CN113293134A - 一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用 - Google Patents

一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤组织工程材料领域，公开了一种三维肺癌模型支架的制备方法，包括猪源性全肺组织预处理、脱细胞碎末冷冻干燥、球磨成纳米颗粒和二次冷冻干燥；还公开了三维肺癌模型支架；还公开了应用。本发明操作过程简单灵活，脱细胞效果好，所制备的复合支架尽量模拟肺脏细胞外基质成分，更好反应基质对肿瘤细胞生物学行为的影响，支架免疫原性低且生物相容性良好，利于肿瘤细胞的生长增殖，利于营养物质及代谢废物的传输，为细胞生长提供了良好的增殖空间；便于直观研究癌细胞在本发明的复合支架中的生物学行为，利用本发明的复合支架构建的三维肺癌模型可作为抗肿瘤药物筛选的重要研究平台。

Description

一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤组织工程材料领域，具体涉及一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用。
背景技术
目前肺癌生物学的研究模型主要包括体外2D细胞培养模型和体内动物模型，体外2D细胞培养模型缺乏体内肿瘤的内在微环境和生理相关性，无法反映肿瘤组织的高度复杂性、异质性和生物学特性，体内动物模型存在动物实验成本高、周期长、操作复杂、伦理问题及个体化差异等问题，因此体外2D细胞培养模型和体内动物模型对现有研究均具有一定的局限性，无法满足现代医学的要求。肿瘤细胞3D培养模型可模拟体内肿瘤细胞生长微环境，弥补2D培养模型的诸多不足，其培养模式下的肿瘤细胞呈现更高的耐药性，有效缩小了抗癌药物筛选体外模型与体内模型的差距，可提高药物筛选的准确性。与体内肿瘤模型相比，3D培养肿瘤模型在营造肿瘤微环境、肿瘤细胞生长及药物敏感性方面呈现更多的相似性，且体外研究更加直观便利，为研究肺癌的发生发展、转移及其相关作用机制提供了一种比动物模型更加快捷、有效且经济的选择。
3D组织工程的三要素包括细胞、支架和生物活性因子，适宜的支架材料是肿瘤细胞3D培养模型构建成功与否的关键因素。在基于支架形成肿瘤球的模型中，支架材料的使用是模拟体内肿瘤微环境的重要环节。3D组织工程肿瘤模型构建所需支架材料主要包括天然衍生生物材料和人工合成的高分子材料，天然来源的材料，尤其像多糖或者蛋白等物质，具有较好的生物相容性，有利于细胞的粘附和增殖，但大多天然材料力学性能较差，往往需要采用交联或者与其它材料复合等方式用于组织工程肿瘤的构建。高分子合成材料易于加工、具有良好生物力学性能、结构和性能易于调控，也被广泛用于肿瘤模型的体外构建，但人工聚合高分子材料因缺少与细胞的作用位点，细胞粘附性一般较差，应用于组织工程构建时往往需要对材料表面进行修饰。
支架材料的作用是充当细胞外基质(ECM)并进一步为新形成的瘤组织提供结构支撑，直接引入ECM是诠释组织工程支架的最佳选择。ECM不仅是肿瘤微环境的重要组成部分，其本身也可以作为许多细胞表面受体和整合素的配体发挥重要作用。器官/组织来源的脱细胞衍生基质可最大程度的保留原细胞外基质成分、生理生化、力学性能及空间结构，体外建立细胞间及细胞与胞外基质之间的相互联系，模拟真实肿瘤微环境，成为构建3D肿瘤模型的理想支架材料。猪源性肺脏组织在生理结构及基因组学等方面与人体肺脏相似，猪源脱细胞化肺基质(PDLM)是将猪源性肺脏组织采用脱细胞技术，去除DNA及表面抗原等细胞成分，保留着组织结构和细胞附着点，形成无免疫原性的工程支架。现有技术公布的脱细胞猪肺支架去细胞化过程大都采用灌注法，借助肺组织的脉络循环清除所有的细胞成分。这种方法多需要蠕动泵等提供压力导入去细胞试剂，并且脱细胞试剂需求量大，脱细胞时间长，脱细胞后肺脏细胞基质成分比如胶原、糖胺聚糖有较多损失，另外，由于目前的脱细胞肺支架主要用于替代损伤肺器官，脱细胞针对整个肺组织、脱细胞过程及再次注入细胞过程都需要保证完全无菌，操作缺乏灵活性。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用，本发明操作过程简单灵活，脱细胞效果好，可有效模拟体内肺脏细胞外基质的成分、肺泡及肺泡小孔结构和生物活性，干燥后获取的3D支架材料具有良好生物相容性，为进一步研究肺癌细胞在仿生肺脏细胞外基质的多种生物学行为提供有效手段。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种三维肺癌模型支架的制备方法，包括如下步骤：
