CN110215539B - 一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质及其制备方法，该凝胶基质由脂肪垫组织基质、β‑环糊精接枝ε‑聚赖氨酸、胆红素和水组成。该凝胶基质可以用于胰岛细胞移植，提高其移植成功率。本发明对胰岛细胞移植提供了一种新基质，其通过优化比例提供移植后的物理支撑，减少胰岛细胞因免疫、炎症反应造成的细胞损失，促进移植部位的血管化，并且维持了体内胰岛细胞的活性和功能。该凝胶基质克服现有基质无法满足移植要求的技术瓶颈，提供一种具有维持胰岛细胞活力和力学支撑作用的新型凝胶基质，为胰岛细胞移植后发挥作用提供最佳的理化和生物学微环境，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术和生物医药领域，特别涉及一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质及其制备方法。

背景技术

1型糖尿病是以胰岛素产生功能减退或完全丧失为特点的慢性代谢疾病。该疾病多发于青少年，患者易发生酮症酸中毒，甚至危及生命。1型糖尿病患者需要长期注射胰岛素来控制血糖。但是，患者即便使用胰岛素，其血糖波动也较大。目前,胰腺移植是治疗该疾病的有效手段，但胰腺移植费用昂贵、成功率较低,且胰腺来源短缺。胰岛细胞移植能重建患者胰腺功能,移植后患者可减少胰岛素使用或者完全停用胰岛素。但是，胰岛细胞在移植后容易发生细胞移位，且营养成分的缺少导致移植成功率低。更为重要的是，胰岛细胞内抗氧化系统差，在移植后易由于缺氧、炎症、氧化应激等原因造成细胞损伤，引起细胞存活率低、胰岛分泌功能差。因此，如何构建适宜的胰岛细胞移植微环境，以提高胰岛细胞的存活率并维持其功能性，是实现胰岛细胞移植的关键。

脂肪垫组织基质是通过脱细胞技术获得的脂肪组织的细胞外基质。研究发现脂肪垫组织基质可以通过上调组织中的VEGF和bFGF表达，促进新生血管的形成，实现慢性创面的修复。但是脂肪垫组织基质的凝胶性能较差，不适宜于细胞移植。ε-聚赖氨酸是由25-35个赖氨酸残基通过α-ε酰胺键连接而成的具有抑菌活性的L-赖氨酸聚合物。由于其抑菌活性强、安全性好、易溶于水、耐酸碱能力强、耐热等特点，ε-聚赖氨酸在食品、医药和生物工程领域都有广泛应用。近年来研究发现，ε-聚赖氨酸具有较好的凝胶特性和生物相容性，可以作为治疗因子的局部给药载体。ε-聚赖氨酸可以通过化学修饰改善其凝胶性能和载药性能。目前，尚无ε-聚赖氨酸与脂肪垫组织基质作为混合凝胶基质用于细胞移植的相关报道。

胆红素是血红素加氧酶催化血红素代谢的产物，20世纪研究发现胆红素具有抗氧化抗炎的作用，可以靶向体内活性氧丰富的组织，临床研究也发现胆红素水平与一系列活性氧相关的疾病呈负相关。但是由于胆红素的水溶性极差，且稳定性低，具有显著的神经毒性，关于其在医学应用中的制剂化研究鲜有报道。利用环糊精与胆红素的相互作用，构建胆红素给药体系尚未见报道。

发明内容

为了解决背景技术中所在的问题，本发明的目的是提供一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质及其制备。该凝胶基质适宜于胰岛细胞存活的细胞微环境，从而明显提高胰岛细胞存活率，克服传统胰岛细胞移植后存活率低的难题，在移植后长期保持细胞的高活性和高功能性，用于糖尿病的胰岛细胞移植。

为实现上述目的，本发明的第一个方面是提供一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质。其技术方案是：所述凝胶基质包括有脂肪垫组织基质、β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸、胆红素和水。

进一步设置是凝胶基质中各组分的质量百分含量为：脂肪垫组织基质1～10％，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸2～8％，胆红素0.005～0.8％，其余为水。

进一步设置是凝胶基质中各组分的质量百分含量为：脂肪垫组织基质3～5％，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸4～6％，胆红素0.05～0.2％，其余为水。

进一步设置是凝胶基质中各组分的质量百分含量为：脂肪垫组织基质4％，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸5％，胆红素0.1％，其余为水。

