KR20120111733A - 탈세포화된 지방 조직 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지방 조직을 하나 이상의 효소를 함유하는 효소 소화 용액에서 일 회 이상 배양시키고, 일 회 이상 용매 추출하는 것을 포함하는 지방 조직의 탈세포화 방법을 제공하며, 잘 보존된 삼차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 지방 조직이 얻어진다. 본 발명은 또한 잘 보존된 삼차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 지방 조직 및 탈세포화된 지방 조직을 포함하는 바이오 스캐폴드, 마이크로캐리어 비드 및 코팅을 제공한다.

Description

탈세포화된 지방 조직{DECELLULARIZED ADIPOSE TISSUE}
본 출원은 그 전체 내용이 여기에 참고로 원용되는 2009년 12월 17일 출원된 미국 가출원번호 61/287,236호의 출원일자의 이익을 주장한다.
본 발명은 지방 조직의 탈세포화 방법에 관한 것이고, 또한 잘 보존된 3차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 갖는 탈세포화된 지방 조직에 관한 것이다. 탈세포화된 지방 조직은 연성 조직 확대 또는 바이오 스캐폴드와 같은 생체 의료 분야에 사용하기에 적합한다. 또한, 탈세포화된 지방 조직은 바이오 리액터 또는 생체 내에서의 정치 배양 (static culture)에서 1차 세포 또는 세포주용 세포 배양 기질로서 사용될 수 있다.
연성 조직 확대를 위한 최근의 임상 전략은 일차적으로 자가 조직 (autologous), 동종 (allogenic) 및 알로플라스틱 (alloplastic) 생체 재료와 관련된다. 자가 조직적 접근에서 대부분의 관심은 지방 조직의 이식에 집중된다. 대부분의 환자들이 이식용으로 사용 가능한 지방 조직의 소모용 여분을 갖고 있다는 점에서 이 접근은 바람직하고, 또한 지방 흡인술의 출현으로 조직 획득 과정이 용이하게 되었다. 그러나, 유리 지방 이식은 지지 맥관 구조의 부족으로 인해 이식 재흡수도의 변화에 따라 만족스럽지 않고, 예측할 수 없는 결과를 가져왔다. 일반적으로, 자가 지방으로 수정될 수 있는 것은 작은 상처뿐이고, 이와 같은 제한은 이식된 지방이 점진적으로 낭성 지방 (oil cyst)이 배치된 섬유 조직으로 대체될 동안 바람직한 부피를 유지하기 위해 반복된 치료를 필요로 한다.
피부, 지방 및 근육에 포함되는 혈관성 피판 (vascularized flap)을 이용한 자가 조직 이식은 상당한 외과 기술을 필요로 하지만, 합성 이식으로 얻을 수 있는 것에 비해 매우 뛰어난 결과를 얻을 수 있다. 그러나, 피판 (flap)은 이식 공여부의 합병증 및 변형의 측면에서 비용이 높고, 입원과 수술 시간을 필요로 한다. 또한 상당한 조직 부피의 이식은, 특히 복부에서 주요 근육 이식의 경우, 공여 위치의 약화를 초래할 수 있다. 주사가능한 자가 조직 콜라겐은 생검 또는 환자 자신의 피부의 대량의 샘플로부터 준비될 수 있다. 그와 같은 재료는 이식 흡수와 관련되어 일시적인 확대 효과만을 제공한다. 피부 결함의 생성으로 인해 이 접근을 사용하여 얻을 수 있는 조직의 양은 제한된다.
동종 재료 (allogenic material)는 얼굴의 주름과 경미한 상처와 관련된 소량의 성형 용도를 위한 주입가능한 벌킹제로서 주로 사용된다. 상기 재료는 일반적으로 피부 영역을 확대시키고, 표피의 외관을 매끄럽게 한다. 일반적으로 이들 재료는 제한되어 있고, 바람직한 효과를 유지하기 위해서는 대부분 반복적이고 비용이 많이 드는 치료를 필요로 한다. 동물 (예를 들면 소, 돼지)로부터 유래되는 콜라겐과 같은 재료원은 과민성 반응 및 면역 반응과 관련될 수 있다. 신속한 이식 흡수 역시 이식 시 과잉 교정 (overcorrection)(100-200%) 이 권고되고, 원하는 볼륨을 유지하기 위해 반복되는 치료 (3 - 6 개월마다)가 필요하다는 점에서 문제가 있다. 글루타르알데히드와 콜라겐의 가교는 재료의 탄성을 향상시키고 면역원성을 감소시킬 수 있다. 질병 전염에 대한 염려로 인해 외인성 콜라겐의 임상적 응용은 제한적이다.
콜라겐, 엘라스틴 및 글리코사미노글리칸 (GAGs)을 함유하는 탈세포화된 인간 사체 진피 (cadaveric dermis)와 같은 다른 동종 재료는 주입가능한 형태 또는 주어진 용도에 따른 형태로 절단가능한 시트상으로 만들어질 수 있다. 상기 재료는 비면역성원이고 2년까지 사용할 수 있다; 그러나 재흡수가 일어나고 200%까지의 과잉 교정이 필요할 수 있다.
폴리 (L-락트산) (PLA)를 포함하는 주입가능한 알로플라스틱 재료가 HIV 환자의 지방조직 위축의 치료에 대해 승인되었다. 반복된 주입이 필요하고, 촉지가능한 결절의 형성이 보고되었다. 주입가능한 폴리테트라플루오로 에틸렌 (PTEE)은 여러번의 치료 없이 영구적인 확대를 가능하게 한다. 그러나, PTEE 임플란트는 이식 위치로부터 이동할 수 있고, 증가된 감염 위험을 갖고, 연성 조직과 상당히 다른 기계적 특성을 갖는다.
상기의 연성 조직 확대에 대한 상기한 자가 조직, 동종 조직 및 알로플라스틱 접근은 실질적인 약점들을 갖는다. 연성 조직 재구축에 대한 대체적인 접근은 세포 파종된 (cell-seeded) 스캐폴드를 이용하는 것이다. 스캐폴드 재료는 합성 유래 (예를 들면 폴리락틱-코-글리콜릭산, 폴리글리콜산, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트) 또는 천연 유래 (예를 들면 콜라겐, 피브린, 히알루로난 유도체, 실크 단백질)일 수 있다. 지금까지는 천연 유래의 스캐폴딩 바이오재료가 바람직했지만, 이 재료는 사용 전에 면역원성 반응에 대한 잠재성을 최소화하고, 장기간의 안정성을 보장하기 위해 사용 전에 탈세포화와 같은 처리가 필요하다는 잠재적인 결점을 갖는다.
여기에 설명되는 것은 지방 조직을 탈세포화하는 방법으로서, 상기 방법은 지방 조직을 하나 이상의 효소를 함유하는 효소 소화액에서 1회 이상 배양시키는 것 및 1회 이상의 용매 추출시키는 것을 포함하고, 잘 보존된 3차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 지방 조직을 얻을 수 있다. 잘 보존된 구조는 맥관 및/또는 관 구조를 포함할 수 있다.
얻어진 세포외 메트릭스는 섬유상 및 네트워크형 콜라겐의 조합을 포함할 수 있다. 얻어진 세포외 메트릭스는 Ⅳ형 콜라겐을 포함할 수 있다. 얻어진 세포외 매트릭스는 하나 이상의 Ⅰ내지 Ⅲ, Ⅴ및 Ⅵ형 콜라겐을 포함할 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 엘라스틴 및/또는 탄섬 섬유를 함유할 수도 있다.
탈세포화된 지방 조직은 라미닌, 피브로넥틴 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 하나 이상의 프로테오글리칸, 당단백질 또는 글리코사미노글리칸 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 기계적 파쇄와 관련된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 기계적 파쇄와 관련된 하나 이상의 단계는 1회 이상의 동결-해동 주기(freeze-thaw cycle) 또는 교반 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 1회 이상의 동결-해동 주기는 저장액 (hypotonic solution), 고장액 (hyperponic solution)또는 중성 버퍼에서 수행될 수 있다. 상기 방법은 세정 버퍼에서 하나 이상의 세정을 포함할 수 있다. 상기 방법은 적어도 하나의 극성 용매, 적어도 하나의 비극성 용매 또는 그들의 조합의 사용을 포함할 수 있다.
상기 방법은 비손상 지방 세포가 실질적으로 전혀 없는 탈세포화된 지방 조직을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법의 실시 형태에 의하면, 지방 조직의 면역원성 성분을 실질적으로 제거하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시의 형태는:
(i) 지방 조직이 동결 버퍼에서 1회 이상의 동결-해동 주기를 갖게 하는 것;
(ii) 지방 조직을 효소 소화시키는 것;
(iii) 지방 조직을 하나 이상의 극성 용매로 추출시키는 것;
(iv) 세정 버퍼에서 지방 조직을 세정하는 것;
(v) 지방 조직을 효소 소화시키는 것;
(vi) 지방 조직을 세정 버퍼에서 세정하는 것;
(vii) 지방 조직을 효소 소화시키는 것;
(viii) 지방 조직을 세정 버퍼에서 세정하는 것;
(ix) 지방 조직을 극성 용매로 추출시키는 것; 및
(x) 지방 조직을 세정 버퍼에서 세정하는 것을 포함한다.
또한 여기에 설명하는 지방 조직으로부터 실질적으로 세포외 매트릭스 재료를 분리하는 방법은, 지방 조직을 효소 소화 용액에서 1회 이상 배양시키는 것과 하나 이상의 용매에서 1회 이상의 용매 추출을 시키는 것을 포함하며, 잘 보존된 3차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스 재료를 얻을 수 있다.
상기 방법은 1단계 이상의 기계적 파쇄, 1회 이상의 효소 소화 단계, 세정 버퍼에서 1회 이상의 세정 및/또는 1회 이상의 극성 용매 추출을 포함할 수 있다. 상기 방법은 지방 조직을 하나 이상의 비극성 용매 및 하나 이상의 극성 용매를 포함하는 용매와 혼합시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법은 탈세포화 과정을 증대 또는 촉진시키기 위해 또는 비손상 영양 동맥 및/또는 정맥을 갖는 지방 조직 피판 및/또는 유경 지방 피판 (pedicled adipose flap)을 포함하는 더 큰 조직 부분의 수집을 용이하게 하기 위해 탈세포화제의 관류 (perfusion)를 포함한다. 관류는 조직의 천연 맥관 구조를 통한 탈세포화제의 전달을 위해 지방 조직에서 하나 이상의 혈관의 삽관 (cannulation)을 포함할 수 있다.
또한, 여기서 설명하는 탈세포화된 지방 조직은 잘 보존된 3차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 포함한다. 세포외 매트릭스는 섬유 상 및 네트워크형 콜라겐의 조합을 포함할 수 있다. 세포외 매트릭스는 Ⅳ형 콜라겐을 포함할 수 있다. 세포외 매트릭스는 하나 이상의 콜라겐 Ⅰ내지 Ⅲ형, Ⅴ형 및 Ⅵ형의 콜라겐을 포함할 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 엘라스틴 및/또는 탄성 섬유를 포함할 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 라미닌, 피브로넥틴 또는 이들 모두 및/또는 하나 이상의 프로테오글라칸을 포함할 수 있다. 메트릭스는 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트 또는 이들 모두 및/또는 하나 이상의 프로테오글리칸, 당단백질 또는 글리코사미노글리칸 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 여기에 설명된 방법에 따라 제조될 수 있다.
탈세포화된 지방 조직은 실질적으로 비손상 지방 세포를 전혀 포함하지 않을 수 있다. 탈세포화된 지방 조직은 실질적으로 면역원성 성분으로부터 자유로울 수 있다.
또한 여기에 설명되는 것은 여기에 설명된 탈세포화된 지방 조직으로부터 만들어진 바이오 스캐폴드이다. 상기 바이오 스캐폴드는 성형 수술이나 재건 수술과 같은 외과 수술, 일반 외과, 심장 외과, 정형 외과, 신경 외과, 비뇨기과, 부인과 또는 미용 성형 수술에 사용될 수 있다. 상기 바이오 스캐폴드는 지혈제 또는 상처 치료 드레싱으로서 사용될 수 있다. 상기 바이오 스캐폴드는 자가 조직, 동종 조직 또는 이종 조직이 될 수 있다.
탈세포화된 지방 조직 외에 하나 이상의 상을 포함하는 복합 바이오 스캐폴드가 만들어질 수 있다. 상기 복합적 접근은 정의된 스캐폴드의 기하 구조 및/또는 특정한 기계적 특성을 가진 탈세포화된 지방 조직을 포함하는 스캐폴드를 제조하거나 또는 탈세포화된 지방 조직의 생분해를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 상기 복합 스캐폴드는 또 다른 탈세포화된 스캐폴드, 또는 탈세포화된 지방 조직 외에 콜라겐, 젤라틴, 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트, 키토산, 알긴산, 실크, 피브린, 단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 또는 다당류와 같은 천연 유래의 하이드로겔 또는 스캐폴드 성분을 포함할 수 있다. 상기 복합체는 또한 탈세포화된 지방 조직 외에 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)-, 폴리에틸렌-, 폴리우레탄-, 폴리락트산 (PLA)-, 폴리글리콜산 (PGA)-, 폴리락틱-코-글리콜산 (PLGA)-계 하이드로겔 또는 스캐폴드와 같은 합성 성분, 또는 하나 이상의 단량체를 포함하는 합성 폴리머를 포함할 수 있다. 상기 복합 스캐폴드는 그들의 구조를 안정화시키기 위해 화학적 및/또는 광화학적 가교 과정을 거칠 수 있다.