S1：取猪源性全肺组织，用纯净水冲洗3-5次，完全切除支气管部分，将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3～0.5cm3的碎末；
S2：于室温下用pH为7.4的PBS缓冲液清洗步骤S1中的碎末3～5次，每次清洗均采用磁力搅拌器搅拌，每次清洗时间均为0.5～1h；
S3：于室温下向经步骤S2处理之后的碎末中加入质量分数为0.1～0.5％的SDS水溶液，用磁力搅拌器搅拌5～10h，初步脱除细胞，得部分脱除细胞的肺脏碎末；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的碎末中加入体积分数为0.1～0.25％的TritonX-100溶液，用磁力搅拌器搅拌5～10h，继续脱除细胞；
S5：室温下，用pH为7.4的PBS缓冲液清洗经步骤S4处理之后的碎末3～5次，每次清洗的持续时间均为0.5～1h，得脱细胞碎末；
S6：将步骤S5中得到的脱细胞碎末置于-10～-20℃条件下预冻5～12h；
S7：将步骤S6中预冻后的脱细胞碎末冷冻干燥，得干燥脱细胞猪肺支架；
S8：将步骤S7中的干燥脱细胞猪肺支架置于球磨机中研磨1～2h，得纳米脱细胞支架颗粒；
S9：将步骤S8中的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中，待混合均匀后置于-20～-30℃条件下预冻12～24h；
S10：将经步骤S9处理之后的混合溶液冷冻干燥，制得3D多孔PDLM-胶原-壳聚糖支架；
S11：除去步骤S10中获得的3D多孔PDLM-胶原-壳聚糖支架的表面致密层，之后用交联剂进行化学交联6～12h，再加入浓度为0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和乙酸2h，之后用浓度为75％的乙醇和pH为7.4的PBS缓冲液清洗3～5次，每次清洗0.5～1h，清洗后在-70～-80℃条件下进行二次冷冻干燥12～24h，获得交联后的3D仿生脱细胞肺脏基质，即三维肺癌模型支架。
进一步的，步骤S7中冷冻干燥的冷阱温度为-75～-80℃，冷冻干燥时间为10～15h。
进一步的，步骤S9中的胶原-壳聚糖溶液包括如下质量比的成分：PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1～9:3:1。
进一步的，步骤S10中冷冻干燥的冷阱温度为-75～-80℃，冷冻干燥时间为24～36h。
进一步的，步骤S11中的交联剂为由40％乙醇溶解的EDC、NHS和MES的混合溶液，交联剂中EDC、NHS和MES的浓度均为50mmol/L。
为解决以上技术问题，本发明还提供了三维肺癌模型支架。
为解决以上技术问题，本发明还提供了三维肺癌模型支架在制备仿生肺脏模型产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明将猪肺组织搅碎后行脱细胞处理，极大的节约了脱细胞试剂的使用量，极大的节约了脱细胞时间，操作过程简单灵活，脱细胞效果好；球磨后的脱细胞基质粉末为纳米尺寸且均匀分布于整个复合支架中，脱细胞基质结构更加均一，可提高实验结果的准确性，同时，支架表面纳米颗粒的引入利于细胞粘附及细胞间生物信号的传递；
