CN113278587B - 一种三维工程化乳腺癌肺转移模型、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤组织工程材料领域,公开了一种三维工程化乳腺癌肺转移模型的构建方法,包括PDLM‑胶原‑壳聚糖支架的构建、单细胞‑复合支架的3D乳腺癌肺转移模型的构建、多细胞‑复合支架的3D乳腺癌肺转移模型和多细胞‑复合支架‑细胞因子共培养体系的3D乳腺癌肺转移模型;本发明还公开了三维工程化乳腺癌肺转移模型和应用。本发明构建的模型支架更接近肺脏ECM的成分、机械强度及生化信息,基于复合支架的多细胞共培养体系能更好地模拟乳腺癌肺转移微环境,所构建的工程化肿瘤组织与在体肺转移灶的生物学特征相近,对乳腺癌肺转移发生发展机制及抗肿瘤策略的研究具有重要的应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤组织工程材料领域,具体涉及一种三维工程化乳腺癌肺转移模型、构建方法及应用。
背景技术
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,已成为危害女性健康的头号杀手,乳腺癌的远端转移,被认为是乳腺癌致死率及复发率高的直接诱因,其最容易转移的靶向器官为肺、骨、肝脏,其中60~70%的乳腺癌患者最终都已发生肺部转移。肺转移作为影响乳腺癌患者生存的主要原因之一,对其发生发展及相关分子机制的研究变得极为重要。
目前,在个体病人身上实施乳腺癌肺转移的研究极为困难,加之缺乏模拟人类转移性癌症生长方式的实验系统,致使肺转移发生机制及肿瘤进展的深入研究受到限制。因此,较多的工作集中于开发实验模型、体外模拟转移过程上。体外2D细胞培养目前虽仍然是大多数肿瘤研究的主要途径,但是2D培养系统因缺乏体内肿瘤的内在微环境和生理相关性而无法反映肿瘤组织的高度复杂性、异质性和生物学特性,并且2D培养系统不能准确预测药物的体内抗癌作用,导致其应用效果并不理想。体内通过在小鼠尾静脉或者原位注射乳腺癌细胞所构建的肺转移模型已被广泛用于研究转移性肿瘤,但动物模型也存在一定局限性,如动物实验成本高、周期长、操作复杂且存在伦理问题及个体化差异等。肿瘤细胞3D培养模型可更好模拟体内肿瘤细胞生长微环境,其培养模式下的肿瘤细胞呈现更高的耐药性,有效缩小了抗癌药物筛选体外模型与体内模型的差距,可提高药物筛选的准确性。
肿瘤微环境在肿瘤发生发展中发挥着重要作用,乳腺癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)是乳腺癌微环境中最主要的间质细胞,在乳腺癌的增殖、侵袭转移及化疗耐药等方面起着关键作用。目前,研究CAFs对乳腺癌细胞的影响通常采用将乳腺癌细胞与培养过乳腺癌CAFs的培养基或直接与乳腺癌CAFs分泌的因子混合培养的间接方式,由于体内肿瘤中乳腺癌细胞与CAFs处于3D环境中且两种细胞间关系复杂,间接手段将导致一定程度的结果误差。因此需构建模拟体内乳腺癌肺转移微环境的3D替代物,构建过程中选择适宜的支架材料是乳腺癌肺转移组织工程模型的重中之重。目前基于天然和合成材料的3D支架与体内肺组织胞外基质不尽相同,导致在此基础上构建的3D乳腺癌肺转移组织工程模型与体内真实肺转移灶环境不同,致使研究及理解乳腺癌转移至肺脏后系列生物学行为及其机制存在较大出入。现有技术公布的肿瘤模型支架多采用大、小鼠器官/组织来源脱细胞衍生基质,而鼠源器官在大小和生理结构方面与人均有较大区别。基于猪源性脱细胞肺基质PDLM-胶原-壳聚糖支架结合肿瘤微环境中多种细胞(乳腺癌细胞、免疫细胞及成纤维细胞)、细胞因子(IL-6、IL-10、TGF-β)所构建的3D乳腺癌肺转移组织工程模型将有望解决这一难题。
发明内容
基于以上问题,本发明提供一种三维工程化乳腺癌肺转移模型、构建方法及应用,本发明构建的模型支架更接近肺脏ECM的成分、机械强度及生化信息,基于复合支架的多细胞共培养体系能更好地模拟乳腺癌肺转移微环境,所构建的工程化肿瘤组织与在体肺转移灶的生物学特征相近,对乳腺癌肺转移发生发展机制及抗肿瘤策略的研究具有重要的应用价值和前景。