여기에 설명되는 것은 또한 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조되는 세포 배양 기질이다. 상기 기질은 고착 1차 세포 (adherent primary cell) 또는 세포주의 부착을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포 파종된 탈세포화된 지방 조직은 정치 조건 하에서, 또는 관류 바이오 리액터와 같은 바이오 리액터 시스템 내에서 생체 외 배양될 수 있다. 파종된 세포를 갖거나 또는 갖지 않는 탈세포화된 지방 조직은 피하 공간 또는 장막 (omentum), 창자간막 (mesentery) 또는 배막 (peritoneum)을 포함하는 복부 공간 내와 같은 일시적인 위치에서 생체 내 이식될 수도 있다. 스캐폴드 배양의 목적은 세포 확장, 세포 분화, 조직 생장 또는 관심 대상인 하나 이상의 특정 단백질의 생산이다.
또한 여기에 설명되는 것은 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조되는 입자이다.
또한 여기에 설명되는 것은, 여기에 설명되는 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조되는 코팅이다.
또한 여기에 설명되는 것은, 여기에 설명되는 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조되는 마이크로캐리어 비드 (microcarrier bead)이다. 상기 마이크로캐리어 비드는 여기에 설명되는 코팅을 포함할 수 있다.
발명의 이해를 위해 본 발명이 어떻게 그 효과를 실현하는지를 명확하게 나타내기 위해 하기의 도면을 참조하여 실시예에 의한 실시 형태가 설명될 것이다.
도 1(a) 내지 (d)는 여기에 설명되는 바와 같이 얻어진 탈세포화된 지방 조직 (DAT)의 SEM 사진으로서, (a)는 처리된 매트릭스와 세포 추출을 확인하는 초미세구조, (b)는 지방 조직의 풍부한 기저막 성분과 일치하는 네트워크형 콜라겐 영역, (c)는 콜라겐 섬유의 거시적 3-D 구조의 보존, (d)는 조직화된 나노-섬유상 콜라겐의 보존을 나타낸다.
도 2(a) 및 (b)는 여기에 설명되는 DAT의 고증폭 SEM 사진이다. 상기 이미지는 전체 조직 구조 내에서 변화하는 배열을 갖는 지방 세포외 매트릭스의 미세 콜라겐 네트워크 구조의 보존을 나타낸다. 도 2(a)는 콜라겐 섬유가 조직화된 번들 내에서 나란히 정렬된 구역을 나타낸다. 도 2(b)는 기저막형 구조와 일치하는 혼교된 (interwoven) 콜라겐 섬유의 네트워크 풍부 영역을 나타낸다.
도 3은 여기에 설명되는 DAT의 SEM 사진으로, 처리 종료 시 매트릭스 내에서 혈관 구조의 보존을 나타낸다. 상기 이미지는 혈관 내강 상의 혈관 내피가 기저막의 네트워크 풍부 세포외 매트릭스 특성을 노출시키면서 추출된 것을 나타낸다.
도 4 (a) 내지 (d)는 세포 추출을 확인하는 여기에 설명된 바와 같이 얻어진 DAT의 TEM 사진으로, (a)는 콜라겐 섬유의 혼교된 특성을, (b)는 콜라겐 섬유 내에 배치된 탄성 섬유를, (c)는 탈세포화된 지방 조직 섬유의 정렬된 영역 내에서, Ⅰ형 콜라겐을 시사하는 미소섬유 콜라겐의 특징적인 구부러짐 패턴을, (d)는 매트릭스 내의 밀집된 콜라겐 섬유 (콜라겐 Ⅰ형의 특징)의 영역의 단면도를 나타낸다. 각 패널의 오른쪽 상단 코너의 막대는 200nm의 거리를 나타낸다.
도 5는 관리 유전자 (즉, 필수적으로 발현되는)로서 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GAPDH)를 사용하여 지방-유래 줄기 세포(ASC) 파종된 스캐폴드와 대조군에서, 지방생성 표지 리포단백질 리파제 (adipogenic markers lipoprotein lipase, LPL), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 γ (peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ) 및 CCAAT-강화제 결합 단백질 α(CEBPα) 발현의 엔드 포인트 RT-PCT 연구 시험 결과를 나타낸다. NI = 유도되지 않음 (10일 간 증식 배지에서 배양). I = 유도됨 (증식 배지에서 72 시간 배양 후, 7일 간 지방 분화 배지에서 배양). CA = 세포 응집 배양. ASC는 외인성 매트릭스 없이 MillicellTM 필터 상의 3-D 시트 포맷에서 배양되었다. TCPS = 조직 배양 폴리스티렌. 유전자 발현의 최고 상대 수준은 유도된 DAT 스캐폴드에서 검출되었다. 지방생성의 주된 조절자인 PPARγ 및 CEBPα는 비유도된 DAT 스캐폴드에서 발현되고, 이것은 이와 같은 미세환경이 외인적인 생장 인자의 필요성 없이 지방생성을 일어나기 쉽게 한다는 것을 나타낸다. 나타낸 염색 패턴은 시험된 모든 샘플을 대표한다 (n=3, N=3).
도 6은 ASC-파종된 스캐폴드와 대조군에서 ECM 유전자 발현의 엔드 포인트 RT-PCT 분석 결과를 나타낸다. NI = 유도되지 않음 (증식 배지에서 10일간 배양). I = 유도됨 (증식 배지에서 72시간 배양 후, 지방 분화 배지에서 7일간 배양). Ⅰ형 콜라겐은 모든 샘플에서 발현되었다. 연골계와 흔히 관련되는 II형 콜라겐은 발현되지 않았다. IV형 콜라겐은 유도된 모든 샘플과, 비분화된 TCPS 대조군에서 발현되었다. 나타낸 염색 패턴은 시험된 모든 샘플을 대표한다 (n=3, N=3).
도 7은 지방생성 분화 후 DAT 스캐폴드 또는 대조군 (n=3, N=3) 당 전체 세포 내 단백질 함량에 대해 정규화된 평균 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GPDH) 효소 활성을 나타내는 막대 그래프이다. 응답 크기에서의 세포 공여자의 가변성으로 인해, 세 개의 세포 공여자에 대한 각각의 결과는 분리하여 나타낸다. 오차 막대는 세 개의 샘플에서 표준 편차를 나타낸다.
도 8(a)는 DAT (200mg) (회색) 상에 파종된 1x106 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC, 백색)를, 도 8(b)는 저산소 조건 (5% O2, 37℃)에서 7일간 배양된 DAT (200mg) (회색)에 파종된 2.5x106 ASC (백색)를 나타낸다. 도 8(c)는 전체 DNA 함량에 대해 측정된 DAT 스캐폴드 상의 ASC 증식을 나타낸다. DAT 스캐폴드는 ASC로 파종되고, 정치 조건 (백색 막대) 또는 관류 바이오 리액터 시스템 (회색 막대) 하에서 증식 배지에서 배양된다.
도 9(a) 내지 (f)는 피하 이식 모델 내에서 탈세포화된 지방 조직 (DAT)의 예비적 생체 내 연구의 조직학적 및 현미경적 데이터를 나타낸다. (i) DAT 스캐폴드 (50 mg), (ii) 수컷 위스타 래트에서 분리된 1 x 106 지방 유래 줄기 세포 (ASC)로 파종된 (이식 24시간 전에) DAT 스캐폴드 (50 mg)를 암컷 위스타 래트의 등 피하 공간에 이식하였다 (도 9(a)). 도 9(b)는 이식 표면의 가시적인 혈관과 함께 4일 (위쪽)과 14일 (아래쪽)에 외식된 ASC-파종된 DAT 스캐폴드의 이미지를 나타낸다. 도 9(c)는 이식 부피의 거시적 보존을 나타내는 14일에서 파종되지 않은 DAT 스캐폴드의 대표적인 H&E 이미지를 나타낸다 (R = 래트 조직; C = 섬유상 캡슐; D DAT 스캐폴드; 막대 = 100 ㎛). 도 9(d)는 상대적으로 가는 섬유 상 캡슐 (C)와 숙주 조직 (R)과의 뛰어난 통합을 나타내는 이식 14일 경과 시점에서 파종되지 않은 DAT 스캐폴드 (D)의 대표적인 SEM 사진이다 (막대 = 500㎛). 14일에서 파종되지 않은 DAT의 중앙 영역의 H&E 염색 (도 9(e))와 ASC-파종된 DAT (도 9(f))는 ASC 파종된 DAT 스캐폴드에서 고도의 세포질을 갖는 세포 침투를 나타낸다 (막대 = 20 ㎛).
도 10은 DAT와 하이드로겔을 포함하는 2-상 복합 스캐폴드를 나타낸다 ( 광 가교 가능한 메타크릴레이트 콘드로이틴 설페이트)
도 11(a) 및 (b)는 에어젯 액적 기술을 이용한 탈세포화된 지방 조직 (DAT)로부터 구형 마이크로캐리어를 제조하는 방법을 나타낸다. 하단의 패널은 거시적으로 본 구형 DAT-기반 마이크로캐리어 (왼쪽). DAT-기반 마이크로캐리어의 미공성 표면 지형 (중앙), DAT-기반 마이크로캐리어의 내부 미세 구조 (오른쪽)을 나타낸다.
도 12(a)는 수화된 DAT-기반 마이크로 캐리어를 나타낸다. 도 12(b)는 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)로 파종되고, 스피너 플라스크 시스템에서 동적 조건 하에서 28일간 배양된 DAT-기반 마이크로캐리어를 나타낸다. 도 12(c)는 약 1cm3의 부피를 채운 인간 ASC로 파종된 DAT-기반 마이크로캐리어의 거시적 응집을 나타낸다 (동적 배양 28일 후). 도 12(d)는 최소 액량으로 18 게이지 바늘로 마이크로캐리어를 채운 주사기를 나타낸다. 도 12(e)는 18게이지 피하 주사기를 통한 압출 후의 마이크로캐리어를 나타낸다.
도 13은 전체 DNA 함량으로 수량화된 동적 스피너 플라스크 시스템에서 14일간 배양된 DAT-기반 및 젤라틴-기반 마이크로스피어에서 인간 ASC의 세포 증식을 나타낸다. 데이터는 세 개의 샘플의 평균 ± 표준 편차로서 제시되었다.
도 14는 DAT-기반 마이크로캐리어, 젤라틴 (G)-기반 마이크로캐리어 및 인간 ASC로 파종되고 지방생성성 배지에서 배양된 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS)에 대한 전체 세포 내 단백질 함량에 대해 정규화된 평균 글리세롤-3-포스페이트 (GPDH) 효소 활성을 나타내는 막대그래프이다. 오차 막대는 세 개의 샘플의 표준 편차를 나타낸다.
지방, 연골 및 골 형성용 중간엽 줄기 세포와 함께 태반, 연골 및 뼈가 각각 연구되었다 [5-7]. 탈세포화된 조직은 통상 세포 물질의 제거와 세포외 매트릭스 (ECM)의 수집에 기여하는 물리적, 화학적 및 생물학적 처리를 거친다. 탈세포화 과정의 효율은 조직의 특성, 처리의 길이 및 채용된 특정 기술에 따라 달라진다. 지금까지 다른 조직들에 대해 다수의 서로 다른 탈세포화의 접근이 있었지만, 지방 조직 (지방)으로부터 잘 보존된 3차원 (3-D) 구조를 갖는 매트릭스 재료의 수집을 가능하게 하는 방법은 개발되지 않았다.
지방 조직은 ECM의 풍부한 원천이며, 특히 지방 조직의 재생 전략에 유용한 기저막 (내피 및 내피 세포의 기저를 이루는 세포외 매트릭스의 얇은 층)의 풍부한 원천이다. ECM은 탄성 섬유, 라미닌 및 피브로넥티과 같은 다른 성분 뿐 아니라 콜라겐을 함유한다. 비손상 기저막의 원천은 이 구조가 기관 형성 및 상처 치료 모두에서 필수적인 역할을 하기 때문에 조직 공학에서 특히 관심을 갖는 대상이다. 주입가능한 세포 전달 비히클로서, 또는 대량 확대용 3-D 다공성 스캐폴드로서 매트릭스를 이용하기 위해 지방으로부터 콜라겐을 추출하는 기술이 개발되어 왔다 [8,9]. 그러나, 지방 조직으로부터 잘 보존된 3-D 구조를 갖는 비손상 ECM의 수집을 가능하게 하는 방법은 기술되지 않았다. 매트릭스 조성이 세포 응답의 매개에 중요한 인자이지만, 3-D 구조의 조직화 역시 동등하게 중요하다.