进一步设置是所述的脂肪垫组织基质是通过脱细胞技术从脂肪组织中提取而来，该脂肪组织为腹股沟脂肪垫、乳腺脂肪垫、膝关节脂肪垫中的一种或几种组合。

进一步设置是所述的β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸，接枝率在10％～50％。

本发明还提供一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将胆红素溶于三氯甲烷获得胆红素溶液，将β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸溶于水中得到β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液，将胆红素溶液加入β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液中，超声乳化后，除去有机试剂，得到胆红素/β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液；

(2)将脂肪垫组织基质加入步骤(1)所得到的胆红素/β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液，搅拌均匀，制成用于胰岛细胞移植的凝胶基质。

本发明的所述凝胶基质在可应用于胰岛细胞移植混合物的制备。每毫升所述凝胶基质可用于制备包含0.5×10⁵～2×10⁷个胰岛细胞的移植混合物。所述胰岛细胞移植包括腹部脂肪垫移植、皮下移植、肾包膜下移植、肝门静脉移植。

本发明基于脂肪垫组织基质、β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸、胆红素形成的超分子凝胶结构，用于胰岛细胞移植，以搭建适宜胰岛细胞生存的移植微环境，促进新生血管生成，拮抗移植后的炎症反应和细胞损伤，提高胰岛细胞移植成功率，关于该方面的文献尚未见报道。

本发明技术方案中脂肪垫组织基质和β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸作为凝胶材料，胆红素具有细胞保护作用，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸作为药物载体和凝胶基质材料，脂肪垫组织基质作为凝胶基质材料和促血管生成材料。

每个组分基本都是双功能的，然后相互协同的，脂肪垫组织基质和β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸组成了凝胶，脂肪垫组织基质自身具有促进血管化，为细胞提供营养；β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸可以调节单纯的脂肪垫组织基质的凝胶性质，也可包载难溶性药物；胆红素自身具有抗氧化和抗炎作用，可以提高细胞移植初期的细胞生存率和功能性。

本发明通过改变组分比例，可以提供胰岛细胞适宜的物理支撑和生物学微环境，促进局部血管再生并降低移植后炎症反应。

本发明的用于胰岛细胞移植的凝胶基质生物相容性好，能够吸附小鼠胰岛细胞减少细胞移位损失，在移植后维持胰岛细胞的高活性和胰岛细胞分泌功能，并且该凝胶基质还有天然防腐作用，便于保存使用。临用前，可直接与胰岛细胞混合用于体内的胰岛细胞移植。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述。

实施例1制备用于胰岛细胞移植的凝胶基质

按照表1的各实验组和对照组的组成，称取各组分，将胆红素溶于三氯甲烷，将β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸溶于去离子水中，将胆红素溶液加入β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液中，超声乳化后，搅拌后旋转蒸发除去有机试剂，得到胆红素/β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液。将脂肪垫组织基质加入胆红素/β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液，搅拌均匀，即得胰岛细胞移植的凝胶基质。γ-射线辐照灭菌后，密闭保存，移植前加入胰岛细胞混悬液即可。

表1用于胰岛细胞移植的凝胶基质的组成

注：缺项对照组1-3中“/”代表该组分为0。替换对照组1：以胰腺组织基质代替脂肪垫组织基质，其质量百分含量为4％。替换对照组2：以肌肉组织基质代替脂肪垫组织基质，其质量百分含量为4％。替换对照组3：以ε-聚赖氨酸和β-环糊精物理混合物(质量比为3:2)代替β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸，其质量百分含量为5％。替换对照组4：以ε-聚赖氨酸代替β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸，其质量百分含量为5％。替换对照组5：以β-环糊精代替β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸，其质量百分含量为5％。替换对照组6：以胆绿素代替胆红素，其质量百分含量为0.1％。替换对照组7：以血红蛋白代替胆红素，其质量百分含量为0.1％。

实验例在体评价各组胰岛细胞移植用水凝胶应用效果

(1)小鼠糖尿病模型的建立

应用链脲佐菌素制备小鼠I型糖尿病模型：造模前小鼠禁食不禁水，按体重单次腹腔注射链脲佐菌素55mg/kg，1周后小鼠表现多饮、多食、多尿和体重减轻，血糖值≥13.88mmol/L。

