CN112029727A - 脑脱细胞基质颗粒支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脑脱细胞基质颗粒支架及其制备方法和应用。本发明所构建的脑脱细胞基质颗粒支架脱除细胞完全，核酸残留少，未经过酶的消化处理等能部分保存原有脑基质的生物成分，能模拟体内脑细胞生长的细胞外基质微环境，使培养的脑细胞的生物学特性更接近在体生长的脑细胞；将脱细胞的脑组织以颗粒的形式涂敷于各种细胞培养容器表面，能改善实验的重复性和可观测性，显著降低了材料的厚度，同时其颗粒的形式又增加了材料的透光性，方便于在倒置光学显微镜下动态观察活细胞的增殖、形态等各种生物学现象。本发明脑脱细胞基质颗粒支架适用脑细胞与ECM以及脑细胞之间互相作用机制研究，也能应用于脑相关疾病的药物筛选。

Description

脑脱细胞基质颗粒支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及脱细胞脑组织材料，尤其涉及脑脱细胞基质颗粒支架及其制备方法和应用，属于脑脱细胞基质颗粒支架领域。
背景技术
细胞生存的微环境是指细胞外基质及其中的体液成分，微环境的完整和稳定是细胞正常增殖、分化、代谢和功能活动所必须的，微环境成分的异常变化可使细胞各种生物特征异常。然而，目前生命科学领域相关的基础科研中使用的细胞培养载体仍然是缺乏细胞外基质的普通塑料培养皿(瓶)。这种培养模式形成的培养物，其分子表型结构单一或者随着传代次数的增加越来越单一，难以模拟体内细胞真实的生物学特征，因此急需新的培养模式及培养载体。
细胞外基质是由生物大分子构成的错综复杂的网络，构成细胞外基质的大分子种类繁多，可大致归纳为四大类：胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖以及弹性蛋白。细胞外基质的组分及组装形式由所产生的细胞决定，并与组织的特殊功能需要相适应。与身体其他组织相比，脑组织中的细胞外基质成分非常特殊，以蛋白聚糖和糖胺聚糖为主，胶原含量极少。因此也有着其自身特有的功能，其为脑细胞(神经元、神经胶质细胞、肿瘤细胞以及其他细胞)的生存及活动提供适宜的场所并通过与细胞膜上受体结合影响神经元和神经胶质的代谢、功能、迁移、突触的引导、增殖和分化等生物学过程。随着组织工程和生物材料科学的发展，生物材料类的细胞培养载体种类也越来越多，脑脱细胞基质就是其中之一。大脑的脱细胞是一个非常成熟的技术，其主要目的是利用化学试剂去除大脑中的细胞成分，尽可能的保存其原有机械性能、ECM成分、各种细胞因子等。
目前脱细胞脑组织材料在科研中主要有以下应用方式：①切成小块后灭菌(或者提前冻干)接种细胞进行三维细胞培养。这种方式的优点在于最大可能的模拟了体内微环境的组织结构和细胞外基质成分。但它却有着难以推广的缺点：a.透光差，无法进行活细胞状态观察；b.细胞接种后在支架内分布不均匀及细胞丢失，导致实验重复性差；c.支架尺寸形状及重量缺乏科学的标准；②用胃蛋白酶等酶消化成多肽混合物，制成水凝胶后接种细胞进行三维培养。这种方式的优点在于：a.能控制水凝胶中细胞外基质的浓度；b.形状能兼容多种培养容器；c.透光性非常好，能在活细胞状态下观察培养物的变化。但它也有着明显的缺点：a.由于经过酶的消化，许多有活性的生物大分子都会失去活性或者原本活性低的大分子活性大增，同时组织的天然结构会被彻底破坏，从而失去原有ECM成分所具有的生物学功能；b.由于脑组织胶原蛋白等成胶分子含量低，制作水凝胶时往往额外引入其他成胶成分，破坏了该水凝胶基质的“原位天然性”；c.成胶过程需要较长时间的温箱孵育，此过程细胞下沉导致细胞在垂直方向上分布不均匀；③用胃蛋白酶等酶消化成多肽混合物或者浸泡形成浸出液，包被培养容器进行二维培养。这种培养方式的优点与水凝胶相似，只是其不能提供三维培养空间。但是，其缺点也与水凝胶相似，只是不需要引入其他成胶成分且细胞能均匀分布。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种更能反应体内细胞生物学特性，又能促进实验的重复性和可观测性的脑脱细胞基质颗粒支架；
本发明的目的之二是提供制备所述脑脱细胞基质颗粒支架的方法；
本发明的目的之三是将所述的脑脱细胞基质颗粒支架应用于单独培养脑细胞或将脑细胞与其它细胞进行共培养。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种脑脱细胞基质颗粒支架，其制备方法包括：
