CN102428168A - 生物反应器系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于培养细胞、特别是贴壁细胞的生物反应器，还涉及该生物反应器的应用，特别是该生物反应器在细胞培养物的培养和增殖中的应用，且还涉及利用本发明的生物反应器培养细胞的方法。应用的一个特别领域是该生物反应器在GMP-适应性全自动化细胞培养和增殖中的应用。

Description

生物反应器系统
技术领域
本发明涉及用于培养细胞、特别是贴壁细胞(adherent cell)的生物反应器，还涉及生物反应器的应用，特别是用于细胞培养物的培养和增殖中的应用，且还涉及利用本发明的生物反应器培养细胞的方法。应用的一个特别领域是该生物反应器在GMP-适应性全自动化细胞培养和增殖中的应用。
背景技术
在组织工程(特别是涉及再生医学)的技术领域中，需要在洁净的室内条件下以GMP-适应性的方式进行生物实验室工艺的自动化操作。通过这种方式，能够实现更高产率、更高工艺安全性和可标准化工艺的优化和工艺控制。
这些年来，已确立了实验室规模生产中的一些标准。因此经常使用由注塑的聚丙烯或聚苯乙烯制成的一次性制品，这样避免了成本非常高的样品容器的清洁和消毒。首先从活体检查物(biopsate)中分离建立组织构造所需的细胞，然后将其在大小不同的细胞培养皿、培养瓶或多孔板中培养数天的时期。
为了培养的目的，首先将分离的原代细胞再悬浮在特定的细胞培养基中。随后将细胞悬浮液吸移至一次性培养器皿中，在该一次性培养器皿中细胞以不定的方式粘附至经过特别的预处理的塑料表面。在孵育器中孵育数天的时期，且定期用新鲜的细胞培养基更换旧的细胞培养基，随后将细胞培养物(生长有足够的密度，即融合的)自细胞培养器皿的塑料材料的表面脱附。脱附过程以完全酶促的方式(例如使用含胰蛋白酶/EDTA的溶液)进行，或者与机械激发联合进行。在此情况下，酶活性和机械应力两者对细胞活力都有负面的影响。
传统的细胞培养器皿不适于量相对较大的自动化生产。细胞仅在满足特定的对细胞典型的条件时才增殖。在这点上，一个重要的因素是例如接种密度，即分离的细胞被引入至培养器皿的细胞浓度。另一方面，必须选择接种密度，使其足够高，以允许细胞能够建立增殖所必需的细胞/细胞相互接触；另一方面，接种密度必需足够低，以提供充足的生长区域。在手动实验室操作中，多次传代(passaging)(即细胞的脱附和在新的、更大的器皿中培养)确保满足这些条件。转种培养工艺包括大量手动操作，例如溶液的添加和移除、在孵育器中孵育、细胞脱附的显微监测、辅助的机械作用、细胞悬浮液至离心管的转移、细胞计数、离心分离、移除上清液、在新鲜的培养基中再悬浮细胞和重新接种。这导致移液管和一次性器皿的消耗增加。当进行独立的操作时，实验室人员经常采用不同的处理技术，并作出独立的决定。这些涉及例如酶反应的时间长短、细胞脱附的监测、选择是否施加机械辅助以及(如果施加机械辅助的话)施加何种机械辅助、或者选择用于转移细胞培养物的器皿。在细胞的培养中，还需要考虑不同细胞类型的生长行为和增殖速度。总的来说，单一培养(unitary cultivation)过程因此高度依赖于自动化系统。
从前对自动化细胞培养系统进行过的尝试局限于使用改造的培养器皿复制手动实验室工艺中的顺序。如此，例如来自Greiner Bio-One公司的
Figure BPA00001463378600021
AutoFlaskTM细胞培养瓶的形状和处理被改造用于现有的自动化系统中。在这种情况中，细胞以与传统手动工艺相同的方式进行传代。
在PET膜上培养细胞的方法被用作实验室中的标准。为此目的，使用细胞培养插件，如通过例如WO 2004/020571A2而众所周知的那些。然而，它们仅以有限的尺寸可利用。在手动实验室工艺中使用插件膜的缺点是培养期间不能在显微镜下监测细胞培养物的生长。
发明内容
本发明是基于以下技术问题：提供使细胞的培养和扩增与现有技术相比够得到改善和/或简化的装置和方法。
本发明还基于以下技术问题：提供使细胞的培养和扩增能够节约细胞的方法和装置。
本发明还基于以下技术问题：提供使细胞的培养和扩增能够自动化的方法和装置。
本发明还基于以下技术问题：提供使细胞的培养和扩增能够简化的方法和装置。
本发明还基于以下技术问题：提供装置和方法，其避免由于多次传代而导致细胞受损，同时特别地使第一次传代的培养时期和生长时间延长。
本发明还基于以下技术问题：提供以节约贴壁细胞的方式使细胞自培养表面脱附的方法和装置。
本发明的技术问题通过本申请独立权利要求的主题得到解决。
特别地，本发明的技术问题通过权利要求1所述的生物反应器得到解决。
特别地，本发明的技术问题通过用于培养细胞的生物反应器得到解决，其中所述生物反应器的反应器空间被膜单元细分成两个反应器区域，且其中所述两个反应器区域各自具有适于导入和/或导出液体的开口，所述膜单元在至少局部区域是液体可渗透性的。
因此，本发明涉及具有一体化的细胞生长膜的生物反应器。生物反应器作为外壳，包围反应器空间(也称作反应器腔室)。该反应器空间被膜单元(在局部区域为液体可渗透性的)分成两个反应器区域。因此，所述生物反应器具有两个反应器区域或反应器空间区域。
根据本发明，所述生物反应器优选用于贴壁细胞的培养。
