CN109689366A - 用于细胞扩增和相关应用的三维生物反应器 - Google Patents

用于细胞扩增和相关应用的三维生物反应器 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及用于细胞扩增和细胞分泌物质生产的三维(3D)生物反应器的设计、制造和应用。生物反应器包含非随机互连的空隙，其为细胞粘附和生长提供连续的三维表面区域。

Description

用于细胞扩增和相关应用的三维生物反应器
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月5日提交的美国临时申请号62/332,177的申请日的权益，其教导内容通过引用结合于本文。
发明领域
本公开内容涉及用于细胞扩增和细胞衍生物质生产的三维(3D)生物反应器的设计、制造和应用。生物反应器包含非随机互连的空隙，其为细胞粘附和生长提供连续的三维表面区域。这种3D生物反应器还是可扩展的，其具有限定的几何形状、表面涂层和流体动力学，以维持单层细胞培养物并减少或防止细胞聚集、表型改变或细胞外生产，并且特别适用于干细胞、原代细胞和其他粘附细胞或非粘附细胞在生物反应器的适当表面涂层下的扩增。
背景
随着干细胞技术和再生医学的最新发展，基于干细胞的疗法的数量显著增加。干细胞具有治愈许多人类疾病的潜力，因为它们尚未特化，并且能够分化成许多类型的细胞用于组织修复和再生。得到充分研究的成体干细胞(如间充质干细胞(MSC))现在能够很容易地从骨髓、脂肪组织、胎盘/脐带和外周血中分离出来。它们具有多能性以分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞用于骨骼、软骨和皮肤再生。
还发现MSC分泌广谱的生物活性分子，包含激素、生长因子、细胞因子、趋化因子和外排体(exosome)，其具有潜在的治疗效果。MSC的一些已知治疗效果包括免疫调节、抗细胞凋亡、血管生成、支持局部干祖细胞的生长和分化、抗瘢痕形成和化学吸引。干细胞的这些特性不仅有助于它们参与基于细胞的疗法，而且还有助于制造由细胞分泌的生物药物。
在临床应用中，典型的治疗剂量需要大约108-109个干细胞(通常每千克体重二百万-二千万个细胞)。还已知一克组织含有约109个细胞。然而，在大多数临床情况下，从供体收集的细胞不足以满足临床需要。通常，来自供体髂嵴的30-50mL骨髓抽吸液包含约600-1000×106个骨髓单核细胞(BMMC)，其包含淋巴细胞、单核细胞、造血和内皮祖细胞和MSC。在BMMC中，仅约6-10×104个细胞(或0.01％或更少)是表面粘附的MSC。从供体收集的大约105个MSC需要10,000倍的细胞扩增，以达到109个细胞的临床注射剂量。
传统的MSC扩增依赖于二维(2D)平面系统，其被鉴别为组织培养瓶(T-培养瓶)或滚瓶，其用选定的培养基沐浴附着于内表面的细胞。两种系统通常由具有用于改善细胞附着的表面处理(氧等离子体)的聚苯乙烯制成。常规的细胞扩增过程在T-培养瓶底部或滚瓶壁上以3×103个细胞/cm2细胞的接种密度起始。如果使用低接种密度，细胞将缓慢生长，可能是由于缺乏来自邻近细胞的信号。培养约5-6天后，细胞在培养物表面形成单层，覆盖整个培养区域(称为100％汇合)，并且细胞密度可达约0.50×105个细胞/cm2。当细胞达到100％汇合时，它们由于细胞-细胞接触抑制而停止增殖并开始分化并形成细胞外基质。然后细胞分化能够改变原始细胞表型。为了减少细胞-细胞接触(或聚集)、细胞表型改变和细胞外基质的形成，通常以80％的汇合(或细胞密度为约0.40×105个细胞/cm2)收获细胞。从3×103个细胞/cm2的接种密度到0.40×105个细胞/cm2的收获密度，细胞扩增约13倍。
可以在T-培养瓶或滚瓶上生长的细胞数量与培养表面积成比例。因此，T-培养瓶根据其细胞培养区域命名为T-25、T-75和T175，其分别指示25、75和175cm2的细胞培养面积。由于低的表面与体积比，2D T-培养瓶难以按比例扩大至升、数十升或数百升的水平而具有合理的占用面积(footprint)。
此外，由于接种密度要求，培养过程必须逐步进行。也就是说，来自供体的105个细胞必须在第一步在T-25或T75培养瓶中扩增。然后将扩增的细胞(约1.3×106)分离(使用酶从表面解离)，然后再接种到5至6个T-75培养瓶中以进一步扩增。从105个细胞扩增到临床相关的109个细胞，它需要超过120个T-75培养瓶和三个细胞分离再接种过程。见图15。每次从一个表面分离细胞并重新接种(或亚培养)到不同表面上称为“传代”。在细胞扩增中手动处理大量T-培养瓶不仅是昂贵的，而且还容易引入污染。
已经报道了其他三维细胞扩增策略，其包括基于堆叠板、中空纤维、基于微载体的搅拌反应器、波(wave)生物反应器、旋转壁生物反应器和固定床生物反应器。参考Large-Scale Industrialized Cell Expansion:Producing The Critical Raw Material ForBiofabrication Processes,A.Kumar and B.Starly,Biofabrication 7(4):044103(2015)。然而，这些现有的3D生物反应器中没有一个能够满足对于粘附细胞尤其是干细胞扩增的所有以下优选条件：(1)相对容易的按比例放大和缩小；(2)能够按比例放大到数百或甚至数千升的细胞制造；(3)机械稳定、不可降解的结构，以允许培养基灌注；(4)对细胞的低剪切应力；(5)营养物和氧气输送的低梯度差异；(6)防止细胞-细胞聚集；(7)相对光滑(和优选无孔)的细胞培养表面；(8)维持单层细胞培养；(9)容易从培养表面解离细胞成单细胞悬浮液；和(10)自动化和成本效益的细胞制造。
因此，仍需要通过提供改进的生物反应器设计、成本效益的制造技术和改进的生物反应器操作能力来改善细胞扩增，特别是干细胞扩增的方法和装置，以实现临床应用剂量要求。
发明概述