(1)以动物或人的脑组织为材料进行脱细胞处理得到脱细胞脑组织；
(2)将得到的脑脱细胞基质进行冷冻干燥；
(3)将冷冻干燥后的脑脱细胞基质研磨破碎；
(4)将脑脱细胞基质碎块用去离子水重悬得到脑脱细胞基质悬液，将脑脱细胞基质悬液进行搅拌破碎处理；
(5)脑脱细胞基质颗粒悬液过滤除掉大颗粒基质后，将滤液涂敷于细胞培养容器的表面干燥固化；
(6)将干燥固化的涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养容器进行灭菌、干燥，即得。
其中，本发明中所述的动物的脑组织中的动物包括大鼠、小鼠或猪等各种实验动物。
步骤(1)中所述的以动物或人的脑组织为材料进行脱细胞处理得到脱细胞脑组织中的脱细胞处理方法可以是本领域常规的脱细胞处理方法，可以参考有关脑脱细胞的各种文献中所披露的有关方法进行，只要该脱细胞程序能完整的脱除细胞，能部分保存原有脑基质的基质结构和生物成分(如透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、各种生长因子等)，这些脱细胞处理方法均能适用于本发明。
作为参考，本发明提供了一种以SD大鼠的脑组织为材料进行脱细胞处理得到脱细胞脑组织的方法，包括：
(a)对SD大鼠进行腹主动脉灌流生理盐水至脑组织变白，然后进行开颅取脑；
(b)将得到的脑去除小脑，延正中矢状面及正中冠状面切开，用1xPBS冲洗一遍后，-80℃与37℃下交替放置30min，冻融四次；
(c)在摇床上，将去除小脑后的脑组织以60rpm的转速，室温下用PBS清洗3次，10min/次；
(d)在摇床上，以60rpm，4℃下用1％的Triton-X100处理12h，得到初步脱细胞的脑组织；
(e)在摇床上，将初步脱细胞的脑组织以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍；
(f)在摇床上，以60rpm，室温下用4％的脱氧胆酸钠处理12h，得到脱细胞的脑组织。
为了达到更好的技术效果，还可以对得到脱细胞的脑组织继续进行下述的后处理，包括：
(a)在摇床上，将脱细胞的脑组织以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍；
(b)在摇床上，以60rpm，室温下用1M NaCl的DNA酶I处理12min；
(c)在摇床上,以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍，放于-80℃冰冻保存。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的冷冻干燥的温度为-45℃，冷冻干燥时间为12h。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(5)中将脑脱细胞基质颗粒悬液用50-120目细胞筛进行过滤，更优选采用70-100目细胞筛进行过滤，最优选采用100目细胞筛进行过滤。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(5)中所述的细胞培养容器包括但不限于细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞培养板。
作为一种优选的具体实施方案，步骤(6)中将得到的涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养容器采用Co60照射灭菌的方式进行灭菌，所述的照射剂量优选为25Gy；步骤(6)中所述的干燥优选为在4℃条件下进行干燥。
本发明所构建的脑脱细胞基质颗粒支架能作为脑细胞单独培养或者与其他相关细胞共培养的支架，应用于脑细胞(神经元、神经胶质细胞、脑相关肿瘤细胞)与ECM以及脑细胞之间互相作用机制研究，也能应用于某些脑相关疾病(例如脑胶质瘤)的药物筛选；在应用本发明所构建的脑脱细胞基质颗粒支架之前，需要将涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的培养皿、培养瓶、培养板在培养细胞之前用PBS洗3次，1h/次，再用相应的培养细胞的完全培养基浸泡过夜。