(2)本发明向脱细胞肺脏胞外基质中进一步引入因脱细胞而损失较多的胶原成分，所制备的复合支架尽量模拟肺脏细胞外基质成分，更好反应基质对肿瘤细胞生物学行为的影响，可有效评估细胞外基质对细胞生物学行为的调控；本发明制备的复合支架有效的去除了细胞成分，所制备的复合支架免疫原性低且生物相容性良好，利于肿瘤细胞的生长增殖；同时，复合支架与肺泡微观结构类似，并在大孔基础上具有类肺泡孔小孔构造，支架通透性良好，利于营养物质及代谢废物的传输，另外，多孔结构为细胞生长提供了良好的增殖空间；便于直观研究癌细胞在本发明的复合支架中的生物学行为，利用本发明的复合支架构建的三维肺癌模型可作为抗肿瘤药物筛选的重要研究平台，较之二维平面培养的细胞更能准确预测药物体内疗效。
附图说明
图1为本发明的实施例2制备的PDLM纳米颗粒和PDLM-胶原-壳聚糖支架的外观图和SEM图；
图2为本发明的实施例2的PDLM-胶原-壳聚糖支架接种肺癌细胞后考察细胞存活的激光共聚焦显微镜图；
图3为本发明的实施例2为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察肺癌细胞渗透的激光共聚焦显微镜图；
图4为本发明的实施例2为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察肺癌细胞增殖的激光共聚焦显微镜图；
图5为本发明的实施例2的PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察肺癌细胞分布的SEM和激光共聚焦图；
图6为本发明的实施例3的PDLM-胶原-壳聚糖支架接种高密度A549细胞后考察肿瘤球形成的SEM图；
图7为本发明的实施例3的PDLM-胶原-壳聚糖支架接种高密度A549细胞后加药处理考察5-FU对细胞活性影响的激光共聚焦图；
图8为本发明的实施例3的PDLM-胶原-壳聚糖支架接种高密度A549细胞后加药处理考察5-FU对细胞杀伤作用的组织切片图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
本实施例提供一种三维肺癌模型支架的制备方法，具体包括如下步骤：
S1：取猪源性全肺组织，用纯净水冲洗3-5次，完全切除支气管部分，将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3～0.5cm3的碎末；
S2：于室温下用pH为7.4的磷酸盐(PBS)缓冲液清洗步骤S1中的碎末3～5次，去除其中的血丝，每次清洗均采用磁力搅拌器搅拌，每次清洗时间均为0.5～1h；
S3：于室温下向经步骤S2处理之后的碎末中加入质量分数为0.1～0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，用磁力搅拌器搅拌5～10h，初步脱除细胞，得部分脱除细胞的肺脏碎末；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的碎末中加入体积分数为0.1～0.25％的TritonX-100溶液，用磁力搅拌器搅拌5～10h，继续脱除细胞；
S5：室温下，用pH为7.4的PBS缓冲液清洗经步骤S4处理之后的碎末3～5次，每次清洗的持续时间均为0.5～1h，得脱细胞碎末；
S6：将步骤S5中得到的脱细胞碎末置于-10～-20℃条件下预冻5～12h；
S7：将步骤S6中预冻后的脱细胞碎末冷冻干燥，得干燥脱细胞猪肺支架，本实施例的冷冻干燥的冷阱温度为-75～-80℃，冷冻干燥时间为10～15h；
S8：将步骤S7中的干燥脱细胞猪肺支架置于球磨机中研磨1～2h，得纳米脱细胞支架颗粒；
S9：将步骤S8中的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中，待混合均匀后置于-20～-30℃条件下预冻12～24h，本实施例的胶原-壳聚糖溶液包括如下质量比的成分：PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1～9:3:1。
S10：将经步骤S9处理之后的混合溶液冷冻干燥，制得3D多孔PDLM-胶原-壳聚糖支架，本实施例冷冻干燥的冷阱温度为-75～-80℃，冷冻干燥时间为24～36h；