여기에서 설명하는 방법은 ECM의 3-D 구조 또는 구성을 실질적으로 보존하면서 지방 세포를 탈세포화하는 것이다. 지방 세포는 예를 들면 인간, 암소, 양 및 돼지와 같은 포유 동물 또는 다른 동물에서 유래할 수 있지만, 그에 제한되지 않는다. 구조 (structure) 및 구성 (architecture)이라는 용어는 여기서 서로 교환적으로 사용된다. 상기 방법은 ECM을 포함하는 탈세포화된 지방 조직 (DAT)을 제공한다. ECM은 콜라겐을 포함한다. ECM은 섬유 상 및 네트워크형 콜라겐의 조합을 포함한다, 상기 ECM은 IV형 콜라겐을 포함한다. ECM은 하나 이상의 I 내지 III형 콜라겐, V형 및 VI형 콜라겐을 포함할 수 있다. DAT는 하나 이상의 라미닌 또는 피브로넥틴과 같은 다른 단백질을 포함할 수 있다. DAT는 네트워크형 콜라겐과 관련될 수 있다. DAT는 또한 하나 이상의 생장 인자를 포함할 수 있다. DAT는 프로테오글리칸, 당단백질 및/또는 글리코사미노글리칸을 포함할 수 있다. DAT는 히알루로난 및/또는 콘드로이틴 설페이트를 포함할 수 있다. DAT는 탄성 섬유 또는 엘라스틴을 포함할 수 있다. DAT는 몇몇 세포 단편을 포함할 수 있지만, 비손상 세포는 실질적으로 포함하지 않는다. 상기 방법은 지방 흡인물 뿐 아니라 25g까지의 지방 조직 블럭에 적용되며, 또한 상기 방법은 용이하게 더 큰 조직 부분의 처리에 적용될 수 있다. 탈세포화제의 관류가 잠재적으로 탈세포화를 촉진 또는 증가시키기 위해, 또는 더 큰 조직부분의 탈세포화를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 관류는 세포 조직 내에서 맥관 구조를 통해 이루어질 수 있으며 또한 분리된 지방 조직 내에서 동맥 또는 정맥과 같은 혈관의 삽관을 통해 이루어질 수 있다. 여기에 설명하는 바와 같이 탈세포화된 지방 조직은 예를 들면, 성형 수술 및 재건 수술, 정형 외과 수술, 심혈관 용도, 일반 외과, 비뇨기과, 부인과 및 경막 재생과 같은 신경외과 등의 넓은 응용 분야 및 지혈제 (혈전 유도 재료) 또는 화상이나 당뇨성 궤양의 치료와 같은 상처 치료 차단막으로서 사용될 수 있는 콜라겐의 원천이다.
또한 여기에 설명되는 것은 지방 조직으로부터 잘 보존된 3-D 구조를 갖는 ECM을 실질적으로 분리하는 방법이다. "잘 보존된 3-D 구조"라는 용어는 분리된 ECM이 비손상 지방 조직 내의 ECM의 3-D 구조와 유사한 섬유 상 및 네트워크형 콜라겐의 고도 조직화된 조합을 포함한다는 것을 의미한다. 그와 같은 분리된 ECM의 잘 보존된 3-D 구조는 체내에서 발견되는 세포의 미세 환경을 복제함으로써 세포의 통상의 세포 조직화 및 배양에서의 거동을 촉진하거나 또는 방해하지 않고, 따라서 세포 생장 및 증식과 같은 천연의 세포 과정을 지지한다. 실질적으로 분리된 ECM은 IV형 콜라겐을 포함할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 하나 이상의 I형 내지 III형, V형 및 VI형 콜라겐을 포함할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 라미닌 또는 피브로넥틴과 같은 하나 이상의 다른 단백질을 함유할 수 있다. 라미닌은 네트워크형 콜라겐과 관련될 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 하나 이상의 생장 인자를 함유할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 프로테오글리칸, 당단백질 및/또는 글리코사미노글리칸을 함유할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 히알루로난 및/또는 콘드로이틴 설페이트를 함유할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 탄성 섬유 또는 엘라스틴을 함유할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 동맥 및 정맥과 같은 도관의 보존된 3-D 구조를 갖는 탈세포화된 혈관을 함유할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 예를 들면 지방 조직이 유방으로부터 취해진 경우, 탈세포화된 도관 구조를 함유할 수 있다. 실질적으로 분리된 ECM은 단백질과 세포 단편과 같은 지방 조직의 성분을 포함할 수 있지만, 생존가능하거나 또는 생존 가능하지 않은 실질적으로 비손상 지방 세포는 포함하지 않는다. 어떤 실시의 형태에서 분리된 ECM은 용해된 세포 및 유사한 세포 부스러기를 포함하는 면역원성 성분을 실질적으로 포함하지 않는다. "면역원성 성분을 실질적으로 포함하지 않는다"는 것은 그와 같은 성분들이, 재료가 도입될 개체에서 면역 반응을 생성하기에 불충분한 수준에 있다는 것을 의미한다.
DAT는 연성 세포 확대를 위한 천연 유래 바이오 스캐폴드를 제조하는 데 사용될 수 있다. DAT는 입술 확대 뿐 아니라, 주름 개선 또는 다른 미세한 상처의 치료를 포함하는 예를 들면 얼굴과 관련된 미용 성형 수술에서 예를 들면 연성 조직 충전제와 같은 미용 및 재건 용도의 벌킹재로서 사용될 수 있다. DAT는 또한 연성 조직에 영향을 미치는 외상성 손상의 재생용으로 화상 및 당뇨성 궤양의 치료에서, 선천성 상처의 치료와 같은 재건 및 상처 치료 용도로, 또는 암 절제 후의 연성 조직 재건에서 사용될 수 있다. DAT 바이오 스캐폴드는 일반적인 외과 수술 및 심장 외과, 정형 외과, 신경 외과, 비뇨기과, 부인과 또는 성형 수술과 같은 특정 외과 수술에서 사용될 수 있다. 상기 바이오 스캐폴드는 지혈제 또는 상처 치료용 드레싱으로 사용될 수 있다. 상기 바이오 스캐폴드는 자가 조직 또는 동종 조직 또는 이종 조직일 수 있다.
예를 들면, DAT는 예를 들면 요실금 방지를 돕기 위해 비뇨기과 또는 부인과용 벌킹제로서 사용될 수 있다. 또한 DAT는 정형외과용으로 사용될 수도 있다. 예를 들면 DAT는 위축증으로 고통받는 노인 환자의 발에서 완충성을 개선하고 그에 따라 운동성을 개선하기 위해 연성 조직 확대에 사용될 수 있으며, 또한 DAT는 인대 재생에 사용될 수도 있다. DAT는 경막 재생에 사용되거나 또는 말초 신경에서 갭을 재생하는 브릿징 재료로서와 같이 신경 외과에서 사용될 수 있다. DAT는 심장혈관 용도로 사용될 수 있다. 예를 들면 DAT는 심장 또는 말초 허혈의 치료용 세포 또는 생장 인자의 캐리어로서 사용될 수 있다. DAT는 비외과적 및 외과적 (개복 수술 및 내시경 수술)용도의 지혈제로서 사용될 수 있다.
현재까지 대부분의 미용 연성 조직의 확대 전략은 진피층의 확대와 관련된 것이었다. 이것은 일시적인 교정 방법으로서 사용할 수 있지만, 얼굴의 연성 조직 상처는 일반적으로 진피 아래의 피하 지방 조직층에서의 변화에 의해 초래된다. 인간이 노화됨에 따라 피하 지방층은 얼굴의 일부분에서 위축되는 경향이 있고 이것이 그 밑에 근육 조직과 연결된 그물 진피 (reticular dermis)의 위축을 초래한다. 근육의 반복된 수축은 피부에 힘을 가하여 섬유화 및 깊은 주름의 생성을 초래한다. 여기서 설명한 DAT로서 실질적으로 분리된 ECM을 사용한 확대는 기저의 지방 조직층을 그 원래 위치로 회복시키는 역할을 하여, 단지 진피를 확대시키는 치료보다 더욱 효과적이다. ECM의 구조 및 조성이 세포 거동에 극적으로 영향을 미치는 것으로 밝혀짐에 따라 매트릭스원으로서 지방을 사용하는 것이 장기적인 연성 조직 재생을 촉진시킬 수 있게 되었다. 지방 조직으로부터 유래된 ECM이 지방생성에 이상적인 환경을 제공할 것으로 기대된다.
DAT는 세포 부착을 지지하는 바이오 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 지방 기반 응용으로서, DAT 스캐폴드는 파종된 간엽 줄기 세포 또는 다른 지방 전구 세포 (progenitors)의 지방 분화를 지지할 수 있다. 연성 조직 재생용으로 DAT로부터 제조된 바이오 스캐폴드는 바이오 스캐폴드가 포함될 천연 연성 조직을 흉내내도록 하는 기계적 특성을 갖는다. 이것은 임플란트가 천연의 느낌을 갖고, 감염 및 상처 조직 형성을 최소화하는 것을 보장한다. 동시에 바이오 스캐폴드의 강도는 간엽 줄기 세포와 같은 파종된 줄기 세포의 분화 응답에 적절히 영향을 미칠 수 있다. 지방 조직 공학용 DAT 바이오 스캐폴드는 통상의 지방의 탄성율과 같거나 유사한, 즉 약 3-4 kPa 범위의 탄성율을 갖으며[10], 부드럽고, 유연하고, 탄력이 있다. 상기 바이오 스캐폴드는 조직에 가해지는 이식 후의 힘을 견딜 수 있을 정도로 충분한 기계적 기밀성 (mechanical integrity)을 갖고 있어서 지방 조직 재생을 파괴할 수 있는 스캐폴드의 조직 붕괴를 피할 수 있다. DAT 바이오 스캐폴드는 파종된 스캐폴드로부터 분화된 세포 및/또는 숙주조직으로부터 침투된 개체를 포함하는 새로운 성숙한 지방 조직의 성장을 지지할 수 있는 속도로 분해될 수 있다.
탈세포화된 지방 조직 외에 하나 이상의 바이오 재료를 포함하는 복합 DAT- 기반 스캐폴드는 바이오 스캐폴드로서 사용되기 위해 제조될 수 있다. 복합 바이오 스캐폴드는 하나 이상의 천연 유래 및/또는 합성 바이오 재료를 포함할 수 있다. 복합 바이오 스캐폴드는 비제한적으로 탈염 골 매트릭스, 탈세포화 골, 탈세포화 혈관, 탈세포화 연골, 탈세포화 태반, 탈세포화 심장 판막, 탈세포화 인대, 탈세포화 진피, 탈세포화 심근, 탈세포화 심막, 탈세포화 평활근, 탈세포화 장, 탈세포화 점막 또는 탈세포화 신경을 포함하는 하나 이상의 다른 탈세포화된 바이오 스캐폴드를 포함할 수 있다. 복합 바이오 스캐폴드는 비손상 DAT 외에 DAT 기반 마이크로캐리어 또는 입자를 포함할 수 있다. 복합 바이오 스캐폴드는 탈세포화된 지방 조직 외에 단백질, 다당류, 프로테오글리칸 또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 다른 천연 유래 생체물질 중에서 콜라겐, 젤라틴, 히알루로난, 콘드로이틴 설페이트, 키토산, 알긴산, 실크 또는 피브린 유도체를 포함할 수 있다. 복합체는 탈세포화된 지방 조직 외에 다른 합성 바이오재료 중에서 폴리카프로락톤(PCL)-, 폴리에스테르-, 폴리우레탄-, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)-, 폴리락트산/폴리락타이드 (PLA)-, 폴리글리콜산/폴리글리콜리드(PGA)-, 폴리락틱-코-글리콜릭산(PLGA)-기반 하이드로겔 또는 스캐폴드를 포함할 수 있다. 복합 바이오 스캐폴드는 그들의 구조를 안정화시키기 위해 열적, 화학적, 효소적 및/또는 광학적 가교 과정을 거칠 수 있다. 복합 바이오 스캐폴드를 제조하는 목적은 잘 정의된 3-D 구조 및/또는 형태를 만들기 위해서이다. 복합 바이오 스캐폴드를 만드는 목적은 바이오 스캐폴드의 기계적 특성 및/또는 생분해를 조율하기 위해서이다.
DAT 바이오 스캐폴드 또는 복합 DAT 바이오 스캐폴드는 약학제제 (예를 들면, 소염제, 진통제), 호르몬, 생장 인자, 단백질 또는 펩타이드, 혈관신생인자, 국소화된 세포 분화를 유도하는 제제, 예를 들면 티아졸리디네디온 (예를 들면 로시글리타존, 트로글리타존, 피오글리타존) 또는 지방생성을 유도하는 제제 (예를 들면 인슐린-감작제), 예를 들면 이소부틸메틸잔틴과 같은 cAMP의 분해를 저해하는 제제, 베타-글리세롤포스페이트, 아스코르브산과 같은 골 염화를 촉진하는 제제 등을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 다른 물질을 포함할 수 있다.
DAT 바이오 스캐폴드는 지방 유래 줄기 세포, 골수 유래 간엽 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 만능 유도 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell), 지방 세포, 지방 모세포 (adipoblast), 전지방 세포 (preadipocyte), 혈액 세포, 심근 세포 (cardiomyocyte), 심근 줄기 세포, 연골 세포, 골 세포, 근 세포, 내피 세포, 내피 모세포 (endothelial progenitor cell), 상피 세포, 섬유 아세포, 조혈 모세포, 혈관 주위 세포, 뉴론, 신경 줄기 세포, 신경 능선 세포 (neural crest cell) 및 신경아교세포 (glial cell)와 같은, 그러나 그에 제한되지는 않는 성숙 세포로 분화될 능력을 갖는 세포를 포함하는 인간 또는 동물 유래 일차 세포 또는 세포주로 파종될 수 있고, 세포 응답은 생체 외 및/또는 생체 내에서 탐색될 수 있다. 예를 들면, 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 지방 조직 공학을 포함하는 재생 전략의 범위용으로 적절한 세포원이다. 지방은 다계열 분화 능력을 갖는 풍부하고, 이용가능한 세포원이다. ASC는 숙주 줄기 세포의 이식 위치로의 이동을 유발함으로써 장기간의 지방 안정성에 필수적인 혈관 맥관화 (vascularization)를 촉진할 뿐 아니라 재생에 기여하는 성숙한 지방 세포 및 생체 내 분비 인자로 분화할 수 있다. ASC는 또한 면역 응답을 조절할 수 있고, 따라서 자가조직 또는 동종 세포원으로서 이용될 수 있다.
