CN104548207A

CN104548207A - 一种猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法

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Publication number: CN104548207A
Application number: CN201510014130.5A
Authority: CN
Inventors: 吕青; 谭秋雯; 张迪; 熊炳钧; 范雪娇; 杨志明
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-01-12
Also published as: CN104548207B

Abstract

本发明公开了一种制备猪脂肪组织无细胞基质材料的方法，包括如下步骤：(1)取新鲜猪皮下脂肪，清洗，剪碎，加水或者生理盐水，匀浆，离心，得沉淀，PBS溶液或水漂洗；(2)将沉淀粉碎，用SDS溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，离心，得沉淀；(3)将沉淀用异丙醇溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，即可。本发明方法制备的脱细胞基质材料脱细胞彻底，免疫原性低，生物相容性好，制备方法简单，成本低廉，具有较好的应用前景。

Description

一种猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法及其用途，属于生物材料领域。

背景技术

近几十年来我国女性乳腺癌发病率持续飙升，目前已成为我国妇女第一大恶性肿瘤，同时由于皮肤软组织肿瘤、外伤、先天畸形、深度烧伤后及慢性溃疡等疾病也会造成不同程度软组织缺损，直接影响患者的外形美观乃至功能，对患者的生活质量造成直接的影响；加之人体形体的美学再塑需求旺盛：根据美国整形外科医师协会统计，2012年美国共进行28.6万次隆乳术，在全美整形术中排名第一；而软组织填充以200万次在微整形术中排名第二。可见理想的软组织缺损修复材料市场需求巨大。根据BCC2012年1月发布的报告显示，全球对组织工程和再生医学相关医用产品的市场在2011年达到598亿美元，2016年预计能达到897亿美元，复合年增长率(Compounded annual growth rate,CAGR)为8.4％。而BCC发布的报告称2011年全球对整形相关材料的市场在240万公吨，而2016年预计将达到460万公吨，复合年增长率为13.8％。

脂肪组织是软组织缺损修复重建，特别是女性乳房修复重建理想的填充物，但我国组织工程产业化总体正处于临床前研究阶段，研究产品多集中于骨、软骨、皮肤、角膜等，脂肪等软组织领域研究相对滞后，但是需求持续增长，因此具有广阔的发展空间和市场需求。

然而，因脂肪组织上具有多种免疫原性物质，直接用于机体会产生强烈的免疫反应，副作用强，需要采用脱细胞方法脱去其免疫原性物质。

脱细胞的方法包括物理法、化学法、酶法，化学法包括酸碱处理、非离子去垢剂处理、离子去垢剂处理、两性离子去垢剂助理、三磷酸盐处理、低渗和高渗液处理、螯合剂处理。其中，物理法和化学法中的非离子去垢剂吹了、低渗和高渗液处理较为温和，对细胞外基质的影响较小，但是脱细胞不彻底；化学法中离子去垢剂可以有效脱细胞，但是对细胞外基质有影响；而酶法处理可以有效脱细胞，且对细胞外基质的影响较小，但是存在价格昂贵，成本高，难以工业应用的缺陷。

由于脂肪组织的特殊性，目前报道的脂肪脱细胞方法均采用了胰酶、DNA酶来处理，可以有效脱细胞和维持细胞外基质的结构，但是酶的价格昂贵，导致生产成本太高，难以大工业应用，同时，整个处理时间过长，通常需要处理5天或更长时间。

急需一种成本低廉、处理时间短的脱细胞方法，制备脂肪组织无细胞基质制备方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备猪脂肪组织无细胞基质材料的方法。