在本发明中，术语″贴壁细胞″是指如下细胞类型：其能够在细胞培养基中以单层或多层、但特别是单层在惰性表面(例如反应器皿)上培养。贴壁细胞与表面接触并粘附于其上。贴壁细胞一般形成连续的细胞层。贴壁细胞通常表现出密度依赖性增殖抑制(也称为接触抑制)，这尤其出现在融合过度的情况中。贴壁细胞通常衍生自组织，如皮肤、肌肉、神经、肝、肾。贴壁细胞的实例是纤维原细胞、HeLa细胞和许多肿瘤细胞。本领域技术人员公知的并根据待生长的细胞类型而选择的基质适合作为细胞培养基。
然而，还可以培养″悬浮细胞″。悬浮细胞是不以单层或多层生长(即不粘附至惰性表面)的细胞。悬浮细胞的实例是血细胞，如白细胞或淋巴细胞系。
本发明的优势，除其它外，在于避免细胞扩增期间的传代步骤并伴随有大大简化的工艺自动性，还在于节约细胞的工艺管理。
通过下面对本发明的生物反应器的应用和本发明的方法的描述，本发明的生物反应器的优势将更明显。
对于本发明的生物反应器，能够提供例如下面的优选和/或可选的实施方式：
根据本发明，所述生物反应器优选为可拆卸的。根据本发明，所述生物反应器优选能够被拆卸成至少三部分。
根据本发明，所述生物反应器优选能够被拆卸成至少三部分，即a)包围第一反应器区域的反应器外壳部分，b)包围第二反应器区域的反应器外壳部分和c)至少局部区域为液体可渗透性的膜单元。
根据本发明，所述生物反应器优选为模件结构。
根据本发明，所述生物反应器外壳因此优选由至少两个反应器外壳部分(尤其是由两个反应器外壳部分)形成。
可选地，第一和第二反应器外壳部分还能够互相连接，尤其是通过铰链互相连接。
优选地，根据本发明，所述第一反应器外壳部分被配置成反应器盖且第二反应器外壳部分被配置成反应器底部。
根据本发明，所述生物反应器优选包括反应器底部、反应器盖和膜单元。根据本发明，所述生物反应器优选由反应器底部、反应器盖和膜单元组成。根据本发明，反应器底部优选向上开口。所述膜单元然后覆盖反应器底部的开口，其中膜单元的膜被水平放置在该开口之上。反应器盖然后具有向下的开口。所述反应器盖然后放置在反应器底部上，使反应器盖中的开口也被水平的膜覆盖。膜单元的膜因此划分由反应器底部形成的反应器区域或反应器空间以及由反应器盖形成的反应器区域或反应器空间。
根据本发明，反应器空间因此优选被膜单元(其局部区域为液体可渗透性的)分成下部反应区域和上部反应区域。
根据本发明，所述两个反应器外壳部分优选能够以密封的方式互相连接。根据本发明，所述两个反应器外壳部分能够通过螺纹连接以密封的方式互相连接。然而，本领域技术人员也熟知另选的或附加的能够以密封的方式连接两个反应器外壳部分的方式，例如通过夹钳、夹具、带(尤其是橡皮带)或绳。
根据本发明，所述两个反应器外壳部分优选当细胞在所述生物反应器中培养期间以密封的方式互相连接。
根据本发明，所述膜单元优选由至少一个膜和至少一个框架组成。可选地，所述膜单元能够仅由至少一个膜组成。
根据本发明，所述膜单元优选由膜和框架组成。可选地，所述膜单元能够仅由膜组成。
根据本发明，所述反应器外壳部分优选具有接收装置，例如槽或突出部，用于接收和设置膜单元。
在可选的实施方式中，所述反应器外壳部分具有接收装置，例如槽或突出部，用于接收和设置膜。
在可选的实施方式中，所述反应器外壳部分具有接收装置，例如槽或突出部，用于接收和设置膜单元的框架。
如果膜单元包括框架，则所述框架优选用于支撑膜和将其定位，并将膜设置在所述生物反应器中。
任选提供的框架能够简易地和廉价地制造成一次性注塑部分。能够以这样的方式选择框架的材料(例如塑料材料，例如聚丙烯或聚苯乙烯)，从而使框架能够被消毒，特别是能够被高压消毒。可以规定膜单元的框架被多次使用，且优选为仅使用一次的膜在框架中可替换。
然而，还可以规定整个膜单元(包括例如框架)被配置成一次性产品。细胞培养框架能够简易地和廉价地制造成一次性注塑部分，且反应器外壳在消毒后能够选择性地被回收再用。这提供广范围的应用。
在本发明优选提供的膜单元中，特别地，膜的具体方式为优选通过夹钳保持在框架中的膜插件。
在本发明一个特别的可选的实施方式中，通过大小不同的框架插件，作为细胞生长区域的膜面积是可变化的，从而允许根据需要改变可使用的细胞生长区域。还可以规定框架的大小为可变化的，从而使其覆盖膜的大小不同的区域。这样使培养过程中可被细胞利用的膜表面的大小可变化，特别是在细胞生长或增殖期间可增大。
能够以不同的方式增加由膜形成的细胞生长区域的大小，而不会破坏生长条件，例如通过机械地可变的可调节的细胞生长区域。
在本发明进一步特别的可选的实施方式中，所述生物反应器能够以这样的方式被构建：使框架可以在生物反应器中反转，特别是能够以自动化的方式反转，从而能够对不同细胞类型进行共培养，包括例如在各种不同的培养基中。在这种情况下，根据本发明，优选规定膜的两个表面均作为细胞的生长区域；特别是，一个膜表面能够作为第一细胞类型的生长区域，且第二膜表面能够作为第二细胞类型的生长区域。这允许例如模拟血/脑屏障。
还可以规定将膜直接插入到生物反应器中，而不使用框架。
如果使用没有框架的膜，则可以提供用于拉紧生物反应器中的膜的拉紧系统。
此外，在生物反应器的制造过程中，能够将膜或膜单元直接连接于其上，尤其是连接至反应器外壳部分，例如连接至反应器底部。这在一次性生物反应器中尤其是可能的。
根据本发明，膜单元优选为通过膜是液体可渗透性的。根据本发明，膜因此优选形成液体可渗透性部分，特别是膜单元的唯一液体可渗透性部分。
在本发明可选的实施方式中，膜还可以被其它合适的多孔材料(例如海绵状材料)代替。
根据本发明，膜单元的膜优选为盘状的或片状的，且其被设置于两个反应器区域之间，使其两表面水平。优选地，根据本发明，整个膜单元粗略地为盘状的或片状的，且被设置于两个反应器区域之间，使其两表面水平。