为解决以上技术问题,本发明提供了一种三维工程化乳腺癌肺转移模型的构建方法,包括如下步骤:
S1:取猪源性全肺组织,完全切除支气管部分,将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3的碎末,用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次直至完全除去血丝,每次清洗时间均为0.5h;
S2:向经步骤S1处理之后的碎末中加入质量分数为0.5%的SDS溶液搅拌10h,进行脱细胞处理;
S3:向经步骤S2处理之后的碎末中加入体积分数为0.25%的TritonX-100溶液搅拌10h,进一步脱除细胞,之后用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次,以洗去残留的脱细胞试剂,每次清洗时间均为0.5h;
S4:将步骤S3中得到的碎末置于-20℃条件下预冻12h后进行冷冻干燥处理得到脱细胞后的PDLM支架,干燥时间为12h;再将干燥后的PDLM支架置于球磨机中研磨2h,得纳米脱细胞支架颗粒;
S5:将步骤S4中得到的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中搅拌均匀,得混合溶液,将混合溶液转移至24孔板中成型,24孔板中每孔加入1.5~2mL混合溶液,于-20℃冰箱中预冻24h;混合溶液中PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1;
S6:将步骤S5中预冻后的混合溶液冷冻干燥24h,制得PDLM-胶原-壳聚糖支架;
S7:将乳腺癌MCF-7细胞接种于步骤S6中的PDLM-胶原-壳聚糖支架中,构建单细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型,其中PDLM-胶原-壳聚糖支架的大小为5mm×5mm×2mm,MCF-7细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,PDLM-胶原-壳聚糖支架的正反面各接种10~20μLMCF-7细胞。
进一步的,步骤S6中制得PDLM-胶原-壳聚糖支架后,将MCF-7细胞、MRC-5细胞及巨噬细胞RAW264.7的细胞混合液接种于步骤S6中的PDLM-胶原-壳聚糖支架中,构建多细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型,其中PDLM-胶原-壳聚糖支架的大小为5mm×5mm×2mm,细胞混合液中MCF-7细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,RAW264.7细胞的密度为2.5×105~1×106个/mL,MRC-5细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,PDLM-胶原-壳聚糖支架的正反面各接种细胞混合液10~20μL。
进一步的,向多细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型中接种细胞因子,构建多细胞-复合支架-细胞因子共培养体系的3D乳腺癌肺转移模型。
进一步的,所述细胞因子为TGF-β、IL-6和IL-10,所述细胞因子混合于细胞混合液中,细胞混合液中的TGF-β、IL-6和IL-10的含量均为10~20pg/mL。
为解决以上技术问题,本发明还提供了三维工程化乳腺癌肺转移模型。
为解决以上技术问题,本发明还提供了三维工程化乳腺癌肺转移模型在制备用于研究乳腺癌肺转移的产品中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明构建的三维工程化乳腺癌肺转移模型可模拟体内乳腺癌转移至肺脏后的微环境,其更接近肺脏ECM的成分、机械强度及生化信息,可望开发人类乳腺癌肺转移生长方式的体外实验系统,可更加全面及准确的研究乳腺癌肺转移灶的形成及发展过程;