本发明制备猪脂肪组织无细胞基质材料的方法，包括如下步骤：

(1)取新鲜猪皮下脂肪，清洗，剪碎，加水或者生理盐水，匀浆，离心，得沉淀，PBS溶液或水漂洗；

(2)将沉淀粉碎，用SDS溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，离心，得沉淀；

(3)将沉淀用异丙醇溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，即可。

漂洗：是指用水或者溶液反复洗涤。

步骤(1)中，剪碎至大小为(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm。

优选地，剪碎至大小为1cm×1cm×1cm。

步骤(1)中，匀浆前，所述水或生理盐水的用量为皮下脂肪体积的0.5～2倍。优选地，所述水或生理盐水的用量为皮下脂肪体积的1倍。

步骤(1)中，所述匀浆的转速为10000～15000rpm，时间为3～7min。优选地，所述匀浆的转速为12000rpm，时间为5min。

步骤(1)中，所述离心的转速为3000～4000rpm，时间为3～7min。优选地，所述离心的转速为3500rpm，时间为5min。

步骤(2)中，所述粉碎是球磨粉碎，球磨的转速为2000～3000r/s，时间为3～7min。优选地，所述球磨的转速为2500/s，时间为5min。

步骤(2)中，所述SDS溶液的浓度为0.25％～1％。

优选地，所述SDS溶液的浓度为0.5％。

步骤(2)中，所述SDS溶液漂洗的时间为2～6h。

优选地，所述SDS溶液漂洗的时间为4h。

步骤(3)中，所述异丙醇溶液的浓度为80～100％。

优选地，所述异丙醇溶液的浓度为100％。

步骤(3)中，所述异丙醇溶液的漂洗时间为1～3h。

优选地，所述异丙醇溶液的漂洗时间为2h。

本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的猪脂肪组织无细胞基质材料。

本发明人通过研究发现，本发明采用SDS溶液、异丙醇溶液，在特定工艺条件下，结合特定的前处理步骤，在有效脱细胞的同时，可以有效维持基质材料的三维结构和多孔结构，孔径平均大小为61.16um，可用于体内修复，取得了意料不到的技术效果。

本发明方法制备的猪脂肪组织无细胞基质材料脱细胞彻底，三维结构良好，同时，本发明使用的试剂便宜，整个工艺时间仅仅10h左右，生产成本低廉，工业应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1脱细胞鉴定。a HE染色：猪脂肪组织(100X)；b：DAPI染色：猪脂肪组织(100X)；c：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料(100X)；d本发明猪脂肪组织无细胞基质材料(200X)；

图2脱脂程度鉴定。a：猪脂肪组织(100X)；b：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料(100X)；

图3扫描电镜。a：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料；b：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料；c：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料胶原纤维完整，无断裂。

图4天狼星红染色。a：天狼星红染色100X；b天狼星红染色200X；

图5实验方法。a：术前备皮；b：示皮下筋膜腔；c：水化完全的本发明猪脂肪组织无细胞基质材料；d：缝合皮肤；

图6本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的体内降解。a：皮下植入3天；b：皮下植入1周；c：皮下植入2周；d：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料皮下植入4周；e：各观察时间点本发明猪脂肪组织无细胞基质材料横径变化；

图7免疫组织化学染色。a：本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入3天，材料周边(200X)；b:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入3天，材料中央(200X)；c:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入1周，材料周边(200X)；d:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入1周，材料中央(200X)；e:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入2周，材料周边(200X)；f:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入2周，材料内部(200X)；g:4周，材料内部(200X)：h：4周，材料内部(200X)；

图8CD68阳性细胞计数观察；

图9组织标本制作方法流程图；

图10切片脱蜡和水化过程流程图；

图11HE染色流程图；

图12DAPI染色流程图；

图13新鲜脱细胞基质冰冻切片的制备流程图；

图14天狼星红染色流程图。

具体实施方式

实施例1本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法

1、制备方法

(1)取新鲜皮下脂肪，使用生理盐水漂洗，去除脂肪表面血迹及其他杂质；

(2)将脂肪组织剪碎至1cm×1cm×1cm大小，脂肪组织与生理盐水按体积比1:1进行匀浆(12000rpm，5min)。将匀浆后获得的溶液以3500rpm，5min进行离心，弃掉上层油脂；

(3)将离心获得的下层材料使用PBS溶液漂洗后球磨仪打粉(2500r/s，5min)；

(4)室温下使用0.5％SDS溶液漂洗粉末状材料4h，大量PBS溶液漂洗至无泡沫，离心(3500rpm，5min)；

(5)100％异丙醇溶液漂洗粉末状材料2h脱脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料无异味，即可。