根据本发明，膜优选占膜单元的至少25％。根据本发明，膜优选占膜单元的至少50％。还可以规定膜占膜单元面积的至少75％，特别是至少90％。
根据本发明，膜优选占膜单元面积的25％至100％。根据本发明，膜优选占膜单元面积的50％至100％。
膜用作细胞的生长区域。根据本发明，优选仅膜的两个表面中的一个用作细胞的生长区域。根据本发明，如果将膜优选水平地插入所述生物反应器中，则根据本发明，优选膜的上表面用作细胞的生长区域。
可选地，然而，特别是在贴壁细胞中，膜的两个表面都能够用作细胞的生长区域。
本领域技术人员熟知适合用于培养细胞(特别是贴壁细胞)的合适的液体可渗透性膜。
细胞生长膜能够例如由PET(即聚对苯二甲酸乙二醇酯)或类似的材料制成。根据定义，膜具有多孔结构，使得液体能够通过膜进行交换。
细胞生长膜能够例如由PET(即聚对苯二甲酸乙二醇酯)或类似的材料制成。还可以使用例如聚碳酸酯膜。根据定义，膜具有多孔结构，使得液体能够通过膜进行交换。
根据本发明，膜优选选自PET膜、PC膜、尼龙膜、两性尼龙膜、带正电荷的尼龙膜、带负电荷的尼龙膜、PTFE膜、纤维素酯膜、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、纤维素混合酯膜、再生纤维素膜、Nytran膜和NytranSuPerCharge++膜。
在本发明可选的实施方式中，膜是PET膜。在本发明可选的实施方式中，膜是PC膜。在本发明可选的实施方式中，膜是尼龙膜。在本发明可选的实施方式中，膜是两性的尼龙膜。在本发明可选的实施方式中，膜是带正电荷的尼龙膜。在本发明可选的实施方式中，膜是带负电荷的尼龙膜。在本发明可选的实施方式中，膜是PTFE膜。在本发明可选的实施方式中，膜是纤维素酯膜。在本发明可选的实施方式中，膜是醋酸纤维素膜。在本发明可选的实施方式中，膜是硝酸纤维素膜。在本发明可选的实施方式中，膜是纤维素混合酯膜。在本发明可选的实施方式中，膜是再生纤维素膜。在本发明可选的实施方式中，膜是Nytran+膜。在本发明可选的实施方式中，膜是Nytran SuPerCharge++膜。
细胞生长膜的涂层或施加表面结构也是可以选择的。
根据本发明，膜的孔径优选为至少0.01μm。根据本发明，膜的孔径优选为至少0.1μm。根据本发明，膜的孔径优选为至少0.35μm。
根据本发明，膜的孔径优选为至多20μm。根据本发明，膜的孔径优选为至多10μm。
根据本发明，膜的孔径优选为至少0.01μm，特别是0.1μm，且为至多20μm，特别为至多10μm。
根据本发明，膜的孔径优选为至少0.35μm，特别是0.4μm，且为至多9μm，特别为至多8μm。
例如可以提供的孔径是0.4μm、0.45μm、1.0μm、1.2μm、3.0μm、5.0μm或8.0μm。
本领域技术人员熟知膜的合适的孔径，其确保足够的液体通道(特别是细胞培养基的通道)，并同时确保良好的细胞培养。
根据本发明，膜单元的膜的孔密度优选为至少105孔/cm2。根据本发明，膜单元的膜的孔密度优选为至多108孔/cm2。
根据本发明，膜单元的膜的孔密度优选为至少105孔/cm2且至多108孔/cm2。例如可以提供的孔密度是0.1×106、0.2×106、0.4×106、2×106、22×106或100×106孔/cm2。
本领域技术人员熟知膜的合适的孔密度，其能够确保足够的液体通道(特别是细胞培养基的通道)，并同时确保良好的细胞培养。
还可以规定例如膜的面积扩展为50cm2至120cm2，特别是75cm2至85cm2。特别地，膜的面积扩展可以是约80cm2。
根据本发明，两个反应器区域各自具有适于导入和/或导出液体的开口。
所述开口连接生物反应器的内部和生物反应器的外部；因此，它们是贯通生物反应器外壳的开口。
根据本发明，优选两个反应器外壳部分各自具有适于导入和/或导出液体的开口。
优选地，所述开口可以是连接器的形式。所述生物反应器能够通过所述连接器(例如经由软管)连接至其它装置(例如在用于从细胞培养物中产生组织的自动化整体系统中)，且液体(特别是细胞培养基或用于使细胞脱附的溶液)能够通过所述连接器供应至所述生物反应器或从所述生物反应器移除。
所述开口还可以是隔板的形式。
所述开口还可以是移液管开口的形式。
根据本发明，第一反应器区域优选具有适于导入液体的开口。根据本发明，第一反应器区域优选具有适于导入和导出液体的开口。
根据本发明，开口优选是可关闭的。可选地，开口还可以配置成不可关闭的，例如，当生物反应器通过开口经由软管连接至整体系统时。
根据本发明，第一反应器区域中适于导入和/或导出液体的开口优选被设置在反应器外壳部分的侧面或上侧。根据本发明，第一反应器区域中适于导入和/或导出液体的开口被设置在反应器外壳部分的侧面。
根据本发明，第二反应器区域优选具有适于导入和导出液体的开口。
根据本发明，第二反应器区域中适于导入和/或导出液体的开口优选被设置在反应器外壳部分的侧面或上侧。根据本发明，第二反应器区域中适于导入和/或导出液体的开口被设置在反应器外壳部分的侧面。
根据本发明，适于导入和/或导出液体的开口被设计成阀。然而，它们也可以被设计成可关闭的或不可关闭的喷嘴或连接器，所述喷嘴或连接器能够与例如软管形式的供料管线或排液管线连接。这样使得能够连续或分步供应新鲜的液体，而将旧的液体同时或提前除去。这是一个优势，特别是当本发明的生物反应器被用在用于细胞培养的自动化装置中时。