一种用于细胞生长的3D生物反应器，该生物反应器包含多个非随机互连的空隙，其以可重复的图案堆积在3D空间中，在所述空隙之间具有多个非随机的孔开口。该生物反应器旨在实现最大可能的表面与体积比，同时几何结构被设计为维持单层细胞培养，减少或防止高细胞剪切应力、细胞聚集、表型变化或细胞外生产，并且特别适用于扩增干细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及用于细胞生长的3D生物反应器，其包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙。所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D>d并且其中：(a)90％或更多的空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定的空隙体积(V)；和(b)空隙之间90％或更多的孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于细胞生长的3D生物反应器，其包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙。所述多个空隙具有大于0.4mm至100.0mm的直径D，所述空隙之间的多个孔开口的直径d在0.2mm至10.0mm的范围内，其中D>d，其特征还在于:(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定的空隙体积(V)；(b)所述空隙之间的90％或更多的孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值，并且3D生物反应器由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料形成。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于细胞生长的3D生物反应器，其包含：
第一和第二多个空隙，其具有用于细胞扩增的表面区域；
所述第一多个空隙具有直径D1，所述第一多个空隙之间的多个孔开口具有直径d1，其中D1>d1，其中90％或更多的多个空隙具有空隙体积(V1)，其公差变化不超过+/-10.0％；
所述第二多个空隙具有直径D2，所述第二多个空隙之间的多个孔开口具有直径d2，其中D2>d2，其中90％的第二多个空隙具有空隙体积(V2)，其公差变化不超过+/-10.0％；和
V1和V2的值是不同的并且在所述公差变化之外，以使得
[V1+/-10.0％]≠[V2+/-10.0％]。
本发明还涉及形成包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙的3D生物反应器的方法。因此，可以首先对于多个空隙设计/鉴定目标内部空隙体积(Vt)，并且还对于3D生物反应器鉴定目标表面积(SAt)。然后可以形成3D生物反应器，其具有：(1)所述一个或多个空隙的实际空隙体积(Va)，其中Va在Vt的+/-10.0％之内；和/或(2)3D生物反应器的实际表面积(SAa)，其中SAa在SAt的+/-10.0％范围内。
附图的简要说明
图1示出了3D生物反应器固定床的截面图。
图1a示出了生物反应器的单元负模型，其显示了邻近球体的重叠。
图1b示出了单元负模型，其中每个球体由12个相同的邻近球体围绕。
图1c示出了3D生物反应器固定床几何形状，其显示了互连的空隙系统。
图1d以横截面视图示出了3D生物反应器固定床几何形状。
图1e以2D视图示出了鉴定的3D生物反应器的球形空隙，以及它们的重叠区域以在球形空隙之间形成互连的孔。
图2示出了位于壳体中的3D生物反应器固定床，壳体具有用于流体灌注的入口和出口。
图3示出了典型的3D生物反应器灌注系统。
图4a、4b、4c和4d显示了通过3D生物反应器的流速特征。
图4e表示通过3D生物反应器的流速的标尺。
图5a和5b示出了3D生物反应器中表面剪切应力的分布。
图5c表示单位为Pa的剪切应力的标尺。
图6a示出了圆柱形3D生物反应器中沿流动方向的压降(梯度)。
图6b表示压力的标尺。
图7a示出了通过FDM 3D打印生成的3D生物反应器固定床。
图7b示出了3D生物反应器固定床以及生物反应器室。
图7c示出了3D生物反应器的入口和出口。
图7d示出了组装的3D生物反应器。
图7e示出了通过SLA 3D打印生成的3D生物反应器固定床。
图7f示出了通过DLP 3D打印生成的3D生物反应器固定床。
图8示出了放置在3D生物反应器的入口和出口处以接近层流的两个流体分配器。
图9示出了当使用流体分配器时通过3D生物反应器的流速特征。
图10a和10b示出了通过替代的致孔剂浸出方法形成3D生物反应器。
图11a、11b和11c显示了具有聚多巴胺和纤连蛋白涂层的由非医用级ABS树脂制成的基底上的细胞附着。
图11d、11e和11f显示了具有聚多巴胺和纤连蛋白涂层的由医用级ABS树脂制成的基底上的细胞附着。
图12a、12b和12c示出了3D生物反应器表面上的细胞附着。
图13a、13c、13e和13g示出了细胞接种后3D生物反应器的入口、固定床、壁和流体分配器上的细胞附着。
图13b、13d、13f和13h示出了7天培养期后的细胞分布。
图14示出了在四天时间内3D生物反应器中细胞数量的变化。
图15示出了使用三种不同尺寸的本文所述的3D生物反应器与使用超过120个T-培养瓶以提供指示的细胞扩增水平的比较。
优选实施方案的详细描述
本公开内容涉及生物反应器设计，其具有相应的操作能力以实现临床细胞扩增剂量要求。本文提及的生物反应器是指所公开的3D反应器，其中能够在选定的环境和操作条件下实施生物和/或生物化学过程。这包括控制以下中的一个或多个：空隙的几何形状/尺寸，空隙之间的互连孔径和包含的空隙总数(确定生物反应器的总体尺寸)。此外，可以选择性地控制表面涂层、通过生物反应器内的空隙的流动特性、pH、温度、压力、氧气、营养物供应和/或废料去除。临床剂量要求是指提供109个细胞或更高剂量的能力。
本文的3D生物反应器优选地提供从相对低数量的供体细胞到临床剂量要求的细胞扩增，其也能够减少或消除培养传代和相关的MSC表型改变。3D生物反应器的优选固定床10通常以图1中的剖视图示出，其示出了优选的堆积和球形空隙结构及其在球形空隙之间的互连孔的实例。
更具体地，生物反应器包含连续互连的3D表面区域12，其提供细胞粘附和生长为单层的能力，并且还在生物反应器内限定如所示例的多个互连的非随机空隙14，其优选为具有内凹表面以最大化表面与体积比的球形。空隙被理解为某种限定体积的开放空间。对于“随机”，应当理解，现在能够鉴定3D生物反应器中的目标或选定数量的空隙，其导致具有所需公差的实际的重复空隙尺寸和/或几何形状。