DAT 바이오 스캐폴드 또는 DAT를 포함하는 복합 바이오 스캐폴드는 일차 세포와 세포주를 포함하는 고착 세포의 배양용과 같은 세포 배양 기질로서 사용될 수 있다. 세포 파종된 DAT-기반 바이오 스캐폴드는 정적인 조건 하에서 생체 내 배양되거나 또는 스캐폴드 기반 관류 바이오 리액터 시스템과 같은 바이오 시스템 내에서 배양될 수 있다. 파종된 세포를 갖거나 갖고 있지 않은 탈세포화된 지방 세포는 피하 공간 또는 예를 들면 장막, 장간막 또는 복막을 포함하는 복부 공간 내의 위치에서 생체 내에 이식될 수 있다. 그와 같은 이식은 일시적일 수 있다. 세포 배양 기질로서 DAT를 이용하는 것은 예를 들면 세포 분화를 위해 관심 대상의 특정 세포의 확장을 위한 목적이거나 또는 조직 또는 하나 이상의 단백질과 같은 생물자원 (bioproduct) 생산을 목적으로 할 수 있다. 하나의 예로서, DAT 바이오 스캐폴드는 자가조직적으로 또는 동종조직적으로 적용될 수 있는 줄기 세포의 임상 관련 산출을 위해 작은 생검 샘플로부터 인간 ASC와 같은 세포의 대규모 확장을 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다. 상기 세포는 콜라게나아제 또는 트립신과 같은 효소 처리등에 의해 세포 배양 종료 시점에서 DAT 스캐폴드로부터 추출될 수 있다. 또는 상기 세포는 예를 들면 바이오 스캐폴드로서 DAT와 조합하여 치료적으로 적용될 수 있다.
지방 조직 공학용 재생 스캐폴드로서 DAT의 이용을 실증하기 위해, 파종된 인간 ASC의 생체 외 지방생성 응답이 검사되었다. 그 결과는 세포 거동에 대한 3-D 미세 환경의 중요성을 강조한다. 더욱이, 실질적으로 비손상 탈세포화된 지방 조직 ECM은 도 5에 도시된 바와 같이 외인성 분화 인자의 필요 없이 지방생성성 표지 (예를 들면 유전자)의 발현을 유도하는 지방생성을 위해 긍정적인 환경인 것으로 나타났다. 그와 같이, 여기에 설명하는 실시의 형태는 대량의 연성 조직 확대에 적절하다.
여기에 설명하는 조직 탈세포화의 목적은 ECM 본래의 구조와 조성을 유지하면서, 면역 반응을 개시시키는 세포 성분을 제거하는 것이다. 여기에 설명하는 조직 탈세포화는 세정제 (detergent)를 사용할 필요가 없어서 세포 독성 및 잔여 세정제의 존재와 관련된 염려를 덜 수 있기 때문에 유익하다. 하나의 실시의 형태에서, 본 발명의 방법은 효소 소화 용액 (하나 이상의 효소를 함유)에서 하나 이상 지방 조직을 1회 이상 배양 및 1회 이상의 극성 용매 추출을 시킨다. 다른 실시의 형태에서, 본 발명의 방법은 지방 세포를, 기계적 파쇄, 지방 소화 용액에서 1회 이상의 배양 및 1회 이상의 극성 용매 추출을 포함하는 하나 이상의 단계를 거치게 한다. 다른 실시의 형태에서, 본 발명의 방법은 지방 세포를, 기계적 파쇄, 지방 소화 용액에서 1회 이상의 배양 및 1회 이상의 극성 용매 추출, 세정 버퍼에서 1회 이상의 세정을 포함하는 하나 이상의 단계를 거치게 한다. 상기 방법의 다양한 단계들은 어떤 순서로도 수행될 수 있다. 각 단계의 지속 기간은 필요에 따라 또는 편이성에 따라 조정될 수 있다. 예를 들면 효소 소화는 몇 시간 이상 또는 하룻밤 동안 수행될 수 있다. 기계적 파쇄는 ECM을 실질적으로 손상하지 않는 과정을 포함한다. 예를 들면, 기계적 파쇄는 1회 이상의 동결-해동 주기 또는 교반을 포함하는 하나 이상의 단계 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 교반은 지방 조직의 물리적 교반 및/또는 조직이 침지된 용매 또는 용액을 교반 또는 유동시키는 것을 포함한다. 동결 버퍼는 동결-해동 사이클에서 사용될 수 있다.
예를 들면, 기계적 파쇄를 포함하는 일반화된 실시 형태가 표 1에 도시된다. 효소 소화 및 극성 용매 추출 단계 후에 각각 버퍼 용액으로 세정이 행해질 수 있고, 이들 단계들은 필요한 만큼 반복될 수 있다.
표 1 지방 조직 탈세포화의 일반화된 방법의 예
Figure pct00001
다양한 실시의 형태에서, 기계적 파쇄, 효소 소화, 극성 용매 추출 및 세정 버퍼 단계는 1 회 또는 1 회 이상 수행될 수 있다. 예를 들면 효소 소화는 표 2 및 3의 실시 형태에 나타낸 바와 같이 2회 또는 3회 수행될 수 있다. 또 다른 실시의 형태에서, 극성 용매 추출은 표 2 및 3의 실시의 형태에서 도시된 바와 같이 2회 또는 3회 이상 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 세정 버퍼 단계는 표 2 및 3의 실시의 형태에 도시된 바와 같이 2, 3 또는 4회 수행되거나 또는 그 이상 수행될 수 있다. 세정 버퍼 단계는 이전 단계의 효소 소화 또는 극성 용매 추출의 활성을 실질적으로 제거하기 위해 필요한 만큼 오래 또는 여러 번 수행될 수 있다.
표 2 지방 조직 탈세포화 방법의 예
Figure pct00002
또 다른 실시의 형태에서, 표 3에 나타낸 바와 같이, 다른 효소 소화 용액이 사용되고, 상기 방법은 5일 간 동안 수행될 수 있다.
표 3 지방 조직 탈세포화 방법의 예
Figure pct00003
동결 버퍼는 저장성 또는 고장성일 수 있으며, 지방 조직으로부터 유래하는 임의의 효소의 활성을 저해하기 위해 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA) 또는 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA)와 같은 하나 이상의 이온 킬레이트제를 포함할 수 있다. 그 예는 예를 들면 pH 8.0에서 10 mM 트리스 염기 및 5 mM EDTA이다. 트리스-HCl이 트리스 염기 대신 사용될 수도 있다. 다른 저장성 또는 고장성 용액 제제는 물과 NaCl 또는 KCl과 같은 하나 이상의 염 용액 또는 저장성 포스페이트 버퍼를 포함할 수 있다. 저장성 용액의 pH는 전형적으로 8.0이지만, pH 7.0 내지 9.0의 범위일 수도 있다.
효소 소화 용액은 ECM에 대한 변형은 최소화하거나 없으면서 세포 매트릭스의 상호 작용을 파괴하는데 효과적인 하나 이상의 프로테아제를 포함할 수 있다. 적절한 프로테아제의 예는 트립신이지만, 예를 들면 임의의 균주로부터의 서브틸리신과 같은 다른 것들이 적절하게 수용가능할 수도 있다. 효소 소화 용액은 DNase, RNase, 리파제 및/또는 포스포리파제와 같은 하나 이상의 다른 분해 효소를 비제한적으로 포함할 수 있다. 즉, 거대분자를 분해하는 효소는 본 발명의 방법에서 유용하다. 선택적으로 EDTA 및/또는 하나 이상의 염과 같은 킬레이트제가 소화 용액에 포함될 수 있다. 예를 들면, 효소 소화 용액 #1은 0.25 % 트립신과 0.1 % EDTA를 포함할 수 있다. 이 용액 내에서 부가적인 효소는 DNase, RNase, 리파제, 및/또는 포스포리파제를 포함할 수 있다. 효소 소화 용액 #2의 예는 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4.9 mM MgSO4 ·H2O, 15,000 U DNase II형, 12.5 mg RNase III A형 및 2000 유닛의 리파제 VI-S형을 포함할 수 있다. 효소 소화 용액 #2는 또한 트립신/EDTA 및/또는 포스포리파제와, 다양한 원천으로부터의 DNase, RNase, 및/또는 리파제의 어떤 조합이라도 포함할 수 있다.
극성 용매의 예는 99.9% 이소프로판올이다. 다른 극성 용매는 비제한적으로 에탄올, 메탄올, 부탄올, n-프로판올, 펜탄올, 헥산올, 이소아밀 알콜, 물, 아세트산, 포름산, 클로로포름, 2,2-디메톡시프로판, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란, 아세토니트릴, 메틸 에틸 케톤, 메틸 프로필 케톤, 디메틸 술폭시드, 디메틸포름아미드, 이소프로필 에테르, 에틸 아세테이트 또는 n-헥산, 이소헥산 또는 디에틸 에테르와 같은 비극성 성분을 포함하는 용매의 혼합이 사용될 수 있다. 이들 용매와 관련된 안전성에 대한 염려 때문에 벤젠 또는 톨루엔과 같은 고독성 또는 잠재적 발암성 또는 돌연변이 발생률을 높이는 용매의 사용은 피하는 것이 바람직하다.
세정 버퍼는 실질적으로 중성 pH에서 하나 이상의 염을 함유하는 물을 포함한다. 세정 버퍼의 예는 pH 7.4 에서 8 g/L NaCl, 200 mg/L KCl, 1 g/L Na2HPO4, 및 200 mg/L KH2PO4 를 포함한다. 다른 세정 버퍼는 pH 7.4에서 포스페이트 완충 식염수 (Ca2 + 또는 Mg2 + 는 함유하지 않음)이다. 세정 버퍼의 다른 예는 pH 7.4.에서 10 mM HEPES 보충된 행크스 완충 염 용액이다.
처리는 37℃에서 교반 하에 수행될 수 있다. 용액에는 프로테아제 저해제 뿐 아니라, 항생제 및/또는 항진균제가 보충될 수 있다.
표 3의 실시의 형태는 처리 시간과 용액 요건을 최소화하기 위해 최적화된 것이다. 그것은 비용면에서 효과적인 방법이고, 확장이 기대된다. 그러나, 상기 방법은 특정 용도가 필요할 경우 추가 조정되거나 최적화될 수 있다. 예를 들면, 효소 소화 용액 # 1 및 #2는 같거나 다를 수 있다. 극성 용매 추출이 관여되는 각 단계는 동일하거나 다른 용액을 사용할 수 있으며, 극성 및 비극성 용매의 혼합을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 세정 버퍼에 관련된 각 단계는 동일하거나 다른 세정 버퍼를 사용할 수 있다.
지방 조직은 예를 들면 복부 또는 유방과 관련된 선택적 수술 (elective surgery)을 받는 환자로부터 얻을 수 있다. 그러나 장막 또는 내장 지방 또는 얼굴, 팔, 다리 및 발을 포함하는 사지의 지방 조직을 포함하는 모든 이용 가능한 지방원 (예를 들면 다른 조직 위치로부터)이 처리될 수 있다. 표 3의 실시의 형태는 절제 조직 블럭을 사용했고, 예를 들면 효소 소화 및 용매 추출의 추가 단계를 포함함으로써 더 큰 조직 블럭을 처리하기 위해 적용될 수 있다. 실시 형태는 탈세포화제를 조직에 관류시키는 것을 포함하도록 적용될 수 있다. 관류는 지방 조직 유경 (pedicle) 또는 피판에 하나 이상의 혈관의 삽관을 포함할 수 있다. 그와 같은 실시 형태는 지방 흡입 과정에서 얻어진 지방 조직 (lipoaspirate)을 사용할 수 있다. 지방 조직 샘플에 대해, 샘플 수집과 용액 변화 과정을 촉진하기 위해 필터가 포함될 수 있다. 또는, 지방 조직화된 물질은 펠렛에서 DAT를 수집하기 위한 처리 동안 상술한 다양한 용액을 상등액으로 사용하여 원심분리될 수 있다.
여기에 설명한 ECM의 원천으로서의 지방 조직의 사용은 지방이 유일하게 확장가능한 물질이고, 또한 풍부하고, 이용가능하다는 사실을 활용하는 것이다. 또한, 여기에 설명하는 실시 형태에 따라 지방 조직 확대의 용도로서, 특정하게 성형외과의가 확대/재생하고자 하는 조직으로부터 유래하는 매트릭스의 사용은 독특한 접근이다 (즉, 부피 확대를 위해 피부원보다 지방을 사용하는 것). 지방 조직은 IV형 콜라겐과 라미닌을 포함하는 기저막 성분의 특히 풍부한 원천이고, 기저막이 조직과 기관 형태 생성과 상처 치료에서 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있다. DAT는 탄성 섬유 및/또는 엘라스틴 및 혈관과 같은 비손상 탈세포화된 맥관 구조를 함유한다. 유방으로부터의 DAT는 탈세포화된 도관 구조를 함유할 수 있다. DAT는 하나 이상의 생장 인자를 포함할 수 있다. DAT는 자가조직 또는 동종 조직 스캐폴드로서 이용될 수 있다.
여기에 설명하는 방법은 인간 및 비인간 대상으로부터의 지방 조직에 적용될 수 있다. 여기에 설명한 바와 같이 DAT와 ECM을 사용하는 조직 확대 및 수술 과정은 인간 및 비인간 대상에게 적용될 수 있다. 소 또는 돼지 지방을 비제한적으로 포함하는 동물원으로부터의 지방 조직은 인간에게 외인성 스캐폴드로서 사용되기 위해 처리될 수 있다. 여기에 설명된 지방 조직의 탈세포화 방법은 조직의 면역원성 성분을 실질적으로 제거하고 따라서 외인성 재료의 제조에 적합하다. 그러나, 인간 지방 조직은 종종 의료 폐기물로서 처리되고, 인간 콜라겐을 쉽게 얻을 수 있는 풍부한 자원을 대표하지만, 동시에 그 과정은 외인성 질병 전염의 염려를 피해야 한다. 버려진 지방은 수집되어 처리 전에 냉동고에 보존될 수 있다. 냉동이 탈세포화 과정에서 첫번째 단계가 될 수 있기 때문에 냉동은 문제가 되지 않는다. 지방 흡입은 미용 용도와 같은 자가 조직 또는 동종 조직 확대에 유용할 수 있는 지방 조직의 소량을 얻기 위해 사용될 수 있다. DAT는 재고 생물 재료 (off-the shelf-biomaterial)로서 몇 년 동안 안정하게 보존될 수 있을 것으로 기대된다.