可选地，然而，特别是在本发明的生物反应器的手动使用中，也可以不一样地供应和/或除去液体，例如通过移液管添加液体、或将其倒入或通过移液管除去液体、将其排掉或将其倒出。
根据本发明，液体优选为细胞培养基或用于将细胞从膜脱附的溶液。
根据本发明，能够这样配置第一和/或第二反应器区域：使它们由反应器腔室(实际的反应器区域)以及将开口连接至反应器腔室的引导系统形成。
根据本发明，可选地，可以规定多个反应器区域或一个反应区域仅由多个反应器腔室或一个反应器腔室形成。
根据本发明，可选地，可以规定所述生物反应器为可反转的。
根据本发明，所述生物反应器优选具有至少一个通风口。
根据本发明，第一反应器外壳部分优选具有至少一个通风口。根据本发明，第一反应器外壳部分(特别是反应器盖)优选具有通风口。
根据本发明，至少一个通风口优选提供有无菌过滤器。
还可以规定通风口是可关闭的。
根据本发明，所述生物反应器优选具有至少一个移液管开口。
根据本发明，第一反应器外壳部分优选具有至少一个移液管开口。根据本发明，第一反应器外壳部分优选具有移液管开口。
根据本发明，可以规定所述生物反应器具有两个移液管开口。在此情况下，可以规定一个移液管开口形成通向第一反应器区域的通路，以及第二移液管开口形成通向第二反应器区域的通路。在此情况下，第二移液管开口能够例如位于反应器盖的上侧，且为通向下面的第二反应器区域的管线的形式。该管线能够例如被引导沿着膜或膜单元。例如，特别成形的网(webs)能够允许通过移液管开口将液体引入下面的反应器区域。
根据本发明，可以特别规定两个移液管开口被设置在反应器盖的上侧。
可选地，还可以规定移液管开口为两个适于导入和/或导出液体的开口。在此实施方式中，因此可以规定不是在适于导入和/或导出液体的两个开口之外存在移液管开口，而是所述移液管开口代替适于导入和/或导出液体的两个开口。
特别是，可以规定所述生物反应器包括两个移液管开口和通风口作为仅有的开口。
根据本发明，移液管开口优选是可关闭的，特别是以密封的方式可关闭的。必要时，移液管开口也可以提供有液体可渗透性无菌过滤器。
可选地，还可以进一步提供开口(特别是可关闭的开口)，使得能够向生物反应器添加和/或从生物反应器除去液体，特别是细胞培养基或添加剂。
根据本发明，第一反应器外壳部分优选具有至少一个尤其提供有无菌过滤器的通风口，和/或可关闭的移液管开口。
在可选的实施方式中，所述生物反应器适于接收计量装置，例如电极；在此情况中，因此提供插槽或类似物，用于接收计量装置。
根据本发明，所述生物反应器中优选整合有能够测量数据的计量装置，例如测量TEER值的计量装置。
通过测量TEER值(TEER＝跨上皮电阻)，能够测定细胞群的密度。因此，能够测定细胞在膜上达到所需的细胞密度的时间点，特别是细胞层变成几乎融合或融合的时间点。
术语“融合”用于描述贴壁细胞在培养器皿面(即本申请中的膜表面)的表面上可能最接近的布置。细胞系之间的融合各不相同。
融合是细胞生长和/或增殖的结果，在即将达到融合或达到融合时，可以将细胞采集或传代。
根据本发明，所述生物反应器优选具有用于测量数据的装置，特别是电极。
根据本发明，所述生物反应器优选具有用于测量TEER值的装置，特别是电极。
可选地，可以为装置(特别是用于测量TEER值的电极)仅提供插槽。
根据本发明，第一反应器外壳部分优选具有用于测量TEER值的至少一个电极，特别是一个电极。根据本发明，第二反应器外壳部分优选具有用于测量TEER值的至少一个电极，特别是一个电极。
优选地，根据本发明，所述第一反应器区域具有用于测量TEER值的电极，且所述第二反应器区域也具有用于测量TEER值的电极。
通过任选地一体化的电极，能够以优选的方式通过测量TEER值来监测细胞在载体结构上的群密度。
根据本发明，优选向生物反应器中整合能够测量液体(特别是细胞培养基)的不透明性、pH、葡萄糖含量和/或含氧量的计量装置。例如，可以提供目测不透明性测量(visual opacity measurement)。
根据本发明，第一反应器区域优选具有用于测量液体量或液体体积的测量工具。根据本发明，第二反应器区域优选具有用于测量液体量或液体体积的测量工具。通过测量生物反应器中或生物反应器局部区域中的液体量，例如可以倒入刚好用于使细胞脱附的酶溶液的量，以便能够以简易的方式实施用于使细胞脱附的方法(其为本发明下文所优选的)，特别是自动化地实施该方法。
然而，也可以规定生物反应器中液体的量不一定需要被测量，因为反应器区域的体积是准确已知的，并且理想的或所需的量因此而同样是已知的且能够例如以计算机可控的方式被准确地计量而加入。
特别地，第二反应器区域，特别是被反应器底部包围的反应器区域的体积可以是5ml至20ml。
特别地，第二反应器区域，特别是被反应器底部包围的反应器区域的体积可以是至少10ml。特别地，第二反应器区域，特别是被反应器底部包围的反应器区域的体积可以是至多15ml。
根据本发明，本发明的生物反应器的两个反应器区域优选具有大致相同的大小和/或占大致相同的体积。
根据本发明，在此情况中，上部反应器区域优选稍微大于，特别是大于下部反应器区域。
根据本发明，所述生物反应器优选具有用于固定膜的支撑组件。根据本发明，第一反应器外壳部分优选具有用于固定膜的支撑组件。根据本发明，第二反应器外壳部分优选具有用于固定膜的支撑组件。根据本发明，第一和第二反应器外壳部分优选具有用于固定膜的支撑组件。根据本发明，反应器底部和反应器盖优选具有用于固定膜的支撑组件。
