储液孔101的阶梯面1010上沿轴向设置有储液通槽102。第一种植孔103位于储液孔101下方且与储液孔101的小尺寸段1012端口连通。第二种植孔105位于第一种植孔103下方且与第一种植孔103连通；且储液通槽102向下延伸至与第二种植孔105连通。半透膜106设置于第一种植孔103的与第二种植孔105连通的端面。其中，每一培养单元10中，多个培养孔100的储液孔101通过第一连通通道107连通。

本公开实施例的气液培养式器官芯片中将两个或两个以上的培养孔100划分为一个培养单元10，在同一培养单元10中，多个储液孔101通过第一连通通道107进行连通，实现更高效的动态物质交换。在细胞培养过程中，可以根据实验需求，利用该器官芯片进行培养基覆盖式的传统液相培养，也可以进行培养基通过半透膜106与细胞发生物质交换的气液界面培养模式。即，可以满足细胞的不同培养需求，如传统胶滴式类器官培养或气液界面培养类器官(ALI类器官)的生长。

本公开实施例的器官芯片的细胞种植和培养采用开放通孔的方式，方便后续的上机检测以及细胞回收进行RNA、蛋白提取等分析应用。同时培养孔100排布布局可以进行标准化设计以与市场上检测设备兼容，更简便，更适合工业化推广。且操作简单，不需要专业技术人员，扩大了器官芯片的应用范围，普适性提高。

本公开实施例的器官芯片可适用于液相培养和气液界面培养两种培养方式，同时可以满足2到3种细胞的独立非接触式，还可适用于贴壁细胞和3D细胞的培养，如细胞的免疫响应、细胞间的招募过程、气液相培养需求细胞的培养等。

与transwell相比，本公开实施例的可进行气液界面培养的器官芯片具有如下优势：动态培养一方面促进物质交换及细胞生长，一方面更好的模拟体内剪切力环境对细胞的影响；培养体积微量，节省样本；结构设计合理，便于种植、换液等培养操作；可以是实现ALI类器官的原位鉴定如原位高内涵荧光观察；动态串联结构设计可以提供一致的培养环境，实现器官共培养模型。

本公开实施例中，培养孔100中的起储液功能的储液孔101部分，呈阶梯式孔，包括连通的大尺寸段1011和小尺寸段1012，且大尺寸段1011位于上层。储液孔101主要储备细胞生长所需培养基或者药物稀释液，并通过第一连接通道进行高效物质交换。当储液孔101的大尺寸段1011填充有培养基或者药物稀释液时，其能够为第一种植孔103和储液通槽102(或第二种植孔105)内的细胞/器官提供所需的营养液或者需要测试的药物；当仅在储液孔101的小尺寸段1012填充有培养基或者药物稀释液时，其仅为第一种植孔103内的细胞/器官提供所需的营养液或者需要测试的药物，即储液孔101的小尺寸段1012为第一种植孔103的专属储液孔，实现类器官传代培养和后续应用时作为消化液、检测液储液孔。

本公开实施例中，储液孔101、第一种植孔103和第二种植孔105的形状不限定，可以是圆孔、椭圆形、正方形、长方形、扇形或多边形(例如六边形、八边形等)等几何形状，在满足设计要求的情况下，储液孔101的形状以尽量盛放更多的培养基或者药物稀释液为设计依据，第一种植孔103和第二种植孔105的形状以便于生长为设计依据。

可选地，储液孔101的横截面呈圆形，储液孔101的大尺寸段1011的直径范围为15～20mm。可选地，储液孔101的大尺寸段1011的直径范围为15～18mm的圆孔。可选地，储液孔101的大尺寸段1011的直径为16.2mm。

可选地，储液孔101的大尺寸段1011深度为15～20mm。可选地，储液孔101的深度为15～18mm。可选地，储液孔101的深度为16.2mm。

可选地，储液孔101的阶梯面的径向宽度d为0.5～5mm。即，储液孔101的小尺寸段1012的半径比大尺寸段1011的半径小0.5～5mm。

可选地，储液孔101的阶梯面的径向宽度d为1～4mm。可选地，储液孔101的阶梯面的径向宽度d为3mm。

可选地，储液孔101的横截面呈圆形，储液孔101的小尺寸段1012的直径范围为8～14mm。可选地，储液孔101的小尺寸段1012的直径范围为9～12mm的圆孔。可选地，储液孔101的小尺寸段1012的直径为10.4mm。