(2)本发明的多细胞-复合支架-细胞因子共培养体系的3D乳腺癌肺转移模型为研究乳腺癌细胞-其它宿主细胞及细胞-细胞外基质成分之间的相互作用及其进一步介导乳腺癌细胞生长、新生血管生成、侵袭和转移提供了良好的平台,所构建的类似于“种子-土壤”体系在组成元素、内部缺氧状态及时间/空间的分布的变化与现有其它模型相比,能更好地探究乳腺癌肺转移的进展及化疗药物作用效果,具有极好的应用前景;
(3)本发明着眼于基础到转化研究,通过体外3D工程化乳腺癌肺转移模型可评估多种药物抑制乳腺癌生长及转移的作用及机制,可提高抗乳腺癌药物筛选的准确性,可更好的为目前众多筛选中及小范围使用的化疗及其辅助药物的应用提供实验基础和理论依据。
附图说明
图1为本发明的实施例3中所获得的PDLM-胶原-壳聚糖支架的外观图和SEM图;
图2为本发明的实施例3中乳腺癌细胞接种于PDLM-胶原-壳聚糖支架后考察细胞生长增殖及体内组织相容性的组织切片图;
图3为本发明的实施例4中多细胞接种于PDLM-胶原-壳聚糖支架上考察成纤维细胞MRC-5和乳腺癌细胞MCF-7相互作用的结果图;
图4为本发明的实施例5中多细胞-活性因子-复合支架共培养体系促进乳腺癌细胞增殖及肿瘤球发展的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
实施例1:
本实施例提供一种三维工程化乳腺癌肺转移模型的构建方法,具体步骤如下:
S1:取猪源性全肺组织,完全切除支气管部分,将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3的碎末,用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次直至完全除去血丝,每次清洗时间均为0.5h;
S2:向经步骤S1处理之后的碎末中加入质量分数为0.5%的SDS溶液搅拌10h,进行脱细胞处理;
S3:向经步骤S2处理之后的碎末中加入体积分数为0.25%的TritonX-100溶液搅拌10h,进一步脱除细胞,之后用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次,以洗去残留的脱细胞试剂,每次清洗时间均为0.5h;
S4:将步骤S3中得到的碎末置于-20℃条件下预冻12h后进行冷冻干燥处理得到脱细胞后的PDLM支架,干燥时间为12h;再将干燥后的PDLM支架置于球磨机中研磨2h,得纳米脱细胞支架颗粒;
S5:将步骤S4中得到的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中搅拌均匀,得混合溶液,将混合溶液转移至24孔板中成型,24孔板中每孔加入1.5~2mL混合溶液,于-20℃冰箱中预冻24h;混合溶液中PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1;
S6:将步骤S5中预冻后的混合溶液冷冻干燥24h,制得PDLM-胶原-壳聚糖支架;
S7:将乳腺癌MCF-7细胞接种于步骤S6中的PDLM-胶原-壳聚糖支架中,构建单细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型,其中PDLM-胶原-壳聚糖支架的大小为5mm×5mm×2mm,MCF-7细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,PDLM-胶原-壳聚糖支架的正反面各接种10~20μLMCF-7细胞。
本实施例构建的单细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型可应用于制备用于研究乳腺癌肺转移的产品中。
实施例2:
本实施例提供一种三维工程化乳腺癌肺转移模型的构建方法,具体步骤如下:
S1:取猪源性全肺组织,完全切除支气管部分,将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3的碎末,用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次直至完全除去血丝,每次清洗时间均为0.5h;
