CN101130744B

CN101130744B - 药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统

Info

Publication number: CN101130744B
Application number: CN 200710044223
Authority: CN
Inventors: 王贵荣; 齐念民; 张宝红; 闫继红; 廖凯
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: SJTU ZHONGYUAN RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2007-07-26
Filing date: 2007-07-26
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2027-07-26
Also published as: CN101130744A

Abstract

本发明涉及的是一种生物技术领域的药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统。本发明包括：储液瓶、反应器主体、重力沉降装置、废液瓶、组织/器官连续收获装置、双联取样瓶、液泵、氧探头、pH探头、在线监测系统、电脑。储液瓶、液泵、反应器主体、重力沉装置、废液瓶通过硅胶管依次相连。氧探头、pH探头通过在线监测系统与电脑相连。本发明具有反应器系统可用于各种不同组织、细胞和器官的培养，节约了成本，避免了对植物组织细胞造成的损伤等优点，应用于药用植物组织、细胞和器官悬浮培养。

Description

药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的系统，具体是一种药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统。

背景技术

我国是世界上药用植物资源最丰富的国家之一，作为最早开发的自然资源，药用植物资源目前面临着两个危机：一是野生植物资源蕴藏量和产量普遍存在着下降趋势；二是药用植物需求量不断增加，造成了对药用植物资源的超量采挖。传统的药用植物大田栽培一方面受“天时地利”的影响，产量质量波动大；另一方面不可避免地带来农药残留污染等问题。组织、细胞生物反应器培养具有生长迅速，易于控制的特点，从而可以逐渐取代大田栽培满足市场的需要。

目前用于药用植物组织、细胞和器官悬浮培养的反应器主要有搅拌式、气升式、鼓泡式等。搅拌式生物反应器操作范围大，供氧能力强，混合效果好，但搅拌过程中产生的剪切力对植物离体组织造成损伤。鼓泡式反应器虽然剪切力小，但不利于物质的混合和气体传递。气升式反应器具有结构简单、剪切力小、传质效果好、成本低的特点，是目前经常采用的反应器类型。

植物组织、细胞生物反应培养的方式一般有分批式、流加式，连续式等。我国在生物反应器工程领域与国际水平相比差距还很大，尤其在重要的连续灌注反应器工程方面还是技术空白。连续续灌培养，不仅使消耗的营养及时得到补充，反应条件保持恒定，而且可以把组织、细胞释放到反应器中的物质带到反应器外面，减轻了酚类物质对离体组织的毒害作用和培养基中目标产物造成的反馈抑制。但连续灌注培养过程中细胞与培养液有效的分离是一个技术瓶颈，限制了连续灌注培养的大规模应用。重力沉降对于敏感的植物离体组织来说是一个理想的组织细胞截留途径，由于植物细胞培养体系的粘度较大，沉降的效果会比较差，所以对沉降装置的设计有一定的技术要求。

经对现有技术文献的检索发现，Wei Wen Su等在《Journal of Biotechnology》(生物技术杂志)1996，50(1)：225-233上发表的“A perfusion air-liftbioreactor for high density plant cell cultivation and secreted protein production”(一个用于植物细胞高密度培养和次生蛋白生产的气升式连续灌培养生物反应器)中是通过重力沉降来截留细胞，把一块档板置于降液管的上部，在档板的一侧出现了一个相对静止的区域，从而实现植物细胞重力沉降。但所述反应器缺陷和不足是：在降液管中放置的档板与管壁不易封闭；另外反应器的升液管和降液管都为圆柱体，不利于植物组织特别是根和植株的伸展；反应器气喷头位于升液管的底部偏上的位置，升液管与降液管连接的地方容易积存细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统。本发明可用于各种不同组织、细胞和器官的培养，具有节约成本，重力沉降避免了对植物组织细胞造成的损伤，玻璃滤蕊气喷头经济实惠不会生锈等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括：储液瓶、反应器主体、重力沉降装置、废液瓶、组织/器官连续收获装置、双联取样瓶、液泵、氧探头、pH探头、在线监测系统、电脑。储液瓶、液泵、反应器主体、重力沉装置、废液瓶通过硅胶管依次相连。氧探头、pH探头通过在线监测系统与电脑相连。组织/器官连续收获装置设于反应器主体下方，并分别与反应器主体、液泵连接。储液瓶中的培养液在液泵的作用下流入反应器主体中，溢出来的液体在重力沉装置中进行培养液与细胞、织和器官的分离。分离后的细胞、织和器官通过液泵返回反应器主体中，废液流入废液瓶。