根据本发明，所述生物反应器外壳(特别是反应器外壳部分)由塑料材料或树脂玻璃制成。本领域技术人员熟知合适的塑料材料，以及其它可用于生物反应器外壳的材料。可用的塑料材料例如是聚丙烯或聚苯乙烯。
根据本发明，所述生物反应器外壳(特别是反应器外壳部分)优选至少在局部区域中是透明的。特别是可以提供透明的局部区域，使得能够观察膜上的细胞。
根据本发明，所述生物反应器外壳(特别是反应器外壳部分)可以优选被消毒。特别是高压消毒。生物反应器的外壳因此能够使用多次。这提供广范围的应用。
然而，可以规定将生物反应器设计成一次性产品。
特别地，可以将生物反应器提供为具有下列任选特征中的一个、多个或全部的一次性产品：
-生物反应器的所有组件被配置成一次性产品。
-生物反应器的反应器外壳由塑料材料(特别是聚丙烯或聚苯乙烯)制成。
-反应器外壳是通过注塑制造的。
-膜单元或膜被固定在反应器底部。
-生物反应器盖能够从由反应器底部和膜单元组成的单元升起。
-生物反应器具有两个移液管开口和可选择的通风口作为仅有的开口。
-两个移液管开口位于反应器盖的上侧。
-第一移液管开口通向第一反应器区域且第二移液管开口通向第二反应器区域。
-生物反应器具有隔板。
-生物反应器的宽度为至少6cm且至多12cm，特别是8cm至9cm，且长度为至少10cm且至多14cm，特别是至少12cm且至多13cm。
-生物反应器具有的宽度和长度为标准化多孔板的尺寸。
-生物反应器的高度为至少1cm且至多10cm。
-膜的面积扩展为50cm2至120cm2，特别是75cm2至85cm2。特别是，膜的面积扩展可以是约80cm2。
当然，此类生物反应器还可以具有本发明的其它特征和进一步的特征。
本发明的生物反应器可以被配置成GMP-适应性形式，且细胞培养物培养期间受污染的风险或无菌性的损失被减少。在此情况下，一次性组件的使用被降至最少，却不显著增加受污染的风险。
本领域技术人员熟知生物反应器的可能的形状。本领域技术人员能够容易地使生物反应器的形状适应其要求。根据本发明，生物反应器优选为盒状、纸板箱状或罐状。
特别是，所述生物反应器能够具有对应于细胞培养器皿(例如多孔板)的标准长度和宽度的长度和宽度。
根据本发明，本身不包括微泵的生物反应器是优选的。
本发明还涉及本发明的生物反应器的应用。
根据本发明，本发明的生物反应器用于培养细胞的应用是优选的。根据本发明，本发明的生物反应器用于细胞的培养和扩增的应用是优选的。
根据本发明，细胞优选是贴壁细胞。
根据本发明，细胞优选是真核细胞。根据本发明，细胞优选是动物细胞。根据本发明，细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人类、牛或鼠科动物细胞。
可选地，然而，还可以培养原核细胞、植物细胞或真菌细胞，特别是如果它们是贴壁细胞。
根据本发明，本发明的生物反应器在用于由细胞培养物产生组织的自动化装置中的应用是优选的。
可选地，然而，本发明的生物反应器也能够被手动使用，例如能够在洁净工作台下组装和加载，然后在孵育器中进行孵育。
能够选择性地使用生物反应器作为单机模块(stand-alone module)，或作为整体系统中的组件，例如用于由活体检查物产生细胞组织。
本发明还涉及培养细胞的方法，本发明的生物反应器被用于培养。根据本发明，细胞优选在该方法中被培养和扩增。
本发明的生物反应器允许进行细胞培养的全自动化方法，其优选能够在GMP-适应性条件下进行。
本发明还特别涉及培养细胞的方法，其包括以下步骤：a)提供本发明的生物反应器，b)将细胞施加至膜单元的膜，c)在生物反应器中培养细胞。
在此情况中，规定上述步骤以特定的顺序进行。根据本发明，步骤a)、b)和c)优选紧接地连续进行，不涉及其它中间步骤。
根据本发明，细胞优选在步骤b)中在液体(特别是细胞培养基)中培养。
根据本发明，细胞优选是贴壁细胞。根据本发明，细胞优选是真核细胞。根据本发明，细胞优选是动物细胞。根据本发明，细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人类、牛或鼠科动物细胞。
根据本发明，优选将细胞留在步骤b)中进行粘附；然后，在步骤c)开始时，使生物反应器第一次充满细胞培养基。其优选通过生物反应器的开口中一个进行。
为了实现满足生长条件，例如与细胞/细胞接触以及因此而必需的多次传代相关的生长条件，开发了用原代细胞填充(populating)细胞生长膜的新方法。根据本发明，优选在步骤b)中使用所述方法。
根据本发明，在此情况下，提供作为细胞生长区域的膜优选在填充期间没有被细胞液整体润湿；相反，生成了均匀分布在细胞生长区域上的单独的细胞簇。
根据本发明，悬浮在细胞培养基中的细胞优选在步骤b)中利用移液管大致恒定地(特别是以恒定的间距)被吸移并滴加在膜上。
在长度为10cm至14cm且宽度为6cm至10cm的膜中，细胞特别地以1ml至10ml，特别是3ml至5ml的总液体体积被施加。总液体量被分成多个液滴。
在此过程中，下列参数对于本领域技术人员来说是可变的：液滴体积、液滴间距、液滴中细胞的浓度和/或直至第一次替换培养基的等候时间。
这些参数还允许改变独立的细胞的培养行为。