可选地，储液孔101的小尺寸段1012深度为1.5～3mm。可选地，储液孔101的深度为2mm。

可选地，储液孔101为凹孔。开设于芯片本体内。

在一些实施例中，结合图4所示，储液通槽102包括沿储液孔101的阶梯面的周向连续的非闭合环形通槽。即储液通槽102为一个连通的连续结构。

可选地，如图4所示，储液孔101的阶梯面上沿轴向延伸设置有一个非闭合环形通槽，作为一个储液通槽102。

在另一些实施例中，储液通槽102包括多个孔道。即在储液孔101的阶梯面上沿轴向开设的多个孔道。本实施例中，多个孔道沿储液孔101的阶梯面周向分布。孔道的截面不限定，可以是圆形、椭圆形、正方形、长方形、扇环形或多边形(例如六边形、八边形等)等几何形状，在满足设计要求的情况下，孔道的形状以尽量盛放更多的培养基或者药物稀释液为设计依据。

可选地，储液孔101的阶梯面上沿轴向延伸设置有多个截面呈扇环形的孔道，作为储液通槽102。

可选地，储液孔101的阶梯面上沿轴向延伸设置有多个截面呈圆形的孔道，作为储液通槽102。

可选地，储液孔101的阶梯面上沿轴向延伸设置有多个截面呈椭圆形的孔道，作为储液通槽102。

在一些实施例中，储液通槽102的容积为20～500μL。保证培养基的储存量。此处，储液通槽102的容积是指一个闭合/非闭合环形通槽的整体容积或者多个孔道的总容积。当然，储液通槽102的容积不限于该数值范围，在结构允许的情况下，可以扩大储液通槽102的容积，满足不同需求。

可选地，储液通槽102的容积为50～300μL。可选地，储液通槽102的容积为100～150μL。可选地，储液通槽102的容积为125μL。

可选地，如图7所示，储液通槽102呈沿储液孔101阶梯面的周向的非闭合圆环形通槽，非闭合圆环形通槽的径向宽度为0.5mm～3mm。可选地，非闭合圆环形通槽的径向宽度为1mm～2.5mm。可选地，非闭合圆环形通槽的径向宽度为2mm。

本公开实施例中，第一连通通道107的尺寸设计以实现储液孔101之间的流体(例如，培养基)的微流控制为依据。其截面形状也不限定，可以是圆形、方形或者其他几何形状。

在一些实施例中，结合图1至图5所示，在芯片本体的厚度方向上，第一连通通道107向下延伸至与储液通槽102连通，向上延伸至储液孔101的大尺寸段1011或者延伸至芯片本体表面。即保证实现储液通槽102内的流体的微流控制。

可选地，每一培养单元10中，第一连通通道107为一个或多个，将一个培养单元10中的多个储液孔101串联连通。例如，一个培养单元10包括两个储液孔101时，通过一个第一连通通道107将两者连通。又如，如图3所示，一个培养单元10包括三个储液孔101时，通过两个第一连通通道107将三个储液孔101串联连通。

在一些实施例中，第一连通通道107的截面面积范围为0.01～100mm²。在该截面面积范围内，能够更好地实现微流控动态培养。

可选地，第一连通通道107截面呈方形，宽度的范围为0.1-10mm，高度的范围为0.1～10mm。

可选地，第一连通通道107截面呈方形，宽度的范围为0.5～5mm，高度的范围为0.5～5mm。

可选地，第一连通通道107截面呈方形，宽度的范围为2mm，高度的范围为2mm。

对于第一种植孔103，其对应设置于储液孔101的底部，且与储液孔101连通。第一种植孔103内接种类器官细胞，例如，肿瘤类器官。在一些实施例中，第一种植孔103的横截面尺寸小于或等于储液孔101的小尺寸段1012端口的横截面尺寸。

可选地，第一种植孔103的容积为1～50μL。在满足前述第一种植孔103的横截面尺寸小于或等于储液孔101的小尺寸段1012端口的横截面尺寸的要求下，不限定第一种植孔103的深度，只要满足容积要求即可。当然，容积值也可以是其他数值，能够培养细胞即可。