비이온성 세정제 트리톤 -X 100과 음이온성 세정제 라우로일 사코시네이트, 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 및 소듐 데옥시콜레이트가 관여하는 프로토콜을 포함하는 또 다른 탈세포화 접근이 연구되었다. 이들 세정제는 모두 다른 형태의 조직의 탈세포화에서 성공율을 달리하면서 시행되었다 [11]. 최근, 세 개의 다른 그룹이 여기에 설명한 것과 실질적으로 다르고, 일차적으로 세정제 기반 방법에 의존하는 프로토콜을 사용하는 지방 세포 또는 지방 조직화된 지방의 탈세포화와 관련된 연구를 보고하였다 [12-14]. 세정제의 사용은 처리된 매트릭스에 잔류 세포독성 화학물질의 존재에 대한 가능성으로 인해 안전성에 대한 염려를 증가시킨다. 특히, SDS는 ECM 성분과 강력하게 상호작용하여 매트릭스 구조를 변경시킨다 [15]. 다른 세정제들도 ECM과 상호작용할 수 있으며, 이것은 잠재적으로 구조의 분해를 초래한다. 수행된 연구에서, SDS와 소듐 데옥시콜레이트는 매트릭스의 상당한 팽윤과 매트릭스 구조의 젤과 같은 물질로의 비가역적 거시적 분해를 초래하였다. 또한 SDS는 처리 종료 시점에서 제거하기 어렵고, 잠재적으로 세포 생존가능성과 처리된 매트릭스 내로의 침투에 영향을 미칠 수 있다 [16]. 이들 결과는 여기에 설명된 바와 같이 세정제를 사용하지 않는 추출 프로토콜이 보다 임상적으로 적용가능한 접근을 제공한다는 점을 제시한다. 또한, 몇몇 세정제 기반 방법들이 가능성을 보이지만, 그들은 모두 여기에 설명된 효소 및 극성 용매 추출 프로토콜보다 상당히 더 긴 처리 시간을 필요로 한다.
DAT 재료는 효소 소화 및/또는 산 가용화를 통해 코팅을 제조하거나 또는 세포 배양 및 전달에 이용되는 마이크로캐리어를 제조하기 위해 더 처리될 수 있다. DAT 물질은 또한 입자를 만들기 위해 동결 분쇄와 같은 과정을 통해 물리적으로 처리될 수 있다. 소화 및 가용화 단계가 보존된 ECM의 3-D 구조를 예외없이 파괴하는 반면, 이들 기술은 스캐폴드 제조를 위해 정제된 콜라겐의 풍부한 원천으로서 DAT를 이용하게 한다. 일 예로, DAT는 습윤 DAT 중량 g당 25 mg 펩신을 함유하는 0.5 M 아세트산 용액에 소화될 수 있다. 소화 종료 다음에, 10 M NaOH에 의해 pH를 8.0까지 상승시킴으로써 펩신이 비활성화되고, 이어서 빙초산으로 pH를 3.5 미만으로 낮춘다. 소화된 DAT는 코팅으로서 다양한 표면에 적용될 수 있고, 자연 건조된다. 코팅은 예를 들면 글루타르알데히드, 로즈 벵골 또는 리보플라빈과 같은 가교제의 사용을 통해 안정화된다.
Tebb 등에 의해 개발된 방법[17]으로의 변형에 기반한 추가의 처리는 DAT로부터 다공성 마이크로캐리어 (예를 들면 비드)의 제조를 가능하게 한다. 요약하면, 용해된 DAT는 소듐 알긴산 용액 (전형적으로 약 3% v/v 범위의 농도)와 같은 기공 유도 물질 (porogen)과 혼합되고, 주사기 펌프의 제어 하에 블런트 니들을 통해 한 방울씩 칼슘 클로라이드 용액과 같은 안정화 버퍼 안으로 부가될 수 있다. 분열적인 공기류 (distruptive airflow)와 교반이 비드 지름을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 비드는 그리고 나서 글루타르알데히드, 리보플라빈, 로즈 벵골 또는 게니핀과 같은 다양한 제제를 사용한 화학적 가교를 통해 안정화될 수 있다. 또는 비드는 트랜스글루타미나제와 같은 효소 가교제의 사용을 통해 안정될 수 있다. 기공 유도 물질은 기공성 비드를 얻기 위해 추출될 수 있다. 예를 들면 알긴산은 소듐 시트레이트 용액을 사용하여 비드로부터 추출되어 다공성 3-D 구조를 얻을 수 있다. 마이크로캐리어 비드는 비제한적으로 간엽 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 조골 세포 및 연골 세포를 포함하는 다양한 종류의 세포 형태의 대규모 확장에 효과적일 수 있다. 마이크로캐리어는 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화를 지지하기 위해 사용될 수 있다. 마이크로캐리어는 세포 또는 생장 인자용의 주입가능한 전달 비히클로서 또는 경미한 상처 및 얼굴 주름의 회복과 같은 작은 부피의 확대를 위한 벌킹제로서 사용될 수 있다.
인용된 모든 문헌은 그들 전체가 여기에 참고로서 원용된다.
이하의 비제한적 실시예에서 실시의 형태가 설명된다.
실시예 1
재료
달리 언급되지 않는다면 모든 화학물질들은 시그마-알드리치 캐나다 Ltd. (캐나다, 오크빌)로부터 구입되고, 입수한 그대로 사용되었다.
지방 조직 조달
절제된 지방 조직 샘플과 지방 조직이 캐나다 킹스턴의 킹스턴 종합병원 또는 호텔 듀 병원에서 복부 또는 유방 관련 선택적 수술을 받은 여성 환자로부터 수집되었다. 통상 이 조직은 일상적인 수술 절차의 일부로서 버려진다. 절제된 샘플은 양이온이 없는 살균된 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 내에서 처리를 위해 얼음과 함께 2시간 이내에 실험실로 전달된다.
지방 조직 탈세포화
표 3에 설명된 탈세포화 프로토콜이 절제된 지방 조직 샘플 및 지방조직 재료에 대해 사용되었다. 처리 전에, 방금 분리된 절제된 지방 조직 샘플을 20-25 g 질량 범위의 조각으로 잘랐다. 지방 조직의 경우, 같은 범위의 질량을 얻기 위해 부피가 선택되었다. 절제된 지방 조직 부분 4개까지가 동시에 100 mL의 탈세포화 용액을 함유하는 250 mL 플라스틱 통에서 37℃에서 ExcellaTM 24 벤치탑 인큐베이터 (뉴 브런스윅 사이언티픽)에서 120 RPM으로 교반 하에 처리되었다. 모든 탈세포화 용액은 1% 항생-항진균 용액 (ABAM) 및 1% 페닐 메탄 술포닐 클로라이드 (PMSF)로 보충되었다.
샘플은 우선 냉동 버퍼, 10mM 트리스 염기 및 5mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA)을 함유하는 저장성 트리스 버퍼 (pH 8.0)에서 3회의 냉동-해동 사이클 (-80℃에서 37℃)을 거친다. 다음으로, 상기 조직은 0.25% 트립신/0.1% EDTA (캐나다 버링턴, 집코)으로 이루어진 효소 소화 용액 #1로 옮겨져서 약 16시간 동안 밤새 배양된다. 이어서 샘플은 지방 함량을 제거하기 위해 99.9% 이소프로판올에서 48시간 동안 극성 용매 추출된다. 처리된 조직은 8 g/L NaCl, 200 mg/L KCl, 1 g/L Na2HPO4, 및 200 mg/L KH2PO4 (pH 8.0)을 함유하는 세정 버퍼에서 3회 (30분간) 세정되고, 효소 소화 용액 # 1에서 6시간 동안 배양된다. 세정 버퍼 용액에서 3회의 추가 세정 후에, 샘플은 55 mM Na2HPO4,17 mM KH2PO4, 4.9 mM MgSO4 ·7H2O, 15,000 U DNase 타입 II (소 췌장으로부터), 12.5 mg RNase 타입 III A (소 췌장으로부터) 및 2000 유닛의 리파제 타입 VI-S (돼지 췌장으로부터)를 함유하는 효소 소화 용액 #2로 옮겨져서 하룻밤 동안 16시간의 처리를 거친다. 다음날 아침, 매트릭스는 세정 버퍼 용액에서 3회 (30분간) 세정된, 99.9% 이소프로판올에서 8시간 동안 최종 극성 용매 추출된다. 처리 종료 시, DAT는 세정 버퍼 용액으로 최종 3회 (30분) 세정되고, 70% 에탄올로 3회 (30분) 세정된 후, 4℃의 1% ABAM 보충된 살균 PBS에서 보존된다.
조직학적 및 면역조직화학적 정의
조직학 및 면역조직화학적 염색을 위해 인간 지방 조직 및 DAT의 대표적 샘플을 10% 중성 완충된 포르말린에서 24시간 동안 고정하고, 세정 후 살균 PBS에 넣어 캐나다 토론토의 토론토 종합 병원 내의 병리학 연구소로 보냈다. 염색은 세포 추출 과정의 효율을 확인하고, 기저막 성분, IV 형 콜라겐 (CIV) 및 라미닌(LN)의 분포를 정의하기 위해 수행되었다. 모든 샘플은 파라핀에 임베딩되고, 절단되었다 (6㎛ 박편). 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 Masson의 삼색 염색이 잔여 세포 또는 세포 절편의 존재를 검출하고 DAT의 콜라겐 구조를 특정하기 위해 사용되었다. 인간 CIV (1:100 희석, 다코, 캐나다, Clone CIV 22) 및 LN (펩신 에피토프 회수, 1:100 희석, 시그마, 토끼 폴리클로날)을 국부화시키기 위한 면역조직화학적 염색은 기질로서 NovaRedTM (벡터 레보러토리즈)를 사용한 스트텝타비딘-ABC (아비딘/비오틴화 효소 복합체)/겨자무 과산화효소 (horseradish peroxidase, HRP) 시스템을 사용한 검출을 수반한다.
주사형 전자 현미경 ( SEM )
탈세포화를 확인하고, 매트릭스의 구조를 평가하기 위해 처리의 종료 시에 DAT 샘플에 대해 SEM이 수행되었다. 분석을 위해 200 mg 샘플이 실온에서 1시간 동안 2.5 % 글루타르알데히드 (SEM 등급)로 고정되고, 4℃에서 24시간 동안 고정되었다. PBS에서의 광범위한 세정 후, 샘플은 액화 질소 내에서 즉시 냉동되고, 파열되었다. 화학적 건조 과정이 샘플을 준비하기 위해 이용되었다. 요약하면, 샘플은 먼저 에탄올 (EtOH)계로 탈수되고, 이어서 헥사메틸 디실라잔 (HDMS)으로 건조되었다 (15분 동안 2:1 100% EtOH:HDMS; 15분 동안 1:2 100% EtOH:HDMS; 15분 동안 100% HDMS, 3회 반복 후 밤새 자연 건조). 건조된 매트릭스는 현미경 스터드 상에 탄소 테이프로 고정되고, 금으로 스퍼터 코팅된다. JEOL 840 현미경에서 작동 거리 15mm, 가속 전압 10kV로 현미경 사진 (도 1 - 3 )을 얻었다.
지방 유래 줄기 세포 배양
인간 ASC의 일차 배양은 문헌 [15]에 기재된 방법에 의해 피하 복부 지방 조직 샘플로부터 수행되었다. 공여자의 나이, 체중 및 신장이 기록되었다. 2 계대 세포가 파종 실험을 위해 사용되었다.
지방생성 분화를 유도하기 위해, 세포는 무혈청 DMEM: 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, 33 ㎛ 비오틴, 17 ㎛ 판토테네이트, 10 ㎍/mL 트랜스페린, 100 nM 코르티솔, 66 nM 인슐린, 1 nM 트리이오도티로닌 (T3), 100 U/mL 페니실린 및 0.1 mg/mL 스트렙토마이신 보충된 HAM's F-12에서 배양되었다. 분화의 처음 72시간 동안, 0.25 mM 이소부틸 메틸 잔틴 (IBMX) 및 1 ㎍/mL 의 트로크리타존이 분화 배지로서 부가되었다.
세포 파종
세포 파종 실험용 DAT를 제조하기 위해, 블러팅에 의해 과량의 버퍼가 제거되고, 처리된 조직은 200mg 수화된 스캐폴드로 절단되었다. 스캐폴드는 70% 에탄올로 30분 동안의 세정에 의해 오염 제거되고, 살균 PBS로 30분 간 3회 세척되어 재수화되고, 생장 배지에서 하룻밤 동안 배양되었다 (37℃, 5% CO2). 각 DAT 스캐폴드는 그 다음 코팅되지 않은 MillicellTM 필터 유닛 (직경 12 mm, 포어 크기 0.4 ㎛, 미국 메사추세츠 빌레리카, 밀리포어사)으로 이동되고, 세포 부착을 촉진시키기 위해 완전 생장 배지 200㎕에서 1 x 106 ASC (계대수 2)로 파종되었다. 각각의 필터는 5mL의 완전 생장 배지를 함유하는 6-웰 플레이트의 개별 웰에서 배양된다 (37℃, 5% CO2). 배양 24시간 후, DAT 스캐폴드는 필터 유닛에서 제거되어 배지에 더 많이 노출될 수 있도록 직접 6-웰 플레이트에 위치된다. 파종된 DAT 스캐폴드 샘플은 24시간 후 수집되고, 상술한 바와 같이 조직학 및 면역조직화학적 특징 파악을 위해 24시간 동안 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정된다.