本发明所构建的脑脱细胞基质颗粒支架由成熟的脑脱细胞技术而来，脱除细胞完全，核酸残留少，未经过酶的消化处理等能部分保存原有脑基质的生物成分(如透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、各种生长因子等)，因此能模拟体内脑细胞生长的细胞外基质微环境，使培养的脑细胞的生物学特性更接近在体生长的脑细胞；本发明所构建的脑脱细胞基质颗粒支架将脱细胞的脑组织以颗粒的形式涂敷于各种培养皿、培养瓶、培养板等，因此能改善实验的重复性和可观测性；适用脑细胞与ECM以及脑细胞之间互相作用机制研究，也能应用于某些脑相关疾病(例如脑胶质瘤)的药物筛选。
本发明的脑脱细胞基质颗粒支架的构建是通过形成脑脱细胞基质颗粒悬液，然后涂敷各种细胞培养皿、瓶、板等，该方式不仅适用各种形状和规格的细胞培养容器且能控制每平方厘米培养面积上的细胞外基质量，使相关实验研究的广度、深度和可重复性增加。
本发明构建的脑脱细胞基质颗粒支架显著降低了材料的厚度，同时其颗粒的形式又增加了材料的透光性，非常方便于在倒置光学显微镜下动态观察活细胞的增殖、形态等各种生物学现象。
本发明取材易得，脱细胞试剂常见便宜，所需设备要求不高，且同一动物的脑组织可进行多次重复实验，既来源充足，又能保证均一性，所以构建成本低，实用性强，适合推广。
本发明通过对脱细胞脑基质材料进行机械破碎、颗粒质控形成了一种脑脱细胞基质颗粒支架，利用涂敷技术等处理兼容市面上各种类型的细胞培养容器构建得到脑脱细胞基质颗粒支架，能够实现活细胞状态下观察培养物的变化；保存了脑组织细胞外基质成分的完整性；可控制使用细胞外基质的浓度和量；细胞均匀分布；兼容多种培养容器的形状；介于二维和三维的培养环境。该脑脱细胞基质颗粒支架适用于脑细胞(神经元、神经胶质、脑肿瘤细胞、脑转移瘤细胞等)培养相关的基础科研中。
附图说明
图1为本发明肉眼下冻干后正常SD大鼠脑(左)与脱细胞SD大鼠脑(右)。
图2为本发明SD大鼠脑脱细胞前(左)后(右)的HE染色图。
图3为本发明脑脱细胞基质颗粒悬液的肉眼观察。
图4为本发明细胞培养于涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养载体底面结构示意图。
图5为本发明涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养载体(培养皿(左)和96孔板(右))的显微观察结果。
图6为本发明涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养载体培养脑相关细胞(以脑胶质瘤细胞U251为例)的显微图：普通光学显微镜下(左)和倒置荧光显微镜下活死染色图(钙黄绿素-碘化丙啶)(右)。
图7为本发明利用涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养96孔板，以普通96孔板为对照，检测U251在脑细胞外基质存在的情况下对化疗药物替莫唑胺的IC50变化结果。
图8为本发明利用涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养皿，检测脑细胞外基质存在的情况下，对U251耐药相关基因转录影响的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 SD大鼠脱细胞大脑基质的制备
将12周，雌性SD大鼠进行腹主动脉灌流生理盐水200ml，共灌注了5min至脑组织变白，然后进行开颅取脑。将所得的SD大鼠脑去除小脑后，放于-80℃，30min，然后室温放置30min，如此反复4次；将冻融后的脑以60rpm，室温下用100ml去离子水处理4h。再以60rpm，4℃下用50ml 1％的Triton-X100处理12h，得到初步脱细胞的脑组织。再以60rpm，室温下去离子水洗3遍，10min/遍。再以60rpm，室温下用50ml，4％的脱氧胆酸钠处理12h得到脱细胞的脑组织。又用60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍。再以60rpm，室温下用10ml，1MNaCl溶解的20KU/ml的DNA酶处理12h。再以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍。然后将脱细胞后的脑放于-80℃冰冻30min后放入冻干机冻干。在冻干前冻干机应该预冷30min，冻干温度为-45℃，冻干6h后将脱细胞基质连同皿放于装有变色硅胶的封口袋中(图1)。HE染色检测脱细胞效果显示脱细胞干净，细胞核残留少(图2)。