可选地，第一种植孔103为圆孔，第一种植孔103直径范围为5mm～12mm。可选地，第一种植孔103直径范围为6mm～10mm。可选地，第一种植孔103直径范围为8mm。

可选地，第一种植孔103深度范围为0.5～1.5mm。可选地，第一种植孔103的深度范围为1mm。

本公开实施例中，储液通槽102向下延伸至与第二种植孔105连通，以方便通过储液通槽102向第二种植孔105内接种细胞。可选地，如图4、图5和图8所示，在第一种植孔103周围设置有与储液通槽102适配连通的贯穿槽孔104，以实现储液槽孔102与第二种植孔105连通，方便由储液通槽102向第二种植孔105内接种细胞。

可选地，在芯片本体厚度方向上，储液通槽102的正投影位于第二种植孔105的正投影内。即，第二种植孔105的尺寸大于或等于储液通槽102的外缘的径向尺寸。

可选地，第二种植孔105尺寸与储液孔101大尺寸段1011的尺寸一致。

可选地，第二种植孔105的深度范围为0.5～1.5mm。可选地，第二种植孔105的深度范围为1mm。

本公开实施例中，第二种植孔105可以是通孔，也可以是盲孔。可选地，结合图4和图5所示，第二种植孔105为通孔；则，气液培养式器官芯片还包括底板160，设置于第二种植孔105底部(图4和图5中未示出底板160)。使用时放置于底板160上。可选地，第二种植孔105为盲孔，则不需要附加设置底板160即可实现在第二种植孔105内接种细胞。

在一些实施例中，结合图1至图5，以及图10所示，气液培养式器官芯片，还包括第二连通通道108，用于连通每一所述培养单元10中的多个第二种植孔105。以使得多个所述第二种植孔105处于相同培养环境中，提供更一致的培养环境。

本实施例中，第二连通通道108的尺寸设计以实现第二种植孔105之间的流体(例如，培养基)的微流控制为依据。其截面形状也不限定，可以是圆形、方形或者其他几何形状。

可选地，每一培养单元10中，第二连通通道108为一个或多个，将一个培养单元10中的多个第二种植孔105串联连通。例如，一个培养单元10包括两个第二种植孔105时，通过一个第二连通通道108将两者连通。又如，如图2和图10所示，一个培养单元10包括三个第二种植孔105时，通过两个第二连通通道108将三个第二连通通道108串联连通。

在一些实施例中，第二连通通道108的截面面积范围为0.01～100mm²。在该截面面积范围内，能够更好地实现微流控动态培养。

可选地，第二连通通道108截面呈方形，宽度的范围为0.1-10mm，高度的范围为0.1～10mm。

可选地，第二连通通道108截面呈方形，宽度的范围为0.5～5mm，高度的范围为0.5～5mm。

可选地，第二连通通道108截面呈方形，宽度的范围为2mm，高度的范围为1mm。

本公开实施例的气液培养式器官芯片中，只要具有前述的一个或多个培养单元10即可，具体的成型方式不限定。

在一些实施例中，气液培养式器官芯片一体注塑成型。例如，采用聚苯乙烯(Polystyrene，PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate，PMMA)一体注塑成型，该些材质的成本低，易于注塑成型，对细胞没有任何毒性，也不会有特异性吸附。

在一些实施例中，气液培养式器官芯片通过分层加工并组装构造获得。分层加工后组装，化整为零，简化成型工艺。

下面给出一种气液培养式器官芯片的具体结构形式，但不限于该种具体结构形式。

在一些实施例中，结合图1至图11所示，气液培养式器官芯片，包括顺次叠置的第一储液层110，第二储液层120，第一培养层130，半透膜层140和第二培养层150。第一储液层110上设置有多个第一储液孔；第二储液层120上设置有多个第二储液孔和围绕每一第二储液孔101段设置的一个或多个储液通槽102；第二储液孔与第一储液孔一一对应同轴设置形成呈阶梯状孔的储液孔101。第一培养层130设置有多个第一种植孔103和围绕每一第一种植孔103设置的一个或多个贯穿槽孔104；第一种植孔103与储液孔101一一对应连通设置，贯穿槽孔104与储液通槽102对应连通设置。第二培养层150设置有多个第二种植孔105；第二种植孔105与第一种植孔103对应设置，且使得第二种植孔105通过贯穿槽孔104与储液通槽102连通。半透膜层140设置于第一培养层130与第二培养层150之间，以在第一种植孔103的与第二种植孔105连通的端口处形成半透膜106。储液孔101、储液通槽102、第一种植孔103、贯穿槽孔104和第二种植孔105构建出所述培养孔100。多个培养孔100划分为一个或多个培养单元10，每一培养单元10中的多个培养孔100之间设置有第一连通通道107，第一连通通道107连通每一培养单元10中的多个储液孔101。