3차원에서 세포 거동에 대한 DAT 스캐폴드의 영향을 더 잘 평가하기 위해, 고농도 세포 응집 (CA) 샘플이 또한 문헌 [18]에 기재된 방법에 따라 준비되었다. 요약하면, MillicellTM 필터 유닛 (지름 12 mm, 포어 크기 0.4 ㎛)가 0.5 mg/mL 의 IV형 콜라겐 (인간 태반 유래)으로 코팅되고, 500 ㎕의 완전 생장 배지에서 1×106 ASC (계대수 2)로 파종되었다. 필터는 웰 당 5 mL의 완전 생장 배지를 함유하는 6-웰 플레이트에서 배양되었다 (37℃, 5% CO2).
배양 배지는 2-3일 마다 교환되었다. 분화를 유도하기 위해 72시간 후, DAT와 CA 샘플은 살균 PBS로 3회 세정되고, 완전 생장 배지는 이전에 설명한 분화 배지로 교체되었다. 모든 실험에 대해 3개로 만들어진 조직 배양 폴리스티렌 (TCPS) 대조군 (분화 및 미분화된)이 5mL의 완전 생장 배지에서 웰 당 300,000 세포로 6-웰 플레이트에 파종되어 준비되었다. PBS로 세정 후 72시간 배양에서 DAT와 CA 샘플에서 지방생성성 분화가 유도되었다. 공급 상의 이유로 인해 세 명의 다른 공여자로부터의 조직이 유전자 발현 연구를 위해 사용되었고 (N=3), 다른 세 명의 공여자로부터의 세포 (N=3)가 GPDH 효소 활성의 수량화를 위해 사용되었다. 세포 공여자의 가변성에 대한 염려를 최소화하기 위해, 동일 공여자로부터의 ASC가 각 평가의 단일 시도에서 모든 시점의 DAT, CA, 및 TCPS 샘플의 파종에 사용되었다.
RT - PCR 분석
엔드 포인트 RT-PCR은 생장 배지 (파종 후 10일) 및 분화 배지 (파종 후 10일/분화유도 후 7일) 조건 (n=3, N=3) 하에서 배양된 샘플에서 핵심적인 지방생성성 마커 (PPARγ, CEBPα, LPL) 및 세포외 매트릭스 성분 (콜라겐 I (CI), 콜라겐 II (CII), 콜라겐 IV (CIV))의 유전자 발현을 확인하기 위해 수행되었다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GAPDH) 및 트랜스페린 수용체 (TfR)가 관리 유전자로서 포함된다 [19].
전체 RNA는 TRIzol? 시약 (캐나다 버링톤, 인비트로겐)을 이용하여 분리되었다. 간략하게는, DAT 스캐폴드는 액화 질소에서 급속 냉동되고 모르타르와 막자를 사용하여 분쇄된다. 각각의 스캐폴드는 1mL의 TRIzol? 시약으로 균질화되고, 조직에 대해 표준화된 방법에 따라 처리된다. 동일한 RNA 추출 절차가 CA 및 TCPS 시료에 대해서도 사용되었다. RAN의 농도와 순도는 나노 드롭 분광 광도계 (ND1000; 미국 델라웨어 윌링턴 나노 드롭 프러덕츠)를 사용하여 측정되었다. 260/280 비율은 일반적으로 1.9 - 2.0 사이의 범위이다. 파종되지 않은 DAT 스캐폴드는 최초 시험에서 네거티브 대조군에 포함되었지만, 추가 분석이 가능한 RAN가 충분히 수집되지 않았다.
제1 스트랜드의 cDNA가 제1 스트랜드 버퍼 (50 mM 트리스-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2), 10 mM 디티오트레이톨 (DTT), 0.09 OD260 유닛의 랜덤 프라이머 (인비트로겐), 0.5 mM의 각각의 dNTP (인비트로겐) 및 200 유닛의 SuperScriptTM II RT (인비트로겐)을 함유하는 20㎕의 반응 부피에서 1㎍의 전체 RNA로부터 합성되었다. 마이너스-RT 대조군이 각 샘플로부터 제조되었다. 표 4에 나타낸 유전자 특정 프라이머 (인비트로겐; 50 nM, 탈염화된)가 프라이머 3 소프트웨어를 사용하여 설계되었다. 모든 프라이머 세트의 용융 온도는 60℃였다. 게놈 오염을 검출하기 위해 CEBPα프라이머를 제외한 모든 프라이머는 인트론-엑손 경계를 가로지르도록 설계되었다. 각각의 PCR 반응은 2.5 ㎕의 희석cDNA (50 ng의 입력 RNA 함유), 1X Taq 버퍼 (10 mM 트리스-HCl, 50 mM KCl, 0.08% Nonidet P40), 250 nM 포워드 프라이머, 250 nM 리버스 프라이머, 250 nM의 각각의 dNTP (인비트로겐), 2.5 mM MgCl2 및 0.375 유닛의 재조합 Taq DNA 폴리머라제 (Fermentas)을 갖는 50 ㎕ 반응 부피에서 수행되었다. Bio-Rad C1000 열 사이클러가 사용되었고 PCR 조건은 95℃에서 5분이고, 이어서 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분의 35사이클이 행해졌다. 최종 연장은 72℃에서 5분간 행해졌다. 마이너스-RT 및 템플레이트 없는 대조군이 모든 회마다 포함되었다. PCR 산물은 5% 아가로즈 겔 상에서 전기 영동에 의해 분리되고, 에티듐 브로마이드로 염색되고, 자외선 하에서 검출되었다 (G:Box Chemi HR16; Syngene, 영국, 캠브릿지).
표 4. PCR 연구에서 사용된 유전자 특정 프라이머
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글리세롤-3- 포스페이트 디이하이드로게나제 활성
세포 GPDH 효소 활성 수준(GPDH 검사 키트, KT-010; 카미야 바이오메디칼 코포레이션)이 문헌 [20]에 설명된 방법을 이용하여 DAT와 CA 샘플에서 분화 (n=3, N=3) 유도 후에 72시간과 7일에서 확인되었다. TCPS에서 분화와 미분화 세포는 각각 포지티브 대조군과 네거티브 대조군을 포함한다. 알부민 표준을 사용하는 Bio-Rad 단백질 검사가 데이터 정규화를 위해 각 샘플 내에서 전체 세포질 단백질 함량을 측정하기 위해 사용되었다.
각각의 DAT 및 CA 샘플은 키트를 구비한 효소 추출 시약 1mL (4℃)으로 분쇄되고, 간헐적으로 얼음으로 냉각되면서 5초 간의 버스트로 3회 초음파 처리하여 분쇄되었다. TCPS 샘플은 동일하게 초음파 처리로 분쇄되었다. 세포질 단백질 분획은 4℃에서 15분 동안 6000 × g 에서 샘플을 원심분리하여 얻었다. 모든 상등액 샘플은 제조자의 지시에 따라 GPDH 활성 및 전체 단백질 함량에 대해 즉시 분석되었다. The GPDH 데이터는 m유닛/mg 전체 세포 내 단백질 (mU/mg)로 표시되었으며, 여기서 1 유닛은 1분 동안 1μ몰의 NADH를 산화시키기 위해 필요한 GPDH 활성으로 정의된다.
결과
탈세포화 과정
세제를 사용하지 않는 탈세포화 방법이 지방 세포와 지방 흡입 물질의 콜라겐이 풍부한 세포외 메트릭스를 분리시키기 위해 확립되었다. 추출 과정의 5일 종료 시점에서, 상당량의 백색의 성긴 매트릭스가 수집되었다. 질적으로, 절제된 샘플에 대해, 탈세포화된 지방 조직 (DAT)은 처리 시작 시에는 조직 블럭과 같은 크기를 갖는다. 또한 양적으로, 매트릭스의 수화된 질량은 특정 조직원에 따라 전형적으로 원래 조직 질량의 30 - 45%를 나타냈다. 일반적으로 유방으로부터 분리된 조직은 복부 영역으로부터 수집된 조직에 비해 더 높은 섬유 함량을 갖는다. 스캐폴드 재료로서, DAT는 겸자를 이용하여 쉽게 조작될 수 있고, 다양한 크기로 절단될 수 있으며, 또한 다양한 3차원 구조의 몰드로 포장될 수 있다. 처리 종료 시에 매트릭스 내에 세포 및 세포 찌꺼기가 존재하지 않는다는 것을 H&E 염색으로 확인하였다. 면역 조직화학적 염색은 탈세포화된 매트릭스에서 기저막 성분 LN 및 CIV를 국소화하였다. 성숙한 인간 지방 조직에서, LN은 개별 지방세포를 분리하는 기저막에서와 지지 맥관 구조의 라이닝을 따라 풍부하게 발현되었다. LN 함량은 조직 처리 동안 보존된다. 염색된 패턴은 지방 세포 분획이 제거된, 이전의 혈관의 빈 내강을 라이닝하는 LN과, 네트워크가 풍부한 영역에서 확산 염색이 있음을 나타낸다. 전처리 염색 결과와 일치하는 결과로서, LN은 매트릭스의 섬유질이 많은 영역에서는 발현되지 않았다. LN과 마찬가지로, CIV는 성숙한 지방 세포 및 맥관 구조와 관련하여 기저막에서 발현되었다. 처리 후, 비록 염색의 강도는 약간 약해졌지만, 네트워크형 영역과 내강에서 검출가능한 레벨의 CIV가 있었다.
콜라겐 구조
거시적으로, 매트릭스의 구조는 잘 보존된 다음의 처리를 나타냈다. Masson의 3색 염색은 처리 종료 시점에서 매트릭스 내에 잔여 세포 또는 세포 찌꺼기가 존재하지 않는 것을 나타내어 탈세포화 과정의 효과를 확인하였다. 또한, 상기 염색은 콜라겐을 보다 상세하게 시험하기 위해 사용되었다. 염색 패턴에 기초하여, DAT 내에 4개의 뚜렷한 영역이 있었다. 첫번째 영역은 스캐폴드에 상당한 부피와 기계적 기밀성을 부여하는 번들을 형성하기 위해 배열된 빽빽하게 밀집된 콜라겐 섬유로 이루어진다. 이들 영역은 지방 조직에서 개별 지방 소엽을 정의하고 분리된 섬유질 조직으로부터 유래한다. 잘 정의된 소엽 구조를 갖는 유방 조직은 피하 복부 지방보다 연결 조직 함량을 더 많이 갖는다. 섬유 구역 내에서, 내강을 함유하는 영역이 확인되었고, 이들은 각각 잘 정의된 경계를 갖는다. 면역조직화학적 염색은 이들 내강이 LN과 CIV와 일치한다는 것을 나타낸다. 이들 염색 결과에 따라, 내강은 처리 동안 보존된 탈세포화된 맥관 영역을 나타낸다. 세 번째 식별가능한 영역은 비어있는 구멍을 갖는 섬유 상 콜라겐의 교직 (cross-woven) 패턴을 갖는다. 마지막 영역은 비슷하게 배열되지만, 콜라겐 섬유의 더 미세한 네트워크로 이루어지고, 더 많은 CIV 함량을 갖는다.
SEM 분석
SEM 분석은 처리된 매트릭스의 어떤 영역에서도 세포나 세포 절편이 보이지 않았기 때문에 탈세포화 프로토콜의 효과를 확인하였다 (도 1). 또한, ECM의 전체 미세 구조는 잘 보존된 다음의 처리를 나타냈다. Masson의 삼색 염색으로, DAT에서 서로 다른 매트릭스 구조의 영역들이 시각화될 수 있었다. 기계적 강도를 부여하는 섬유상 콜라겐의 두꺼운 번들이 더 미세한 네트워크형 콜라겐과 연결되어 있었다 (도 1 a, 1c). 지방 조직에서 높은 기저막 함량을 갖는 분기되고, 교직된 (interwove) 콜라겐으로만 거의 전적으로 이루어진 영역이 있었다 (도 1b). 고배율에서도, 나노 섬유 콜라겐 구조는 손상되지 않았으며, 이는 개발된 프로토콜이 매트릭스에 최소의 손상만을 초래한다는 것을 의미한다 (도 1d).
세포 파종
DAT 스캐폴드는 매트릭스에 대한 세포 부착을 최대화하기 위해 MillicellTM 필터 유닛에서 파종된다. 파종 24시간 후 조직학적 분석을 위해 보내진 샘플은 ACC가 잘 분포되어 있고, 스캐폴드 상에 잘 부착되고 확산되어 있음을 나타냈다. DAT스캐폴드의 느슨한 특성은 구성체의 상부, 중간 부분 및 하부에서 취해진 H&E 염색부분에 존재하는 세포에 의한 세포 침투를 가능하게 한다. 파종되지 않은 대조군 스캐폴드에서 세포의 존재는 없었다. 면역조직학적 염색은 또한 ASC가 단백질 LN을 발현하는 것을 나타냈다. 양성 염색된 세포는 이전에 LN을 함유하지 않는 것으로 나타났던 DAT 스캐폴드의 섬유 상 영역에서 쉽게 시각화될 수 있다. CIV 염색된 부분의 같은 시험은 파종되지 않은 대조군과 일치하는 염색 패턴에 의해 ASC가 CIV를 발현하지 않았음을 나타낸다.
