CN106350482A - 一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法 - Google Patents

一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法。本发明提供的培养体系能够用于软骨细胞的三维培养，其配方合理，从而能够促进细胞的快速增殖，同时避免纤维软骨细胞的生成，所得组织中透明软骨细胞的比例较高。实验表明，该培养体系能够缩短软骨细胞的培养时间，培养26天，可以得到透明软骨。

Description

一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法。
背景技术
关节软骨损伤和骨关节炎是最常见的关节疾病，并且关节很容易被损害，运动损伤或老化，目前关节软骨损伤的修复方法主要包括镶嵌式成形术、微骨折、注射自体软骨细胞，并且这些治疗方法主要产生纤维软骨而不是透明软骨，虽可以缓解疼痛和改善关节功能，但是长期的结果不是令人不满意。
现较有前途的方法就是关节腔内大量注射间充质干细胞，因为细胞可以作为营养的生物活性因子启动再生活动导致缺陷的修复。但是软骨细胞培养条件和移植后的固定问题限制了软骨细胞移植的临床应用。有研究首先将软骨细胞种植于人工合成多聚物和胶原凝胶支架上，成功的在体外再生了软骨组织，用于修复关节软骨缺损，获得了满意的效果。然而在细胞支架复合物移植入体内后，支架将可能引起受者的免疫排斥反应；原有组织和支架材料整合困难，复合物的机械强度较低。
人的健康关节软骨细胞来源有限，含量低，细胞增殖活性较弱，且在其体外培养过程中会发生去分化现象。因此，如何既能获得高数量的软骨细胞，又能有效地保持培养软骨细胞良好的分化表型是亟待解决的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法，本发明提供的培养基用于培养软骨细胞能够促进细胞的增殖，促进透明质软骨的形成的生成。
本发明提供的三维培养体系，包括凝胶和培养液；
凝胶由海藻酸钠和壳聚糖制得；其中海藻酸钠与壳聚糖的质量比为0.6:5～0.3:1。
壳聚糖是天然有机高分子材料，具有促进骨细胞和成纤维细胞黏附、分化和增殖，以及引导和促进骨形成的作用。壳聚糖是一种带正电荷的高分子聚合物，具有良好的生物相容性、透明性以及可降解性，且其降解产物对机体无毒性，广泛应用于组织工程及药物载体的研究中。但其存在强度低和在湿态环境下强度损失过快的问题。
海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取的一种碳水化合物，是美国食品药品管理局(FDA)批准用于生物医学领域的天然生物材料之一，其分子中含有能与多种金属离子反应形成凝胶的羧基和羟基，并且具有良好的生物相容性、生物降解性和可塑性，并且能较有效地维持培养细胞的分化表型。
本发明将壳聚糖和海藻酸钠结合，构建三维培养支架，可以改善壳聚糖的机械强度过大、降解过慢的弱点，壳聚糖又可以促进软骨细胞增殖，引导以及促进透明质软骨的形成形成。以本发明提供的三维培养体系进行培养，可以避免纤维软骨的产生，所得细胞中透明软骨的比例较高。
在一些实施例中，海藻酸钠与壳聚糖的质量比为0.3:1。
在本发明的实施例中，培养液为CC培养基。
本发明所述的三维培养基在培养软骨细胞中的应用。
本发明还提供了一种软骨细胞的培养方法，将原代培养的软骨细胞以本发明提供的的三维培养体系扩增培养。
在本发明的实施例中，扩增培养具体为将软骨细胞接种于凝胶后，置于培养液中培养；
凝胶由海藻酸钠和壳聚糖制得；其中海藻酸钠与壳聚糖的质量比为0.6:5～0.3:1。
在本发明的实施例中，接种的密度为2×106个/mL。
在本发明的实施例中，接种具体包括：以海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液的混合物重悬细胞后，0℃～4℃静置4min；然后经氯化钙溶液处理，再0℃～4℃静置4min。
所述海藻酸钠溶液中，海藻酸钠的质量分数为3％。
海藻酸钠溶液的配制方法为：称取海藻酸钠与超纯水混合，70℃水浴加热，同时搅拌30min，静止20min，重复2遍，直至完全溶解，震荡排除气泡，制得3％的海藻酸钠溶液。
所述壳聚糖溶液中，壳聚糖的质量分数为10％。
壳聚糖溶液的配制方法为：取壳聚糖加入体积分数为2％醋酸溶液中磁力搅拌1h，待粉末完全溶解后，静置12h以排出气泡，制得质量分数为10％的壳聚糖溶液。
所述海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液混合的体积比为2：5～1:1。
一些具体实施例中，海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液混合的体积比为1:1。
所述氯化钙溶液中，氯化钙的浓度为200mmol/L.