本公开实施例中，器官芯片包括五层芯片结构，将五层芯片结构按顺序叠置连接即可。可以利用双面胶、超声、热键合、plasma、热压等封接工艺将各层芯片粘结组装到一起。其中，基于半透膜层140的厚度，在图4和图5的剖视图中未示出半透膜层140。

本公开实施例中，各层芯片结构的材质为PMMA、PS等。各层结构的制作可以采用软光刻、塑模法、激光刻蚀、机加工、LIGA或者一次性注塑等方式获得各层芯片结构。

本实施例中，将芯片本体100进行分层加工时，结合储液孔101、第一种植孔103、第二种植孔105等结构特点进行分割加工即可。

可选地，第一储液孔的尺寸(例如，直径)大于第二储液孔的尺寸，两者叠置后，形成阶梯孔状的储液孔101。本实施例中，第一储液孔即为储液孔101的大尺寸段1011，第二储液孔即为储液孔101的小尺寸段1012。分别在第一储液层110和第二储液层120加工出多个通孔即可，成型/加工简单。

可选地，第一连通通道107分两部分加工形成。在第一储液层110的下侧面(即与第二储液层120的上侧面连接的侧面)上开设第一连通通槽Ⅰ1071，在第二储液层120上开设厚度方向上贯通的第二连通通槽Ⅱ1072，连通每一培养单元10中多个储液通槽102；将第一储液层110和第二储液层120叠置后，第一连通通槽Ⅰ1071与第一连通通槽Ⅱ1072对接构建为第一连通通道107。本实施例中，通过控制第一连通通槽Ⅰ1071在厚度方向上的深度从而构建出不同结构的第一连通通道107。

可选地，结合图1至图4所示，在芯片本体的厚度方向上，第一连通通槽Ⅰ1071贯通第一储液层110，获得向上延伸至芯片本体表面的第一连通通道107。

可选地，结合图5所示，在芯片本体的厚度方向上，第一连通通槽Ⅰ1071的深度小于第一储液层110的厚度，即，第一连通通槽Ⅰ1071向上仅延伸至储液孔101的大尺寸段1011，未贯通第一储液层110(或者，增加设置第三储液层170，将第三储液层170叠置于第一储液层110上)。

在一些实施例中，气液培养式器官芯片还包括第二连通通道108，则，第二培养层150上开设厚度方向上贯通的第二连通通道108，连通每一培养单元10中的多个第二种植孔105。

本公开实施例中，当第二种植孔105为通孔时，气液培养式器官芯片，还包括底板160，第二种植层150叠置与底板160上。方便接种培养。底板160可以采用玻璃或者PS底板。

在一些实施例中，在芯片本体的厚度方向上，第一连通通道107向上延伸至储液孔101的大尺寸段1011或者延伸至芯片本体表面。如图1所示，以第一储液层110作为芯片本体的表层时，第一连通通道107向上延伸至芯片本体表面。而当第一连通通道107向上延伸至储液孔101的大尺寸段1011时，则芯片本体还包括第三储液层170(如图5所示)，其上设置有多个第三储液孔1013，且第三储液孔1013的尺寸与第二储液孔1012的尺寸一致。第三储液层170叠置于第一储液层110上，第三储液孔1013与第二储液孔1012同轴设置。

本公开实施例提供了一种气液培养式器官芯片用于采用液相培养构建类器官模型的应用；或者，用于采用气液界面培养构建气液界面类器官(ALI类器官)3D模型或者2D单层模型的应用。