对于“连续表面”，可以理解，扩增细胞能够易地从3D生物反应器内的一个表面区域位置迁移到另一个表面区域位置，并且表面不包含任何随机中断(interruption)，例如表面中的0.1mm或更大的随机破裂(break)或随机间隙(gap)。优选地，用于细胞扩增的3D生物反应器内的表面区域的50％或更多是连续表面，更优选地，3D生物反应器内60％或更多，70％或更多，80％或更多，90％或更多，95％或更多或99％或更多的表面区域是连续的。
另外，生物反应器固定床10包含在空隙之间的非随机互连的孔开口16。同样，应当理解，对于“非随机”，现在能够鉴定空隙的具有选定孔径的目标或选定数量的孔，其导致具有所需公差的孔径的实际数量的孔。如剖视图中所示的生物反应器还最终限定了一层非随机空隙(参见箭头“L”)，并且可以理解，生物反应器的多个层然后可以允许鉴定在一列(参见箭头“C”)内的多个这样的非随机空隙。
生物反应器可以由生物相容的或生物惰性的聚合物材料制成，这样的材料包括例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚乳酸(PLA)、用于FDM(熔融沉积建模)3D打印技术的聚己内酯(PCL)。生物相容或生物惰性应理解为对培养细胞无毒的材料。此外，用于3D生物反应器的聚合物材料优选选自在细胞培养期间不易水解的那些聚合物，使得水解量不超过存在的聚合物材料的5.0重量％，更优选不超过2.5重量％，最优选不超过1.0重量％。生物反应器还可以由在SLA(立体光刻)和DLP(数字光处理)3D打印技术中使用的生物相容的光敏材料(例如，Pro3Dure，Somos WaterShed XC 11122等)制成。
用于制造生物反应器的材料优选在水性介质中不可降解，并且能够提供机械稳定的结构以在细胞扩增期间耐受水性介质流动。优选的是，材料和制造过程能够产生用于单层细胞扩增的固体和光滑的互连表面区域。对于固体表面，应该理解的是，该表面使得其将减少或防止培养细胞的渗透或嵌入，培养细胞通常具有约20微米至100微米的直径。优选地，本文的3D生物反应器是表面具有表面粗糙度值(Ra)的3D生物反应器，Ra表示在评估长度内记录的与平均线的剖面高度偏差的绝对值的算术平均值。因此，本文考虑了3D生物反应器表面的Ra将具有小于或等于20μm的值，更优选地，小于或等于5μm。
本文的3D生物反应器还优选是由指示邵氏D硬度为至少10或在10-95的范围内、并且更优选在45-95的范围内的材料形成的3D生物反应器。在这方面，还值得注意的是，本文的3D生物反应器是不使用水凝胶型结构的结构，水凝胶型结构可以被理解为亲水型聚合物结构，其包含一定量的交联，并且其吸收显著量的水(例如，10-40重量％)。还值得注意的是，本文的3D生物反应器优选是不利用胶原、藻酸盐、纤维蛋白和细胞可以容易地消化并经历重塑的其他聚合物的3D生物反应器。
此外，本文的3D生物反应器优选是由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料制成的3D生物反应器。更优选地，拉伸模量的值在0.01GPa至20.0GPa的范围内，增量为0.01GPa。甚至更优选地，用于3D生物反应器的材料的拉伸模量在0.01GPa至10.0GPa或1.0GPa至10GPa的范围内。例如，关于适用于制造本文3D生物反应器的较早提及的聚合物材料，聚苯乙烯指示约3.0GPa的拉伸模量，聚碳酸酯指示约2.6GPa的拉伸模量，ABS指示约2.3GPa的拉伸模量，PLA指示约3.5GPa的拉伸模量和PCL指示约1.2GPa的拉伸模量。
具有这种优选的规则几何特征和连续表面区域的3D生物反应器设计优选地根据可由例如SolidWorksTM计算机辅助设计(CAD)程序实现的计算机生成的设计通过增材制造(Additive Manufacturing)技术(例如FDM、选择性激光烧结(SLS)、立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)3D打印技术等)制造。
作为优选示例，下面描述利用SolidWorksTM来创建3D生物反应器设计的过程。首先创建用于负生物反应器的计算机模型。更具体地，创建可以因此描述为负3D生物反应器的物质，例如，使用堆积的6.0mm直径的球体，其重叠以在球体之间产生1.0mm直径的连接孔。当然，在本公开内容的广泛背景下可以预期其他可能的尺寸。
球体优选地组织成六边形密堆积(HCP)晶格以产生有效(或紧密)堆积的几何形状，其导致每个球体被12个邻近球体包围。该示例性几何形状的晶胞如图1a所示。更具体地，在图1a中，存在HCP晶格的晶胞，其中顶部三个球体显示为透明的，以示出邻近球体之间的6个径向重叠区域。在这些重叠区域形成孔。优选地，孔的最大数量为12以优化堆积。最小孔数为2，以允许通过3D生物反应器的空隙的介质灌注。因此，3D生物反应器中存在的至少90.0％至100％的空隙具有至少2个孔开口/空隙。更优选地，3D生物反应器中至少90.0％至100％的空隙具有8-12个孔开口/空隙。在一个特别优选的实施方案中，3D生物反应器中至少90.0％至100％的空隙具有12个孔开口/空隙在存在的多个空隙内的相邻空隙之间，更优选地，在相邻空隙之间存在8-12个互连的孔开口，并且在一个特别优选的实施例中，在相邻空隙之间存在12个孔开口。
在图1b中，示出了单元的所有球体。然后优选地通过反转负模型以产生包含图1c中所示的互连球形空隙系统的正模型来产生生物反应器几何形状。此外，在图1d中，能够再次看到横截面视图的3D生物反应器，其提供了在14处的剖视图中示出的互连空隙的另一个图示，其具有规则的几何特征(基本上与上文所述的相同的空隙体积控制)和相应的互连孔开口16。
在上文所述的优选的规则几何3D生物反应器中，能够鉴定空隙直径和互连孔径之间的关系。现参见图1e。对于这种优选的几何形状，球形空隙1由实心圆表示，直径为D(由箭头指示)。因此，直径“D”可以理解为内部空隙表面上的任何两个点之间的最长距离。球形空隙2由虚线圆圈表示，并且还具有直径D(未示出)。球形空隙2是球形空隙1的12个邻近空隙中的一个。由于邻近空隙之间的重叠，它在球形空隙之间形成互连的孔，其具有直径“d”，也由大致水平的箭头表示。因此，直径“d”可以理解为孔开口处的任何两个点之间的最长距离。空隙的总3D球形表面积是SA空隙＝4×π×(D/2)2。A和B之间的表面区域，称为Scap＝π×D×h，其中3D生物反应器中给定空隙的有用空隙表面将是SAu＝SA空隙–[12×Scap]。