所述氯化钙处理具体为，将氯化钙溶液贴壁加入细胞培养板的培养孔中。
所述氯化钙溶液的体积与凝胶的体积比为1:1。
本发明中培养软骨细胞的容器为经过琼脂糖的包被的细胞培养板。
具体为，将加热的琼脂糖溶液倒入细胞培养板的培养孔中，使琼脂糖平铺满培养孔的底部。
包被琼脂糖凝胶，可以有效避免软骨细胞的贴壁生长，进一步避免纤维软骨的生成。
所述细胞培养板为24孔板或6孔板。
在本发明的实施例中，软骨细胞的原代培养具体为：将软骨组织经II型胶原酶消化后以CM培养液培养至细胞80％～90％汇合。
II型胶原酶溶液的浓度为1mg/mL，酶解温度为37℃，时间为14h，摇床转速为50rpm。
原代培养的软骨细胞在进行扩增培养前，经过效果，所述效果具体为：胰蛋白酶提前置于37℃预热，消化P0代的软骨细胞，0.25％胰蛋白酶消化4min。用CM培养基与胰蛋白酶1：1的比例终止消化，1100rpm，5min离心细胞，去上清，收获细胞。
在本发明的实施例中，培养的时间为26天。培养过程中，每2～3天更换CC培养液。
本发明提供的培养体系能够用于软骨细胞的三维培养，其配方合理，从而能够促进细胞的快速增殖，同时避免纤维软骨细胞的生成，所得组织中透明软骨细胞的比例较高。实验表明，该培养体系能够缩短软骨细胞的培养时间，培养26天，可以得到透明软骨。
附图说明
图1示原代软骨细胞，100×；
图2示原代软骨细胞以实施例2培养体系培养的效果，其中图2-a示培养第0天细胞形态，100×；图2-b示培养第26天细胞形态，100×；图2-c示培养26天后，细胞中II型胶原染色；图2-d示培养26天后，细胞中I型胶原染色；图2-e示培养26天后，甲苯胺蓝染色；
图3示原代软骨细胞以对比例1方法培养的效果，其中图3-a示培养第0天细胞形态，100×；图3-b示培养第26天细胞形态，100×；图3-c示培养26天后，细胞中II型胶原染色；图3-d示培养26天后，细胞中I型胶原染色；图3-e示培养26天后，甲苯胺蓝染色。
具体实施方式
本发明提供了一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
将软骨组织划成多个小块，置于1×双抗溶液中。称重后迅速转移到超净台中。
将1×PBS替换成10×双抗溶液，用力摇晃装有软骨的离心管，持续10s。将软骨转移到转移到100mm的培养皿中。用1ml枪头弃掉溶液，添加新的1×PBS，用一个干净的手术刀以及镊子将软骨片的内表面刮干净，弃掉PBS。
向处理干净的软骨片中加入10ml CM培养基，将软骨片切成米粒大小的碎片，置于培养箱中待消化。
弃掉CM培养基，添加15mL的1mg/mL II型胶原酶溶液。放在孵箱中摇床上消化14h(50rpm)。
第2天，用1mL枪头将消化软骨组织的消化液转移至50mL离心管中。细胞计数后，1100rpm离心5min，去除上清，添加CM培养基。接种在培养皿中，置于培养箱中培养。接种的第2天，弃掉培养液，用PBS冲洗细胞一遍，添加CM培养基继续培养。
骨细胞消化14h培养至第6天(P0代)的骨细胞形态如图1，此时细胞汇合至90％。
胰蛋白酶提前置于37℃预热，消化P0代的软骨细胞，0.25％胰蛋白酶消化4min。用CM培养基与胰蛋白酶1：1的比例终止消化。细胞用计数板计数，1100rpm，5min离心细胞，去上清，收获细胞。
实施例2
1、培养板的预处理：
1)、琼脂糖包被培养板：琼脂糖用前加热溶解，铺24孔板，置于4℃保存，凝固使用后使用。
2)、明胶基质包被培养皿：明胶基质用前加热溶解，铺24孔板，置于4℃保存。凝固后使用。
2、凝胶溶液的配制
1)、壳聚糖胶体的制备：配置2％醋酸溶液；分别称取1g的壳聚糖粉末，加入10mL醋酸溶液中磁力搅拌1h，待粉末完全溶解后，静置12h以排出气泡，制得10％的壳聚糖溶液。