制备粉末状材料后，可将粉末放入不同的模具中，冻干制成不同形状的猪脂肪组织源性无细胞基质材料，包装后环氧乙烷消毒。

实施例2本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法

1、制备方法

(1)取新鲜皮下脂肪，使用水漂洗，去除脂肪表面血迹及其他杂质；

(2)将脂肪组织剪碎至0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，脂肪组织与生理盐水按体积比1:0.5进行匀浆(10000rpm，3min)。将匀浆后获得的溶液以3000rpm，3min进行离心，弃掉上层油脂；

(3)将离心获得的下层材料使用PBS溶液漂洗后球磨仪打粉(2000r/s，3min)；

(4)室温下使用0.25％SDS溶液漂洗粉末状材料2h，大量PBS溶液漂洗至无泡沫，离心；

(5)80％异丙醇溶液漂洗粉末状材料1h脱脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料无异味，即可。

实施例3本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法

1、制备方法

(2)将脂肪组织剪碎至1.5cm×1.5cm×1.5cm大小，脂肪组织与生理盐水按体积比1:2进行匀浆(15000rpm，7min)。将匀浆后获得的溶液以4000rpm，7min进行离心，弃掉上层油脂；

(3)将离心获得的下层材料使用PBS溶液漂洗后球磨仪打粉(3000r/s，7min)；

(4)室温下使用1％SDS溶液漂洗粉末状材料6h，大量PBS溶液漂洗至无泡沫，离心；

(5)100％异丙醇溶液漂洗粉末状材料3h脱脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料无异味，即可。

实施例4本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的参数筛选

1、实验方法

实验分组：

组1:1％SDS组

组2:0.5％SDS组

组3:1％Triton X100组

组4：0.5％Triton X100组

组5：0.25％胰酶组

步骤(4)中的SDS溶液用前述5种溶液替代，处理时间分别为2h、4h、6h、8h组，其余参数同实施例1的方法，采用DAPI染色评价脱细胞效果。

2、实验结果

按照时间梯度(2h、4h、6h、8h)进行处理，发现1％SDS、0.5％SDS、0.25％胰酶分别处理4h能脱细胞完全。基于试剂价格最低化的原则，我们选择了0.5％SDS 4h作为最后的脱细胞方案。

以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：

实验例1本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的特性检测

1、试验方法

取新鲜皮下脂肪以及实施例1制备的猪脂肪组织无细胞基质材料按照如下方法进行检测：

1.1脱细胞效果

(1)定性试验

梯度脱水，常规包埋切片后行HE染色及DAPI染色。

组织标本制作方法如图9所示。

切片脱蜡和水化过程如图10所示。

HE染色步骤如图11所示。

DAPI染色流程图如图12所示。

(2)定量试验

用Quant-iT^TM PicoGreendsDNA Reagent and Kits(Invitrogen,UK)测得：将猪脂肪组织无细胞基质材料球磨打粉，取10mg材料100ug/ml蛋白酶K溶液(Sigma公司，美国)于65℃下充分消化72小时，提取DNA后，使用荧光酶标仪(BioTek公司，美国)测量DNA含量(激发波长：485nm，接收波长：538nm)。

1.2脱脂程度鉴定

-20℃保存的新鲜脱细胞基质冰冻切片的制备流程图如图13所示：

1.3结构及含有的成分初步鉴定

1.3.1可溶性蛋白定量(BCA法)

可溶性蛋白采用BCA法蛋白定量试剂盒(Generay Biotech，上海)检测。

1.3.2扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)

扫描电镜观察。

1.3.3天狼星红染色如图14所示。

1.3.4生长因子检测

20mg猪脂肪组织无细胞基质材料加入1ml双蒸水碾磨匀浆，使用VEGF检测试剂盒(Cloud-Clone Corp.USA)检测。

1.4细胞毒性检测

将猪脂肪组织无细胞基质材料修成大小为1cm*1cm*0.1-0.2cm大小的膜片，置于完全培养基内(1.25cm²/ml)，于37℃孵箱内孵育24小时。

将人脂肪来源干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)按3000个/孔接种在梯度浓度的浸提液中(浓度设置为0％、25％、50％、75％、100％)，于接种后1天、3天和5天，使用CCK8试剂盒(Dojindo laboratories,Maryland)检测其相对生长率(Relative growth rate,RGR)并对材料毒性进行分级。