在此情况下，液滴中的细胞浓度导致维持细胞生长所必需的细胞/细胞接触，同时使可利用的细胞生长区域的尺寸增加至标准实验室培养器皿的细胞生长区域的倍数。此外，此优选的填充方法确保细胞在作为培养区域的多孔材料中的均匀分布，而在标准的培养器皿中，细胞随机地分布，且在边缘区域中的分布一般高于中心处的分布。均匀的细胞分布的优点是填充的多孔材料上的生长条件是单一的。此足够大的细胞生长区域的结果是，特别是能够避免特别是在自动化工艺中额外的细胞传代步骤，从而免除了对大量会妨碍自动化工艺和损害细胞的处理步骤的需要。
根据本发明，液滴体积优选为至少2.5μl且至多30μl。液滴体积可以是例如2.5μl、5μl、10μl、20μl或30μl。
根据本发明，接种期间液滴中优选包含10至500，特别是25至350个细胞，例如约20、40、80、160或320个细胞。
根据本发明，在接种期间，优选将细胞以约4,000至约20,000细胞/cm2，特别是约4,000至约16,000细胞/cm2的细胞浓度施加至多孔表面。例如，可以向多孔材料，特别是膜施加4,000细胞/cm2、5,000细胞/cm2、8,000细胞/cm2、10,000细胞/cm2、16,000细胞/cm2或20,000细胞/cm2。对于约80cm2的膜面积，每个生物反应器具有大约320,000至1,280,000个细胞。
细胞生长区域中均匀的逐滴填充使细胞生长区域的尺寸能够成倍增加，而不破坏细胞成功扩增的条件。这样，能够实现无传代的细胞扩增所必需的细胞生长区域的尺寸。
传代过程中，酶反应作用或机械负载对细胞的其它损害也能够被减至最少，特别是减至培养期终结时细胞的单一脱附。
培养结束后细胞采集的时刻因此优选保持为细胞唯一所需的脱附过程。此外，通过新的脱附方法能够将酶对细胞的不良作用最小化。
可选地，细胞生长膜还能够以不同于吸移液滴的方式被填充，例如通过用悬浮在液体中的细胞进行喷雾而填充。
根据本发明，贴壁细胞优选保留在步骤b)中以粘附至膜，然后加入液体(特别是细胞培养基)以进一步培养。
根据本发明，液体优选在步骤c)中被再生。这特别地可通过适于导入和/或导出液体的开口来进行。液体可以被连续地、半连续地或分步地再生。
优选地，根据本发明，在此情况下，新的液体通过第一或第二反应器外壳部分中的开口被引入，且旧的液体通过第一或第二反应器外壳部分中的开口被除去。
优选地，根据本发明，在此情况下，新的液体通过反应器盖中的开口被引入，且旧的液体通过反应器底部中的开口被除去。
可选地，然而，还可以规定通过移液管开口引入或除去液体。
可选地，然而，还可以规定不使液体再生。
可以规定通过步骤c)的工艺控制对细胞状态的宽范围参数进行计量测试，例如通过用于测量TEER值的电极和/或培养基的自动化供应进行。特别是，可以规定通过测量TEER值确定步骤c)的持续时间。在此情况中，步骤c)优选可以在达到所需的细胞密度时终止，特别是当细胞几乎融合或融合时。
根据本发明，在培养后，优选将细胞在步骤d)中从膜表面脱附。根据本发明，优选使用适于使细胞脱附的溶液进行脱附。根据本发明，优选进行酶促脱附。
可使用含酶溶液(例如在现有技术中也用于使贴壁细胞脱附的含酶溶液)进行酶促脱附。特别是，本领域技术人员会使用胰蛋白酶，特别是EDTA溶液中的胰蛋白酶作为酶。在此情况中，本领域技术人员熟知合适的胰蛋白酶浓度。
根据本发明，酶优选为胰蛋白酶。然而，也可以使用本领域技术人员已知的其它酶，例如Accutase或rProtease。
酶溶液可通过生物反应器开口中的一个或通过敞开的生物反应器倒入。
根据本发明，适于使细胞脱附的溶液优选通过适于导入和/或导出液体的开口中的一个倒入生物反应器中，并由此到达膜。
根据本发明，所述生物反应器的设计和适于导入和/或导出液体的开口的位置使得能够进行温和的脱附工艺以及提高脱附的细胞的活力。
根据本发明，粘附至膜的细胞的脱附优选通过酶反应来控制，其中酶能够仅在细胞层与膜接触之处通过多孔膜起作用。
根据本发明，优选在培养后将细胞从膜的表面脱附，其中将适于使细胞脱附的溶液倒入反应器区域中，所述反应器区域环绕未通过该反应器区域中的开口施加细胞的膜的表面，使得溶液与膜接触。根据本发明，适于使细胞脱附的溶液优选仅与细胞的与膜连接的细胞分枝(cell branches)接触。
根据本发明，适于使细胞脱附的溶液优选通过反应器底部的开口引入到生物反应器中。根据本发明，优选仅引入如下量的溶液：使溶液的充入水平刚及至膜。当细胞优选粘附至朝向反应器盖的膜表面时，适于使细胞脱附的溶液因此仅与细胞的与膜连接的细胞分枝接触。
同样地，可以通过改变反应器的设计来修饰脱附过程和通过物理方法辅助酶促脱附，或必要时，用物理方法替代酶促脱附。物理方法包括向反应器底部施加压力；此外，还可以通过敲击和/或振动生物反应器来辅助脱附过程。物理方法还包括使用超声或从反应器下面往上升起气泡。
在本发明可选的实施方式中，在步骤d)中，细胞被酶促脱附，脱附由物理方法辅助。因此加速脱附过程。
可以规定细胞还在步骤d)或在步骤d)后通过过度压力脱附。例如，能够将适于使细胞脱附的溶液在压力下压经膜。
例如，可以规定在步骤d)中特别是通过引导系统除去细胞培养基，以及用PBS/EDTA充满两个反应器区域并孵育1至30min。取决于细胞的类型，此过程能够重复1至2次。然后可以将两个反应器区域完全排空，然后可以用酶溶液充满下部反应器区域。经过0.2至10min的特定范围，并通过施加50至2,000Pa的特定压力，酶溶液能够流经膜的孔(其直径为0.1至10μm)，甚至到达细胞与膜的上侧接触的点。随后，可以进行孵育步骤，持续时间为0.5至10min。