(2)胰岛细胞凝胶基质的准备

将350±50IEQ胰岛混悬至实施例1中各实验组胰岛细胞移植用凝胶基质。

(3)小鼠糖尿病模型肾被膜下胰岛细胞移植

糖尿病小鼠术前15min皮下注射50μL头孢唑啉钠(浓度：50mg/mL)，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，固定小鼠，剃去腹部毛发，用酒精消毒手术野，暴露小鼠肾脏，移植前将胰岛再次混悬，在体视显微镜下推注胰岛至肾被膜下，推注完毕，用棉签和止血棉花压迫出血点约1-2min，观察无出血后，关闭腹腔，并注射2mL生理盐水补液。

(4)移植后小鼠糖尿病模型疗效评价

①组织病理检查相关炎症指标：取移植后3d每组3只受体鼠尾静脉血的血清，用ELISA法测IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-1β等，染色观察炎症细胞浸润情况。

②新生微血管的评价：石蜡或冰冻切片，用鼠抗人CD31单克隆抗体，免疫组织化学染色试剂盒；用改进的Weidner方法计数微血管密度(MVD)。

③移植后β细胞活性评价：应用Tunnel原位末端标记法检测β细胞凋亡和增生情况。

④胰岛功能评价：移植起效后，在移植后第四周测定各组大鼠的口服糖耐量试验：灌胃葡萄糖溶液后定期测定尾静脉血糖，并同时收集尾静脉血，分离血清，评价胰岛素的分泌、C肽含量。

⑤一般疗效评价：检测移植前后大鼠饮食、体重、血糖等指标变化情况。

基于以上结果，采用双盲法评价各组水凝胶的应用效果，给出评分(每个单项20分，满分100分)，分数越高代表综合效果越好。

实验结果：胰岛细胞移植用水凝胶的实验结果见表3。从表3数据可见，各个实验组炎症指标、新生微血管、β细胞、胰岛功能、一般疗效等指标良好，验证了实验组对于大鼠胰岛细胞移植具有良好的作用效果。各对照组中，炎症指标、新生微血管、β细胞、胰岛功能、一般疗效等指标很差，综合评分明显区别于实验组结果。由上可知，各实验组对于大鼠胰岛细胞移植具有良好的作用效果，可以作为胰岛细胞移植的水凝胶。

表3各组胰岛细胞移植用水凝胶的应用效果

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质，其特征在于：所述凝胶基质为超分子凝胶结构，

凝胶基质中各组分的质量百分含量为：脂肪垫组织基质1~10%，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸2~8%，胆红素0.005~0.8%，其余为水;

所述的β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸，接枝率在10%~50%。

2.根据权利要求1所述的一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质，其特征在于：凝胶基质中各组分的质量百分含量为：脂肪垫组织基质3~5%，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸4~6%，胆红素0.05~0.2%，其余为水。

3.根据权利要求2所述的一种用于胰岛细胞移植的凝胶基质，其特征在于：凝胶基质中各组分的质量百分含量为：脂肪垫组织基质4%，β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸5%，胆红素0.1%，其余为水。

4.根据权利要求1所述的用于胰岛细胞移植的凝胶基质，其特征在于：所述的脂肪垫组织基质是通过脱细胞技术从脂肪组织中提取而来，该脂肪组织为腹股沟脂肪垫、乳腺脂肪垫、膝关节脂肪垫中的一种或几种组合。

5.一种如权利要求1所述的用于胰岛细胞移植的凝胶基质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将胆红素溶于三氯甲烷获得胆红素溶液，将β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸溶于水中得到β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液，将胆红素溶液加入β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液中，超声乳化后，除去有机试剂，得到胆红素/β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液；

（2）将脂肪垫组织基质加入步骤（1）所得到的胆红素/β-环糊精接枝ε-聚赖氨酸水溶液，搅拌均匀，制成用于胰岛细胞移植的凝胶基质。

6.一种如权利要求1~4之一所述的凝胶基质在制备胰岛细胞移植混合物的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的胰岛细胞移植混合物中每毫升所述凝胶基质可用于制备包含0.5×10⁵～2×10⁷个胰岛细胞的移植混合物。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述胰岛细胞移植混合物的移植部位包括腹部脂肪垫、皮下、肾包膜下、肝门静脉。