유전자 발현
지방생성성 유전자 발현 연구에서, ASC가 생장 배지에서 MillicellTM 필터 유닛 내의 CA 배양되었을 때 또는 TCPS 상에서 단층 배양되었을 때의 어느 경우에도, 지방생성성 마커인 LPL, PPARγ 또는 CEBPα는 검출가능한 수준으로 검출되지 않았다 (도 5). 대조적으로, 비유도된 DAT 스캐폴드는 지방생성성 분화의 주된 조절자인 PPARγ 및 CEBPα 양자의 상대적으로 높은 발현 정도를 나타낸다[21]. 7일 동안의 지방생성성 분화 배지에서의 배양 후, 세 개의 지방생성성 마커가 모든 샘플 그룹에서 검출되었다. 그러나, 가장 높은 발현도는 DAT 스캐폴드 상에서 파종된 세포와 일관되게 관련되어 있었다 (도 5). 2차 관리 유전자로서 TrR의 포함 (결과 도시하지 않음)은 GAPDH에 대해 나타난 결과를 확인한다.
매트릭스 생성 ASC는 지방생성 중에 ECM 환경의 재조직화에 책임이 있기 때문에 [22,23], 세 개의 계열과 관련된 콜라겐의 발현을 시험하는 연구가 수행되었다 (도 6). 제I형 콜라겐은 DAT 스캐폴드, CA 및 TCPS 배양 조건에 대해 비유도 및 유도 조건에서 모두 발현되었다. 제I형 콜라겐은 종종 조골세포 계열과 연결되며, 또한 지방의 연결 조직 성분에서도 매우 높게 발현된다 [24]. 가장 전형적으로 연골 계열과 관련되는 제II형 콜라겐 [25]은 어떤 샘플에서도 발현되지 않았다. 문헌과 일치하는 결과로서, 기저막 성분 IV형 콜라겐은 모든 유도된 샘플에서 발현되었다 [26]. 흥미롭게도, IV형 콜라겐 역시 TCPS 상에서의 생장한 모든 비유도 ASC에서 발현되었다 (도 6). 대조적으로, 비유도 DAT 스캐폴드 그룹에서는 매우 낮은 발현 수준만이 발견되었고 (CIV 면역 염색 결과와 일치), 상기 유전자는 사실상 비유도 CA 샘플에서 검출할 수 없었다.
효소 활성
GPDH 효소 활성 연구 결과는 지방 형성에 대한 미소 환경의 영향에 있어서의 유전자 발현 데이터를 확증한다. 활성 레벨 정도에 대한 다수의 세포 공여자의 변동가능성으로 인해, 세 명의 다른 공여자로부터의 샘플 데이터 대신 그룹 간의 전체적인 경향을 독립적으로 고려하였다 (도 7). 국립 건강표준원에 따르면,세포 공여자 중 한 명은 과체중이고 (BMI 29.1) 두 명은 비만이다 (BMI 38.3 및 44.0). 가장 높은 활성 수준은 일반적으로 DAT 샘플에서 검출되며, 이것은 이 환경이 지방 형성이 일어나기 쉬운 환경이라는 것을 나타낸다. 일반적으로 GPDH 활성은 72시간에서 7일까지 증가하는데, 이것은 지방 성숙의 진행과 일치한다. DAT 그룹을 제외하고, 상대적으로 낮은 활성 수준이 72시간 시점에서 관측되었다. 기대한 바와 같이, 매우 낮은 활성 수준이 비유도된 TCPS 네거티브 대조군 샘플에서 두 개의 시점에서 나타났다. 시험된 실험 조건 하에서, 공여자의 BMI가 낮을수록 DAT 스캐폴드와 TCPS 포지티브 대조군에서 활성 수준은 7일째에 더 높았다. 보다 상세하게는, BMI 29.1의 샘플에 대해 GPDH 활성은 72시간 (10.7 ±3.6 mU/mg)에서 7일 (77.2 ±13.0 mU/mg)로 상승하였다. GPDH 활성은 BMI 38.3인 공여자로부터의 세포를 파종한 DAT 스캐폴드에서 72시간에서 더 높았고 (28.8 ±1.0 mU/mg), 이는 7일째에 약 2배인 56.9 ±7.3 mU/mg로 증가하였다. BMI 44.0인 세포 공여자의 세트에서는, DAT 스캐폴드의 활성 수준은 72시간에서 11.4 ± 2.7 mU/mg이고, 7일째에 29.3 ± 0.8 mU/mg였다. 일반적으로, 외인성 매트릭스를 갖지 않는 세포 응집에서 MillicellTM 필터 유닛 상에서의 ASC 배양은 TCPS 상에서의 DAT 스캐폴드 또는 단층 세포 배양에 비해 상대적으로 지방생성을 촉진하지 않았다.
토의
이 실시예는 ECM의 3차원 구조가 세포 응답을 지시하는데 중요할 것이라는 예상을 지지한다. 여기에 설명된 세포 분획의 제거는 ECM 구조에서 매우 작은 변화만을 가져오면서 본래의 매트릭스 환경을 실질적으로 보존한다. 따라서, 여기에 설명하는 방법은 조직의 분쇄 또는 콜라게나제 소화를 필요로 하는 다른 프로토콜에 비해 뛰어나다. SEM 영상은 처리된 매트릭스 내에서 미세한 네트워크형 콜라겐의 보존을 분명하게 나타낸다. 조직학적 염색 결과는 맥관 구조의 적어도 일부가 보존되어 있는 것을 나타내며, 이는 스캐폴드를 맥관화하기 위한 침투한 내피 세포의 조직화의 촉진에 매우 유리하다.
유전자 발현 결과는 탈세포화 지방 조직이 인간 ASC의 지방생성성 분화를 위해 허용적인 미소 환경을 제공한다는 점을 명확하게 나타낸다. 파종된 ASC는 증식 배지에서 배양될 때 지방생성성 마커인 PPARγ 및 CEBPα의 상대적으로 높은 발현 수준을 나타낸다는 것이 중요하다. PPARγ 또는 CEBPα는 지방생성성 분화의 주된 조절자로서 인식되어 있다 [27]. 상호 조절되고, 지방 세포에서 높은 수준으로 유지되는 이 두 개의 세포의 발현은 성숙한 표현형의 유지에 필수적인 역할을 하는 것으로 생각된다. 이들 두 개의 인자는 다른 전사 인자와, 지방생성에 필요한 단백질과 관련된 다수의 유전자를 유도한다 [28,29]. 이들 PPARγ 또는 CEBPα의 강제된 발현은 비지방생성성 섬유아세포를 유도하기에 충분한 것으로 보여진다 [28,30]. MSC가 다계열 분화 마커를 발현할 수 있지만, 그들은 전형적으로 낮은 수준에서 발현되고, 비분화 상태를 유지하기 위해 서로를 상호 조절한다 [21]. 전형적으로 다수의 자극제를 함유하는 유도성 배지는 특정 계열을 향한 분화를 촉진하고, PPARγ 또는 CEBPα을 포함하는 계열 특정 유전자 발현의 높은 수준이 관측된다 [13]. 이 경향은 현재의 실시예에 포함된 TCPS 대조군에서 분명하게 관측된다. 일반적으로, 지방생성성 유전자 발현의 최고 수준은 유도된 DAT 샘플에서 나타난다. 지방생성성 분화의 초기 마커인 리포단백질 리파제 (LPL)는 유리 지방산을 얻기 위해 모세 혈관 내에서 지방산 결합 단백질 aP2를 통해 전개되는 지방 세포로 전이될 수 있는 트리글리세라이드의 가수분해를 촉진함으로써 지방생성에서 역할을 하는 효소이다. 그 결과는, 분화 배지는 현재의 연구의 기간 내에서 모든 샘플 그룹 내에서 LPL 발현을 유도하는 것이 필요하다는 것을 나타낸다. 이후의 연구는 LPL과 같은 추가적인 지방생성 마커가 이후의 시점에서 비유도 DAT 환경에서 발현되는지 여부를 확인할 수 있을 것이다. 또한 비유도 조건 하에서, CIV는 TCPS 샘플에서 발현되지만, DAT 스캐폴드에서는 발현되지 않는다는 점 역시 흥미롭다. CIV가 풍부한 DAT 스캐폴드 환경은 CIV 합성을 억제하는 네거티브 피드백 메커니즘을 개시할 수도 있으며, 이는 I형 콜라겐 겔에서 배양된 신경아세포에 의한 CI발현에 의해 관측된 결과와 유사하다 [34]. 지방생성성 분화 배지는 모든 그룹에서 CIV 발현의 높은 수준을 유도하며, 이것은 지방생성 동안의 ECM 발현 패턴과 일치하는 것이다.
비유도 세포 응집 샘플에서 지방생성성 유전자 발현의 결여와, 유도된 샘플에서 DAT에 비해 상대적으로 낮은 유전자 발현 정도는 지방생성에 있어서 외인성 매트릭스의 중요성을 나타낸다. 필터 유닛을 사용한 방법론은 연골 배양에 있어서 통상 채용되어 왔다. 상기 기술은 보통 연골 생성의 관점에서 유리한 보다 둥근 세포 조직화를 촉진하는 것으로 알려졌다. CII 유전자 발현의 분석은 보다 더 연골과 비슷한 매트릭스의 생성을 위해 파종된 ASC를 유도하지 않는 배양 방법을 확인하기 위한 최근의 연구에 포함된다. 추가적인 연구 결과, 뼈 생성 대 지방생성의 2-D 연구에서 나타난 결과의 확장에 기반하여, 이와 같은 둥근 형태가 지방생성에 잠재적으로 유리할 수 있다 [36]. 그러나, DAT 스캐폴드의 포함은 탈세포화 매트릭스가 지방생성성 유전자 및 단백질 마커의 발현을 분명하게 증가시키고, 또한 부피 확대 용도에 있어서 중요한 변형된 (engineered) 조직에 부피감과 기계적 기밀성을 제공한다는 사실에 의해 지지된다.
GPDH 단백질 발현 연구의 결과는 DAT가 지방생성을 촉진한다는 것을 나타내는 유전자 발현 데이터를 지지한다. 탈세포화된 인간 태반을 사용한 이전의 연구 결과와 비교하여, 동일한 정의 방법을 사용하여 [20], 분화 유도 후 72시간, 7일, 14일 시점에서 5 mU/mg 미만의 평균 활성 레벨을 갖는 탈세포화된 태반으로 이루어진 구성물에서보다, DAT 스캐폴드에서 더 높은 GPDH 활성 수준이 관측되었다. 이 비교는 지방 세포와 태반의 ECM은 농도과 분포가 다른, 동일한 콜라겐 형을 함유하기 때문에 ECM 조성과 구조 모두가 세포 응답의 지시에서 중요한 역할을 한다는 것을 지지한다 [15].
또한 GPDH 데이터는 관측된 세포 응답에서 세포 공여자의 다양성의 영향을 강조한다. 동일한 경향이 세 개의 다른 공여자에 대해 다양한 배양 조건 간에서 관측되지만, 응답의 크기는 크게 변화했다. 연구된 세 명의 공여자에 대해, GPDH 활성 및 공여자 BMI 간의 역비례 관계가 있다. 이 결과는 비만이 인슐린 내성의 발전과 관련이 있다는 지식과 일치한다 [37,38]. 연재의 연구에서 사용된 유도 배지는 인슐린과 인슐린 민감화 시약인 트로글리타존을 모두 포함한다. 더 비만한 공여자로부터의 ASC가 이들 자극의 유도 효과에 대해 보다 더 저항이 클 가능성이 매우 높다. 이 사실은 자가조직 또는 동종성 ASC를 이용하는 보편적인 지방 조직 공학 전략 개발의 관점에서 중요한 의미를 갖는다. 추가적인 연구에 의해, 지방생성성 분화 능력에 있어서의 이들 개별적 제한을 극복할 수 있는 전략이 개발될 수도 있다. 현재의 연구에서 관측되는 일관된 경향은 세포 제공원에 관계없이 지방 형성에 유리한 미세환경을 구축하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 2
여기에 설명된 탈세포화된 지방 조직 (DAT)이 DAT 스캐폴드 상에 부착 세포를 위한 배양 기질로서, 더 구체적으로는 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)의 DAT 스캐폴드 상의 부착 및 증식을 위해 사용되었다. 도 8 (a) 및 (b)의 결과는 공초점 현미경에 의한 시각화를 용이하게 하기 위해 CellTrackerTM 그린 (인비트로겐) (흰색으로 도시)으로 표지된 ASC 및 아민 반응성 알렉사 플루오르 350 카르복실산 숙신이미딜 에스테르 (인비트로겐)로 표지된 DAT (회색으로 표시)를 나타낸다. 도 8(a)와 (b)는 저산소 조건 (5% O2, 37 ℃)에서 7일 동안 배양된 DAT (200mg) 상에 파종된 1x106 ASC 및 DAT (200 mg) 상에 파종된 2.5x106 ASC 의 대표 이미지를 각각 나타낸다. 도 8(c) 는 전체 DNA 함량에 대해 측정된 DAT 스캐폴드 상의 AS증식의 PicoGreen? (인비트로겐) 분석을 나타낸다. DAT 스캐폴드 (200 mg)는 1x106 ASC (2계대)로 파종되고, 정치 조건 (흰색 막대) 또는 세포 확산을 촉진하기 위한 관류 바이오 리액터 시스템 (회색 막대) 하에서 (배지 유속 =1.5mL/분) 증식 배지에서 배양되었다. 데이터는 두 개의 조건 하에서의 증식과 일치하지만, 관류 바이오 리액터 시스템에서 더 높은 세포 밀도가 얻어진다는 것을 나타낸다.
실시예 3
피하 이식 모델 내에서의 탈세포화된 지방 조직 (DAT)의 예비적인 생체 내 연구가 수행되었다. 캐나다 동물 관리 협회 (CCAC)의 가이드 라인을 준수하였다. 모든 작업은 퀸스 유니버시티의 보테렐 홀 내의 동물 취급 시설 내에서 수행되었다. 이 작업에 대한 동물 보호 프로토콜은 퀸스 유니버시티 동물 관리 위원회 (UACC)에 의해 검토되고, 승인되었다.