本实施例中，第一种植孔103内的细胞群可以通过底部半透膜106与第二种植孔105内的细胞发生信息交换以及与培养基发生营养物质交换，同时半透膜106的存在可以实现第一种植孔103内细胞的气液培养，即培养基存放于第二种植孔105内，储液孔101的小尺寸段1012内无需培养基存在以满足ALI样本的生长条件。第二种植孔105内也可以种植细胞，种植方式可以为传统2D贴壁生长，也可以为3D生长，通过不同的实验目的选择不同的种植方式。同时，利用该器官芯片还可以进行培养基覆盖式的传统液相培养。

采本公开实施例的器官芯片的结构设计与玻璃基底可以实现ALI类器官的原位鉴定，如通过免疫荧光法对ALI类器官进行标志物鉴定，大大增加ALI类器官鉴定的便捷性；ALI类器官的药筛应用鉴定等。

本公开实施例中，依据实际需要，在第一种植孔103和/或第二种植孔105内接种一种器官细胞或者分别接种不同的器官细胞，实现细胞培养，从而构建相应的类器官培养模型。

在一些实施例中，采用气液界面培养构建气液界面类器官3D模型，包括以下步骤：

S11、将原代组织细胞或类器官细胞接种于第一种植孔103内。

此处，原代组织细胞是将原代组织经物理破碎、消化和离心处理等一系列操作获得的细胞；其中原代组织是指由活体(例如，人体)上切除下来的器官组织。原代组织可以为正常器官组织，也可以为肿瘤组织，例如，结肠癌组织、肺癌组织、乳腺癌组织等。

类器官细胞是将类器官经过消化和离心处理等一系列操作获得的细胞；其中，类器官是指经过器官芯片将原代组织细胞培养获得的类器官，依据原代组织类型获得对应类型类器官。例如，原代组织为正常器官组织，则类器官为正常类器官；原代组织为肿瘤器官组织，则类器官为肿瘤类器官。具体地，类器官细胞可以为肿瘤细胞。例如，结肠癌类器官、肺癌类器官、乳腺癌类器官等需要使用基质胶或胶原包埋生长的肿瘤类器官。

原代组织细胞或类器官细胞的接种方式不限，例如，采用基质胶或胶原包裹的3D接种方式。

S12、将培养基由储液通槽102加入第二种植孔105内，且控制培养基液面不高出第一种植孔103的下端面。

这里，加入的培养基的具体成分依据第一种植孔103内接种的细胞确定，不限定。

本步骤S12中，培养基的液面不高出第一种植孔103的下端面为准，该下端面上设置有半透膜，因此，可选地，以液面与半透膜的上表面(位于第一种植孔103侧的表面)平齐。此时，液面刚没过半透膜，培养效果更好。

S13、将器官芯片稳定设定时间后，放置于动态摇床上进行动态培养。

这里，设定时间可以是12h～24h。即，器官芯片平台稳定12h～24h后，将器官芯片放置于动态摇床上进行动态培养。

可选地，动态培养参数包括：频率1cycle/min，角度10°。

可选地，本步骤S11中，将原代组织细胞或者类器官细胞接种于第一种植孔103内，具体包括：S111、制备中性胶原并以30μL/孔的标准在第一种植孔103铺胶原基底，并放置于37℃固定；S112、使用胶原酶消化胶原，然后将消化后的原代组织细胞或者类器官细胞加入中性胶原中制备获得原代组织细胞/类器官细胞-胶原悬液，并以30μL/孔(或，每孔200～500个细胞)的标准种植于已准备好带有胶原底的第一种植孔103内，随后置于37℃固定。完成原代组织细胞或类器官细胞接种。

下面以构建结肠癌类器官气液界面3D培养模型(ALI结肠癌类器官培养模型)为例，具体说明本公开实施例的气液培养式器官芯片的应用。

首先，类器官采用结肠癌类器官，按照前述S111至S112完成类器官种植。然后将结肠癌类器官用培养基由储液通槽102加入第二种植孔105内，并控制液面不高出储液通槽102。将接种完成的器官芯片平台稳定12h～24h后，将器官芯片放置于动态摇床上进行动态培养，其中，动态培养参数包括：频率1cycle/min，角度10°。构建获得ALI结肠癌类器官3D培养模型。

对上述获得的ALI结肠癌类器官3D培养模型进行原位成像拍照，获得的ALI结肠癌类器官培养模型形态图如图12和图13所示，可知，类器官呈典型的空腔结构，且可以通过形态分析在类器官内外分布有其他类型的细胞，该特征负责ALI肿瘤类器官样本的典型特征。