S2:向经步骤S1处理之后的碎末中加入质量分数为0.5%的SDS溶液搅拌10h,进行脱细胞处理;
S3:向经步骤S2处理之后的碎末中加入体积分数为0.25%的TritonX-100溶液搅拌10h,进一步脱除细胞,之后用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次,以洗去残留的脱细胞试剂,每次清洗时间均为0.5h;
S4:将步骤S3中得到的碎末置于-20℃条件下预冻12h后进行冷冻干燥处理得到脱细胞后的PDLM支架,干燥时间为12h;再将干燥后的PDLM支架置于球磨机中研磨2h,得纳米脱细胞支架颗粒;
S5:将步骤S4中得到的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中搅拌均匀,得混合溶液,将混合溶液转移至24孔板中成型,24孔板中每孔加入1.5~2mL混合溶液,于-20℃冰箱中预冻24h;混合溶液中PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1;
S6:将步骤S5中预冻后的混合溶液冷冻干燥24h,制得PDLM-胶原-壳聚糖支架;
S7:将MCF-7细胞、成纤维细胞(MRC-5)及巨噬细胞RAW264.7的细胞混合液接种于步骤S6中的PDLM-胶原-壳聚糖支架中,构建多细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型,其中PDLM-胶原-壳聚糖支架的大小为5mm×5mm×2mm,细胞混合液中MCF-7细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,RAW264.7细胞的密度为2.5×105~1×106个/mL,MRC-5细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,PDLM-胶原-壳聚糖支架的正反面各接种细胞混合液10~20μL。
本实施例还可向上述制备的多细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型中接种细胞因子,构建多细胞-复合支架-细胞因子共培养体系的3D乳腺癌肺转移模型。本实施例所述细胞因子为TGF-β、IL-6和IL-10,所述细胞因子混合于细胞混合液中,细胞混合液中的TGF-β、IL-6和IL-10的含量均为10~20pg/mL。
本实施例构建的多细胞-复合支架的3D乳腺癌肺转移模型或多细胞-复合支架-细胞因子共培养体系的3D乳腺癌肺转移模型可应用于制备用于研究乳腺癌肺转移的产品中。
实施例3:
本实施例将整个猪肺组织切除支气管部分,剪成小块,使用搅碎机搅碎为大小约为0.5cm3的碎末,将碎末置于烧杯中,加入1000mL超纯水,磁力搅拌30min后更换新的超纯水,重复三次后,加入1000mLPBS同样清洗3次,每次磁力搅拌30min,待样品中无明显血色后,加入0.5%(wt%,下同)SDS溶液1000mL,磁力搅拌5h后,更换新的0.25%SDS溶液继续搅拌5h,用于除去细胞;随后,加入0.25%(v%,下同)TritonX-100溶液1000mL搅拌5h,进一步除去剩余细胞;待细胞脱除后,加入1000mLPBS清洗5次,每次持续时间30min,用于洗净脱细胞试剂。将脱细胞碎末置于-20℃冰箱中预冻5h后,置于-80℃冷冻干燥机中干燥12h,获得干燥脱细胞猪肺基质支架,进一步将其倒入行星组织球磨机研磨2h,获得PDLM纳米颗粒。
通过评估PDLM脱细胞中胶原以及糖胺聚糖损失情况,分别配置胶原水溶液及2%壳聚糖-乙酸溶液,两者质量比为2:1,待两者溶解后,倒入同一个烧杯中继续搅拌至混合均匀。于上述胶原-壳聚糖混合溶液中加入PDLM纳米颗粒,PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1,继续搅拌至三者完全混匀。随后,将配置的混合液缓慢加入24孔板中,保证无气泡产生,将24孔板置于冰块上以避免PDLM颗粒在混合液中沉降过快引起其分布不均。将混合液置于-20℃冰箱中预冻12h后,置于-80℃冷冻干燥机中干燥24h,获得PDLM-胶原-壳聚糖支架。