空隙直径D越小，越多数量的空隙能够被堆积到设定的3D空间(体积)中，并因此导致更大的总体细胞培养表面。然而，为了最小化或防止细胞聚集(如本文所讨论的能够抑制细胞生长并诱导细胞表型改变)，对于该几何形状，孔的最小直径d＝0.2mm。孔的直径d可以落在0.2mm至10mm的范围内，更优选0.2mm至2.0mm。最优选地，d>0.5mm并且落入0.5mm至2.0mm的范围内。
如果D＝0.40mm或更小，则当d＝0.2mm时计算的SAu小于0，这导致不可能的结构，因此对于该3D生物反应器几何形状，D必须>0.4mm。然而，D的值可以为0.4mm至100.0mm，更优选地，0.4mm至50.0mm，并且还可以在0.4mm至25.0mm的范围内。D的一个特别优选的值落在2.0mm至10.0mm的范围内。具有相对大的D值的球形空隙可以降低在相同生物反应器体积内尽可能多地增加细胞培养表面区域的目的。因此，对于图1e中所示的优选几何形状，D>0.4mm(空隙的直径)，d>0.20mm(孔的直径)。还值得注意的是，对于0.4mm至100.0范围内的空隙的任何选定的直径D值，以及0.2mm至10.0mm范围内的孔的任何选定的直径d值，D的值使得它大于d的值(D>d)。
现在可以理解，本文的3D生物反应器能够根据其非随机特征来表征。优选地，3D生物反应器内的所有空隙使得它们具有基本相同的体积以实现最有效的3D空间堆积并提供最大的相应连续表面区域。关于任何给定的3D生物反应器中存在的互连空隙的总数，优选地，90.0％或更多的这样的空隙，或甚至95.0％或更多的这样的空隙，或甚至99.0％至100％的这样的空隙具有空隙体积(V)，其公差为使得其变化不超过+/-10.0％，或+/-5.0％，或+/-2.5％或+/-1.0％，或+/-0.5％或+/-0.1％。应该注意的是，尽管图1中的空隙是显示为通常为球形的，但也可考虑其他空隙几何形状。选择空隙的直径以最小化或避免细胞聚集并为细胞培养提供最大可用的表面区域。
本文3D生物反应器的另一个非随机特征是空隙之间的孔开口，具有直径d(再次参见图1e)。与上述类似，孔隙开口的90.0％或更多，或甚至孔隙开口的95.0％或更多，或甚至孔隙之间的孔隙开口的99.0％至100％表示d的值，其公差变化不超过+/-10.％，或+/-5.0％，或+/-2.5％或+/-1.0％，或+/-0.5％或+/-0.1％。
因此，现在可以理解，本文中用于细胞生长的3D生物反应器包含用于细胞扩增的表面区域、具有直径D(内部空隙表面上任意两点之间的最长距离)的多个空隙、所述空隙之间的具有直径d(孔开口上任意两点之间的最长距离)的多个孔开口，其中D>d。另外，90％或更多的空隙具有变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V)，并且90％或更多的孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
另外，本文中用于细胞生长的3D生物反应器可包含具有直径D1的第一多个空隙、在所述第一多个空隙之间的具有直径d1的多个孔开口，其中D1>d1，其中90％或更多的第一多个空隙具有空隙体积(V1)，其公差变化不超过+/-10.0％。这种3D生物反应器还可以包含具有直径D2的第二多个空隙，所述第二多个空隙之间的多个孔开口具有直径d2，其中D2>d2，其中90％的第二多个空隙具有空隙体积(V2)，其公差变化不超过+/-10.0％。V1和V2的值是不同的并且在其公差变化之外。换句话说，V1的值，包括其+/-10.0％的公差，和V2的值，包括其+/-10.0％的公差，是不同的，或[V1+/-10.0％]≠[V2+/-10.0％]。
因此，空隙内表面的曲率半径(Rc)优选为1/0.5(D)，或1/0.2mm＝5mm-1或更低。优选地，Rc可以具有0.2mm-1至1.0mm-1的值，其对应于10.0mm至2.0mm的D的值。高曲率(大Rc)表面提供与还可以诱导细胞表型变化的典型单层2D培养显著不同的环境。
细胞优选接种在3D生物反应器的互连球形空隙表面上。这种3D结构优选是可扩展的，并且能够利用相对小的占用面积的细胞扩增生物反应器为相对大的细胞扩增提供相对高的表面与体积比。表面积与体积比也优选由球形空隙的直径确定。直径越小，表面积与体积比越高。优选地，空隙提供相对“平坦”的表面(即，低曲率半径≤1.0mm-1)，用于生长尺寸为20μm至100μm的细胞，并且还减少或避免细胞聚集。另外，如上所述，通过控制互连孔的直径d也减少或避免了细胞聚集，该直径优选为至少500μm，但如所指出的，任何大于200μm的尺寸。
因此，生物反应器固定床10可以优选地用作一次性3D生物反应器，如图2中进一步所示的。更具体地，生物反应器10可以定位在壳体18中，然后放置在入口和出口隔室20中，对于其可以提供流体的流入和流出。优选地，生物反应器10、壳体18以及入口和出口隔室20可以使用增材制造技术制造为单个部件。如图3所示，壳体18中的生物反应器10以及入口和出口隔室20可以成为用于MSC扩增的整个3D生物反应器系统的一部分。更具体地，3D生物反应器优选地定位在灌注系统内，该灌注系统通过3D生物反应器递送细胞培养基和氧气以促进细胞生长。在2D T-培养瓶中使用的多次传代细胞扩增方法也可以直接应用于3D生物反应器，除了3D生物反应器具有相当于10个、100个或1000个T-培养瓶的细胞培养面积。除了多次传代细胞扩增外，还考虑了从少量供体细胞到临床相关数量的细胞的一步扩增，从而消除了在扩增期间诱导MSC表型变化的多次传代问题。
如现在可以理解的，本文的3D生物反应器依赖于互连空隙的直径提供相对大的表面与体积比。举例来说，限定直径为5cm且高度为15cm的圆柱体的传统滚瓶提供236cm2的细胞生长表面积。如果使用相同的体积将本文的3D生物反应器封装在具有2.0mm直径的互连空隙中，则可以在该空间中堆积总共44,968个球形空隙，这可以提供具有约5,648cm2表面积的基质，几乎是滚瓶表面积的24倍。此外，虽然滚瓶只能收获约9.4×106个细胞，但本文的等体积的3D生物反应器预期收获2.2×108个细胞。