其中RGR＝实验组A值/阴性对照组A值，分级标准如下：

0级，RGR≥100％；

1级，80％≤RGR<100％；

2级，50％≤RGR<80％；

3级，30％≤RGR<50％；

4级，RGR<30％。

1.5体内实验证明材料细胞生物相容性

采用经典的SD大鼠皮下植入模型评价猪脂肪组织无细胞基质材料的生物相容性。实验动物为SPF清洁级雄性SD大鼠(体重250-300g)(成都达硕生物科技公司，中国)。

其主要的手术操作如下：

麻醉消毒：SD大鼠使用水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉剂量为1ml/300g)；肥皂水备皮清洁后碘伏消毒(图5a)。

常规铺巾，与SD大鼠髂窝处做长约2-3cm切口，分离皮下筋膜(图5b)。

将水化完全(术前半小时)的猪脂肪组织无细胞基质材料植入皮下筋膜腔内，缝合筋膜及皮肤(图5c，图5d)。

评价时间点为：3天(3D)、1周(1W)、2周(2W)和4周(4W)。每个时间点，将SD大鼠麻醉处死，将移植物连周围皮肤取下测量其横经，行常规HE染色及CD68染色(Abcam Inc.，英国)。

2、试验结果

1.1脱细胞效果

(1)定性试验

如图1所示，脱细胞处理前，HE染色可见脂肪组织由大量油脂构成，细胞核位于细胞周围(图1a)，脱细胞后获得的猪脂肪组织无细胞基质材料行HE染色未见蓝染细胞核(图1c)。DAPI染色结果与HE染色结果一致。脱细胞处理前细胞核在荧光显微镜激发下发蓝紫光(图1b)，脱细胞处理后的猪脂肪组织无细胞基质材料未见蓝紫色的细胞核(图1d)。

(2)定量试验

经检测，猪脂肪组织无细胞基质材料平均DNA含量为4.01ng/mg(1.578-6.354ng/mg)。

试验结果说明，本发明方法制备的猪脂肪组织无细胞基质材料，脱细胞完全，免疫原性低。

1.2脱脂程度鉴定

如图2所示，脂肪组织主要为成熟脂肪细胞构成。脂肪细胞体积较大，胞浆内蓄积大量脂滴(图2a)。经脱细胞脱脂处理的猪脂肪组织无细胞基质材料行油红O染色未见红色的脂滴(图2b)，说明猪脂肪组织无细胞基质材料脱脂处理完全。

1.3成分及特性初步鉴定

1.3.1可溶性蛋白定量(BCA法)

可溶性蛋白采用BCA法蛋白定量试剂盒(Generay Biotech，上海)检测，测得猪脂肪组织无细胞基质材料可溶性蛋白含量为79％。

1.3.2扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)

如图3所示，经扫描电镜观察可见猪脂肪组织无细胞基质材料的三维结构良好，仍保持多孔特性，孔径平均大小为61.16um，可用于体内修复。

1.3.3天狼星红染色

如图4所示，天狼星红染色可见猪脂肪组织无细胞基质材料主要成分为红色的I型胶原。

1.3.4生长因子检测

20mg猪脂肪组织无细胞基质材料加入1ml双蒸水碾磨匀浆，使用VEGF检测试剂盒(Cloud-Clone Corp.USA)测得VEGF为133.26pg/ml，即6.66pg/mg。

1.4细胞毒性检测

实验结果如下表1所示：

表1 不同稀释浓度材料浸提液作用后细胞A值及RGR检测(n＝3)