所获得的PDLM-胶原-壳聚糖支架的外观图和SEM图见附图1,可见PDLM-胶原-壳聚糖支架呈白色多孔结构,孔连贯性较好,PDLM纳米颗粒均匀分布于支架表面及孔壁,与单纯明胶-壳聚糖支架相比,其表面更加粗糙,有利于细胞粘附。PDLM-胶原-壳聚糖支架的孔径为215.62±27.85μm,且孔壁上存在类似肺泡孔的小孔结构,利于细胞营养物质的供给和代谢废物的排出。
将交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架切成5mm*5mm*2mm薄片后置于10cm直径的无菌培养皿中,将无菌培养皿放入超净台内,加入75%酒精并于紫外照射下浸泡过夜,以保证支架完全除菌。之后换用PBS溶液交替浸泡2h,移除PBS后加入高糖DMEM浸泡30min,超净台内风干后,分别接种20μL乳腺癌细胞MCF-7(2.5×106cells/mL)和4T1(2.5×106cells/mL),前者在培养不同时间点取出部分支架做相关检测,其中一部分支架10%福尔马林固定,石蜡包埋切片后,H&E染色观察细胞生长增殖情况。后者培养三天后将4T1细胞-复合支架植入BABL/c小鼠右前肢附近皮下4周,常规H&E分析确定有无炎症反应及血管形成情况,通过以上体内体外实验确定复合支架的生物相容性情况。
见附图2,为乳腺癌细胞接种于PDLM-胶原-壳聚糖支架后考察细胞生长增殖及体内组织相容性的组织切片图。可见MCF-7接种于复合支架培养第1天,少量细胞稀疏的分布在支架孔壁及孔隙中;培养第3天,细胞密度增加,细胞间连接趋于明显;培养第3天到第7天,细胞数显著增加,形成很多细胞集落,且逐渐填满整个孔隙。4T1-复合支架构建物植入小鼠皮下4周后,小鼠移植部位形成明显的肿瘤突起(皮下成瘤图),H&E切片结果显示,支架植入后有较少的炎症细胞、成纤维细胞浸润,复合支架可显著诱导血管生成,血管内皮细胞衬里明显,内含大量红细胞,以上结果表明本发明制备的复合支架体内外均具有良好的生物相容性,适合作为构建乳腺癌肺转移模型的支架材料。
实施例4:
本实施例将整个猪肺组织切除支气管部分,剪成小块,使用搅碎机搅碎为大小约为0.5cm3的碎末,将碎末置于烧杯中,加入1000mL超纯水,磁力搅拌30min后更换新的超纯水,重复三次后,加入1000mLPBS同样清洗3次,每次磁力搅拌均为30min,待样品中无明显血色后,加入0.5%(wt%,下同)SDS溶液1000mL,磁力搅拌5h后,更换新的0.25%SDS溶液继续搅拌5h,用于除去细胞;随后,加入0.25%(v%,下同)TritonX-100溶液1000mL搅拌5h,进一步除去剩余细胞;待细胞脱除后,加入1000mLPBS清洗5次,每次持续时间30min,用于洗净脱细胞试剂。将脱细胞碎末置于-20℃的冰箱中预冻5h后,置于-80℃冷冻干燥机中干燥12h,获得干燥脱细胞猪肺基质支架,进一步将其倒入行星组织球磨机研磨2h,获得PDLM纳米颗粒。
通过评估PDLM脱细胞中胶原以及糖胺聚糖损失情况,分别配置胶原水溶液及2%壳聚糖-乙酸溶液,两者质量比为2:1,待两者溶解后,倒入同一个烧杯继续搅拌至混合均匀。于上述胶原-壳聚糖混合溶液中加入PDLM纳米颗粒,PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1,继续搅拌至三者完全混匀。随后,将配置的混合液缓慢加入24孔板中,保证无气泡产生,孔板置于冰块上以降低PDLM颗粒在混合液中沉降过快引起其分布不均。将混合液置于-20℃冰箱中预冻12h后,置于-80℃冷冻干燥机中干燥24h,获得PDLM-胶原-壳聚糖支架。