2)、海藻酸钠胶体的制备：分别称取0.3g的海藻酸钠粉末，与10mL超纯水在三角烧瓶中混合，70℃水浴加热，同时搅拌30min，静止20min，重复2遍，直至完全溶解，震荡排除气泡，制得3％的海藻酸钠溶液。
3、细胞的接种
海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液以体积比为1：1的比例混合，以2×106个细胞/mL的海藻酸钠和壳聚糖混合溶液的比例，向细胞中加入混合溶液，重悬细胞(实施例1收获的原代软骨细胞)。
将细胞悬液加入到经明胶包被的24孔板中，每孔400μL细胞悬液，往培养板孔中间加入，避免产生气泡，旋转培养板，使得细胞悬液铺满孔。置于4℃，4min。
4min后取出培养板，向有细胞的孔壁上轻缓旋转地加入400μL 200mM CaCl2溶液/每孔。置于4℃，4min。
4、细胞的培养
向包被琼脂糖的24孔板中每孔加入1mL CC培养基。用小勺子将凝固的细胞凝胶块(约0.4mL)转移到琼脂糖包被的24孔板中培养，每隔2～3天换液，共培养26天。
实施例3
1、培养板的预处理：
1)、琼脂糖包被培养板：琼脂糖用前加热溶解，铺24孔板，置于4℃保存，凝固使用后使用。
2)、明胶基质包被培养皿：明胶基质用前加热溶解，铺24孔板，置于4℃保存。凝固后使用。
2、凝胶溶液的配制
1)、壳聚糖胶体的制备：配置2％醋酸溶液；分别称取1g的壳聚糖粉末，加入10mL醋酸溶液中磁力搅拌1h，待粉末完全溶解后，静置12h以排出气泡，制得10％的壳聚糖溶液。
2)、海藻酸钠胶体的制备：分别称取0.3g的海藻酸钠粉末，与10mL超纯水在三角烧瓶中混合，70℃水浴加热，同时搅拌30min，静止20min，重复2遍，直至完全溶解，震荡排除气泡，制得3％的海藻酸钠溶液。
3、细胞的接种
海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液以体积比为2:5的比例混合，以2×106个细胞/mL的海藻酸钠和壳聚糖混合溶液的比例，向细胞中加入混合溶液，重悬细胞(实施例1收获的原代软骨细胞)。
将细胞悬液加入到经明胶包被的24孔板中，每孔400μL细胞悬液，往培养板孔中间加入，避免产生气泡，旋转培养板，使得细胞悬液铺满孔。置于4℃，4min。
4min后取出培养板，向有细胞的孔壁上轻缓旋转地加入400μL 200mM CaCl2溶液/每孔。置于4℃，4min。
4、细胞的培养
向包被琼脂糖的24孔板中每孔加入1mL CC培养基。用小勺子将凝固的细胞凝胶块(约0.4mL)转移到琼脂糖包被的24孔板中培养，37℃，5％CO2培养，每隔2～3天换液，共培养26天。
对比例1
向包被琼脂糖的24孔板中每孔加入1mL CC培养基，接种实施例1制得的原代软骨细胞至细胞密度为2×106个细胞/mL。37℃，5％CO2培养，每隔2～3天换液，共培养26天。
实施例4
对实施例2～3和对比例1培养获得的软骨细胞进行鉴定，鉴定采用免疫组化方式进行，主要鉴定I型、II型胶原的表达。具体方法为：透明软骨的鉴定
(1)I型、II型胶原免疫组化操作流程：
1.脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1)组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；
2)无水乙醇中浸泡5min；
3)95％乙醇中浸泡5min；
4)70％乙醇中浸泡5min；
2.PBS洗两次各5min。
3.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3％H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。
4.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。蛋白酶K稀释液室温修复30min。