S11：除去步骤S10中获得的3D多孔PDLM-胶原-壳聚糖支架的表面致密层，之后采用交联剂进行化学交联6～12h，再加入浓度为0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和乙酸2h，之后用浓度为75％的乙醇和pH为7.4的PBS缓冲液清洗3～5次，每次清洗0.5～1h，清洗后在-70～-80℃条件下进行二次冷冻干燥12～24h，获得交联后的3D仿生脱细胞肺脏基质，即三维肺癌模型支架；本实施例所用的交联剂为由40％乙醇溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和乙磺酸(MES)的混合溶液，交联剂中EDC、NHS和MES的浓度均为50mmol/L。
本实施例制备的三维肺癌模型支架(PDLM-胶原-壳聚糖支架)保留了肺脏特有的肺泡结构，且创造出类肺泡小孔结构，纳米PDLM颗粒均匀分散于支架表面，复合支架孔径在168μm～276μm之间，孔隙率范围为90.32％～96.58％，吸水率为205.79％～310.27％，支架应力在206.33～697.35kPa之间。
本实施例选取脱细胞肺脏胞外基质为体外构建肺癌模型的主要材料，在此基础上加入因脱细胞而损失较多的胶原，以及类似糖胺聚糖结构的壳聚糖，尽量模拟体内肺脏组织的细胞外基质及营造肿瘤细胞生长的微环境，提高了研究肺癌细胞一系列生物学行为的准确性。本实施例制备的复合支架平均孔径约为200μm左右，与体内肺泡孔径接近，且所制备的肺泡孔微观结构为肺癌细胞生长提供了良好的增殖空间。制备的脱细胞肺脏胞外基质纳米颗粒均匀分散于复合支架表面、孔壁及骨架中，表面非完全光滑利于细胞粘附，且纳米颗粒利于细胞-细胞、细胞-基质间生物信号的传导。另外，脱细胞肺脏基质、胶原及壳聚糖三者均具有良好的生物相容性，利于肺癌细胞的定植及不断的生长繁殖，复合支架经进一步交联处理后，其力学性能也显著提高，为肺癌细胞长时间培养发展成较大肿瘤球提供了支撑条件。
本实施例将猪肺组织搅碎后再行脱细胞处理，因此可极大减少脱细胞时间及脱细胞试剂的用量。脱细胞后的组织碎末干燥后进一步研磨成纳米颗粒，因纳米结构的基质利于促进细胞之间的相互作用及细胞间生物信息的传递，进而促进细胞的生长增殖。同一个肺脏组织可以获得较多脱细胞肺脏胞外基质纳米颗粒，且进一步制备的复合支架结构较为一致，保证复合支架批次统一性及各项检测试验结果的准确性。另外，利用本实施例制备的复合支架在体外构建的三维肺癌模型进行的一系列检测直观可视且操作简单方便。
实施例2：
本实施例将整个猪肺组织切除支气管部分，剪成小块，使用搅碎机将其搅碎，大小约为0.5cm3，将猪肺碎末置于烧杯中，加入1000mL超纯水，磁力搅拌30min后更换新的超纯水，重复三次后，加入1000mLPBS同样清洗3次，每次磁力搅拌30min，待样品中无明显血色后，加入0.5％(wt％，下同)SDS溶液1000mL，磁力搅拌5h后，更换新的0.25％SDS溶液继续搅拌5h，用于除去细胞；随后，加入0.25％(v％，下同)TritonX-100溶液1000mL搅拌5h，进一步除去剩余细胞；待细胞脱除后，加入1000mLPBS清洗5次，每次持续时间30min，用于洗净脱细胞试剂。将脱细胞碎末置于-20℃的冰箱中预冻5h后，置于冷冻干燥机中-80℃干燥12h，获得干燥脱细胞猪肺基质支架，进一步将其倒入行星组织球磨机研磨2h，获得PDLM纳米颗粒，所获得的PDLM纳米颗粒的外观图和SEM图见附图1。
通过评估PDLM脱细胞中胶原以及糖胺聚糖损失情况，分别配置胶原水溶液和2％壳聚糖-乙酸溶液，胶原和壳聚糖的质量比为2:1，待两者溶解后，倒入同一个烧杯中继续搅拌至混合均匀，再于上述胶原-壳聚糖混合溶液中加入PDLM纳米颗粒，最终PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1，继续搅拌至三者完全混匀。随后将配置的混合液缓慢加入24孔板中，保证无气泡产生，孔板至于冰块上以降低PDLM颗粒在混合液中沉降过快引起其分布不均，将混合液置于-20℃冰箱中预冻12h后，置于-80℃冷冻干燥机中干燥24h，获得PDLM-胶原-壳聚糖复合支架。