도 9(a) 내지 (f)는 조직학 및 현미경 데이터를 나타낸다. 이 연구에서 (i) DAT 스캐폴드 (50 mg), 및 (ii) 수컷 위스타 래트로부터 분리된 1 x 106 지방 유래 줄기 세포 (ASC)로 파종된 (이식 24시간 전에) DAT 스캐폴드 (50 mg)가 암컷 위스타 래트의 등 피하 공간에 이식되었다 (도 9(a)). 각각의 래트들은 두 개의 파종되지 않은 DAT 스캐폴드와 두 개의 ASC 파종된 DAT 스캐폴드를 각각 이식받았다. 이식 후 4일 째, 7일째 및 14일째에, 동물들은 인도적으로 희생되었고, DAT 스캐폴드가 외식되었다. 육안으로 볼 때, DAT 스캐폴드의 부피는 모든 시점에서 모든 그룹에서 잘 보존되었으며, 이식 맥관화 (implant vascularization)의 증거가 있었다. 도 9(b)는 4일째 (상부) 및 14일째 (하부)의 이식 표면 상의 가시적인 혈관을 갖는 ASC 파종된 DAT 스캐폴드의 이미지를 나타낸다. 도 9(c)는 이식 부피의 거시적 보존을 나타내는 14일째에서 파종되지 않은 DAT 스캐폴드의 대표적인 H&E 이미지를 나타낸다 (R = 래트 조직; C =섬유상 캡슐; D = DAT 스캐폴드; 막대 = 100 ㎛). 조직학적 결과는 각 그룹에서 강한 면역원성 반응의 증거 없이 통상의 상처 치유를 나타낸다. 시간 경과에 따라, 숙주 반응은 통상의 상처 치유에서와 같이 사라지고, 각 그룹에서 4일에서 14일 사이에 섬유 상 캡슐의 혈관 농도 및 두께에서 점진적인 감소가 나타났으며, 이것은 DAT가 숙주에게로 통합되었음을 나타낸다. 도 9(d)는 이식 후 14일에서 파종되지 않은 DAT의 대표적인 SEM 현미경 사진으로 (막대 = 500㎛), 상대적으로 가는 섬유 캡슐 (C)과 숙주 조직 (R)과의 양호한 통합을 나타낸다. 파종되지 않은 DAT (도 9(e))와 ASC 파종된 DAT (도 9(f))의 중앙 영역의 H&E 염색은 ASC 파종된 DAT 스캐폴드에서 더 높은 세포충실도 (cellularity)를 갖는 세포 침투를 나타낸다 (막대 = 20㎛).
실시예 4
탈세포화된 지방 조직 (DAT)와 하이드로겔 (광 가교화가능한 메타크릴레이트 콘드로이틴 설페이트)로 이루어지는 두 개의 상의 복합 스캐폴드의 예비적인 연구가 수행되었다. 도 10은 대표적인 실시 형태를 나타낸다. 복합 콘드로이틴 설페이트 + 탈세포화된 지방 조직 (CS + DAT) 스캐폴드가 몰드 (6 mm x 8 mm) 내에서 제조되고, EFOS 3000 광원을 사용하여 10 mW/cm2 의 강도에서 320-380 nm UV 광으로 가교되었다. 복합 스캐폴드는 몰드에 의해 정의되는 부피와 형태를 갖고, 연성 조직과 유사한 거시적인 기계적 특성을 갖는다.
실시예 5
이 실시예에서는, 에어젯-액적 기술을 이용하여 탈세포화된 지방 조직 (DAT)로부터 구형 마이크로캐리어가 제조되었다. 이 실시예에서 사용된 방법은 도해적으로 도 11(a) 및 도 11 (b)에 도시된다. 간략하게는, 가용화된 DAT 가 일시적으로 기공유도물질 (알긴산)으로 안정화되고, 복합 비드가 가교되고, DAT-기반 마이크로캐리어를 얻기 위해 기공유도물질이 추출된다. 대표 SEM 사진 (도 11의 아래쪽 세 개의 패널)은 구형 DAT-기반 마이크로캐리어의 거시도 (왼쪽), DAT-기반 마이크로캐리어의 미소 공성 (microporous) 표면 (가운데), DAT-기반 마이크로캐리어의 내부 미세 구조 (오른쪽)을 나타낸다.
도 12(a) 내지 (e)는 광학 현미경에 의한 수화된 DAT-기반 마이크로캐리어의 형태와 DAT-기반 마이크로캐리어의 주입성 (injectability)을 나타낸다. 도 12(a)는 수화된 DAT-기반 마이크로캐리어를 나타낸다. 도 12 (b)는 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)로 파종되고 스피너 플라스크 시스템 하에서 28일간 동적 조건 하에서 배양된 DAT-기반 마이크로캐리어를 나타낸다. 마이크로캐리어는 배양 기간 전체 동안 관측가능한 저하 없이 세포 부착을 촉진시키고 뛰어난 기계적 기밀성을 나타낸다. 도 12(c)는 인간 ASC로 파종되고 (동적 배양 28일 후), 약 1cm3의 부피로 충전된 DAT-기반 마이크로 캐리어의 거시적 응집을 나타낸다. 도 12(d)는 최소 유량으로 18게이지 바늘을 갖는 주사기에 마이크로캐리어를 충전한 것을 나타낸다. 도 12(e)는 18게이지 피하 주사기를 통해 압출된 후의 마이크로캐리어를 나타낸다. DAT-기반 마이크로캐리어는 바늘을 통해 용이하게 압출되고 광학 및 SEM 영상을 사용하여 평가했을 때 비드 크기나 형태에서 검출가능한 변화나 손상의 가시적 징후 없이 잘 보존되었다. 주사 위치에 따라, 압출된 마이크로캐리어는 단층을 형성하거나 또는 더 큰 부피로 응집할 수 있다.
동적 스피너 플라스크 시스템에서 14일간 배양된 DAT-기반 및 젤라틴-기반 마이크로캐리어 상에서의 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)의 세포 증식이 피코 그린 분석 (인비트로겐)을 사용하는 전체 DAT 함량에 대해 정량화되었다. 도 13에서, 데이터는 삼중 샘플에서의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 동일한 방법을 사용하여 제조된 젤라틴 제어 마이크로캐리어보다 DAT- 기반 마이크로캐리어에서 더 높은 세포 증식이 나타났다.
전체 세포 내 단백질 함량에 대해 정규화된 평균 글리세롤-3-포스페이트 (GPDH) 효소 활성이 인간 지방 유래 줄기 세포 (ASC)로 파종되고, 지방생성성 배지에서 배양된 DAT-기반 마이크로캐리어와 젤라틴 (G)-기반 마이크로캐리어 및 세포 배양 폴리스티렌 (TCPS) 대조군에 대해 측정되었다. 도 14의 데이터에서 오차 막대는 삼중 샘플에서의 표준 편차를 나타낸다. 데이터는 DAT-기반 마이크로캐리어가 동일한 방법을 사용하여 제조된 젤라틴-기반 마이크로캐리어에 비해 상대적으로 더 강한 지방생성성 응답을 촉진한다는 것을 나타낸다.
균등물
본 발명이 예시적인 실시의 형태에 대해 설명되었지만, 본 발명의 범위 내에서 실시의 형태에 대한 다양한 변형이 가능하다는 것이 이해되어야 한다. 따라서 여기에 설명한 실시의 형태는 단지 예시적인 것으로 고려되어야 하며, 본 발명은 그에 의해 제한되지 않는다.
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Claims (43)

  1. 지방 조직의 탈세포화 방법으로서,
    상기 지방 조직이 하나 이상의 효소를 함유하는 효소 소화 용액에서의 1회 이상의 배양 및 1회 이상의 용매 추출을 거치는 것을 포함하며;
    잘 보존된 3차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 지방 조직이 얻어지는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 극성 용매, 하나 이상의 비극성 용매 또는 그들이 조합의 사용을 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 기계적 파쇄와 관련된 하나 이상의 단계를 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 효소를 함유하는 효소 소화 용액 및/또는 하나 이상의 극성 용매 추출 용액을 상기 지방 조직 안으로 관류하는 것을 더 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  5. 제4항에 있어서, 동맥 및/또는 정맥의 삽관에 의한 지방 조직 관류를 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  6. 제1항에 있어서, 세정 버퍼로 1회 이상 세정하는 것을 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  7. 제3항에 있어서, 기계적 파쇄와 관련된 하나 이상의 단계는 냉동-해동 사이클 또는 교반, 또는 그들의 조합을 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  8. 제7항에 있어서, 1회 이상의 냉동-해동 사이클은 저장액 또는 고장액에서 수행되는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    (i) 지방 조직을 냉동 버퍼에서 1회 이상의 냉동-해동 사이클을 거치도록 하는 단계;
    (ii) 지방 조직을 효소 소화시키는 단계;
    (iii) 지방 조직을 1회 이상의 극성 용매 추출시키는 단계;
    (iv) 지방 조직을 세정 버퍼로 세정하는 단계;
    (v) 지방 조직을 효소 소화시키는 단계;
    (vi) 지방 조직을 세정 버퍼로 세정하는 단계;
    (vii) 지방 조직을 효소 소화시키는 단계;
    (viii) 지방 조직을 세정 버퍼로 세정하는 단계;
    (ix) 지방 조직을 극성 용매 추출하는 단계; 및
    (x) 지방 조직을 세정 버퍼로 세정하는 단계를 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화된 지방 조직은 실질적으로 비손상 지방 세포가 전혀 없는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  11. 제1항에 있어서, 지방 조직의 면역원성 성분을 실질적으로 제거하는 것을 포함하는 것인 지방 조직의 탈세포화 방법.
  12. 잘 보존된 삼차원 구조를 갖는 세포외 매트릭스를 포함하는 탈세포화된 지방 조직.
  13. 제12항에 있어서, 얻어진 탈세포화된 지방 조직은 실질적으로 비손상 지방 세포가 전혀 없는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  14. 제12항에 있어서, 얻어진 탈세포화된 지방 조직은 실질적으로 면역원성 성분을 갖지 않는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  15. 제12항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스는 섬유상 및 네트워크형 콜라겐의 조합을 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  16. 제12항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스는 IV형 콜라겐을 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  17. 제12항에 있어서, 상기 세포외 매트릭스는 하나 이상의 I형 내지 III형, V형 및 VI형 콜라겐을 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  18. 제12항에 있어서, 라미닌, 피브로넥틴 또는 이들 모두를 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  19. 제12항에 있어서, 하나 이상의 프로테오글리칸, 당단백질 또는 글리코사미노글리칸 또는 그들의 조합을 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  20. 제12항에 있어서, 하나 이상의 생장 인자를 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  21. 제12항에 있어서, 탄성 섬유 및/또는 엘라스틴을 포함하는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  22. 제12항에 있어서, 세포 배양 기질용인 것인 탈세포화된 지방 조직.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포 배양은 세포 확장 및/또는 세포 분화 및/또는 조직 및 하나 이상의 단백질을 포함하는 생물자원 제조용인 것인 탈세포화된 지방 조직.
  24. 제22항에 있어서, 상기 세포는 정치 배양 및/또는 바이오 리액터 시스템 내에서 생체 외 배양되는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  25. 제22항에 있어서, 상기 세포는 생체 내에서 배양되는 것인 탈세포화된 지방 조직.
  26. 제1항의 방법에 의해 제조되는 탈세포화된 지방 조직.
  27. 제12항의 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조된 바이오 스캐폴드.
  28. 제27항에 있어서, 외과 수술용인 것인 바이오 스캐폴드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 외과 수술은 일반 외과 수술, 재건 수술, 미용 성형 수술, 심장 수술, 정형외과 수술, 신경외과 수술, 비뇨기과 수술 또는 산부인과 수술인 것인 바이오 스캐폴드.
  30. 제27항에 있어서, 상기 바이오 스캐폴드는 상처 치료용으로 사용되는 것인 바이오 스캐폴드.
  31. 제27항에 있어서, 상기 바이오 스캐폴드는 지혈제로서 사용되는 것인 바이오 스캐폴드.
  32. 제27항에 있어서, 상기 바이오 스캐폴드는 하나 이상의 부가 재료를 포함하는 것인 바이오 스캐폴드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 하나 이상의 부가 재료는 탈세포화 매트릭스, 천연 유래 재료, 합성 재료, 약학적 조성물, 호르몬, 생장 인자 및 그들의 조합으로부터 선택되는 것인 바이오 스캐폴드.
  34. 제27항에 있어서, 상기 바이오 스캐폴드는 자가조직성 또는 동종조직성인 것인 바이오 스캐폴드.
  35. 제27항에 있어서, 상기 바이오 스캐폴드는 외인성인 것인 바이오 스캐폴드.
  36. 제12항의 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조된 코팅.
  37. 제12항의 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조된 마이크로캐리어 비드.
  38. 제36항의 코팅을 포함하는 마이크로캐리어 비드.
  39. 제37항에 있어서, 세포 및/또는 약물 및/또는 생장 인자 전달 비히클로서 사용되는 것인 마이크로캐리어 비드.
  40. 제37항에 있어서, 성형 수술 또는 재건 수술에서 소량 벌킹제로서 사용되는 것인 마이크로캐리어 비드.
  41. 제37항에 있어서, 탈세포화된 지방 조직을 갖는 복합 바이오 스캐폴드의 제조에 사용되는 것인 마이크로캐리어 비드.
  42. 제12항의 탈세포화된 지방 조직으로부터 제조된 입자.
  43. 제36항의 코팅을 포함하는 입자.
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