其中图14a至图14d所示依次为ALI结肠癌类器官原位免疫荧光复合通道图，细胞核染料图、ALI类器官细胞骨架图和免疫细胞荧光图。由此可知，该模型培养的ALI类器官与文献报道特征一致，即在培养类器官的同时，可以保证免疫细胞的存在，较为完整的重构肿瘤微环境。

对上述获得的肿瘤气液界面培养模型进行了细胞流式检测，检测结果图如图15所示，测试的ALI类器官的细胞群共有2024个细胞，横向坐标为免疫细胞标志物CD3蛋白，带有荧光染料PE标记，其中LR区域(Low and Right区域)内细胞群即为免疫细胞标志物CD3蛋白表达阳性的细胞群，即代表免疫细胞，数据显示，免疫细胞群占总细胞群的2.27％，即代表ALI类器官样本细胞群中包含2.27％的免疫细胞亚群，，此数据也与文献报道ALI类器官细胞群中有免疫细胞共存的研究结果一致，进一步证明该平台培养的ALI类器官的稳定性。

在另一些实施例中，采用气液界面培养构建气液界面类器官2D单层模型，包括以下步骤：

S21、对第一种植孔进行包被处理。

可选地，包被处理包括以下步骤：S211、将基质胶用预冷的基础培养基DMEM稀释后，取基质胶(例如，50μL)包被液加入第一种植孔103；S212、将器官芯片放置于细胞培养箱静置包被1～2h后，弃除上清液体即为包被完成。

S22、将原代组织细胞或类器官细胞接种于包被完成的第一种植孔103内；然后置于培养箱静置培养至细胞贴壁。

这里，原代组织细胞和类器官细胞参见前述步骤S11的相关内容，在此不再赘述。

其中，将原代组织细胞或类器官细胞的重悬混合液以50μL/孔(或，每孔200～500个细胞)的标准将细胞加到包被完成第一种植孔内。

培养箱静置培养时间不限，以完成细胞贴壁为准。可选地，培养箱静置培养2.5～3.5小时。

S23、将培养基由储液通槽102加入第二种植孔105腔室内，且控制培养基液面不高出第一种植孔103的下端面。液面控制参见前述步骤S12中所述内容，在此不再赘述。

S24、培养20～28h后将第一种植孔内103的培养基去除，并置于摇床进行动态培养。获得ALI类器官2D单层模型。

本步骤S24中，培养20～28h后仅需要将高出半透膜106的第一种植孔103内的培养基去除即可。

可选地，动态培养参数包括：频率1cycle/min，角度10°。

本实施例中，原代组织或者类器官可为正常器官的原代组织或者类器官，例如，结直肠，肺等；也可为肿瘤器官的原代组织或者类器官。

可选地，步骤S22中采用结直肠原代组织器官或者利用结直肠原代组织培养构建的结直肠类器官。此时第二种植孔105内流动培养基流体产生的张力可以还原肠道在体内受到张力的真实生理状态以及血管内的血液流动，上层的气体界面还原肠道细胞的气界面生理状态，能够更加良好的模拟肠道细胞的生长环境。从而构建呈更加仿生的ALI肺类器官2D单层模型。如图16所示的ALI结直肠2D单层模型的形态学结构图，可见，细胞在第一种植孔的半透膜表面形成一种致密的2D单层细胞。

在另一些实施例中，本公开实施例的气液培养式器官芯片用于构建药物筛选模型的应用。本应用中，是在前述采用液相培养构建类器官模型或者采用气液界面培养构建气液界面类器官模型(3D培养模型或者2D单层模型)的基础上，向培养模块内加入梯度浓度的待测试药物溶液进行药物处理，获得ALI肿瘤药物筛选模型。在此不进行赘述。

以上描述和附图充分地示出了本公开的实施例，以使本领域的技术人员能够实践它们。其他实施例可以包括结构的以及其他的改变。实施例仅代表可能的变化。除非明确要求，否则单独的部件和功能是可选的，并且操作的顺序可以变化。一些实施例的部分和特征可以被包括在或替换其他实施例的部分和特征。本公开的实施例并不局限于上面已经描述并在附图中示出的结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种气液培养式器官芯片，其特征在于，包括芯片本体，其上设置有一个或多个培养单元，每一所述培养单元包括多个培养孔，每一所述培养孔，包括：