所述的储液瓶，其一端经由液泵与反应器主体连接，其另一端设有空气滤头。

所述的反应器主体，其下方设有气喷头，气喷头与气体流量计连接，气体流量计的另一端连接有气泵，气体流量计与气泵之间设有空气滤头。

所述的反应器主体设有细胞连续收获口，细胞连续收获口与组织/器官连续收获装置连接。

所述的废液瓶设有空气滤头。

所述的反应器主体包括：反应器升液管、重力沉降装置、气液分离区、降液管、气喷头、液体培养基入口、组织/器官连续收获口、细胞取样口、培养液出口、细胞连续收获口。升液管通过气液分离区与反应器升液管连接。反应器升液管其侧边分别设有液体培养基入口、细胞取样口，其上端设有筛板，其下端设有气喷头、组织/器官连续收获口。重力沉降装置附着于反应器升液管外侧，其上端设有培养液出口，其下端设有细胞连续收获口。本发明中反应器主体为外循环气升式结构，反应器升液管的主体为一个椭球体，反应器升液管上部有一个筛板。反应器升液管外侧附加一个重力沉降装置，在该重力沉降装置内培养物与培养液通过用重力沉降实现分离。将反应器升液管主体设计成椭球体是为药用植物组织、器官的生长提供一个足够大的生长空间。

所述气喷头置于反应器主体正下方，为镶嵌于玻璃管中孔径180μm的玻璃滤蕊。

所述的重力沉降装置为一个附加在反应器升液管外侧的圆柱瓶，圆柱瓶高为16cm，半径为8cm。圆柱瓶的下部与反应器主体相连，药用植物组织、细胞和器官于沉降瓶中在重力的作用下与培养液实现分离，分离后药用植物细胞和组织器官沉降到反应器主体中，上清液流入废液瓶。

所述的组织、器官连续收获装置包括：腔体、推动装置、过滤筛、除菌滤膜、组织器官收获口、组织器收获装置入口、培养液回流管。所述的腔体其上端设有组织器官收获口，其两侧分别为组织器收获装置入口、推动装置，其腔体内依次设有过滤筛、除菌滤膜。

所述的推动装置包括活塞式推动片、推动手柄、橡皮软管、弹簧。活塞式推动片紧贴于腔体内壁，弹簧套于推动手柄并设于橡皮软管内，橡皮软管连接于活塞式推动片与推动手柄之间。连续收获时，药用植物组织、器官随着培养液流入收获装置中，然后在过滤网上实现分离。培养液经过除菌滤膜后在液泵的作用下返回反应器，药用植物组织、器官被推入组织器官收获口中。

药用植物的入药部位有根、球茎和整个植株(全草)等，一般情况下，药用植物不同的组织、细胞器官培养需要不同类型的反应器，本发明为一个多功能型气升式生物反应器，适用于药用植物的各种不同组织、细胞和器官培养；使用重力沉降来实现组织细胞截留；气喷头为镶嵌在玻璃管中孔径180μm的玻璃滤蕊。

本发明为一个外循环式气升式反应器系统，主体反应器的反应器升液管主体为一个椭球体，降液管外侧附加一个沉降管，在该重力沉降装置内培养物与培养液通过用重力沉降实现分离。该反应器的总体积为5升，沉降区体积为800ml，降液管与升液管直径比(Ad/Ar)为：0.25；高径比(H/D)为6。将升液区主体设计成椭球体为药用植物组织、器官的生长提供一个足够伸展的空间。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)将外循环气升式反应器主体的升液管主体部分做成椭球体，可以使药用植物的不同组织、器官和植株在反应器内有一个足够的生长空间，一套反应器系统可用于各种不同组织、细胞和器官的培养，节约了成本；(2)降液区外侧附加一个重力沉降装置，沉降下来的组织细胞自动流回反应器内，避免了对植物组织细胞造成的损伤，同时节约了反应器外沉降时培养物返回反应器所消耗的能量。

附图说明

图1为本反应器系统结构示意图

图2反应器主体结构示意图

图3组织、器官连续收获装置结构示意图

其中：1-储液瓶，2-空气滤头，3-液泵，4-反应器，5-筛板，6-组织、器官连续收获装置，7-双联取样瓶，8-气泵，9-气体流量计，10-氧探头，11-pH探头，12-在线监测系统，13-电脑，14-重力沉降装置，15-废液瓶，16-细胞连续收获口，17-反应器升液管，19-气喷头，20-液体培养基入口，21-组织、器官连续收获口，22-细胞取样口，23-培养液出口，24-气液分离区，25-降液管，27-活塞式推动片，28-组织器收获装置入口，29-组织器官收获口，30-弹簧，31-培养液回流管，32-过滤筛，33-除菌滤膜，34-推动手柄，35-橡皮软管。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1所示，本实施例包括：储液瓶1、反应器主体4、重力沉降装置14、废液瓶15、组织/器官连续收获装置6、双联取样瓶7、液泵3、氧探头10、pH探头11、在线监测系统12、电脑13。储液瓶(1)、液泵3、反应器主体4、重力沉装置14、废液瓶15通过硅胶管依次相连。氧探头10、pH探头11通过在线监测系统12与电脑13相连。组织/器官连续收获装置6设于反应器主体4下方，并分别与反应器主体4、液泵连接。储液瓶1中的培养液在液泵的作用下流入反应器主体4中，溢出来的液体在重力沉装置14中进行培养液与细胞、组织和器官的分离。分离出来的细胞、组织织和器官通过液泵返回反应罐中，废液流入废液瓶。