5.PBS洗5min。
6.滴加5％BSA封闭液，室温封闭15分钟。甩去多余液体，不洗。
7.滴加一抗，4℃过夜(4℃过夜后在室温复温45min)。
8.PBS洗3次每次2min。
9.滴加聚合HRP标记抗兔子/小鼠IgG二抗，室温孵育1h。
10.PBS洗3次每次2min。
11.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)，观察至目的信号深背景颜色浅时立即用蒸馏水终止。
12.苏木素复染20s，蒸馏水洗2次每次2min。
13.脱水：把切片放入50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇中脱水，每次2min。
14.透明：将切片放入100％二甲苯10min透明。
15.中性树脂50ul封片，室温保存。
(2)甲苯胺蓝染色流程
1、石蜡切片脱蜡至水；
2、蒸馏水浸洗3次；
3、0.1％甲苯胺蓝液浸染10min；
4、水洗，洗去多余染液；
5、各级酒精脱水；
6、二甲苯透明，中性树胶封固。
结果表明，采用实施例2～3培养体系进行培养，软骨细胞在3D培养环境中大量增殖，细胞水凝胶的外周可以清晰地看到细胞紧密生长的细胞团，呈现出组织的形态。所获得的细胞大量分泌II型胶原，少量分泌I型胶原和部分GAG，说明其主要获得的是透明质软骨，其中透明软骨的比例可以达到90％以上，其余为纤维软骨。其中，对实施例2培养体系进行培养的细胞的染色效果和生长情况如图2，实施例3提供的培养体系的培养效果与此相似。
而采用对比例1培养方法制得的软骨细胞以散在的细胞团生长，不能形成组织。染色结果显示几乎没有II型胶原，很少的I型胶原，少量的GAG，即并未形成组织，几乎只有单一的软骨细胞。
说明本发明提供的方法能够显著促进软骨细胞的生长，提高透明软骨的比例。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种三维培养体系，其特征在于，包括凝胶和培养液；
所述凝胶由海藻酸钠和壳聚糖制得；其中海藻酸钠与壳聚糖的质量比为0.6:5～0.3:1。
2.根据权利要求1所述的三维培养体系，其特征在于，所述海藻酸钠与壳聚糖的质量比为0.3:1。
3.根据权利要求1所述的三维培养体系，其特征在于，所述培养液为CC培养基。
4.权利要求1～3任一项所述的三维培养基在培养软骨细胞中的应用。
5.一种软骨细胞的培养方法，其特征在于，将原代培养的软骨细胞以权利要求1～3任一项所述的三维培养体系扩增培养。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述扩增培养具体为将软骨细胞接种于凝胶后，置于培养液中培养；
所述凝胶由海藻酸钠和壳聚糖制得；其中海藻酸钠与壳聚糖的质量比为0.6:5～0.3:1。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述接种的密度为2×106个/mL。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述接种具体包括：以海藻酸钠溶液与壳聚糖溶液的混合物重悬细胞后，0℃～4℃静置4min；然后经氯化钙溶液处理，再0℃～4℃静置4min。
9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述软骨细胞的原代培养具体为：将软骨组织经II型胶原酶消化后以CM培养液培养至细胞80％～90％汇合。
10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述培养的时间为26天。
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