实施例2 SD大鼠脑脱细胞基质颗粒悬液的制备
根据实验目的配置一定浓度的悬液(以20mg/ml为例)，将冻干后的脱细胞脑基质(实施例1所制备)在5ml的EP管中用玻璃棒尽可能的研磨碎，称取80mg于一个新的5mlEP管中，用4ml去离子水重悬，加入搅拌子，在磁力搅拌器上180rpm/min搅拌12h尽可能的破碎脱细胞脑基质，用1ml的移液枪反复吹打，将破碎好的脱细胞脑基质悬液用目筛(选择70目(颗粒直径212μm)以上，推荐100目(150μm))过滤除掉大块基质得到脑脱细胞基质颗粒悬液(颗粒直径≤200μm)，悬液呈黄白色(图3)。
实施例3 SD大鼠脑脱细胞基质颗粒悬液涂敷于96孔板得到脱细胞基质颗粒支架载体
为了实现图4中呈现的培养模式，取一块新的96孔细胞培养板于超净工作台中(字母标记于孔板左侧、数字标记于孔板上侧)，取500ul20mg/ml脑脱细胞基质颗粒悬液(实施例2所制备)于1.5mlEP管中，用200ul的移液枪，吸取脑脱细胞基质颗粒悬液，加入96孔板的B2孔中(舍弃边缘36个孔)，液面淹没底面即吸回，移液枪移至B3孔相同角度、相同位置推出脑脱细胞基质颗粒悬液至液面淹没底面，吸回孔中残留的悬液，移至下一个孔，重复以上步骤直至涂敷中央60个孔(推荐涂敷方向为从左至右、从上至下的顺序)，移液枪中剩余的脑脱细胞基质颗粒悬液回收至原处并混均，将孔板放于超净工作台的出风口处10min干燥固化。待干燥固化后，将孔板旋转180°(字母标记于孔板右侧、数字标记于孔板下侧)，按照之前的涂敷方案进行涂敷、干燥固化，再旋转、涂敷、干燥固化，如此重复3-4次直至500ul脑脱细胞基质颗粒悬液涂敷完成。将干燥固化好的孔板放于装有变色硅胶的封口袋中。然后进Co60的照射灭菌，剂量为25Gy。最后在4℃干燥保存。
光学显微镜下观察可见脑脱细胞基质颗粒涂敷于孔板底面，成块分布，各块之间分布均匀，块之间有大量间隙形成高低不平的3D结构(图5右)。
实施例4 SD大鼠脑脱细胞基质颗粒悬液涂敷于直径3.5mm培养皿得到脱细胞基质颗粒支架载体
为了实现图4中呈现的培养模式，取一新直径3.5mm细胞培养皿，取250ul 20mg/ml脑脱细胞基质颗粒悬液(实施例2所制备)用去离子水稀释至1ml，混均。将1ml脑脱细胞基质颗粒悬液放入培养皿中并摇均匀，覆盖整个底面。放于烘箱中37℃(必须＜56℃)12h干燥，将干燥固化好的培养皿放于装有变色硅胶的封口袋中。然后进行Co60的照射灭菌，剂量为25Gy，最后在4℃干燥保存。
光学显微镜下观察，可见脱细胞脑基质颗粒涂敷层分布均匀，颗粒物大小均匀(图5左)。
实验例1利用SD大鼠脑脱细胞基质颗粒支架载体研究替莫唑胺对U251细胞IC50的影响
1.实验方法
取出实施例3所制备的一块灭菌好的涂敷有脑脱细胞基质颗粒支架(decellularized brain extracellular matrix granular scaffolds，dBECMgs)的96孔板，每个孔用无菌的1XPBS洗3遍，4h/遍。再用10％FBS的DMEM高糖完全培养基，37℃浸泡12h。每孔2000个U251细胞接种，以普通无菌96孔板作对照，每孔2000个U251细胞接种，观察(图6左)状态恢复24h后，加入替莫唑胺(0mM、0.1mM、0.3mM、1mM、3mM、10mM共6个浓度)处理72h，用CCK-8试剂检测各孔的吸光度，计算细胞存活率，用Graphpad软件对数变换后，进行非线性拟合计算出IC50(图7)。实验每个浓度设置3个复孔，共做4次独立重复实验。然后对0mM组进行活死染色观察(图6右)。
2.实验结果
普通光学显微镜下可见细胞分布和形态大致可以分辨，细胞分布均匀，细胞形态多样；荧光显微镜下观察无障碍，几乎未见到碘化丙啶染色的死细胞的存在，可见大量被钙黄绿素染色的活细胞，细胞呈集落样分布，各集落大小和分布均匀，细胞形态多样化。
CCK8实验测IC50显示在dBECMgs上生长的U251细胞比普通平面培养下对替莫唑胺的耐药性明显升高(p<0.05)。
实验例2利用SD大鼠脑脱细胞基质颗粒支架载体研究大脑基质对U251细胞耐药相关基因的影响
1.实验方法