本实施例将交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架切成5mm*5mm*1mm薄片后置于10cm直径无菌培养皿中,支架薄片不能相互覆盖;放入超净台后,于培养皿中加入不超过2/3体积的75%酒精并开紫外照射3h后,移除剩余酒精,再次加入75%酒精继续照射3h。换用PBS浸泡1h,移除PBS,超净台内风干。将支架转移至24孔板后,分别于支架两面接种多细胞混合液各10μL,包含:GFP-荧光标记MCF-7细胞(2.5×106cells/mL)、巨噬细胞(2.5×105cells/mL)和成纤维细胞MRC-5(2.5×106cells/mL),仅GFP-荧光标记MCF-7细胞(2.5×106cells/mL)作为对照组,培养1h后,补加1mL培养基继续培养,于不同时间点取出多细胞-复合支架进行相关检测。其中一部分构建物置于激光共聚焦显微镜下488nm激发波长下考察MRC-5的加入对MCF-7细胞集落发展的影响;另一部分构建物加入CCK-8和基础培养基混合液(体积比1:10)于37℃反应3h后,测定吸光度值考察MRC-5对MCF-7细胞生长增殖的影响。
见附图3,为多细胞接种于PDLM-胶原-壳聚糖支架上考察成纤维细胞MRC-5和乳腺癌细胞MCF-7相互作用的结果图,从图中可看出MRC-5与MCF-7细胞共同接种于复合支架后,MRC-5细胞逐渐被MCF-7细胞活化,表现出CAFs特性高表达α-SMA,活化的MRC-5细胞又可显著促进MCF-7细胞的生长增殖,且随着培养时间延长,相比单MCF-7细胞培养增殖愈加明显;另外,MRC-5细胞的加入也可显著介导GFP-MCF-7细胞的聚集及维持肿瘤球外观形貌。
实施例5:
本实施例将整个猪肺组织切除支气管部分,剪成小块,使用搅碎机搅碎为大小约为0.5cm3的碎末,将碎末置于烧杯中,加入1000mL超纯水,磁力搅拌30min后更换新的超纯水,重复三次后,加入1000mLPBS同样清洗3次,每次磁力搅拌30min,待样品中无明显血色后,加入0.5%(wt%,下同)SDS溶液1000mL,磁力搅拌5h后,更换新的0.25%SDS溶液继续搅拌5h,用于除去细胞;随后,加入0.25%(v%,下同)TritonX-100溶液1000mL搅拌5h,进一步除去剩余细胞;待细胞脱除后,加入1000mLPBS清洗5次,每次持续时间30min,用于洗净脱细胞试剂。将脱细胞碎末置于-20℃冰箱中预冻5h后,置于-80℃冷冻干燥机中干燥12h,获得干燥脱细胞猪肺基质支架,进一步将其倒入行星组织球磨机研磨2h,获得PDLM纳米颗粒。
通过评估PDLM脱细胞中胶原以及糖胺聚糖损失情况,分别配置胶原水溶液及2%壳聚糖-乙酸溶液,两者质量比为2:1,待两者溶解后,倒入同一个烧杯继续搅拌至混合均匀;于上述胶原-壳聚糖混合溶液中加入PDLM纳米颗粒,PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1,继续搅拌至三者完全混匀。随后,将配置的混合液缓慢加入24孔板中,保证无气泡产生,孔板置于冰块上以避免PDLM颗粒在混合液中沉降过快引起其分布不均,将混合液置于-20℃冰箱中预冻12h后,置于-80℃冷冻干燥机中干燥24h,获得PDLM-胶原-壳聚糖复合支架。
本实施例将交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架切成5mm*5mm*1mm薄片后置于12cm直径的无菌培养皿中。放入超净台后,于培养皿中加入大约2/3体积的75%酒精,保证支架完全浸没酒精,开紫外照射5h后,移除剩余酒精,再次加入75%酒精继续照射5h;换用PBS浸泡2h,移除PBS,超净台内风干。将支架转移至24孔板后,分别于支架两面接种混合细胞因子(TGF-β、IL-6、IL-10,10pg/mL)的多细胞混合液各20μL,包含:MCF-7细胞(2.5×106cells/mL)、巨噬细胞(2.5×105cells/mL)和成纤维细胞(2.5×106cells/mL),并加入100μL培养基,保证培养基浸润支架且不漂浮起来,培养2h后,补加1.5mL培养基,继续培养不同时间点取出构建物并进行相关检测。其中一部分构建物经钙黄绿色Calcein和Hoechst染色后,置于荧光显微镜下评估细胞存活情况;一部分构建物置于2.5%戊二醛中固定3h及梯度酒精脱水(50%,70%,90%,100%)后,表面喷金于扫描电镜下考察肿瘤球发展情况;另一部分构建物经Ki67和F-actin荧光染色后,置于激光共聚焦显微镜下考察肿瘤球外观及肿瘤细胞增殖活性。