为了辅助脱附过程，在脱附过程中或在其后(即在脱附后)，可以在下部腔室中施加相同压力范围的压力。所述压力可以以0.1至200Hz的频率进行额外的调整。另外，可以通过对整个反应器实施机械激发来强化此过程。所施加的压力使特别是20ml/(min cm2)的体积流经膜。
可以规定在步骤d)完成后，在步骤e)中将细胞从膜除去。例如，细胞可以在细胞培养基(特别是含血清的细胞培养基)中被取出，然后被抽吸或通过移液管被除去。
可以规定在步骤d)完成后，在步骤e)中引入更多适于使细胞脱附的溶液，由此将细胞推离多孔表面。
可以规定在步骤d)中或在步骤d)后例如借助胰蛋白酶挑选细胞。
根据本发明，所述方法优选以自动化的方式进行，特别是在用于由细胞培养物产生组织的自动化装置中和/或使用机器人进行。
根据本发明，优选在用于由细胞培养物产生组织的自动化装置中进行所述方法。
在优选的实施方式中，本发明的生物反应器能够进行细胞(特别是贴壁细胞)的自动化细胞培养。
在此情况下，可以实现细胞生长区域的尺寸的有利增长，同时满足细胞生长的条件。
本发明的生物反应器还能够避免传代步骤，传代步骤特别是在自动化过程中是非常复杂的且能够很容易损害细胞。
本发明的生物反应器优选提供一体化计量，特别是测量TEER值。因此能够准确测定采集时刻(harvest moment)，包括特别是在自动化工艺中。
本发明的生物反应器使本发明用于使细胞从膜脱附的方法能够节约细胞，且其中仅细胞与膜的接触点与用于脱附的酶接触。
本发明的生物反应器、其根据本发明的应用以及本发明的方法尤其能够用在被操作用于培养贴壁细胞的自动化系统中。
然而，本发明的生物反应器、其根据本发明的应用以及本发明的方法还能够以实验室规模使用，特别是为了尽量减少污染的风险，以及避免将液体直接计量至制剂。
本发明的生物反应器、其根据本发明的应用以及本发明的方法尤其能够用在用于组织工程的细胞培养中。
本发明的生物反应器、其根据本发明的应用以及本发明的方法尤其能够用在用于产生作为体外测试系统或移植物的人造皮肤的各种细胞类型的培养中。
本发明的生物反应器、其根据本发明的应用以及本发明的方法尤其能够用在用于产生人造软骨移植物的各种细胞类型的培养中。
本发明的生物反应器的根据本发明优选的和可选的实施方式也应当被理解为生物反应器的应用的根据本发明优选的和可选的实施方式，以及本发明的方法的根据本发明优选的和可选的实施方式。
本发明的应用的根据本发明优选的和可选的实施方式也应当被理解为本发明的生物反应器的根据本发明优选的和可选的实施方式，以及本发明的方法的根据本发明优选的和可选的实施方式。
本发明的方法的根据本发明优选的和可选的实施方式也应当被理解为生物反应器的应用的根据本发明优选的和可选的实施方式，以及本发明的生物反应器的根据本发明优选的和可选的实施方式。
本发明的特别的实施方式示于从属权利要求中。
本发明的其它优点将体现在下文描述的附图中，其中：
图1示出组装状态下的本发明的生物反应器的优选实施方式(非真实比例示意图)；
图2示出拆卸状态下的本发明的生物反应器的优选实施方式(非真实比例示意图)；
图3示出本发明可选的反应器盖的各种视图；
图4示出本发明可选的反应器底部的各种视图；和
图5例示本发明优选的用于将细胞施加至反应器的膜单元的膜的方法。
图1示出组装状态下的本发明的生物反应器(100)的优选实施方式(非真实比例示意图)。所述生物反应器由反应器底部(20)、反应器上部(30)以及由膜(10)和框架(15)形成的膜单元组成。反应器底部(20)和反应器上部(30)具有用于固定膜(10)的支撑组件(21，31)。反应器底部(20)和反应器上部(30)以密封的方式连接，使得仅连接器形式的开口(24，34)通过引导系统(23，33)将反应器腔室(22，32)与生物反应器(100)的外界连接。引导系统(23，33)确保在细胞生长膜的整个区域上的连续和均匀的供应。任选的通风口或移液管开口未示出。反应器底部(20)和反应器上部(30)均具有用于测量培养细胞的TEER值的电极(26，36)。通过所测量的TEER值，可以监测生长过程并确定最佳的采集时刻。
膜(10)具有上侧(11)和下侧(12)。优选地，贴壁细胞在膜的上侧(11)被培养。在此情况中，通过开口(24，34)中的一个使反应器腔室(22，32)充满细胞培养基。当通过电极(26，36)进行的TEER值测量显示已到达最佳的细胞密度时，例如细胞已生长为融合，则能够通过下部开口(24)排出细胞培养基。然后能够通过开口(24)将含胰蛋白酶的溶液引入到生物反应器(100)中。引入溶液的量使得溶液仅刚好接触到膜(10)。结果，细胞从膜表面(11)脱附；然而，仅细胞的膜接触点与胰蛋白酶接触，使得与传统的细胞脱附相比，细胞受到较少的损害。
图2示出拆卸状态下的图1的本发明的优选的生物反应器(100)(非真实比例示意图)。反应器上部(30)以及由膜(10)和框架(15)形成的膜单元与反应器底部(20)分离。膜(10)的膜表面(11)因此是可及的，且能够进行细胞填充，例如通过向其上吸移细胞。其后，反应器上部(30)、膜单元和反应器底部(20)能够重新组装。
同样，示出开口(24，34)、反应器腔室(22，32)和引导系统(23，33)以及电极(26，36)。
图3和图4示出本发明优选的反应器盖(30)和本发明优选的反应器底部(20)的各种视图。反应器盖(30)和反应器底部(20)具有与多孔板大致相同的长度和宽度。对于这两个反应器外壳部分，可以看到支撑组件(21，31)。