取出实施例4所制备的一个灭菌好的涂敷有脑脱细胞基质颗粒支架的直径3.5cm的培养皿，每个孔用无菌的1XPBS洗3遍，4h/遍。再用10％FBS的DMEM高糖完全培养基，37℃浸泡72h。接种细胞量为3×105个。以普通直径3.5cm培养皿接种3×105个细胞为对照。培养2天后，收集细胞提出RNA，进行RT-PCR检测，检测的耐药相关基因有MGMT、BCL3、ABCC1、ABCC2和ABCC4，以β-actin为内参，进行3次独立重复实验。
2.实验结果
根据实验结果可见，在dBECMgs上生长的U251细胞比普通平面培养下耐药相关基因MGMT、BCL3、ABCC1、ABCC2、ABCC4转录组水平均有升高趋势，其中ABCC1和ABCC2这两个广谱耐药基因差异具有统计学意义(P<0.05)(图8)。

Claims (10)

1.一种脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，其制备方法包括：
(1)以动物或人的脑组织为材料进行脱细胞处理得到脱细胞脑组织；
(2)将得到的脑脱细胞基质进行冷冻干燥；
(3)将冷冻干燥后的脑脱细胞基质研磨破碎；
(4)将脑脱细胞基质碎块用去离子水重悬得到脑脱细胞基质悬液，将脑脱细胞基质悬液进行搅拌破碎处理；
(5)脑脱细胞基质颗粒悬液过滤除掉大颗粒基质，滤液涂敷于细胞培养容器的表面后干燥固化；
(6)将干燥固化的涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养容器进行灭菌、干燥，即得。
2.按照权利要求1所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，所述的动物的脑组织中的动物包括大鼠、小鼠或猪。
3.按照权利要求1所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，步骤(1)中所述的以动物或人的脑组织为材料进行脱细胞处理得到脱细胞脑组织中的脱细胞处理方法是完整的脱除细胞，部分保存原有脑基质的基质结构和生物成分。
4.按照权利要求3所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，步骤(1)中所述的以动物或人的脑组织为材料进行脱细胞处理得到脱细胞脑组织中的脱细胞处理方法，包括：
(a)对SD大鼠进行腹主动脉灌流生理盐水至脑组织变白再进行开颅取脑；
(b)将得到的脑去除小脑，延正中矢状面及正中冠状面切开，用1xPBS冲洗一遍后，-80℃与37℃下交替放置30min，冻融四次；
(c)在摇床上，将去除小脑后的脑组织以60rpm的转速，室温下用PBS清洗3次，10min/次；
(d)在摇床上，以60rpm，4℃下用1％的Triton-X100处理12h，得到初步脱细胞的脑组织；
(e)在摇床上，将初步脱细胞的脑组织以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍；
(f)在摇床上，以60rpm，室温下用4％的脱氧胆酸钠处理12h，得到脱细胞的脑组织。
5.按照权利要求4所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，对得到脱细胞的脑组织进行下述的后处理，包括：
(a)在摇床上，将脱细胞的脑组织以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍；
(b)在摇床上，以60rpm，室温下用1M NaCl的DNA酶I处理12min；
(c)在摇床上,以60rpm，室温下用去离子水洗3遍，10min/遍，放于-80℃冰冻保存。
6.按照权利要求1所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，步骤(2)中所述的冷冻干燥的温度为-45℃，冷冻干燥时间为12h。
7.按照权利要求1所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，步骤(5)中将脑脱细胞基质颗粒悬液用50-120目细胞筛进行过滤，更优选采用70-100目细胞筛进行过滤，最优选采用100目细胞筛进行过滤；步骤(5)中所述的细胞培养容器包括但不限于细胞培养皿、细胞培养瓶或细胞培养板。