由上表可见，猪脂肪组织无细胞基质材料毒性分级为0-1级。

1.5体内实验证明材料细胞生物相容性

(1)猪脂肪组织无细胞基质材料体内降解速度

猪脂肪组织无细胞基质材料植入SD雄性大鼠体内，3天左右有血管新生(图6a)，4周左右移植物基本被大鼠完全降解(图6d)。测量其横径后绘制线性图如图6e所示。

(2)组织学评价—HE染色

3D:猪脂肪组织无细胞基质材料植入后三天，HE染色可见猪脂肪组织无细胞基质材料在HE染色下呈较均一粉红色，有少量细胞进入材料内(图7a，7b),且有血管新生(图7a，箭头示)。

1W:猪脂肪组织无细胞基质材料植入1周，大量细胞进入材料周边及内部，其主要成分为炎症细胞(巨噬细胞、淋巴细胞等)和成纤维细胞(图7c,7d)。经CD68免疫组织化学染色可见1周为炎症反应相对较严重时期。新生血管明显。

2W:猪脂肪组织无细胞基质材料植入2周时，进入材料的细胞数量继续上升(图7e，7f)，其主要的细胞类型为成纤维细胞。经CD68免疫组化染色发现，炎症反应较1周时明显降低，且差异具有统计学意义(P＝0.000)。

4W：猪脂肪组织无细胞基质材料植入4周时，可见植入材料几乎被完全降解，与周围组织融合可，新生血管粗大明显，周边细胞主要为成纤维细胞。

(3)免疫组织化学染色—CD68显示巨噬细胞

巨噬细胞是参与急性炎症反应的主要细胞，在机体异物清除等方面有重要的作用。CD68是目前使用最为广泛显示巨噬细胞的标记点。我们行CD68染色后对每个标本在400倍下随机取10个观察点并拍照，通过计数CD68阳性细胞观察局部炎症反应，结果如图8所示。

如图可以看到，CD68阳性细胞在1周时最多，后随着时间进展，CD68阳性细胞逐渐减少。整个过程中局部无脓肿、无畸形形成。

实验结果说明，本发明方法制备的猪脂肪组织无细胞基质材料可以有效修复机体缺损，且体内降解速度适宜，炎症反应弱，可以与周围组织组织融合，生物相容性好。

综上，本发明方法可以有效对猪脂肪组织进行脱细胞和脱脂，制备的猪脂肪组织无细胞基质材料平均DNA含量仅仅为4.01ng/mg，无毒，三维结构良好，有良好的生物相容性，生长因子含量高，可以有效用于修复机体缺损。同时，本发明方法使用价格便宜的SDS及异丙醇处理，成本低廉，并且，整个工艺的处理时间约10小时，显著短于现有的处理方法，工业应用前景良好。

Claims

1.一种制备猪脂肪组织无细胞基质材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取新鲜猪皮下脂肪，清洗，剪碎，加水或者生理盐水，匀浆，离心，得沉淀，用PBS溶液或水漂洗；

(3)将沉淀用异丙醇溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，剪碎至大小为(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：剪碎至大小为1cm×1cm×1cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，匀浆前，所述水或生理盐水的用量为皮下脂肪体积的0.5～2倍。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述水或生理盐水的用量为皮下脂肪体积的1倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述匀浆的转速为10000～15000rpm，时间为3～7min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述匀浆的转速为12000rpm，时间为5min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述离心的转速为3000～4000rpm，时间为3～7min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述离心的转速为3500rpm，时间为5min。

10.根据要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述粉碎是球磨粉碎，球磨粉碎的转速为2000～3000r/s，时间为3～7min。

11.根据要求10所述的方法，其特征在于：所述球磨粉碎的转速为2500r/s，时间为5min。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述SDS溶液的浓度为0.25％～1％w/v。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述SDS溶液的浓度为0.5％w/v。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述SDS溶液漂洗的时间为2～6h。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述SDS溶液漂洗的时间为4h。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述异丙醇溶液的浓度为80～100％。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述异丙醇溶液的浓度为100％。

18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述异丙醇溶液的漂洗时间为1～3h。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：所述异丙醇溶液的漂洗时间为2h。

20.权利要求1～19任意一项方法制备得到的猪脂肪组织无细胞基质材料。