上述复合支架保留孔板圆柱外形，用刀片切去复合支架各面致密层后，将支架转移至500mL烧杯中，加入400mL40％乙醇溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)/MES(乙磺酸)交联剂，EDC、NHS和MES的浓度均为50mmol/L。将其置于磁力搅拌器上缓慢搅拌12h，随后加入Na2HPO4(0.1mol/L)溶液反应3h以除去复合支架中的乙酸，先后用75％乙醇和PBS各冲洗2h后，支架转移至24孔板中-20℃冰箱中预冻5h后，置于-80℃冷冻干燥机12h后，获得交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架，所获得的PDLM-胶原-壳聚糖支架的外观图和SEM图见附图1。
将交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架切成5mm*5mm*1mm薄片后置于6孔板中，每个孔中薄片数量少于20；放入超净台中，每孔倒满75％酒精并于紫外照射情况下浸泡过夜，以保证支架完全除菌。换用PBS浸泡2h并于超净台内风干后，接种A549细胞，持续培养14天，在培养不同时间点取出部分支架做相关检测。其中一部分支架直接经钙黄绿素Calcein-AM染色后置于显微镜下通过荧光及明场视野观察细胞渗透和生长增殖情况；一部分支架经碘化丙啶PI、钙黄绿色Calcein和Hoechst染色后评估细胞存活情况；一部分支架置于2.5％戊二醛中固定5h及梯度酒精脱水(50％，70％，90％，100％，100％)后，表面喷金于扫描电镜下考察细胞粘附伸展情况；另一部分支架经Ki67和F-actin荧光染色后，置于激光共聚焦纤维下考察细胞在复合支架的分布以及增殖活性。
见附图2，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察细胞存活的激光共聚焦显微镜图，从附图2中可以看出A549细胞接种支架三天后，只有零星几个死细胞被PI染色呈现红色荧光，绝大多数活细胞被钙黄绿素Calcein-AM染色呈强绿色荧光；另外，活细胞同时被Hochest染色呈淡蓝色荧光，而复合支架中因胶原的存在导致支架同时被着色；死活染色结果表明PDLM-胶原-壳聚糖仿生肺脏细胞外基质支架具有极好的生物相容性。
见附图3，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察肺癌细胞渗透的激光共聚焦显微镜图，A549细胞接种PDLM-胶原-壳聚糖支架2天后，通过激光共聚焦显微镜对细胞-支架构建物进行序列扫描考察肺癌细胞在复合支架中的渗透情况，通过结果发现细胞在支架表面及其以下不同深度(0μm、50μm和100μm)均有不同程度的渗透，且随着深度的增加，细胞数量减少，表明A549细胞在复合支架各层的渗透效果不同。
见附图4，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察肺癌细胞增殖的激光共聚焦显微镜图，结果显示，接种1天后，绝大部分细胞在复合支架骨架及表面贴壁且铺展；培养2天后，细胞沿支架骨架及孔隙呈良好伸展，支架结构清晰可见，随着培养时间延长，到第5天的时候，大部分细胞开始收缩且细胞间堆叠形成大小不一的集落，细胞间连接非常紧密；培养10天后，复合支架表面及孔隙逐渐被细胞集落覆盖，支架骨架逐渐模糊；培养14天后，细胞集落发展迅速逐渐填满整个支架，支架的透光度明显下降。
见附图5，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种A549细胞后考察肺癌细胞分布的SEM和激光共聚焦图，从SEM及F-actin染色可以看出，细胞遍布整个PDLM-胶原-壳聚糖支架，细胞在支架骨架、孔壁和表面分布较为均匀且粘附良好，支架表面细胞因更容易接触营养物质数量稍多；同时，Ki67荧光强阳性结果也说明A549细胞培养一周后仍然保持较强的增殖活性；另外，F-actin及Ki67荧光染色很好呈现PDLM-胶原-壳聚糖的3D微观结构。