见附图4,为多细胞-活性因子-复合支架共培养体系促进乳腺癌细胞增殖及肿瘤球发展的结果图,从图中可看出培养3天后,从死活染色结果中可看到已形成众多肿瘤球,并且大多数活细胞被Calcein荧光标记呈强绿色荧光,将明场放大后,可以看到肿瘤球在复合支架表面、孔壁和骨架上都有分布(箭头),肿瘤球平均孔径约为100μm;培养7天后,SEM及免疫荧光结果表明其他基质细胞和活性因子可显著促进乳腺癌细胞的增殖(Ki67的表达)及促进肿瘤球的进取性的发展,肿瘤球愈发致密且尺寸可到345μm。以上结果证实其他基质细胞和活性因子的引入对模拟肿瘤微环境并研究其对肿瘤生长增殖等实际影响的重要性。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程,并非用以限制本发明的专利保护范围,本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准,凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化,同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种三维工程化乳腺癌肺转移模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1:取猪源性全肺组织,完全切除支气管部分,将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3的碎末,用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次直至完全除去血丝,每次清洗时间均为0.5h;
S2:向经步骤S1处理之后的碎末中加入质量分数为0.5%的SDS溶液搅拌10h,进行脱细胞处理;
S3:向经步骤S2处理之后的碎末中加入体积分数为0.25%的TritonX-100溶液搅拌10h,进一步脱除细胞,之后用pH为7.4的PBS缓冲液清洗5次,以洗去残留的脱细胞试剂,每次清洗时间均为0.5h;
S4:将步骤S3中得到的碎末置于-20℃条件下预冻12h后进行冷冻干燥处理得到脱细胞后的PDLM支架,干燥时间为12h;再将干燥后的PDLM支架置于球磨机中研磨2h,得纳米脱细胞支架颗粒;
S5:将步骤S4中得到的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中搅拌均匀,得混合溶液,将混合溶液转移至24孔板中成型,24孔板中每孔加入1.5~2mL混合溶液,于-20℃冰箱中预冻24h;混合溶液中PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1;
S6:将步骤S5中预冻后的混合溶液冷冻干燥24h,制得PDLM-胶原-壳聚糖支架;
S7:将MCF-7细胞、巨噬细胞RAW264.7及MRC-5细胞的多细胞混合液接种于步骤S6中的PDLM-胶原-壳聚糖支架中,PDLM-胶原-壳聚糖支架的大小为5mm×5mm×2mm,多细胞混合液中MCF-7细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,RAW264.7细胞的密度为2.5×105~1×106个/mL,MRC-5细胞的密度为2.5×106~1×107个/mL,PDLM-胶原-壳聚糖支架的正反面各接种多细胞混合液10~20μL,多细胞混合液中混合有细胞因子,细胞因子为TGF-β、IL-6和IL-10,含量均为10~20pg/mL,以构建多细胞-复合支架-细胞因子共培养体系的3D乳腺癌肺转移模型。
2.权利要求1所述的构建方法构建的三维工程化乳腺癌肺转移模型。
3.权利要求2所述的三维工程化乳腺癌肺转移模型在制备用于研究乳腺癌肺转移的产品中的应用。
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