与基于中空纤维或微载体的生物反应器相比，本文的3D生物反应器的至少一个独特特征是能够提供大的互连的连续表面而不是碎片表面。因此，预期本文的3D生物反应器内的连续表面使细胞能够更自由地从一个区域迁移到另一个区域。然后细胞能够局部增殖，同时逐渐迁移出该区域，以避免细胞-细胞接触抑制和分化。使用图3中所示的灌注系统，预期人们能够容易地在生物反应器内产生营养物或细胞信号的梯度，以在增殖的同时诱导细胞迁移到开放空间中(如在伤口愈合过程中)。
本文的3D生物反应器还预期允许人们在基质表面上相对均匀地接种相对较少数量的细胞。根据3D生物反应器的尺寸，预期接种细胞的数量能够落在每平方厘米有效空隙表面积30至3000个细胞的范围内。分布在3D生物反应器内的3D空间中的细胞能够具有相对大的细胞内2D分离以避免直接的细胞-细胞接触。同时，可以具有相对短的3D分离距离(例如，当细胞位于相反方向的球形表面上时)，使得能够接收来自附近细胞的信号。
结合本文所述的用于制备3D生物反应器的优选3D打印技术，计算流体动力学(CFD)现在能够用于模拟生物反应器内的介质流并估计3D互连表面内的任何位置处的流速和剪切应力，并允许优化以改善细胞培养环境。更具体地，CFD用于模拟通过本文的生物反应器的3D互连空隙的流动特性并估计以下的分布：(1)流速；(2)压降；和(3)壁剪切应力。可以理解，后一参数(剪切应力)对于细胞扩增是重要的。剪切应力的降低能够减少或防止剪切诱导的细胞分化。
在下面报告的模拟中使用小规模(以增加计算机模拟速度)圆柱形3D生物反应器，其直径为17.5mm，高度为5.83mm，空隙直径为2mm，而孔径为0.5mm。在这种情况下，生物反应器的直径(Φ＝17.5mm)与高度(H＝5.83mm)之比为3:1(图1d)，这是降低生物反应器的入口和出口之间的营养物和氧气的梯度的优选比率。基于固定床球形表面上可用的细胞密度，估计氧气和营养物消耗速率，并确定需要更换细胞培养基的频率(即体积流速)。在该模拟中假设总线性流速为38.5μm/sec。通过使用38.5μm/sec速率层流作为3D生物反应器的输入，CFD结果显示在图4-6中。
图4a、4b、4c和4d显示了整个小规模圆柱形3D生物反应器的流速特征。图4e指示流速的标尺。更具体地，图4a指示从生物反应器侧面观察的流速分布。流动使每个球形空隙沿着流动方向通过孔隙。图中的白色/灰色区域是球形空隙之间没有流体流动的实心区域。通过与图4e中的彩色速度标尺进行比较，图4a表明孔处沿流动方向的流速达到200μm/s至240μm/s的最大流速。相反，球形表面附近的流速降低至0.06μm/s至19.0μm/s的最小值，这将显著减少对驻留在球形表面上的细胞的流动引起的剪切应力。
图4b指示从生物反应器顶部观察的通过3D结构的中心横截面的速度特征。再次，该图像显示最大速率在沿着流动方向的球形空隙的每个孔中心处。该最大速率再次在200μm/s至240μm/s的范围内。球形表面附近的流速再次是低的，并且具有0.06μm/s至19.0μm/s的值。
图4c指示单个球体空隙的速度特征，显示了通过径向互连孔的流动。因此，图4c提供了球形空隙内的流动分布的有用图示。高流速位于空隙的中心空空间，其中没有细胞并且处于200μm/s至240μm/s的水平。细胞驻留在凹陷的空隙表面上，其中流速降低并且流速再次处于0.06μm/s至19.0μm/s的水平。因此，这种独特的结构能够防止细胞暴露于相对高的流动应力。这是本文所述的3D生物反应器相对于例如基于微载体的反应器的另一个明显优势，其中细胞生长在300μm至400μm直径的具有凸球形表面的微珠的外表面上，所述微珠悬浮在细胞培养基中并在生物反应器中搅拌，为细胞提供营养和氧气。驻留在这种凸球形表面上的细胞能够暴露于相对大的剪切应力，达到0.1Pa，已知其影响细胞形态、渗透性和基因表达。图4d指示沿流动方向通过侧孔的流动轨迹，表明本文的3D生物反应器提供相对均匀的流动模式以在各处提供营养物和氧气。
因此，在优选的3D生物反应器内计算的最大线性流速为200μm/s至240μm/s，其发生在沿流动方向的2.0mm直径空隙之间的0.5mm直径的互连孔处。如图4a-4e所示，当流动优先沿着流动的中心方向时，在球形表面附近仍然存在流动(约19.0μm/sec)，以允许营养供应到驻留在球形表面上的细胞。因此，预期细胞能够驻留在整个结构中的任何位置并在任何位置茁壮成长，因为可以通过整个3D生物反应器结构中的流动对流和扩散来供应营养物。
图5a和5b显示了整个上述圆柱形3D生物反应器以及单个球形空隙表面上的表面剪切应力的分布。图5c指示以Pa为单位的剪切应力的标尺。在互连孔的边缘处观察到最高剪切应力。这是由于这些位置的流速较高。然而，生物反应器内的大部分有用的球形表面区域指示小于3×10-4Pa的剪切应力，这可以理解为生物反应器的90％或更多的表面区域。这提供了细胞增殖，而没有剪切诱导的分化。此外，甚至最大剪切应力4.0×10-3Pa被认为低于细胞在基于中空纤维的生物反应器、波生物反应器和基于微载体的生物反应器中培养时经历的平均剪切应力。因此，与现有的细胞扩增生物反应器相比，本文预期3D生物反应器为细胞生长提供相对较低的剪切应力环境。参见，例如，Large-Scale Industrialized CellExpansion:Producing The Critical Raw Material For Biofabrication Processes,A.Kumar and B.Starly,Biofabrication 7(4):044103(2015)。
图6a示出了从上述圆柱形3D生物反应器的底部到顶部的沿流动方向的压降。图6b提供了适用的压力标尺。该图表明生物反应器的入口和出口之间的总压降小于或等于1.0Pa。因此压降可以落在0.1Pa至1.0Pa的范围内。换句话说，生物反应器的入口和出口附近的细胞不会经历显著的压力差异。低压力梯度表明，这种设计还将在生物反应器的入口和出口之间产生营养物/代谢物浓度的小梯度(或差异)。低梯度是由于生物反应器的设计使得直径Φ大于高度H，而总生物反应器体积保持相同。这优于中空纤维生物反应器。难以制造具有Φ>H比率的中空纤维生物反应器以减少生物反应器的入口和出口之间的营养物/代谢物的梯度。