图3还示出了通风口(37)和两个移液管开口(28，38)。移液管开口(28)用作通往上部反应腔室的通道。移液管开口(38)用作通往下部反应腔室的通道。可以通过绕过膜(设置在反应腔室之间)的引导系统以密封的形式实现该通道。
图3a和4a中示出的放大视图示出网(38a)的具体实施方式，所述网有助于液体通过移液管开口的引入。
图4示出安装的电极(26)。两个反应器外壳部分(20，30)能够通过钻孔(29，39)而彼此螺接。
图5例示了本发明优选的用于将细胞施加至反应器的膜单元的膜的方法。示出了具有膜(10)和框架(15)的膜单元。膜(10)的膜上侧(11)用来自细胞培养基的含细胞的液滴(60)均匀地覆盖。放大视图示出其内包含液滴(61)和细胞(62)的膜表面(11)的细节。
表1以实例的方式示出可使用的各种膜：
Figure BPA00001463378600211
表1：本发明的生物反应器中可使用的膜的示例性列表
因此，所述方法可以规定使用移液管将悬浮在细胞培养基的原代细胞以恒定的间距逐滴吸移到细胞生长膜上。
只有在细胞粘附时，生物反应器(100)才被组装且用细胞培养基充满。在此情况下，液滴中的细胞浓度导致维持细胞生长所必需的细胞/细胞接触，同时使可利用的细胞生长区域的尺寸增加至标准实验室培养器皿的细胞生长区域的倍数。此外，此填充方法确保细胞在整个培养区域中均匀分布，而在标准的培养器皿中，细胞随机地分布，且在边缘区域中的分布一般高于中心处的分布。均匀的细胞分布的优点是培养容器内的生长条件是单一的。此足够大的细胞生长区域的结果是，能够避免自动化工艺中的传代步骤，从而免除了对大量会妨碍自动化工艺的处理步骤的需要。
多次传代过程中，由于酶反应作用或机械应力对细胞的其它损害也能够被最小化，即减至培养期终结时细胞的单一脱附，原因是膜提供足够的空间用于细胞生长和增殖。
培养结束后细胞采集的时间点因此保持为细胞唯一所需的脱附过程。此外，通过优选的脱附方法能够将酶对细胞的不良作用最小化。

Claims (17)

1.一种用于培养细胞的生物反应器，其中所述生物反应器的反应器空间被膜单元细分成两个反应器区域，且其中所述两个反应器区域各自具有适于导入和/或导出液体的开口，所述膜单元在至少局部区域是液体可渗透性的。
2.如权利要求1所述的生物反应器，其中所述生物反应器能够拆卸成至少三部分，即
a)包围第一反应器区域的反应器外壳部分；
b)包围第二反应器区域的反应器外壳部分；
c)至少在局部区域为液体可渗透性的膜单元。
3.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述第一反应器外壳部分被配置成反应器盖，且所述第二反应器外壳部分被配置成反应器底部。
4.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述两个反应器外壳部分能够以密封的方式互相连接，特别是通过螺纹连接而互相连接。
5.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述膜单元由膜和框架组成，或者所述膜单元仅由膜组成。
6.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述膜单元是盘状的，且其被设置于所述两个反应器区域之间，使其两表面水平。
7.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述膜占所述膜单元面积的25％至100％。
8.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述膜的孔径为至少0.1μm且至多20μm。
9.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述膜单元的膜的孔密度为至少105孔/cm2且至多107孔/cm2。
10.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述第一反应器外壳部分具有至少一个尤其提供有无菌过滤器的通风口，和/或可关闭的移液管开口。
11.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器具有用于测量TEER值的电极。
12.如前述权利要求中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器是盒状或罐状。
13.前述权利要求中任一项所述的生物反应器用于培养细胞的应用。
14.权利要求1至12中任一项所述的生物反应器在用于由细胞培养物产生组织的自动化装置中的应用。
15.培养细胞的方法，其包括以下步骤：
a)提供权利要求1至12中任一项所述的生物反应器；
b)将细胞施加至所述膜单元的膜；
c)在所述生物反应器中培养细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中在培养细胞后，将细胞自膜表面脱附，其特征在于将适于使细胞脱附的溶液倒入反应器区域中，所述反应器区域环绕未通过该反应器区域中的开口施加细胞的膜的表面，使得溶液与膜接触。
17.如权利要求15至16中任一项所述的方法，其中所述方法以自动化的方式进行，特别是在用于由细胞培养物产生组织的自动化装置中和/或使用机器人进行。
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