储液孔，呈阶梯状孔，且所述储液孔的大尺寸段端口位于所述芯片本体的上表面；且在所述储液孔的阶梯面上沿轴向设置有储液通槽；

第一种植孔，位于所述储液孔下方且与所述储液孔的小尺寸段端口连通；

第二种植孔，位于所述第一种植孔下方且与所述第一种植孔连通；且所述储液通槽向下延伸至与所述第二种植孔连通；

半透膜，设置于所述第一种植孔的与所述第二种植孔连通的端面；

其中，每一所述培养单元中，多个所述培养孔的储液孔通过第一连通通道连通。

2.根据权利要求1所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，在所述芯片本体的厚度方向上，所述第一连通通道向下延伸至与所述储液通槽连通，向上延伸至所述储液孔的大尺寸段或者延伸至所述芯片本体表面。

3.根据权利要求1或2所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，所述储液通槽包括沿所述储液孔阶梯面周向的非闭合环形通槽；

或者，所述储液通槽包括多个孔道。

4.根据权利要求1或2所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，

所述第一种植孔的横截面尺寸小于或等于所述储液孔的小尺寸段端口的横截面尺寸；

在所述芯片本体厚度方向上，所述储液通槽的正投影位于所述第二种植孔的正投影内。

5.根据权利要求1或2所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，还包括：

第二连通通道，用于连通每一所述培养单元中的多个第二种植孔，以使得多个所述第二种植孔处于相同培养环境中。

6.根据权利要求5所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，所述第一连通通道和/或所述第二连通通道的截面面积范围为0.01～100mm²。

7.根据权利要求1或2所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，包括：

底板，设置于所述第二种植孔底部。

8.根据权利要求1或2所述的气液培养式器官芯片，其特征在于，所述器官芯片，包括顺次叠置的第一储液层、第二储液层、第一培养层、半透膜层和第二培养层；

第一储液层，设置有多个第一储液孔；

第二储液层，设置有多个第二储液孔和围绕每一所述第二储液孔设置的一个或多个储液通槽；所述第二储液孔与所述第一储液孔一一对应同轴设置形成呈阶梯状孔的储液孔；

第一培养层，设置有多个第一种植孔和围绕每一所述第一种植孔设置的一个或多个贯穿槽孔；所述第一种植孔与所述储液孔一一对应连通设置，所述贯穿槽孔与所述储液通槽对应连通设置；

第二培养层，设置有多个第二种植孔；第二种植孔与所述第一种植孔对应设置，且使得所述第二种植孔通过所述贯穿槽孔与所述储液通槽连通；

半透膜层，设置于所述第一培养层与所述第二培养层之间，以在所述第一种植孔的与所述第二种植孔连通的端口处形成半透膜；

所述储液孔、所述储液通槽、所述第一种植孔和所述第二种植孔构建出所述培养孔；

多个所述培养孔划分为一个或多个培养单元，每一培养单元中的多个所述培养孔之间设置有第一连通通道，所述第一连通通道连通每一培养单元中的多个储液孔。

9.如权利要求1至8中任一项所述的气液培养式器官芯片用于采用液相培养构建类器官模型的应用；或者，用于采用气液界面培养构建气液界面类器官3D模型或者2D单层模型的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述采用气液界面培养构建气液界面类器官3D模型，包括：

将原代组织细胞或类器官细胞接种于所述第一种植孔内；

将培养基由所述储液通槽加入所述第二种植孔内，且控制培养基液面不高出所述第一种植孔的下端面；

将器官芯片稳定设定时间后，放置于动态摇床上进行动态培养；

或者，

所述采用气液界面培养构建气液界面类器官2D单层模型，包括：

对所述第一种植孔进行包被处理；

将原代组织细胞或类器官细胞接种于包被完成的第一种植孔内；然后静置培养至细胞贴壁；

将培养基由储液通槽加入所述第二种植孔腔室内，且控制培养基液面不高出所述第一种植孔的下端面；

培养20～28h后将所述第一种植孔内的培养基去除，并置于摇床进行动态培养。

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