还对具有不同纵横比(即，Φ:H比率，Φ：生物反应器固定床的总直径，H：生物反应器固定床的总高度)的相同总体积圆柱形3D生物反应器进行了比较。参加见图1d。如表1所示，对于相同的体积流速(体积流速＝流动的横截面积×线速度)，对于具有低Φ:H比率的生物反应器，线速度显著增加。线速度的增加还会增加表面剪切应力、压降以及入口和出口之间营养物/代谢物浓度的梯度，这将对细胞扩增产生不利影响。因此，所公开的固定床3D生物反应器优选设计成Φ:H比率结构，例如，Φ:H比率在大于1:1且最高100:1的范围内。优选地，Φ:H比率大于1:1并且最高为10:1。
表1
具有不同纵横比的3D生物反应器的流速比较
图7a示出了通过FDM 3D打印产生的3D生物反应器固定床部件，其具有互连的6mm直径空隙和1mm互连孔。该3D生物反应器具有ABS细丝。该特定3D生物反应器的直径(Φ)和高度(H)分别为4.28cm和1.43cm。因此，Φ:H比为3:1。固定床中包含大约134个互连的开放空隙。用于细胞培养的总互连连续球形表面积SAu为约152cm2。入口和出口处的入口和出口壁以及流体分配器22(图8)提供额外的88cm2表面区域用于细胞培养。换句话说，在3D生物反应器中存在约240cm2的总的有用表面积用于细胞附着。流体分配器能够改善通过生物反应器的层流。如果雷诺数(Reynolds number)<2100或在大于0至2100(不包含2100)的范围内，则流体分配器是可选的。
图7b显示3D生物反应器的固定床被溶剂结合到生物反应器室中。这将密封固定床和室壁之间的间隙，这将迫使灌注细胞培养基通过互连的孔而不是通过这些间隙。优选地，固定床和腔室作为整合的部件一起打印，以提高制造效率。图7c示出了生物反应器的入口和出口。它们被几何设计来促进通过固定床的层流。生物反应器的入口任选地包含内置旋转齿轮，其可以耦合到步进马达以控制生物反应器的旋转以实现均匀的细胞接种(参见下文)。整合的生物反应器如图7d所示，并且能够连接到1/8英寸管以引导流体流动。或者，入口和出口能够制成用于重复使用，其中只有内部生物反应器固定床是一次性的。还在图7e中示出的是通过SLA 3D打印生产的3D生物反应器固定床，其具有6.0mm的空隙和1.0mm的孔。图7f是使用DLP3D打印的具有3.0mm空隙和0.5mm孔的3D生物反应器固定床。
接下来应该注意的是，流体分配器22(图8)优选为使得它将改善通过3D生物反应器的流动均匀性。入口、出口和流体分配器的设计还优选考虑以下因素：(1)改善通过3D生物反应器的流动均匀性；(2)最小化入口和出口处的死体积24，以减少生物反应器的总体预充体积；和(3)防止生物反应器内的气泡聚集。图9显示了通过使用流体分配器基于CFD模拟的整个3D生物反应器的流速特征。流体分配器(图8)的使用改善了流动的均匀性。最大流速(约30μm/s)和最小流速(约10μm/s)彼此相对接近并且用于促进均匀的层流(即，流体在相对平行的层中流动)。生物反应器中各处的相对均匀的流速也将为驻留在生物反应器中的不同位置的细胞提供较小的剪切应力差异。
3D生物反应器能够通过其他增材制造技术制造，例如选择性激光烧结(SLS)、立体光刻(SLA)、数字光处理(DLP)等，图7b、7e、7f。
除了通过增材制造或3D打印制备本文的3D生物反应器之外，还考虑了3D生物反应器可通过传统的致孔剂浸出方法制备，以提供互连的细胞培养表面。图10a和10b显示了利用致孔剂浸出方法的3D生物反应器。这是指将致孔剂和聚合物在模具中结合，然后从致孔剂中浸出以产生孔。图10a中的3D生物反应器开始于通过摇动、敲击和压制珠子(以使珠粒接触)将4.0mm水溶性球形糖珠(作为致孔剂)紧密堆积在圆柱形不锈钢模具中的步骤。珠粒之间的间隙填充有含有5.0重量％去离子水的丙酮。然后在真空室中将丙酮和水蒸发过夜。然后用低粘度可聚合乙烯基单体如苯乙烯和聚合引发剂如苯甲酰基或叔丁基过氧苯甲酸酯填充珠粒之间的间隙。然后苯乙烯单体聚合形成聚苯乙烯。将样品在90℃保持8-12小时，然后将其加热至115℃再保持3小时并从烘箱中取出以提供图10a所示的内容。然后将糖珠浸出同时浸没在超声水浴中以留下具有互连空隙的聚苯乙烯3D生物反应器固定床。参见图10b。然后用甲醇萃取3D生物反应器三天以除去任何残留的苯乙烯单体。然而，致孔剂浸出方法不仅具有复杂的制造工艺，而且难以实现精确的可再现结构，因为致孔剂珠粒的堆积是随机过程。
对于使用ABS的3D打印生物反应器(图7d)，优选对生物反应器的疏水内表面进行改性以允许细胞粘附。因此利用聚多巴胺作为底漆涂层，然后使用纤连蛋白涂层来改善ABS表面。为了优化涂覆程序，分别在医用级和非医用级ABS的基底上评估使用不同浓度的多巴胺盐酸盐(Sigma#H8502)和纤连蛋白(Sigma#F1141)的涂层。将ABS表面在溶解在10mM Tris缓冲液(pH＝8.5，25℃)中的0.25mg/mL多巴胺中孵育约18小时，得到有效的聚多巴胺层用于随后的纤连蛋白涂覆。在聚多巴胺涂覆后，将ABS表面在浓度为50或100μg/mL的纤连蛋白(来自牛血浆的纤连蛋白)中孵育4小时，促进间充质干细胞附着。应该注意的是，聚多巴胺加上纤连蛋白涂层的使用预期用于除本文公开的基于ABS的3D生物反应器之外的生物反应器，特别是用于用疏水材料制造的生物反应器。还应注意，聚多巴胺底漆涂层可与其他涂层组合，例如肽、胶原蛋白、层粘连蛋白、多细胞细胞外基质蛋白或特定细胞类型所需的选定抗体。在聚多巴胺沉积在生物反应器表面上之后，它可以通过迈克尔加成和/或希夫碱反应与功能配体结合。因此配体分子包含亲核官能团，例如胺和硫醇官能团。
图11a、11b和11c显示在上文所述的聚多巴胺涂覆后，在非医用级ABS(用于涂覆的浓度分别为20μg/ml纤连蛋白、50μg/ml纤连蛋白和100μg/ml纤连蛋白)上的细胞(用绿色荧光标记)附着。图11d、11e和11f分别显示在医用级ABS(用于涂覆的浓度分别为20μg/ml纤连蛋白、50μg/ml纤连蛋白和100μg/ml纤连蛋白)上的细胞附着浓度。这些数据表明，医用和非医用级ABS在聚多巴胺/纤连蛋白涂覆后在细胞附着方面具有相似的性能。对于良好的细胞附着，优选50μg/ml或100μg/ml浓度的纤连蛋白涂层。这些图还显示细胞与3D打印过程中产生的表面纹理对齐。因此，通过SLA或DLP 3D打印产生的生物反应器表面优选用于细胞扩增。