储液瓶1，其一端经由液泵3与反应器主体4连接，其另一端设有空气滤头2。反应器主体4，其下方设有气喷头19，气喷头19与气体流量计9连接，气体流量计9的另一端连接有气泵8，气体流量计9与泵8之间设有空气滤头2。反应器主体4设有细胞连续收获口16，细胞连续收获口16与组织/器官连续收获装置6连接。废液瓶15设有空气滤头2。

如图2所示，所述的反应器主体4包括：反应器升液管17、重力沉降装置14、气液分离区24、降液管25、气喷头19、液体培养基入口20、组织/器官连续收获口21、细胞取样口22、培养液出口23、细胞连续收获口16。升液管17通过气液分离区24与反应器升液管17连接。反应器升液管17其侧边分别设有液体培养基入口20、细胞取样口22，其上端设有筛板5，其下端设有气喷头19、组织/器官连续收获口21。重力沉降装置14附着于反应器升液管17外侧，其上端设有培养液出口23，其下端设有细胞连续收获口16。本实施例中反应器主体4为外循环气升式结构，反应器升液管17的主体为一个椭球体，反应器升液管17上部有一个筛板5。反应器升液管17外侧附加一个重力沉降装置14，在该重力沉降装置14内培养物与培养液通过用重力沉降实现分离。将反应器升液管17主体设计成椭球体是为药用植物组织、器官的生长提供一个足够大的生长空间。

气喷头19置于反应器主体4正下方，为一个孔径为180μm玻璃璃滤蕊。重力沉降装置14为一个附加在反应器升液管17外侧的圆柱瓶，圆柱瓶高为16cm，半径为8cm。圆柱瓶的下部与反应器主体4相连，药用植物组织、细胞和器官于沉降瓶中在重力的作用下与培养液实现分离，分离后药用植物细胞和组织器官沉降到反应器主体4中，上清液流入废液瓶15。

如图3所示，所述的组织/器官连续收获装置6包括：腔体、推动装置、过滤筛32、除菌滤膜33、组织器官收获口28、组织器收获装置入口29、培养液回流管31，所述的腔体其上端设有组织器官收获口28，其两侧分别为组织器收获装置入口29、推动装置，其腔体内依次设有过滤筛32、除菌滤膜33。

所述的推动装置包括活塞式推动片27、推动手柄34、橡皮软管35、弹簧30。活塞式推动片27紧贴于腔体内壁，弹簧30套于推动手柄34并设于橡皮软管35内，橡皮软管35连接于活塞式推动片27与推动手柄34之间。连续收获时，药用植物组织、器官随着培养液流入收获装置中，然后在过滤网上实现分离。培养液经过除菌滤膜后在液泵的作用下返回反应器，药用植物组织、器官被推入组织器官收获口中。

本实施例的反应器主体4的总体积为5升，重力沉装置14体积为800ml，降液管25与升液管17直径比(Ad/Ar)为：0.25；高径比(H/D)为6。将升液管17主体设计成椭球体为药用植物组织、器官的生长提供一个足够伸展的空间。本实施例是一个多功能物生物反应器，可用于将药用植物组织、细胞和器官的连续培养。在进气速率为200-500vvm的条件下，K_La为5-10h^-1，沉降效率达到100％，适用于大部分药用植物的组织、细胞和器官连续灌注培养。

Claims

1.一种药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统，包括：储液瓶(1)、反应器主体(4)、废液瓶(15)、双联取样瓶(7)、液泵(3)、氧探头(10)、pH探头(11)、在线监测系统(12)、电脑(13)，其特征在于，还包括：组织/器官连续收获装置(6)、重力沉降装置(14)，所述的储液瓶(1)、液泵(3)、反应器主体(4)、重力沉装置(14)、废液瓶(15)通过硅胶管依次相连，氧探头(10)、pH探头(11)通过在线监测系统(12)与电脑(13)相连，组织/器官连续收获装置(6)设于反应器主体(4)下方，并分别与反应器主体(4)、液泵连接，所述的重力沉降装置(14)附着于反应器升液管(17)外侧，呈现圆柱管状。

2.如权利要求1所述的药用植物组织细胞连续灌注培养气升式生物反应器系统，其特征是，所述的反应器主体(4)设有细胞连续收获口(16)，细胞连续收获口(16)与组织/器官连续收获装置(6)连接。