实施例3：
本实施例将整个猪肺组织切除支气管部分，剪成小块，使用搅碎机将其搅碎至大小约为0.2cm3；之后将猪肺碎末置于烧杯中，再向烧杯中加入1000mL超纯水，磁力搅拌30min后更换新的超纯水，重复三次后，加入1000mLPBS溶液同样清洗5次，每次磁力搅拌1h，待样品中无明显血色后，加入0.25％(wt％，下同)SDS溶液1000mL，磁力搅拌3h后，更换新的0.1％SDS溶液继续搅拌3h，用于除去细胞。随后，加入0.1％(v％，下同)TritonX-100溶液1000mL搅拌8h，进一步除去剩余细胞，待细胞脱除后，加入1000mLPBS清洗3次，每次持续时间1h，用于洗净脱细胞试剂。再将脱细胞碎末置于-30℃的冰箱中预冻10h后，置于冷冻干燥机中-75℃干燥15h，获得干燥脱细胞猪肺基质支架。进一步将其倒入行星组织球磨机研磨1.5h，获得PDLM纳米颗粒。
通过评估PDLM脱细胞中胶原以及糖胺聚糖损失情况，分别配置胶原水溶液及2％壳聚糖-乙酸溶液，两者质量比为3:1，待两者溶解后，倒入同一个烧杯继续搅拌至混合均匀。于上述胶原-壳聚糖混合溶液中加入PDLM纳米颗粒，三者质量比为9:3:1，继续搅拌至PDLM完全分布于胶原-明胶溶液中。随后，将配置的混合液缓慢加入24孔板中，保证无气泡产生，孔板至于冰块上以降低PDLM颗粒在混合液中沉降过快引起其分布不均。将混合液至于-20℃冰箱中预冻15h后，置于冷冻干燥机干燥中-75℃干燥30h，获得干燥的PDLM-胶原-壳聚糖复合支架。
上述复合支架保留孔板圆柱外形，刀片切去复合支架各面致密层后，将支架转移至1000mL烧杯中，加入800mL 60％乙醇溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)/MES(乙磺酸)交联剂，交联剂浓度均为50mmol/L。将其置于磁力搅拌器上缓慢搅拌8h，随后加入Na2HPO4(0.1mol/L)溶液的反应2h以除去复合支架中的乙酸，先后用75％乙醇和PBS各冲洗2h后，支架转移至24孔板中-30℃冰箱中预冻10h后，置于-75℃冷冻干燥机15h后，获得交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架。
将交联后的PDLM-胶原-壳聚糖支架切成5mm*5mm*2mm薄片后置于10cm无菌培养皿中；放入超净台中，倒入75％酒精并打开紫外灯照射3h后，移去剩余酒精并再次加入75％酒精照射3h以保证支架完全除菌。换用PBS浸泡1h后，更换培养基继续浸泡30min并于超净台内风干后，于复合支架正反面接种A549细胞5*105个，持续培养7天待肿瘤球发展到一定程度后，加入5-FU(50μg/mL)继续培养5天，通过多种检测考察5-FU对3D培养A549细胞的抑制作用。在培养不同时间点取出部分支架做相关检测，其中一部分支架置于2.5％戊二醛中固定5h及梯度酒精脱水(50％，70％，90％，100％，100％)后，表面喷金于扫描电镜下观察肿瘤球发展情况；一部分支架经碘化丙啶PI、钙黄绿色Calcein和Hoechst染色后评估5-FU对细胞活性的影响；一部分支架10％福尔马林固定，石蜡包埋切片后，H&E和Masson’sTrichrome三染常规操作考察5-FU对3D乳腺癌细胞杀伤作用。
见附图6，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种高密度A549细胞后考察肿瘤球形成的SEM图，高密度A549细胞接种复合支架培养3天后，SEM结果显示复合支架表面及内部肿瘤球随处可见，且随着培养天数延长至7天时，肿瘤球之间相互连接，覆盖整个支架，可作为后续考察5-FU对肿瘤细胞抑制作用的平台。
见附图7，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种高密度A549细胞后加药处理考察5-FU对细胞活性影响的激光共聚焦图，从图中可看出，培养3天后，未加药组肿瘤球间相互连接覆盖整个支架，Calcein-AM标记活细胞发出强绿色荧光，且PI标记死细胞较少；5-FU处理3天后，Calcein-AM荧光信号明显减弱，表明活细胞数量显著减少，同时，PI标记死细胞明显增多，且肿瘤球数量和尺寸低于未加药组。