还在3D生物反应器上评估细胞附着。参考图12a、12b和12c，其示出了细胞(用绿色荧光标记)很好地附着在3D生物反应器表面上。图12a显示了3D生物反应器固定床。图12b显示了接种在球形空隙表面上的细胞(标记为指向绿色荧光的箭头)。图12c显示细胞驻留在球形空隙之间的互连孔附近。
如上所述(图3)，本文的3D生物反应器优选用于灌注系统。更具体地，将3D生物反应器夹具放置在37℃的培养箱内以将系统维持在体温。Cole-Parmer Masterflex泵用于将细胞培养基在通过氧合器后递送至生物反应器。MCQ 3通道气体混合器混合适量的氧气、二氧化碳和氮气，以提供供给氧合器的气体混合物，以调节细胞培养基。通过使用气体混合器，可以控制气体混合物以产生具有约2％氧浓度的低氧条件(如果需要)，其预期比21％的氧浓度提供相对更快的间充质干细胞生长。气体混合器还可以随着生物反应器中总细胞数的增加而相应地调节氧浓度。另外，在灌注系统中，细胞接种期间的3D生物反应器可以优选地水平定位并连接到步进电动机，使得生物反应器围绕生物反应器轴旋转，使得细胞更均匀地接种在生物反应器内。
作为实例可以如下实现3D生物反应器的细胞接种。对于图7a-7d中所示的3D生物反应器，生物反应器的总预充体积为约22mL，其包含固定床的体积(约16mL)以及入口和出口的空间(约6mL)。将悬浮在25mL中的总共1.5×106个间充质干细胞注入生物反应器中。通过注射泵使用2mL/min的输注速率进行输注。在培养基输注后，立刻将生物反应器水平放置在生物反应器夹具上，以允许生物反应器围绕其轴以0.15RPM的旋转速率缓慢旋转。因此，本文的生物反应器可以以0.5RPM至0.5RPM范围的旋转速率旋转。使生物反应器旋转约6小时，然后开始灌注流。使用该细胞负载方法测量了96.3％的高负载效率。
为了观察接种后生物反应器内的细胞分布，将细胞固定在生物反应器的表面上。然后将固定的细胞用DAPI荧光染料(蓝色)染色以标记细胞核。然后将生物反应器接合(splice)以打开内室，并使用荧光显微镜观察细胞在生物反应器内的不同表面上的附着和分布。图13a、13c、13e和13g分别示出了入口、固定床、壁和流体分配器上的细胞分布。所有区域均表明具有相对低细胞密度的接种细胞。这些图像表明细胞接种在整个生物反应器中相对均匀分布。图13b、13d、13f和13h指示在7天的扩增期后在生物反应器内的相应表面上的细胞分布。图13a和13b是3D生物反应器入口壁。图13c和13d是在3D生物反应器内壁上。图13e和13f是在3D生物反应器中心-空隙球形表面上，图13g和13h在3D生物反应器导流器表面上。
在静态(无培养基灌注)细胞接种期后，3D生物反应器优选在灌注期间置于垂直位置(生物反应器入口低于出口)以防止生物反应器内的气泡聚集。图7d中所示的组装的生物反应器以2mL/min的流速灌注。根据CFD模拟，38.5μm/sec的层流流速不会对细胞产生相对高的剪切应力。对于图7中所示的这种生物反应器，其固定床直径为4.28cm，或横截面积约为14.4cm2，计算出的等效流速为3.3mL/min。应该注意的是，体积灌注速率取决于生物反应器的总体积和横截面积，生物反应器内的球形空隙直径和孔径，以及细胞类型、氧气和营养物消耗、剪切耐受性等。因此，需要通过细胞制造工艺开发来确定优化的灌注速率。
细胞培养基在流入3D生物反应器之前循环通过氧合器。气体混合器产生含有74％的N2、21％的O2和5％的CO2的气体混合物，将其加入氧合器中以更新细胞培养基，然后输送到生物反应器内的细胞。
每24小时测量一次葡萄糖和乳酸的变化。基于葡萄糖和乳酸盐的变化，估计生物反应器内的细胞数量。图14示出了在四天时间内生物反应器中细胞数量的变化。生长曲线显示细胞生长的三个时期：即，缓慢细胞生长(第1天)，指数细胞生长(第2天)和生长平台期(第3天和第4天)。在4天的扩增后，预计收获大约8×106个细胞。
假设以80％汇合或约0.4×105个细胞/cm2收获细胞，如图15所示的具有107、108和109个细胞扩增能力的生物反应器将需要分别为250cm2、2,500cm2和25,000cm2的总细胞培养表面积。假设生物反应器由2.0mm直径的球形空隙和十二个(12)0.5mm直径的互连孔组成。每个球形空隙的SAu＝10.16mm2。换句话说，具有107、108和109个细胞扩增能力的生物反应器需要2,461、24,606和246,063个2.0mm球形空隙。考虑到每个球形空隙的体积为4.19mm3，合理的堆积效率为73.6％(根据SolidWorksTM计算机模拟)，具有107、108和109个细胞扩增能力的生物反应器需要分别14.0cm3、140.1cm3和1400.8cm3的体积。堆积效率是指球形空隙占据的体积(V占据的)除以具有给定直径Φ和高度H的3D圆柱体空间的总体积(V圆柱体)。对于本文的3D生物反应器，堆积效率优选具有大于64.0％，更优选大于70.0％，最优选大于75.0％的值。假设生物反应器的直径Φ和高度H具有3:1的比率，那么图15中所示的具有107、108和109细胞扩增能力的生物反应器分别具有5.2cm(Φ)和1.7cm(H)、16.4cm(Φ)和5.5cm(H)、51.8cm(Φ)和17.3cm(H)的Φ和H。预计生物反应器可扩展至1010、1011、1012个细胞扩增能力。
然后评估来自3D生物反应器的细胞分离。测试两种试剂的细胞分离。一种是传统的胰蛋白酶-EDTA(0.25％)，另一种是新的TrypLESelect。预计后者将成为胰蛋白酶的优良替代品。使用利用约5分钟温热(37℃)孵育期的胰蛋白酶，可以成功地从3D生物反应器中分离>95％的细胞。
从上述所有内容可以理解，本文公开的3D生物反应器的附加特征之一是现在可以设计3D生物反应器，其具有特定的几何和空隙体积要求，以及相应的可用表面积要求，并且能够以相对最小的变化实现(即，在制造或制作期间)这种目标。例如，现在可以确定3D生物反应器的设计要求，其中一个或多个内部空隙具有目标空隙体积“Vt”，并且3D生物反应器本身具有用于细胞培养的目标总表面积“SAt”。因此，现在可以形成这样的3D生物反应器，其中一个或多个内部空隙具有的实际空隙体积“Va”，其在Vt的+/-10.0％之内，或更优选地，在Vt的+/-5.0％之内。类似地，用于细胞培养的实际表面积SAa在SAt的+/-10.0％之内，或更优选地在SAt的+/-5.0％之内。此外，还可以为目标空隙内的内表面鉴定用于制造的目标几何形状，例如目标曲率半径“Rct”，然后在制造中，现在可以实现空隙内表面的实际曲率半径“Rca”，其在Rct的+/-5％之内。