8.按照权利要求1所述的脑脱细胞基质颗粒支架，其特征在于，步骤(6)中将得到的涂敷有脑脱细胞基质颗粒悬液的细胞培养容器采用Co60照射灭菌的方式进行灭菌，所述的照射剂量优选为25Gy；步骤(6)中所述的干燥在4℃条件下进行干燥。
9.按照权利要求1-8任何一项所述的脑脱细胞基质颗粒支架在单独培养脑细胞或将脑细胞与其它细胞进行共培养中作为培养支架中的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于，在应用所构建的脑脱细胞基质颗粒支架培养细胞之前，将其用PBS洗3次，1h/次；再用相应的用于培养细胞的完全培养基浸泡过夜。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961830A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 重庆医科大学附属口腔医院 口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用
CN113293134A (zh) * 2021-04-29 2021-08-24 潍坊医学院 一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用
CN114191614A (zh) * 2022-01-07 2022-03-18 华东理工大学 一种脑脱细胞基质的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050013872A1 (en) * 2003-07-17 2005-01-20 Toby Freyman Decellularized bone marrow extracellular matrix
CN110257335A (zh) * 2019-04-10 2019-09-20 首都医科大学附属北京天坛医院 单层或多层的3d脑胶质瘤细胞培养模型及其构建方法和应用
CN110272860A (zh) * 2019-06-30 2019-09-24 东南大学苏州医疗器械研究院 一种细胞三维培养微环境构建方法及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050013872A1 (en) * 2003-07-17 2005-01-20 Toby Freyman Decellularized bone marrow extracellular matrix
CN110257335A (zh) * 2019-04-10 2019-09-20 首都医科大学附属北京天坛医院 单层或多层的3d脑胶质瘤细胞培养模型及其构建方法和应用
CN110272860A (zh) * 2019-06-30 2019-09-24 东南大学苏州医疗器械研究院 一种细胞三维培养微环境构建方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIEGO REGINENSI,等: "Role of Region-Specific Brain Decellularized Extracellular Matrix on In Vitro Neuronal Maturation", 《TISSUE ENG PART A》 *
丁明祥等: "骨髓间充质干细胞与脱细胞脑组织支架的生物相容性", 《中国组织工程研究》 *
彭?王玉杰等: "兔膀胱脱细胞基质负载大鼠毛囊干细胞的体外培养", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961830A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 重庆医科大学附属口腔医院 口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用
CN113293134A (zh) * 2021-04-29 2021-08-24 潍坊医学院 一种三维肺癌模型支架、制备方法及应用
CN114191614A (zh) * 2022-01-07 2022-03-18 华东理工大学 一种脑脱细胞基质的制备方法

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