见附图8，为PDLM-胶原-壳聚糖支架接种高密度A549细胞后加药处理考察5-FU对细胞杀伤作用的组织切片图，从图中可看出，培养5天后，通过每层细胞数量、状态和分布情况进行组织学分析考察5-FU对3D培养A549细胞的杀伤作用；H&E和Masson’s Trichrome切片结果显示未加药组细胞连接紧密，分布于支架孔壁及孔隙间，且细胞及细胞核形态完整；5-FU处理后，细胞数量明显减少呈零星分布，且出现大片细胞核破裂及细胞溶解现象。
综上所述，本实施例制备的三维生物支架在成分、外形、生物力学等方面接近体内肺脏细胞外基质，构建的3D工程化模型利于反映肺癌细胞在支架中生长、增殖、迁移等生物学行为的真实性和可靠性，为肺癌的生物学研究及药物筛选提供了良好平台。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种三维肺癌模型支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取猪源性全肺组织，用纯净水冲洗3-5次，完全切除支气管部分，将剩余部分用搅碎机搅碎成0.2cm3～0.5cm3的碎末；
S2：于室温下用pH为7.4的PBS缓冲液清洗步骤S1中的碎末3～5次，每次清洗均采用磁力搅拌器搅拌，每次清洗时间均为0.5～1h；
S3：于室温下向经步骤S2处理之后的碎末中加入质量分数为0.1～0.5％的SDS水溶液，用磁力搅拌器搅拌5～10h，初步脱除细胞，得部分脱除细胞的肺脏碎末；
S4：于室温下向经步骤S3处理之后的碎末中加入体积分数为0.1～0.25％的TritonX-100溶液，用磁力搅拌器搅拌5～10h，继续脱除细胞；
S5：室温下，用pH为7.4的PBS缓冲液清洗经步骤S4处理之后的碎末3～5次，每次清洗的持续时间均为0.5～1h，得脱细胞碎末；
S6：将步骤S5中得到的脱细胞碎末置于-10～-20℃条件下预冻5～12h；
S7：将步骤S6中预冻后的脱细胞碎末冷冻干燥，得干燥脱细胞猪肺支架；
S8：将步骤S7中的干燥脱细胞猪肺支架置于球磨机中研磨1～2h，得纳米脱细胞支架颗粒；
S9：将步骤S8中的纳米脱细胞支架颗粒加入胶原-壳聚糖溶液中，待混合均匀后置于-20～-30℃条件下预冻12～24h；
S10：将经步骤S9处理之后的混合溶液冷冻干燥，制得3D多孔PDLM-胶原-壳聚糖支架；
S11：除去步骤S10中获得的3D多孔PDLM-胶原-壳聚糖支架的表面致密层，之后用交联剂进行化学交联6～12h，再加入浓度为0.1mol/L的Na2HPO4溶液中和乙酸2h，之后用浓度为75％的乙醇和pH为7.4的PBS缓冲液清洗3～5次，每次清洗0.5～1h，清洗后在-70～-80℃条件下进行二次冷冻干燥12～24h，获得交联后的3D仿生脱细胞肺脏基质，即三维肺癌模型支架。
2.根据权利要求1所述的一种三维肺癌模型支架的制备方法，其特征在于，步骤S7中冷冻干燥的冷阱温度为-75～-80℃，冷冻干燥时间为10～15h。
3.根据权利要求1所述的一种三维肺癌模型支架的制备方法，其特征在于，步骤S9中的胶原-壳聚糖溶液包括如下质量比的成分：PDLM、胶原和壳聚糖的质量比为9:2:1～9:3:1。
4.根据权利要求1所述的一种三维肺癌模型支架的制备方法，其特征在于，步骤S10中冷冻干燥的冷阱温度为-75～-80℃，冷冻干燥时间为24～36h。
5.根据权利要求1所述的一种三维肺癌模型支架的制备方法，其特征在于，步骤S11中的交联剂为由40％乙醇溶解的EDC、NHS和MES的混合溶液，交联剂中EDC、NHS和MES的浓度均为50mmol/L。
6.权利要求1-5中任意一项所述的制备方法制备的三维肺癌模型支架。
7.权利要求6中的三维肺癌模型支架在制备仿生肺脏模型产品中的应用。
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