因此，本发明描述了一种可扩展的3D生物反应器，其能够从使用数百个T-培养瓶减少到仅3个不同尺寸的单个3D生物反应器，用于从105个细胞扩增到109个细胞。如图15所示，为了将105个细胞扩增到109个细胞，必须使用124个T-培养瓶。相比之下，通过使用渐增尺寸的本文的三个3D生物反应器，可以更容易地实现这种水平的细胞扩增。此外，3D生物反应器有利于自动闭环细胞扩增，这将显著提高细胞扩增的效率，并满足cGMP(current GoodManufacturing Practice)监管要求，以扩增细胞用于临床应用。此外，本文中3D生物反应器的使用将显著减少细胞培养基的使用。本文的3D生物反应器可以以限定的几何形状、表面涂层和流体动力学进行扩展，以维持单层细胞培养物并减少或防止细胞聚集(细胞-细胞接触和/或堆积)、表型改变或细胞外生产，并且特别适合于在生物反应器的适当表面涂层下扩增干细胞、原代细胞和其他粘附细胞或非粘附细胞。

Claims (21)

1.一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包含多个具有用于细胞扩增的表面区域的空隙，所述多个空隙具有直径D，所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D>d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定的空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
2.权利要求1的3D生物反应器，其中所述空隙的直径(D)大于0.4mm，并且所述孔的直径(d)大于0.20mm。
3.权利要求1的3D生物反应器，其中所述空隙的直径(D)在大于0.4mm至100.0mm的范围内。
4.权利要求1的3D生物反应器，其中所述孔的直径(d)在0.2mm至10.0mm的范围内。
5.权利要求1的3D生物反应器，其中95.0％或更多的所述空隙指示变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V)。
6.权利要求1的3D生物反应器，其中99.0％至100％的所述空隙指示变化不超过+/-10.0％的空隙体积(V)。
7.权利要求1的3D生物反应器，其中所述空隙之间的95.0％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
8.权利要求1的3D生物反应器，其中所述空隙之间的99.0％至100％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值。
9.权利要求1的3D生物反应器，其中存在的至少90.0％的空隙具有2个孔开口/空隙。
10.权利要求1的3D生物反应器，其中存在的至少90.0％的空隙具有8至12个孔开口/空隙。
11.权利要求1的3D生物反应器，其中所述空隙具有内凹表面。
12.权利要求1的3D反应器，其中所述空隙包含球形空隙。
13.权利要求12的3D生物反应器，其中所述球形空隙在3D圆柱形空间中具有大于64.0％的填充效率。
14.权利要求1的3D生物反应器，其中所述3D生物反应器由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料形成。
15.权利要求1的3D生物反应器，其中所述3D生物反应器由生物相容的材料形成。
16.权利要求1的3D生物反应器，其中所述3D生物反应器由在细胞培养期间不易水解的材料形成，使得水解量不超过存在的材料的5.0重量％。
17.权利要求1的3D生物反应器，其中所述生物反应器具有直径Φ和高度H，并且比率Φ:H在大于1:1至100:1的范围内。
18.权利要求1的3D生物反应器，其中所述生物反应器表面包含聚多巴胺，所述聚多巴胺能够通过功能配体结合额外的一层或多层用于细胞培养。
19.一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有大于0.4mm至100.0mm的直径D，所述空隙之间具有多个孔开口，所述多个孔开口具有在0.2mm至10.0mm的范围内的直径d，其中D>d，进一步的特征在于：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的选定的空隙体积(V)；(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值，并且所述3D生物反应器由具有至少0.01GPa的拉伸模量的材料形成。
20.一种用于细胞生长的3D生物反应器，其包含：
第一和第二多个空隙，其具有用于细胞扩增的表面区域；
所述第一多个空隙具有直径D1，所述第一多个空隙之间的多个孔开口具有直径d1，其中D1>d1，其中90％或更多的第一多个空隙具有空隙体积(V1)，其公差变化不超过+/-10.0％；
所述第二多个空隙具有直径D2，所述第二多个空隙之间的多个孔开口具有直径d2，其中D2>d2，其中90％的第二多个空隙具有空隙体积(V2)，其公差变化不超过+/-10.0％；和
V1和V2的值是不同的并且在所述公差变化之外，以使得
[V1+/-10.0％]≠[V2+/-10.0％]。
21.一种形成包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙的3D生物反应器的方法：
(a)对于所述多个空隙鉴定目标内部空隙体积(Vt)；
(b)对于所述3D生物反应器鉴定目标表面积(SAt)；
(c)形成所述3D生物反应器，其具有：(1)所述一个或多个空隙的实际空隙体积(Va)，其中Va在Vt的+/-10.0％之内；和(2)实际表面积(SAa)，其中SAa在SAt的+/-10.0％范围内。
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